Duplex PCR to detect both Papaya ring spot virus and

Papaya leaf curl virus simultaneously from naturally

infected papaya (Carica papaya L.)
Papaya, a major fruit crop in India and worldwide, is affected
by many fungal and viral diseases. A mixed infection of
Papaya ring spot virus (PRSV), a linear single-stranded (+)
RNA genome of approx 10 kb size, and Papaya leaf curl virus
(PaLCV), a bipartite Gemini virus (component A & B) having
circular singlestranded DNA (+) genome of about 5.2 kb, has
hampered the production and productivity of papaya in many
parts of world. Rapid detection techniques are important in
prevention of spread of the disease in field conditions. In the
present study, a rapid and reliable PCR based detection
protocol has been standardized. Sets of primers were
designed, based on the respective virus isolate sequence data
available in GenBank, to obtain anticipated products of
calculated size.
Papaya (Carica papaya L.; Family: Caricaceae) is an important
fruit crop believed to be the native to Southern Mexico and
neighbouring Central America. It is grown in many tropical and
subtropical countries all over the world. The production is
hampered by numerous fungal pathogens and viral diseases.
Among the viruses, Papaya ring spot virus (PRSV), a definite
member of the genus Potyvirus belonging to the family
Potyviridae and having linear singlestranded (+) RNA genome
of approximately 10 kb size, and Papaya leaf curl virus
(PaLCV), a bipartite Geminivirus (component A & B) having
circular single-stranded DNA (+) genome of about 5.2 kb in
total, drastically reduce the yield and market quality of fruits
either singly or in mixed infections. PRSV is perhaps the most
limiting factor in papaya production in many countries1-4. The
virus was first reported from western India in 1958 and since
then it has spread over many geographical locations causing
severe crop losses of upto 85-90%. The virions of PRSV are
flexuous filamentous particles of about 760-800 nm 12 nm
and are capable of producing inclusion bodies in the
cytoplasm of host cells. Natural transmission of PRSV occurs

by various species of aphids in a non persistent manner and

has a limited host range that consists mainly of cucurbits and
papaya. The two serologically indistinguishable strains of
PRSV have been recorded, viz., PRSV-P infecting papaya and
cucurbits and PRSV-W infecting only cucurbits. PRSV causes
an array of symptoms in papaya. These include mottling and
malformation of leaves, ringspots and streaking on fruits,
stems and petioles. As a result of which the plant becomes
stunted with fewer and smaller fruits, and eventually die.
Leaf curl disease of papaya, caused by PaLCV, is a devastating
disease prevailing in several parts of India. This disease is
characterized by severe curling, crinkling and deformation of
leaves. Severity is more on Young leaves, sometimes
accompanied by vein clearing, inward rolling and thickening of
veins. As the disease progresses plants become stunted and
fruit yield is reduced. The virus measures 38 nm in length and
22 nm in diameter and is readily transmitted by grafting and
by means of polyphagus white fly Bemisia tabaci Genn.
Early infection of the cultivars by two different viruses results
in complete loss in yield. In mixed infections of papaya with
two or more viruses, a synergistic interaction between two
independent viruses in the same host can occur; it is typically
characterized by a dramatic increase in symptoms and
accumulation of one of the two coinfecting viruses. Many
synergistic diseases involve a member of the genus Potyvirus
as one of the infecting viruses. Although serological
techniques can be deployed as a strategy to detect the mixed
infections, it may be fatal at times to the low titre of one of
the viruses of mixed infection. So, simple, sensitive and
reliable tools for the early and simultaneous diagnosis need to
be employed. RT-PCR and PCR is routinely used to detect ring
spot and leaf curl virus of papaya. In the present study, a
sensitive and reliable technique has been devised to detect
PRSV and PaLCV infections simultaneously in the same
preparations employing PCR.

