Dossier

Le point sur les antisens

La biologie molculaire sattache relier chaque vnement biologique, normal ou non,
une cause gntique, ce qui conduit naturellement envisager une intervention
thrapeutique au niveau mme des gnes. Il faut alors distinguer les troubles par dficience
gntique, o il faut ajouter un gne cest lobjet de la thrapie gnique des troubles lis
lactivit dltre dun gne. On peut dans ce cas inactiver trs prcisment le gne
responsable, grce aux proprits de complmentarit des acides nucliques.
Les gnes anti-gnes utiliss sont aussi appels antisens.

les rgles de complmentarit et dappariement restent identiques, que les brins soient
composs dADN ou dARN (dans lARN, la
thymine, T, est remplace par luracile, U).

De la double hlice
aux antisens

Mcturk/Parker/SPL/Cosmos

Pour atteindre un acide nuclique sens

portant linformation gntique (ADN ou ARN
LADN chromosomique possde une
messager, voir figure 2), il nexiste donc rien de
structure bien particulire en double hlice,
forme de deux brins enrouls lun avec lautre.
mieux, du moins en thorie, que dutiliser lanChaque brin est constitu dun long enchanetisens qui lui correspond. Ainsi, un oligonument de nuclotides. Il existe quatre types de
clotide antisens est un court fragment
nuclotides (dsigns habituellement par les
dADN (une vingtaine de nuclotides), qui
initiales A, T, G et C, pour adnine, thymine,
peut tre synthtis chimiquement et possde
guanine et cytosine). Le message gntique
naturellement la proprit de sassocier un
est cod par lordre denchanement des nugne donn. On peut aussi utiliser un oligonuclotides. On parle de squence nucloticlotide antisens fait dARN, puisque celui-ci
dique, caractristique dun gne donn. Les
possde les mmes proprits dappariement,
deux brins sont associs selon deux rgles.
mais il est plus instable. Lassociation sens-an1) La rgle de complmentarit A-T, G-C
tisens est capable dinhiber lexpression du
: un A sur un brin est toujours en face dun T Ce plasmide dADN bactrien, porteur de rsistance aux
gne vis (voir les mcanismes daction, fisur lautre brin, et un C est toujours en face antibiotiques, contient notamment deux gnes (en bleu) qui ont t
gure 2). Or, si lon connat la structure du gne
squencs. Un tel plasmide est lune des cibles de choix de la
dun G.
cible, cest--dire la squence denchanement
thrapie par antisens, qui pourront tre fabriqus sur mesure
2) La rgle dorientation oppose des partir des rsultats du squenage.
des A, T, G et C qui le constituent, il est posbrins : le dbut dun brin est toujours en
sible de concevoir de faon rationnelle et diface de la fin de lautre (tte-bche). De ce fait, on dit que les deux brins de la double hlice sont recte loligonuclotide antisens correspondant en
anti-complmentaires (voir figure 1). Un seul brin suivant simplement la rgle : A en face de T et G en
porte
linformation ncessaire la synthse des pro- face de C. Rien voir avec la complexit de la
Source :
tines, on lappelle brin sens . Lautre brin est dit conception dune molcule capable de se fixer sur
Dr Pierre Sonigo, directeur de recherches Inserm
une cible protique.
antisens .
(Institut Cochin de gntique molculaire, Paris).
Pour en savoir plus :
C. Hlne et E. Saison-Behmoaras La stratgie antisens :
nouvelles approches thrapeutiques , Medecine/Sciences
1994 ; 10 : 253-73.
S. Agrawal Antisense oligonucleotides as antiviral agents ,
Tibtech, 1992, vol. 10.
J. Liszieviwz et coll. Long-term treatment of human
immunodeficiency virus-infected cells with antisense
oligonucleotide phosphorothioates , Medical Sciences,
1993, vol. 90.

N 9 1994 A.I.M.

