UNIVERSIDAD AUTNOMA DE

CHIHUAHUA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROTECNOLGICAS
DIVISIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO

Reaccin en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa

(RT-PCR)

Biotecnologa vegetal
Dra. Ana Cecilia Gonzlez

Por:
Alejandra Villa Martnez
207419

Introduccin
PCR
La biotecnologa, en un sentido amplio se puede definir como la aplicacin de
organismos, componentes o sistemas biolgicos para la obtencin de bienes y
servicios. La Ingeniera Gentica (I.G.), conocida como tecnologa del ADN
recombinante in vitro, se caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar
genes o fragmentos de ADN de organismos distintos, creando nuevas
combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que ponemos a
trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro
provecho.
No cabe ninguna duda de que la tcnica ms revolucionaria de los ltimos 15
aos ha sido la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado
nuevas alas a la propia Ingeniera gentica y a toda la biologa molecular. En
1986, Kary Mullis, un investigador de la Corporacin Cetus invent un mtodo
para lograr la multiplicacin in vitro de fragmentos definidos de ADN sin
necesidad de recurrir a los vectores y su replicacin en bacterias Se trata de la
reaccin en cadena de la polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas
provenientes del ingls Polymerase Chain Reaction. Muchas de las tcnicas
clsicas de la Ingeniera gentica estaban encaminadas a resolver el complejo
problema de cmo clonar o localizar un gen o un segmento de ADN. Sin
embargo, esas tcnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no
den resultados.
La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en principio producir
in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta sin recurrir a la
clonacin en un organismo husped. Esencialmente la tcnica permite la
amplificacin selectiva de cualquier segmento de ADN, conociendo las
secuencias que lo flanquean.
Las aplicaciones de la PCR y de sus numerosas variantes son prcticamente
ilimitadas:
Simplifica muchos experimentos de I.G.
Permite muchos estudios de expresin gentica
Secuenciacin directa de secuencias amplificadas
Deteccin de mutaciones
Seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades
Diagnsticos de enfermedades genticas e infecciosas
En ciencia forense: identificacin de restos biolgicos, determinacin
de paternidad, pruebas periciales en criminalstica
En arqueologa y paleontologa

Este mtodo se vale de una enzima presente en un microorganismo que vive

en aguas termales, la bacteria Thermus aquaticus (Taq), la cual tiene una DNA
polimerasa que funcionaba bien a altas temperaturas e incluso es estable a 94
C, para sintetizar infinidad de copias de ADN a partir de una cantidad mnima
inicial de este, de tal manera de se puede detectar visualmente el producto de
esta amplificacin en forma directa.
Es una tcnica altamente especfica, rpida, sensible y verstil para detectar
cantidades nfimas de un cierto ADN especfico, posibilitando su fcil
identificacin y prescindiendo del uso de radioistopos, indispensables antes
de su invencin.

El Dr. Kary Mullis comparte el premio Nobel de Qumica en 1993 por inventar la
tecnologa de PCR.

Figura 1. PCR
desarrollada por Kary
Mullis en 1986

Transcriptasa inversa
Una serie de experimentos realizados durante los aos 40, 50 y 60 del pasado
siglo sentaron las bases de la trasferencia de informacin gentica para
sintetizar protenas. Se demostr que la informacin flua desde el ADN, que se
transcriba en ARN mensajero, y ste era descifrado por los ribosomas en
protenas. Los resultados de estos experimentos fueron tan convincentes que
quedaron extraordinariamente implantados en el conocimiento cientfico, hasta
el punto de que el flujo mencionado se conoci como el dogma central de la
biologa molecular.. Sin embargo, entre 1960 y 1970 determinados trabajos con
virus ARN sealaron que era posible que dicho dogma fuera violado. En 1975
se concedi el Premio Nobel de Medicina o Fisiologa a tres investigadores:
Temin, Baltimore y Dulbecco, por sus descubrimientos sobre la interaccin
entre los virus tumorales y el material gentico de la clula. Temin y Baltimore
haban descubierto simultneamente, aunque de forma separada, la
transcriptasa inversa (RT), la enzima que puede transcribir ARN en ADN,
mientras que Dulbecco se centr en las interacciones entre los poliomavirus
oncognicos y la clula. El descubrimiento de la transcriptasa inversa se bas,
sobre todo, en observaciones de Temin sobre los oncornavirus, que hoy
conocen como retrovirus.