Papaya leaf sample naturally exhibiting mixed infection of

both PRSV and PaLCV were collected from papaya orchard in
Bihar, India (Fig. 1). Two sets of primers were designed to
successfully amplify both viruses in simplex and duplex PCR
preparations. The primers were forward primer PRS8617F: 5'ATCACAATGATTACGCGCTGCG-3', and reverse primer PRSPATR:
5'-CTCTCATTCTAAGAGG CTCGAATAG-3' for PRSV coat protein
plus partial Nib region; and forward primer MKBEGAF4: 5'ATATCTGCAGGGNAARA THTGGATGGA-3' and reverse primer
MKBEGAR5: 5'-TGGACTGCAGACNGGNAARA CNATGTGGGC- 3'
for PaLCV coat protein plus partial AC2 protein (Figs 2 & 3).
The mixed infected sample was individually amplified for PRSV
and PaLCV in a simplex PCR preparation to confirm the
presence of both viruses. Further, the same sample was
subjected for simultaneous detection of both viruses in a
duplex PCR preparation. Total RNA was extracted from mixed
infected as well as PRSV infected papaya leaf sample (positive
control) using TRI reagent following manufacturers protocol.
Similarly DNA was extracted from mixed infected as well as
from PaLCV infected papaya leaf sample (positive control)
using CTAB method. 100 mg of healthy and PRSV infected
papaya tissue was used for RNA extraction and 2 g of healthy
and PaLCV infected papaya sample was used for DNA
extraction. Simplex PCR for PRSV and PaLCV detection from
single and mixed infected simple was first standardized. cDNA
was synthesized using 3 L of total RNA and 1 L of antisense
primer (100 pmole/L), the mixture was centrifuged and
incubated at 70C for 5 min. A master mix was prepared
separately, using 5MMuLV buffer, 10 mM dNTPs, 25 U MMuLV
RT enzyme (MBI, Fermentas), and then transferred into PCR
tube containing template RNA and mixed gently. The PCR tube
was incubated at 42C for 1 h, followed by 70C for 10 min in
a thermal cycler (Applied Biosystems, GenAmp PCR system
9700). 3 L of amplified cDNA (for PRSV) and DNA (for PaLCV)
was used in 25 L of reaction mixture separately, containing 3
U of Taq DNA polymerase
(Sigma, Aldrich), 25 mM MgCl2, 2 mM dNTPs and 50 pmole/L
each of forward and reverse primers. PCR was performed with
an initial denaturation step of 94C (2 min), followed by 35

cycles of 94C (45 sec), 54-58C (60 sec) and 72C (90 sec)
and a final 20 min extension step at 72C. PCR products were
analyzed electrophoretically in 0.8% agarose gels in 0.5TBE
buffer and visualized on a UV-transilluminator by ethidium
bromide staining.
Fig. 1Symptoms of mixed infection of both PRSV and PaLCV
in naturally infected papaya leaf.
Fig. 2Schematic presentation of bipartite (DNA-A & DNA-B)
circular ss DNA(+) genome of PaLCV encoding proteins:
Capsid protein (Coat protein; CP), Transcriptional activator
protein (TrAP; Protein AC2), Replication enhancer protein (REn;
Protein AC3), Protein AC4, Movement protein (BC1) and
Nuclear shuttle protein (NSP).
Fig. 3Schematic presentation of monopartite linear ss
RNA(+) genome of PRSV encoding ten mature proteins.
In order to standardize the duplex PCR, two sets of primers
were mixed in a 50 L reaction mixture containing 10PCR
buffer (5 L), 2 mM DNTPs (4 L), 25 mM MgCl2 (4 L), 100
pmole/L of PaLCV forward and reverse primer (1 L each),
100 pmole/L of PRSV forward and reverse primer (1 L each),
DNA (2 L), cDNA (6 L), Taq (0.6 L). The cDNA was
synthesized using same protocol followed for simplex PCR.
PCR was performed using the following parameters: one cycle
at 94C for 2 min, 35 cycles at 94C for 45 sec, 54-58C for 60
sec and 72C for 90 sec, followed by 72C extension for 20
min to determine the annealing temperature for both the
viruses. PCR products were analyzed electrophoretically in
0.8% agarose gels. Simplex and duplex PCR was
simultaneously carried out for comparison. In the present
investigation, two different sets of primer pairs, designed to
amplify coat protein plus partial AC2 protein coding region of
PaLCV and coat protein plus partial Nib region of PRSV,
successfully produced amplicons of 1.2 and 1.4 kb from the
PaLCV and PRSV infected papaya leaf samples (positive
control), respectively by simplex PCR, while no amplification

products were observed in healthy plant samples (Figs 4 & 5).