Lorsquils sont anticomplmentaires, deux brins

peuvent se reconnatre spcifiquement et sassocier.
De plus, la structure dun brin peut tre immdiatement reconstruite (ou dduite) si la structure de lautre
est connue. Ces proprits permettent la duplication
du matriel gntique au cours de la division cellulaire, ainsi que la production dARN messagers partir de lADN chromosomique (voir figure 2). En effet,

Les travaux des pionniers de la fin des annes 1960,

D. Knorre Novossibirsk et P. Miller Baltimore, ont
t intensivement repris depuis les annes 1980. Lindustrie pharmaceutique est entre dans la thmatique
et aprs les premires exprimentations chez lanimal
et dans nombre de systmes vgtaux, des essais cliniques de phase I ont commenc lanne dernire.

Exemples dutilisation

T
T

C
G

G
A
T
A

Figure 1
Cest pour la dcouverte en 1953 de
cette fameuse structure en double
hlice de la molcule dADN que
Watson, Crick et Wilkins ont obtenu
le prix Nobel 1962. Nous savons
aujourdhui que les bases puriques
et pyrimidiques qui composent ses
deux brins sont disposes de faon
anticomplmentaire : le brin sens
porte linformation, lautre brin est
dit antisens .

G
C

G
T

des antisens
1) Maladies infectieuses
En thorie, lutilisation des antisens est possible
chaque fois que lactivit dltre dun gne a pu tre
implique dans une pathologie, et que la squence
nuclotidique de ce gne est connue. Les applications
les plus videntes concernent les maladies infectieuses, o il suffit de viser les gnes du micro-organisme. La recherche se concentre donc sur les activits antiparasitaires et antivirales, par exemple
contre le virus du sida. Actuellement, un essai de
phase I a t entam en octobre 1993 en France, chez
10 patients sropositifs asymptomatiques infects par
HIV-1. Loligonuclotide antisens, appel GEM91 et
produit par les Laboratoires Hybridon, est dirig
contre lARN messager viral qui dirige la synthse
des protines Gag (protines virales internes). Cet
oligonuclotide de 25 nuclotides, de type phosphorothioate, a montr son activit en culture cellulaire
contre trois souches virales diffrentes. Pour lessai
clinique, il est administr aux patients par voie souscutane ou intraveineuse lente des doses variant de

0,1 1 mg/kg tous les quinze jours.

Les antisens anti-bactriens pourraient aussi tre
utiles en complment de lantibiothrapie, en sattaquant par exemple aux gnes de rsistance aux antibiotiques.
En dehors de linfectiologie, nous avons choisi
quelques exemples dapplications potentielles, en
cancrologie et dans les maladies inflammatoires ou
vasculaires.

2) Cancrologie
Certains gnes prsents dans la cellule normale,
appels proto-oncognes, participent la rgulation
de la dure de vie cellulaire. Ils interviennent lors des
cycles de prolifration, de diffrenciation et probablement de mort de la cellule. Les oncognes, qui
peuvent engendrer la transformation cellulaire et favoriser lmergence de tumeurs, semblent tre des
formes anormales de ces proto-oncognes.
Lapparition des oncognes peut tre le fruit dune
anomalie gntique telle que mutation ponctuelle, dltion ou translocation. Il en rsulte la fabrication de
formes anormales dARN messagers, qui reprsentent autant de cibles discriminantes par rapport aux

Infections
Bactriennes

Cibles molculaires

Rsistances : -lactamases.

Parasitaires

Virales

(leishmanie, trypanosome,
Plasmodium)

(virus de lhpatite B, virus

Herpes type 1, VIH,
Papillomavirus, virus de la grippe)

Squences communes
lextrmit 5 du gnome.
Enzyme de synthse du
parasite.

Extrmit commune des ARN.

Protines de structure ou de
rgulation du virus.

Avantages

Complment des antibiotiques Pas de rsistance connue.

pour les bactries rsistantes.
Slectivit.

