VECTORES DE CLONACIN

Tipos de vectores

-Plsmidos
-Derivados de bacterifagos
-Csmidos
- De alta capacidad (P1, PAC, BAC, YAC)

PLSMIDOS

-Origen de replicacin, genes de resistencia a antibiticos y metales

pesados, de utilizacin de compuestos, etc.
-Para utilizacin en ingeniera gentica: modificaciones: adicin de un
polilinker (sitio de clonacin mltiple: MCS), sistemas de seleccin de
recombinantes.
- Origen de replicacin: ejerce un control sobre el nmero de copias del
plsmido en la clula; control relajado (alto nmero de copias, independiente
de sntesis de protena, se regula por ARN y ARN antisentido), control
astringente (bajo nmero, interviene la protena del gen repA).

Fenmeno de incompatibilidad:
- En una bacteria donde hay un plsmido no pueden entrar otros plsmidos que
pertenezcan al mismo tipo de incompatibilidad: es decir, que tengan el mismo origen de
replicacin. Importante en experimentos de clonacin

Plsmidos

pBR322

- Marcadores de seleccin.
- Un marcador de seleccin que permite que crezcan slo las bacterias que
llevan el plsmido: transformantes. Resistencia a ampicilina (ampR), a
cloramfenicol (CmR)
- Un marcador que permite seleccionar aquellos clones donde el plsmido es
recombinante, tiene inserto. En ese marcador se encuentra el MCS
- Inactivacin de un gen de resistencia: hace a la bacteria sensible a
un antibitico, ej. pBR322, gen de resistencia a tetraciclina (tetR)
- -complementacin: la bacteria es deficiente en la actividad galactosidasa (gen lacZ), el plsmido tiene un fragmento de la galactosidasa que complementa esa deficiencia (complementacin); en presencia de X-gal e IPTG forma colonias
azules. Cuando se introduce un inserto el fragmento de la galactosidasa es interrumpido, no hay complementacin: colonias
blancas. pBluescript, pUC18
- Seleccin directa: presencia de un gen letal en el vector, slo si es
interrumpido (inactivado) por el inserto la bacteria puede crecer.

Seleccin de recombinantes en vectores plasmdicos, -complementacin

VECTORES DERIVADOS DEL

FAGO

VECTORES DERIVADOS DEL FAGO

Ciclo del fago

- Ciclo ltico y lisognico

- Ciclo ltico: el ADN se replica y forma
concatmeros. 48 kb
- Pueden empaquetarse molculas de ADN
con 78% - 105% de la longitud del genoma
- Regin dispensable: no afecta al ciclo ltico
- Vectores derivados de :
- Sustitucin o reemplazamiento
- Insercin
- Genes red y gam confieren fenotipo Spi+

VECTORES DERIVADOS DEL FAGO

Vectores de sustitucin
8-23 kb

Vectores de insercin
0,5-10 kb
-gt11

SP6

SfiI

(43'0)

XbaI
XhoI
EcoRI
BamHI
NotI
SacI

SacI
NotI
BamHI
EcoRI
XhoI
XbaI

T7

(0'0)

Sfi I

brazo izquierdo (20 kpb)

regin central
(14 kpb)
dispensable

-GEM-12

brazo
(9 kpb)
derecho

VECTORES DE ALTA CAPACIDAD

CSMIDOS
- Plsmidos que contienen los sitios
cos del fago para empaquetamiento
in vitro
- Pueden infectar E. coli, pero no
lisarla, se comportan como plsmidos,
seleccin por resistencia a ampicilina
- Admiten tamaos entre 35-45 kb
- El ADN para la genoteca se digiere
parcial con Sau3AI y se desfosforila, o
por seleccin de tamao en gel de
PFGE
- Rastreo: igual que una genoteca en
plsmidos

BACs: BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOMES

- Molcula de ADN circular de unas 7 kb con un marcador de seleccin (CmR), un
replicn derivado del factor F (oriS) y tres genes que aseuran la particin de las copias
entre las cllas hijas. Sitio de clonacin BamHI en fragmento lacZ: permite seleccin por
color. No hay lmite de tamao para el empaquetamiento: tamao medio 120 kb. El ADN
para la genoteca se digiere parcial con Sau3AI y se hace seleccin de tamao en gel de
PFGE. El vector se corta con BamHI y se desfosforila.
- Rastreo: mediante hibridacin de arrays ordenados o por PCR en pooled libraries

YACs: YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES

- Molcula de ADN lineal con los elementos de un cromosoma de levaduras que le
permiten funcionar como tal: origen de replicacin ARS1, telmeros. Un marcador de
seleccin en cada brazo que asegura que el DNA forneo est flanqueado por ambos
brazos. Seleccin de transformantes usando una cepa auxtrofa de uridina y triptfano, y
de recombinantes mediante color. Tamao medio de los insertos 250-400 kb.