The same primers were successfully employed to amplify
fragments of both viruses in a mixed infection in duplex PCR
since they displayed commonalty in terms of G+C content,
melting temperature and length of primer pairs. Considerably
good amount of DNA and RNA were extracted from
conventional methods without using expensive kits for
performing PCR. Various parameters, such as, primer
concentration of forward and reverse primers (50-100
pmole/L), annealing temperature (55-60C), annealing time
(45-60 sec) and number of cycles (25-35) used, were
standardized for the simplex and duplex PCR reactions for
PaLCV and PRSV detection. Better amplification was observed
at 50 pmole/L concentrations of each primer, 55C annealing
temperature for 60 sec and 35 cycles in case of simplex PCR
for PaLCV and touchdown PCR at 58C with 0.1C decrease at
each cycle. Duplex PCR successfully amplified both viruses at
55C annealing temperature for 60 sec and 35 cycles with 100
pmole/L primer concentration. Thus, the procedure can be
effectively employed for validation of field samples with mixed
infection.
Fig. 4Standardization of Simplex PCR in infected papaya
(positive control): M, 1 kb marker (Fermentas #SM0331); 1,
Simplex PCR to detect PRSV; H1: Healthy control for PRSV; 2,
Simplex PCR to detect PaLCV; & H2: Healthy control for PaLCV.
Fig. 5Detection of PRSV and PaLCV in mixed infected papaya
sample using virus specific primers: M, 1 kb marker
(Fermentas #SM0331); 1, Simplex PCR to detect PRSV; 2,
Simplex PCR to detect PaLCV; 3 & 4, Duplex PCR to detect
PaLCV and PRSV.
Fig. 6Validation of Duplex PCR on field samples (1-9): M, 1
kb marker (Fermentas #SM0331); H, Healthy control; 1 & 2,
Test samples infected with PRSV; 3, 5 & 6, Mixed infected
samples; 4, 7, 8 & 9, Samples infected with PaLCV.

The present optimized detection procedure was used for

validating
papaya
samples
collected
from
different
geographical locations. Among the samples tested, few of
them were found to be infected with both viruses, whereas
others with either of the two. A representative gel picture
showing detection of viruses in field samples tested is
presented in Fig 6. Further, the sequence identity of amplicons
was confirmed by sequencing in duplicate. The BLAST search
revealed highest homology to AF120270 and AY738103 for
PRSV and PaLCV, respectively.
In the present study, all reactions were carried out using
conventional PCR mixture and the extraction procedures of
RNA and DNA was also done without the use of expensive kits.
Thus, here we report the simultaneous detection of RNA and
DNA viruses infecting papaya using duplex PCR from India.
Such fast and reliable detection techniques can be used to
monitor disease at an early stage of crop growth in the field to
forego losses. Moreover, there is a need to develop breeding
lines/cultivars showing multiple resistances to economically
important viruses. Transgenic technology, so far, is one of the
effective strategies to control viruses of papaya20 and
pyramiding genes into single cultivar to control more than one
virus would sustain the productivity in papaya cultivation.

Dplex PCR para detectar tanto virus de la mancha

anular de la papaya y el virus del enrollamiento de la
hoja de papaya simultneamente de papaya infectados
naturalmente (Carica papaya L.)

Papaya, un importante cultivo de frutas en la India y en todo

el mundo, se ve afectado por muchas enfermedades fngicas

y virales.Una infeccin mixta de virus de la mancha anular de

la papaya (PRSV), un (+) ARN del genoma lineal de una sola
cadena de aproximadamente 10 kb de tamao, y la papaya
leaf curl virus (PaLCV), un virus Gemini bipartito (componente
A & B) que tiene ADN circular singlestranded (+) del genoma
de alrededor de 5,2 kb, ha obstaculizado la produccin y la
productividad
de
papaya
en
muchas
partes
del
mundo. Tcnicas de deteccin rpida son importantes en la
prevencin de la propagacin de la enfermedad en
condiciones de campo. En el presente estudio, un protocolo
de deteccin basado rpida y fiable de PCR se ha
estandarizado. Conjuntos de cebadores fueron diseados, en
base a los respectivos aislar el virus datos de secuencias
disponibles en GenBank, para obtener productos esperados
del tamao calculado.
Papaya (Carica papaya L .; Familia: Caricaceae) es un
importante cultivo de frutas se cree que es el nativo de
Mxico y el sur de la vecina Centroamrica. Se cultiva en
muchos pases tropicales y subtropicales de todo el
mundo. La produccin se ve obstaculizada por numerosos
hongos patgenos y enfermedades virales. Entre los virus,
virus de la mancha anular de la papaya (PRSV), un miembro
del gnero definido Potyvirus perteneciente a la familia
Potyviridae y tener lineal singlestranded (+) RNA del genoma
de aproximadamente 10 kb de tamao, y Papaya leaf curl
virus (PaLCV), un bipartito geminivirus (componente A y B)
que tiene circular de ADN de una sola hebra (+) del genoma
de alrededor de 5,2 kb en total, reducir drsticamente el
rendimiento y la calidad de las frutas de mercado, ya sea
individualmente o en infecciones mixtas. PRSV es quizs el
factor ms limitante en la produccin de papaya en muchos
countries1-4. El virus fue reportado por primera vez desde el
oeste de la India en 1958 y desde entonces se ha extendido
por muchos lugares geogrficos causando graves prdidas de
cosechas de hasta el 85-90%. Los viriones de PRSV son
partculas filamentosas flexuosas de aproximadamente 760800 x 12 nm y son capaces de producir cuerpos de
inclusin en el citoplasma de las clulas husped. La

