PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR

TIAMINA (Vit. B1) EN HARINA DE TRIGO

Mtodo FluoromtricoHPLC
Basado en mtodo 953.17 AOAC, modificado
Seccin Qumica de
Alimentos y Nutricin

1.

PRT711.02047

Fecha emisin:
09/01/2008
Revisin: 3
Fecha revisin:
09-12-2011
Pgina 1 de 7

OBJETIVO

Determinar la concentracin de tiamina por cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) en

harina de trigo.
2.

CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

El mtodo es aplicable a muestras de harinas, enriquecidas o no con tiamina (vitamina B1).

3.

FUNDAMENTO

Se basa en la extraccin de la tiamina a travs de un tratamiento enzimtico, hidrlisis cida,

filtracin por membrana 0,22 micras, seguido por una oxidacin a tiocromo (compuesto
fluorescente, cuya fluorescencia es directamente proporcional a la concentracin de tiamina
presente en la muestra) y posterior identificacin y cuantificacin por cromatografa liquida
isocrtica en fase reversa con detector de fluorescencia, ajustada a una longitud de onda de
excitacin de 365 nm y de emisin de 436 nm.
4.

REFERENCIAS

4.1

Horwitz, W. Latimer, G. (2005) Official Methods of Analysis, of AOAC

International, 18 th edition, Chapter 45 pp. 11, Mtodo 953.17

4.2

United State Pharmacopeia U.S.P. XIX, pg 504, 629, ao 1975.

4.3

Anlisis de Vitaminas, Rolf Strobecker and Heinz M. Henning, ao 1967, pgina 80,
82.

4.4

Methods for the determination of vitamins in food, G. Brubacher Muller Mulot and
A.T. Southgate, pginas 51 64, ao 1986.

5.
5.1

TERMINOLOGA
Tiamina: Se encuentra en forma sinttica frecuentemente como Tiamina Clorhidrato o
mononitrato, aunque existen ms sales de Tiamina. pertenece al grupo de las vitaminas
solubles y se denomina Vitamina B1. Forma parte del grupo de vitaminas del
complejo B.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR

TIAMINA (Vit. B1) EN HARINA DE TRIGO
Mtodo FluoromtricoHPLC
Basado en mtodo 953.17 AOAC, modificado
Seccin Qumica de
Alimentos y Nutricin

6.

PRT711.02047

Fecha emisin:
09/01/2008
Revisin: 3
Fecha revisin:
09-12-2011
Pgina 2 de 7

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1

Materiales

6.1.1

Columna HPLC C18 5 m * 125 mm * 4,6 mm.

6.1.2

Precolumna C18 (5 m) 4*4

6.1.3

Matraz aforado mbar de 1000 mL

6.1.4

Matraz aforado mbar de 500 mL

6.1.5

Matraz aforado mbar de 100 mL

6.1.6

Matraz aforado mbar de 50 mL

6.1.7

Matraces Erlenmeyer de 250 y 125 color mbar y cuello esmerilado con tapa

6.1.8

Pipetas de 5 y 10 mL

6.1.9

Probetas

6.1.10

Embudos

6.1.11

Esptula

6.1.12

Jeringas desechables de 5 o 10 mL

6.1.13

Papel filtro Whatman N 2

6.1.14

Dispositivos de filtracin sobre membrana Millipore

6.1.15

Membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm

6.1.16

Membranas Millipore de 0,22 micras de 47 mm

6.1.17

Navecillas

6.1.18

Material usual de laboratorio

6.2

Equipos

6.2.1

Cromatgrafo Liquido de Alta Resolucin (HPLC) con detector de fluorescencia

6.2.2

Balanza analtica sensibilidad 0,01 g

6.2.3

Balanza analtica sensibilidad 0,001 g

6.2.4

Bao termorregulado con agitacin magntica y rango de temperatura de 40 a 50 C

6.2.5

Bao termorregulado con rango de temperatura de 80 a 90 C

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR

TIAMINA (Vit. B1) EN HARINA DE TRIGO
Mtodo FluoromtricoHPLC
Basado en mtodo 953.17 AOAC, modificado
Seccin Qumica de
Alimentos y Nutricin

PRT711.02047

Fecha emisin:
09/01/2008
Revisin: 3
Fecha revisin:
09-12-2011
Pgina 3 de 7

6.2.6

PHmetro

6.2.7

Estufa

6.2.8

Placa calefactora con agitacin magntica

6.2.9

Bomba de vaco

6.2.10

Sonicador

6.2.11

Purificador de Agua Milli-Q

6.2.12

Campana de Extraccin Qumica

6.3

Reactivos

6.3.1

cido clorhdrico fumante 37 % p.a.