Pas dantiviraux efficaces

connus.
Slectivit.

Limites

Impermabilit de la paroi
bactrienne.
Cot

Polymorphisme des parasites

au cours du cycle de
dveloppement.
Barrire cellulaire difficile
franchir (ex. globules rouges).

Variabilit.

Essais

In vitro.

In vitro.

In vitro.
In vivo (modles animaux,
chez lhomme pour le VIH).

ARN messagers correspondant aux proto-oncognes

exprims par les cellules normales. Par exemple, dans
le cancer de la vessie, lactivation de loncogne Harvey-ras est lie une mutation ponctuelle de lADN
chromosomique. Cela entrane la synthse dune protine dans laquelle le douzime acide amin est une
valine, au lieu dune glycine. Il a t possible dinhiber la croissance de cellules de cancer de vessie en
culture laide dun antisens complmentaire du gne
mut. Cet antisens na pas deffet sur la division de
cellules dpithelium vsical normal.

3) Inflammation
Les gnes gouvernant la synthse des mdiateurs de linflammation cytokines (voir AIM n2 et
3), interleukines, facteurs de croissance et/ou leur rcepteurs, molcules dadhsion, prostaglandines, leucotrines sont autant de cibles potentielles pour des
antisens vise anti-inflammatoire. On a montr
quun antisens dirig contre le rcepteur de linterleukine 1 (IL1) inhibe la synthse des prostaglandines PG E2, dont la production est normalement stimule par la fixation de lIL1 sur son rcepteur. De
mme, linjection sous-cutane chez la souris dun
antisens anti-rcepteur de lIL1 entrane une rduction significative de linfiltration de polynuclaires
neutrophiles conscutive linjection dIL1 au mme
site. Il sagit l dune des premires dmonstrations
des effets dun antisens in vivo chez lanimal.

4) Stnose vasculaire
Cette approche repose sur la mise en vidence rcente dagents mitognes synthtiss et relargus
la suite de lsions de la paroi artrielle. Ainsi certains gnes, comme c-myb et c-myc, sont prcocement exprims en cas de lsion et semblent induire
la prolifration et la migration de cellules musculaires lisses responsables, au moins en partie, du phnomne de restnose. Un antisens dirig contre cmyb a t utilis pour inhiber cette prolifration
cellulaire aprs angioplastie carotidienne segmentaire. Loligonuclotide, appliqu localement sous
forme de gel, a permis dobserver une diminution
franche de lexpression de c-myb et de la prolifration des cellules musculaires lisses.

A.I.M. 1994 N 9

Des chromosomes aux protines

LES CIBLES DE LA THRAPIE ANTISENS

TRANSCRIPTION

EPISSAGE

TRADUCTION

de lADN en ARN

(limination des introns inutiles)

de lARNm en protine

ARN en cours
de synthse

ARN polymrase

B ARN

Introns

Ribosome

polymrase
ARNm

ARN
ADN
Exons

C
A

ARN messager

ARN

Les chromosomes sont composs de deux brins dADN complmentaires apparis en hlice (A). Chaque gne est une petite section de chromosome qui peut
tre transcrite en une copie dARN, par un mcanisme nomm transcription, catalys par lARN polymrase (B).

LARN ainsi obtenu va alors subir lpissage (C),

cest--dire llimination de certaines rgions, les
introns, qui ne codent pas pour la protine finale.
On obtient un ARN raccourci, contenant seulement
les exons, appel ARN messager (ARNm). Cet
ARNm sert de plan la synthse de la protine dfinie par le gne initial...

Protine en cours
de synthse

... Cest la traduction. Des molcules spcialises (ribosomes...) se fixent au dbut

de lARNm, puis coulissent le long de celuici en fixant chaque pas de lecture un nouvel acide amin la protine en cours de
synthse (D). La squence de lARNm, donc
du gne, dfinit celle de la protine.