transmisin natural de PRSV ocurre por varias especies de

fidos de manera no persistente y tiene un rango de
hospederos limitado que se compone principalmente de las
cucurbitceas y papaya. Las dos cepas serolgicamente
indistinguibles de PRSV se han registrado, a saber., PRSV-P
infectar papaya y cucurbitceas y PRSV-W infectar slo
cucurbitceas. PRSV provoca una serie de sntomas en la
papaya. Estos incluyen el moteado y malformacin de las
hojas, manchas anulares y las rayas en las frutas, tallos y
peciolos. Como resultado de la cual la planta se convierte
retraso en el crecimiento con menos y ms pequeos frutos,
y finalmente mueren.
Hoja enfermedad rizo de la papaya, causada por PaLCV, es
una enfermedad devastadora que prevalece en varias partes
de la India.Esta enfermedad se caracteriza por severa curling,
arrugamiento y deformacin de las hojas. La gravedad es ms
en las hojas jvenes, a veces acompaado de compensacin
vena, hacia el interior de rodadura y el engrosamiento de las
venas. A medida que la enfermedad progresa las plantas se
vuelven atrofiado y rendimiento de fruta se reduce. El virus
mide 38 nm de longitud y 22 nm de dimetro y se transmite
fcilmente por injerto y por medio de la mosca
blanca Bemisia tabaci Genn polyphagus.
La infeccin temprana de los cultivares por dos virus
diferentes resultados en la prdida completa del
rendimiento. En infecciones mixtas de papaya con dos o ms
virus,
una
interaccin
sinrgica
entre
dos
virus
independientes en el mismo host puede ocurrir; por lo
general se caracteriza por un aumento espectacular en los
sntomas y la acumulacin de uno de los dos virus
coinfecting. Muchas enfermedades sinrgicos implican un
miembro del gnero Potyvirus como uno de los virus que
infectan. Aunque las tcnicas serolgicas se pueden
implementar como una estrategia para detectar las
infecciones mixtas, puede ser fatal a veces a la baja del ttulo
de uno de los virus de infeccin mixta. As, herramientas
simples, sensibles y fiables para el diagnstico precoz y
simultnea deben ser empleados. RT-PCR y PCR se utiliza de