6.3.2

cido clorhdrico 1 N. En un matraz aforado de 1000 mL que contenga

aproximadamente 500 mL de agua destilada, aadir con cuidado 82 ml de HCL al
37%, enrasar con agua destilada.

6.3.3

Hidrogenofosfato de di-Potasio trihidratado p.a. (K2HPO4 3 H2O) p.a

6.3.4

Solucin de Hidrogenofosfato de di-potasio, solucin 10 mM pH 7,2. En un vaso de

1000 mL pesar exactamente 2,28 g de K2HPO4 3 H2O.y disolver en aproximadamente
800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 con HCL 1N.Trasvasar a un matraz
aforado de 1000 mL y enrasar con agua destilada. Desgasificar bajo presin reducida y
filtrar a travs de. Membranas Millipore 0,22 micras x 47 mm.

6.3.5

N,N-Dimetilformamida grado ACS.

6.3.6

NaOH 15%

6.3.7

Papana soluble p.a

6.3.8

Sodio Acetato trihidratado p.a.

6.3.9

Solucin de acetato de sodio 2,5 M: Pesar 340 mg de g de acetato de sodio

trihidratado y llevar a un matraz aforado de 1000 mL con agua destilada y enrasar.

6.3.10

Fase mvil: Mezclar N,N-dimetilformamida + Hidrogenofosfato de Di-potasio, 10

mM pH 7,2. (30:70).

6.3.11

Takadiastasa p.a

6.3.12

Tiamina clorhidrato estndar, almacenar en desecador con deshidratante adecuado.

6.3.13

Ferricianuro de potasio p.a.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR

TIAMINA (Vit. B1) EN HARINA DE TRIGO
Mtodo FluoromtricoHPLC
Basado en mtodo 953.17 AOAC, modificado
Seccin Qumica de
Alimentos y Nutricin

PRT711.02047

Fecha emisin:
09/01/2008
Revisin: 3
Fecha revisin:
09-12-2011
Pgina 4 de 7

6.3.14

Solucin de ferricianuro de potasio al 1%. Pesar 0,1 g de ferricianuro de potasio y

llevar a 10 mL con agua destilada o desionizada.

6.3.15

Solucin oxidante: Tomar 4 mL de la solucin de ferricianuro de potasio al 1% en un

matraz de 100 mL y enrasar con solucin de NaOH al 15%.

6.3.16

cido Ortofosfrico

6.4

Solucin Estndar de Tiamina:

6.4.1

Solucin stock de 1 mg/mL: Pesar exactamente 63,6 mg de Tiamina Clorhidrato, los

cuales equivalen a 50 mg de Tiamina en un matraz de 50 mL color mbar, disolver en
agua desionizada adicionando 5 mL de HCL 1N y enrasar con agua desionizada.
Guardar en frasco oscuro a una temperatura menor de 10 C (preparar la solucin cada
6 meses o cuando se requiera).

6.4.2

Solucin intermedia de 100 g/mL: Diluir 5 mL de la solucin stock a 50 mL con

agua desionizada. Guardar en frasco oscuro a una temperatura menor de 10 C.

6.4.3

Solucin de 10 g/mL: Diluir 5 mL de la solucin intermedia de 100 g/mL en un

matraz de 50 mL y enrasar con agua desionizada.

6.4.4

Solucin de 1 g/mL: Diluir 5 mL de la solucin de 10 g/mL en un matraz de 50

mL y enrasar con agua desionizada.

6.5

Curva de trabajo de 0,02 0,05 0,1 y 0,2 g/mL: En matraces aforados de 10 mL

de color mbar tomar alcuotas de 0,2 - 0,5 1,0 y 2,0 mL respectivamente de la
solucin de 1 g/mL (6.4.4) y proceder a la oxidacin agregando 2,0 mL de
ferricianuro alcalino y agitar por 2 minutos, enseguida adicionar 0,45 mL de cido
ortofosfrico, enfriar inmediatamente y enrazar con agua desionizada.

7.

DESARROLLO

El ingreso de la muestra para su anlisis debe cumplir con el Instructivo de Aceptacin o

Rechazo de muestras IT711.02065.
Profesional de laboratorio es el encargado de realizar el anlisis HPLC, clculo e informa los
resultados del ensayo.
Tcnico del Laboratorio realiza la preparacin y tratamiento de la muestra segn procedimiento.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR

TIAMINA (Vit. B1) EN HARINA DE TRIGO
Mtodo FluoromtricoHPLC
Basado en mtodo 953.17 AOAC, modificado
Seccin Qumica de
Alimentos y Nutricin

PRT711.02047

Fecha emisin:
09/01/2008
Revisin: 3
Fecha revisin:
09-12-2011
Pgina 5 de 7

7.1

Preparacin de la muestra

7.1.1

La vitamina B1 no es sensible a la luz; en cambio el tiocromo que es el producto de la

oxidacin si es fotosensible, por lo cual se debe utilizar material mbar o color marrn
durante la etapa de oxidacin.