Figura 2. Dogma central de la

biologa molecular (corregido)

Fundamento RT-PCR

Figura 3. Premio Nobel de

medicina en 1975 a Temin,
Baltimore y Dulbecco

PCR con transcriptasa inversa, es una variante de la PCR en la que se usa ARN
como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa para
realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). La Tth ADN
Polimerasa en presencia de Mg 2+ cataliza la polimerizacin de dNTPs usando
como molde ADN, mientras que en presencia de Mn 2+ exhibe preferencia por
utilizar ARN como molde. Como ventaja la Tth ADN polimerasa permite realizar
la RT a elevadas temperaturas aumentando as la especificidad de la reaccin y
permitiendo resolver estructuras secundarias del ARN.
La Taq polimerasa es termoestable a altas temperaturas (hasta 95 C), lo que
permite la desnaturalizacin, alineamiento y extensin sucesivos del ADN sin
perder actividad, en ciclos sucesivos de elevacin de la temperatura. La
tcnica de PCR es un mtodo de sntesis in vitro de un nmero de copias muy
alto de un fragmento especfico de ADN, que requiere de un molde de ADN
matriz, unos iniciadores que delimitan la zona del ADN matriz que deber ser
copiado, nucletidos que sern adicionados a la nueva cadena y la enzima ADN
Taq polimerasa que se encargar de hacer la sntesis qumica.
El inters de esta tcnica es que no importa de qu cantidad de sustrato se
parte (ARN a ADNc) ya que si el nmero de ciclos de sntesis es suficiente,
siempre se obtendr una cantidad de producto elevado, puesto que se trata de
un fenmeno de amplificacin exponencial.
Con una eficiencia terica del 100%, una molcula de ADN de doble cadena
deber producir al cabo de 30 ciclos de polimerizacin un nmero de copias
aproximado de 230 (Ms de dos mil millones).

Procedimiento
Objetivo de la tcnica: Amplificar ARN mensajero (mARN) por PCR. El ARNm
es convertido primero en ADN complementario (ADNc) y luego se amplifica por
PCR la regin especifica a niveles detectables.
Requerimientos: El material puede ser ARN celular total (incluyendo ARN
ribosomal (ARNr), ARN de transferencia (ARNt) y ARN mensajero (ARNm) o
ARN purificado.

De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera:

a) Retrotranscripcin a partir del ARN
La transcripcin inversa puede convertir mARN en cADN a travs de tres
mtodos diferentes, dependiendo de los cebadores utilizados para el paso
inicial:
1. Cebadores hexamricos al azar, que contienen 6 nucletidos
(6-mer)que contienen todas las posibles combinaciones de dA,
dG, dC y dT. Estos cebadores se hibridaran a la secuencia
complementaria correspondiente en el ARN molde.
2. Cebadores de oligonucletidos que contienen dT e hibridan en
la cadena complementaria de dA nucletidos presentes en el
extremo de las molculas de ARNm (cola poli A).
3. Cebador que solo hibrida en una secuencia especfica de
ARNm.

Figura 4. Transcripcin
inversa por 3 mtodos
de inicio segn el
cebador a utilizar

Figura 5. Conversin de ARNm a ADNc

por la transcriptasa inversa

b) Amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc.

Luego de obtener el ADNc, se agregan los cebadores que se hibridarn a
una secuencia especfica que permitir la amplificacin por PCR.
1. La PCR comienza cuando el DNAc se desnaturaliza entre 94 y
96 C, las dos hebras se separan. (CICLO 1)

2. Entre 50 y 65 C los primers especficos se alinean con el sitio

complementario en cada cadena.

3. A 72 C la Taq DNA polimerasa extiende el DNA desde los

primers. Se obtienen 2 cadenas dobles de ADNc

4. CICLO 2 PCR: se obtienen 4 cadenas dobles de ADN

1
4

2
3
Figura 6. 1) dos cadenas dobles de ADN resultantes del ciclo
uno, 2) Se eleva la temperatura de 94 a 96 C para
desnaturalizacin de ADN, 3) Entre 50 y 65 C los primers
especficos se alinean con el sitio complementario en cada
cadena, 4) A 72 C la Taq DNA polimerasa extiende el DNA desde
los primers

sntesis de cDNA
amplificacin:

se

5. Despus de 30 ciclos
puede obtener una grfica

de
de

Figura 7. Grfica de
amplificacin por PCR
despus de 30 ciclos se
obtienen millones de
copias del DNA

6.

Los productos
de reaccin son analizados usualmente por electroforesis en
gel de agarosa. El gel se tie con bromuro de etidio (Figuras 8 y
9).

Figura 8. Separacin de fragmentos de DNA por tamaos

mediante electroforesis en gel agarosa

Figura 9. Resultado de la migracin de fragmentos de DNA al

someterlos a un campo elctrico en la electroforesis en gel
agarosa

Bibliografa
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Fecha
de
consulta:
16
de
Diciembre
2013,
Disponible
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http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html

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