3
Les thrapies antisens

ARN polymrase

Blocage
de la traduction

1
ARN

Blocage
de transcription

2
ADN

Blocage
de l'pissage

ARNm
ARN non
messager

Antisens

4 Destruction de l'ARN
Le processus naturel peut tre artificiellement perturb par des acides nucliques
thrapeutiques cibls sur le gne voulu. Le simple appariement dun antisens peut
suffire entraver la transcription de lADN (1), et dans certains cas lexpression
de lARNm. En effet, la transcription commence par une ouverture de la double
hlice ADN/ADN, mais une triple hlice ADN/ADN/antisens ne peut tre transcrite correctement.

Figure 2

N 9 1994 A.I.M.

Par ailleurs, un ADN ou un

ARN thrapeutique peut
tre cibl sur une zone ncessaire lpissage de lARN, par exemple la jonction intron-exon. Il va alors empcher cet pissage,
interdisant de traduire le gne vis en protine (2).

De mme, lappariement au dbut de

lARNm, en amont de la zone dancrage du
ribosome, empche la traduction par blocage physique (3).
Dautres mcanismes peuvent sajouter
ceux-ci. Il existe dans les cellules une enzyme naturelle, la RNAse-H, qui dgrade
les brins dARN lorsque ceux-ci sont apparis de lADN. Donc, si un ADN antisens
sapparie sa cible ARN, cette dernire sera
dtruite par la RNAse-H, et lantisens libr
pour agir sur dautres cibles (4).

Effet catalytique
ARN messager cible

U C

ARN-enzyme
ou ribozyme

Les limites de la thrapie

antisens
Les principaux obstacles au dveloppement de la
thrapeutique par les antisens proviennent des mauvaises proprits pharmacologiques des molcules
dADN. En effet,linjection intraveineuse doligonuclotides chez la souris montre que ces molcules
diffusent dans tous les tissus et plus particulirement
le plasma, le foie et lintestin. On en trouve galement dans le cerveau et dans les poumons. Cependant, lorsque les oligonuclotides sont libres, ceuxci se retrouvent en 15 minutes dans les urines. La
structure de lADN naturel doit donc tre modifie pour optimiser la biodisponibilit et lefficacit des antisens. Le couplage des oligonuclotides avec des molcules comme les lipoprotines ou
le cholestrol prolonge leur demi-vie plasmatique.
On utilise aussi les liposomes, sphrules de phospholipides destines encapsuler lantisens avant de
le librer au sein des cellules, ventuellement de manire cible. Par exemple, un liposome contenant un
antisens et portant sa surface un anticorps anti-hpatocytes favorisera la dlivrance de lantisens aux
hpatocytes. Enfin, les outils de transfert de gnes
(thrapie gnique, voir AIM n 1) pourraient permettre
dinduire la synthse dantisens au sein de la cellule
cible elle-mme. De tels procds sont en cours
dtude au laboratoire.
Une fois entr dans la cellule, loligonuclotide
doit pour tre efficace rencontrer sa cible. Le gne
cible se trouve dans le noyau, ainsi que les ARN messagers au moment de la transcription et de llimination des introns. Par contre, au moment de la traduction du message gntique pour la synthse des
protines, lARN messager se trouve dans le cytoplasme. Diffrentes tudes ont montr que les oligonuclotides sont capables dagir dans ces deux compartiments cellulaires. Nanmoins, les lments
contrlant la distribution dans lun ou lautre de ces
compartiments restent mal connus.
Dans la cellule, se pose encore le problme de
linactivation des antisens par des enzymes qui dgradent spcifiquement lADN, les nuclases. Pour
rgler ce point, on peut modifier chimiquement les
oligonuclotides, qui acceptent divers groupements
qui les rendent rsistants aux nuclases. Il sagit sur-