manera rutinaria para detectar la mancha anular y leaf curl

virus de la papaya. En el presente estudio, una tcnica
sensible y fiable se ha ideado para detectar infecciones PRSV
y PaLCV simultneamente en las mismas preparaciones que
emplean PCR.
Papaya muestra de hoja que muestra de forma natural la
infeccin mixta de ambos PRSV y PaLCV fueron recogidos de
la huerta de papaya en Bihar, India (Fig. 1). Dos juegos de
primers fueron diseados para amplificar con xito ambos
virus en simplex y dplex preparaciones de PCR. Los
cebadores
fueron
PRS8617F
cebador:
5'ATCACAATGATTACGCGCTGCG-3 'y revertir PRSPATR cartilla:
5'-CTCTCATTCTAAGAGG CTCGAATAG-3' para la protena de la
cubierta PRSV plus regin parcial plumilla; y hacia adelante
MKBEGAF4 cartilla: 5'-ATATCTGCAGGGNAARA THTGGATGGA-3
'y revertir MKBEGAR5 cartilla: 5'-TGGACTGCAGACNGGNAARA
CNATGTGGGC- 3' para la protena de la cubierta PaLCV ms
protena parcial AC2 (figuras 2 y 3). La muestra mezclada
infectados se amplific individualmente para PRSV y PaLCV
en una preparacin de PCR simplex para confirmar la
presencia de ambos virus.Adems, la misma muestra fue
sometida para la deteccin simultnea de ambos virus en
una preparacin de PCR dplex. El ARN total se extrajo partir
de la mezcla infectados, as como PRSV infectados muestra
de hoja de papaya (control positivo) utilizando el reactivo TRI
siguiendo el protocolo del fabricante. Del mismo modo se
extrajo el ADN partir de la mezcla infectados as como de
PaLCV infectados muestra de hoja de papaya (control
positivo) utilizando el mtodo de CTAB. 100 mg de tejido sano
y PRSV papaya infectadas se utilizan para la extraccin de
RNA y 2 g de saludable y PaLCV infectados papaya muestra
se utiliz para la extraccin de ADN. Simplex PCR para PRSV y
deteccin PaLCV desde la simple infectado solo y mezclado
fue el primer estndar. cDNA fue sintetizado utilizando 3 l de
RNA total y 1 l de cebador antisentido (100 pmol / l), la
mezcla se centrifug y se incub a 70 C durante 5 min. Una
mezcla maestra se prepara por separado, utilizando
5 tampn MMuLV, 10 m M dNTP, 25 U de la enzima RT

MMuLV (MBI, Fermentas), y luego se transfiere en el tubo de

PCR que contena ARN molde y se mezcl suavemente. El
tubo de PCR se incub a 42 C durante 1 h, seguido de 70 C
durante 10 min en un ciclador trmico (Applied Biosystems,
sistema GenAmp PCR 9700). 3 l de ADNc amplificado (por
PRSV) y el ADN (por PaLCV) se utiliz en 25 l de mezcla de
reaccin por separado, que contiene 3 U de Taq ADN
polimerasa
(Sigma, Aldrich), 25 m M de MgCl2, 2 m M dNTP y 50 p mol / l
de cada uno de cebadores directo e inverso. PCR se realiz
con una etapa de desnaturalizacin inicial de 94 C (2 min),
seguido por 35 ciclos de 94 C (45 seg), 54-58 C (60
segundos) y 72 C (90 segundos) y una final etapa de
extensin de 20 min a 72 C. Productos de PCR fueron
analizados por electroforesis en 0.8% geles de agarosa en
0,5 tampn TBE y se visualizaron en un transiluminador de
UV mediante tincin con bromuro de etidio.
Fig. 1-Los sntomas de la infeccin mixta de ambos PRSV y
PaLCV de hoja de papaya infectados naturalmente.
Fig. Presentacin 2-esquemtica de bipartita (DNA-DNA-A & B)
ss circular de ADN (+) del genoma que codifican protenas de
PaLCV: protena de la cpside (protena de la cubierta; CP), la
protena activadora de la transcripcin; protena potenciador
de la replicacin (TRAP protena AC2), ( Ren; AC3 protena),
CA4 protena, Movimiento protena (BC1) y la protena de
enlace nuclear (NSP).
Fig. Presentacin 3-Esquema de ARN lineal monopartite ss (+)
del genoma de codificacin PRSV diez protenas maduras.
Con el fin de estandarizar la PCR doble, dos conjuntos de
cebadores se mezclaron en una mezcla de reaccin que
contiene 50 l 10 tampn de PCR (5 l), 2 m M dNTPs (4 l), 25
m M de MgCl2 (4 l), p 100 mol / l de PaLCV adelante y atrs
primers (1 l cada uno), 100 pmol / l de PRSV adelante y
cebador inverso (1 mu l cada una), ADN (2 l), ADNc (6 l), Taq

(0,6 l). El ADNc se sintetiz usando el mismo protocolo

seguido para simplex PCR. PCR se realiz utilizando los
siguientes parmetros: un ciclo a 94 C durante 2 min, 35
ciclos a 94 C durante 45 seg, 54-58 C durante 60 seg y
72 C durante 90 segundos, seguido de 72 C extensin
durante 20 min para determinar la temperatura de recocido,
tanto para los virus. Productos de PCR fueron analizados por
electroforesis en 0.8% geles de agarosa. Simplex y duplex
PCR
se
llev
a
cabo
simultneamente
para
la
comparacin. En la presente investigacin, dos conjuntos
diferentes de pares de cebadores, diseado para amplificar
protena de la cubierta, ms zona parcial protena AC2
codificacin de PaLCV y protena de la cubierta adems de
zona parcial Plumn de PRSV, producido con xito los
amplificados de 1,2 y 1,4 kb de la PaLCV y PRSV infectados
papaya
muestras
de
hojas
(control
positivo),
respectivamente, por smplex PCR, mientras que no hay
productos de amplificacin se observaron en muestras de
plantas sanas (Figs 4 y 5). Los mismos cebadores se utilizaron
con xito para amplificar fragmentos de ambos virus en una
infeccin mixta en duplex PCR ya que muestran vulgo en
trminos de contenido de G + C, temperatura de fusin y la
longitud de los pares de cebadores. Considerablemente
buena cantidad de ADN y ARN se extrajeron de los mtodos
convencionales sin necesidad de utilizar costosos kits para la
realizacin de PCR. Varios parmetros,
tales como,
concentracin de cebador de adelante y atrs primers (50100 p mol / l), la temperatura de recocido (55-60 C), tiempo
de recocido (45-60 seg) y el nmero de ciclos (25-35)
utilizado, se estandarizaron para las reacciones de PCR
simplex y dplex para PaLCV y deteccin PRSV. Mejor se
observ amplificacin en 50 p mol / l de concentraciones de
cada cebador, 55 C temperatura de recocido durante 60
segundos y 35 ciclos en caso de simplex PCR para PaLCV y
touchdown PCR a 58 C con 0.1 C disminucin en cada
ciclo. Dplex PCR amplificado con xito ambos virus a 55 C
de temperatura de recocido durante 60 segundos y 35 ciclos
con 100 pmol / l de concentracin de imprimacin. Por lo

tanto, el procedimiento puede ser empleado eficazmente

para la validacin de muestras de campo con infeccin mixta.
Fig. 4-Normalizacin de Simplex PCR en la papaya infectada
(control positivo): M, 1 kb marcador (Fermentas #
SM0331); 1, Simplex PCR para detectar PRSV; H1: control
sano para PRSV; 2, Simplex PCR para detectar PaLCV; Y H2:
control sano para PaLCV.
Fig. 5-La deteccin de PRSV y PaLCV en la muestra de papaya
mezclado infectado de virus utilizando primers especficos: M,
1 kb marcador (Fermentas # SM0331); 1, Simplex PCR para
detectar PRSV; 2, Simplex PCR para detectar PaLCV; 3 y 4,
Dplex PCR para detectar PaLCV y PRSV.
Fig. 6-La validacin de PCR doble en muestras de campo (19): M, 1 kb marcador (Fermentas # SM0331); H, control
sano; 1 y 2, las muestras de prueba infectadas con PRSV; 3, 5
y 6, las muestras infectadas, compuestos; 4, 7, 8 y 9,
muestras infectadas con PaLCV.
El presente procedimiento de deteccin optimizada se utiliz
para la validacin de las muestras de papaya recolectadas de
diferentes ubicaciones geogrficas. Entre las muestras
analizadas, algunos de ellos resultaron estar infectadas con
ambos virus, mientras que otros con ninguno de los dos. Una
imagen representativa de gel que muestra la deteccin de
virus en muestras de campo probados se presenta en la
figura 6. Adems, la identidad de la secuencia de los
amplicones se confirm mediante secuenciacin por
duplicado. La explosin de bsqueda revel ms alta
homologa con AF120270 y AY738103 para PRSV y PaLCV,
respectivamente.
En el presente estudio, todas las reacciones se llevaron a
cabo utilizando mezcla convencional de PCR y los
procedimientos de extraccin de ARN y ADN tambin se llev
a cabo sin el uso de kits caros. Por lo tanto, aqu se presenta
la deteccin simultnea de ARN y virus ADN que infectan la
papaya mediante PCR doble de la India. Tales tcnicas rpidas

y fiables de deteccin pueden utilizarse para monitorizar la

enfermedad en una etapa temprana de crecimiento de los
cultivos en el campo a renunciar a las prdidas.Por otra parte,
hay una necesidad de desarrollar lneas de cra / cultivares
que muestran mltiples resistencias a los virus de
importancia econmica. La tecnologa transgnica, hasta el
momento, es una de las estrategias eficaces para controlar
los virus de papaya20 y genes pirmide en una sola variedad
de controlar ms de un virus podra sostener la productividad
en el cultivo de la papaya.