Figure 3
De lantisens au ribozyme.
Les ribozymes ont t mis au point partir dARN naturels
dous dune activit enzymatique de type ARNase (coupure de
lARN). Des ARN possdant ces proprits existent chez
certains virus. En insrant la squence emprunte ces ARN
viraux (en vert) au centre de la squence antisens (en rouge)
correspondant la cible choisie (en bleu), on peut couper
spcifiquement lARN messager dun gne. Il reste cependant
optimiser lefficacit catalytique et les proprits
pharmacologiques des ribozymes.

tout de groupements phosphotriester, phosphorothioate, et phosphoramidate. Toutefois, il advient dans

certains cas que lADN obtenu, rsistant aux nuclases, perde sa capacit attirer sur les ARN cibles
lactivit RNAse-H, malgr un appariement normal
(voir Mcanismes daction des antisens, figure 2).
Par ailleurs, peu de donnes sont disponibles
concernant lventuelle toxicit des oligonuclotides. Avec des oligonuclotides modifis de type
phosphothioates, aucun effet secondaire grave na t
observ chez la souris et le rat pour des concentrations 60 fois suprieures la dose active dtermine
in vitro. On observe dans certains cas chez lanimal
hypothermie, lthargie, vomissements, diarrhe,
signes de toxicit hpatique. Les lments dterminants lexistence ou non dune toxicit seront sans
doute les modifications apportes aux oligonuclotides et leur mode dadministration.
Il faudra aussi tenir compte de la slectivit de
lantisens, cest--dire de sa capacit se lier son
gne cible et lui seul. Cela dpend en grand partie de la taille de loligonuclotide. Cest un simple
problme de combinatoire : on peut tomber par hasard sur une combinaison six chiffres, mais pas sur
une de trente. Ainsi, on peut retrouver par hasard dans
dautres gnes non viss un enchanement de six nuclotides prsent dans le gne cible, mais on ne retrouvera jamais dans dautres gnes un enchanement
de trente nuclotides prsent dans le gne cible.Un
calcul statistique prdit que la taille minimale pour
un oligonuclotide devant sapparier avec un ARN
messager de faon spcifique est de 12 15 nuclotides.
Cependant, une trop grande spcificit peut aussi
tre un inconvnient. Les proprits de diffusion et
le cot sont favorables aux antisens les plus courts.
De plus, la squence du gne cible peut varier au
cours du temps chez un mme individu, ou varier
dun individu un autre. Lexemple le plus dmonstratif est celui des protines du virus HIV-1. Deux individus infects par HIV-1 portent des virus dont les
squences sont diffrentes. Aussi, pour que lantisens soit efficace chez ces deux individus, il faut soit
trouver une rgion transcrite dont la squence ne varie jamais, soit utiliser un oligonuclotide capable de
sassocier avec des squences qui diffrent lgrement.

Conclusion
Les antisens sduisent : ils conjuguent lidal
scientifique de la biologie molculaire tout vient
des gnes et celui de lindustrie pharmaceutique
les mdicaments peuvent tre conus comme nimporte quel autre produit industriel. En effet, ils sattaquent directement aux causes gntiques de la
pathologie et leur design molculaire est des
plus simples. Les antisens sont donc un espoir bien
comprhensible, en ces temps o le dchiffrage de
lensemble du gnome humain est une priorit technologique soutenue par les investissements massifs
de lindustrie pharmaceutique.
Nanmoins, avant que ces molcules soient utilises large chelle, il convient de trouver des formes
galniques capables damliorer leur stabilit et
leur biodisponibilit. Il faudra donc rsoudre des
problmes bien classiques dont la solution passera
probablement par des mthodes moins sduisantes
pour lesprit : sries de drivs chimiquement modifis, criblage, essais, etc. Il est possible aussi que ladministration de tels gnes anti-gnes passe par la mise
au point des outils de la thrapie gnique (voir A.I.M.
n 1). Ils pourraient alors apporter des solutions nouvelles aux domaines pauvres de la thrapeutique : antiviraux et SIDA, antiparasitaires, etc.

Prochain article :
Lapoptose.

A.I.M. 1994 N 9