7.1.2

Homogeneizar la muestra en forma manual, agitando el envase o bolsa sin abrirla,

pesar entre 4,0 a 5,0 g de harina en un matraz Erlenmeyer mbar con tapa de 250 mL,
anotar exactamente lo pesado.

7.1.3

Adicionar 0,5 g de Taka-Diastasa, 0,25 g de papana y 20 mL de agua desionizada a +

45-50 C. Mezclar bien a fin de obtener una suspensin homognea.

7.1.4

Tapar el matraz y colocarlo durante 30 min. en un bao termorregulado con agitacin

a + 45-50 C. Enseguida aadir 50 mL de agua desionizada entre + 45-50 C.

7.2

Hidrlisis

7.2.1

Aadir 5 mL de HCL 1 N al matraz anterior, mezclar bien tapar el matraz con papel
alumnio. Calentar por 45 min. a bao mara hirviente agitando ocasionalmente para
evitar grumos.

7.2.2

Enfriar y aadir 5 mL de acetato de sodio 2,5 M, mezclar bien y transferir

cuantitativamente a un matraz aforado de 100 mL color mbar y enrasar con agua
destilada.

7.2.3

Filtrar a travs de papel filtro Whatman N 2 y membranas Millipore de 0,22 micras

de 13 mm. La solucin est lista para la oxidacin.

7.3

Oxidacin

7.3.1

En un matraz aforado de 10 mL color mbar, adicionar una alcuota de 1 mL de

filtrado anterior que contiene la tiamina.

7.3.2

Aadir 3 mL de solucin de ferrocianuro de potasio alcalino, agitar por 2 min en

forma constante.

7.3.3

Aadir 0,45 mL de cido ortofosfrico concentrado, mezclar, enfriar y enrasar con

agua desionizada.

7.3.4

La solucin est lista para traspasar a vial mbar e inyectar en HPLC.

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR

TIAMINA (Vit. B1) EN HARINA DE TRIGO
Mtodo FluoromtricoHPLC
Basado en mtodo 953.17 AOAC, modificado
Seccin Qumica de
Alimentos y Nutricin

PRT711.02047

Fecha emisin:
09/01/2008
Revisin: 3
Fecha revisin:
09-12-2011
Pgina 6 de 7

7.4

Determinacin cromatogrfica de Tiamina

7.4.1

Curva de calibracin de las soluciones estndares

7.4.1.1

Inyectar en triplicado 20 L de cada una de las soluciones estndares de acuerdo al

punto 6.5.

7.4.1.2

Tiempo de corrida: 7 minutos.

7.4.1.3

Realizar la curva de calibracin utilizando el mtodo de clculo con estndar externo

integrado en el equipo.

7.5

Condiciones Cromatograficas de Tiamina

: C18 o RP 18 (5 m) 125 x 4,6 mm y Pre-Columna RP 18 (5 m) 4-4

: Mezcla N,N-dimetilformamida + Hidrogenofosfato de Di-potasio, 10 mM pH
7,2. (30:70)
Inyeccin
: 20 L
Flujo o caudal : 0,8 mL / min.
Detector
: Espectrofluormetro, Excitacin: 365 nm y Emisin 436 nm
Columna
Fase mvil

7.6

Cuantificacin de Tiamina en muestras

7.6.1

Ingresar al HPLC en mtodo Tiamina que contiene la curva de calibracin obtenida de

concentracin (C) en g/mL e interpolar la muestra para cuantificar el resultado del
rea vs concentracin. Valor C (g/mL)

7.6.2

Inyectar en duplicado 20 L de la solucin eluida del extracto de la muestra de harina de

trigo.

7.6.3

Tiempo de corrida: 7 minutos.

7.7

Clculo e informe de resultados

CxVxFxP
mg /Kg = ---------------------M

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR

TIAMINA (Vit. B1) EN HARINA DE TRIGO
Mtodo FluoromtricoHPLC
Basado en mtodo 953.17 AOAC, modificado
Seccin Qumica de
Alimentos y Nutricin

PRT711.02047

Fecha emisin:
09/01/2008
Revisin: 3
Fecha revisin:
09-12-2011
Pgina 7 de 7

Donde:
C=
Concentracin en g/mL obtenidos por la interpolacin en la curva de calibracin de la
muestra.
V=
Volumen de la muestra final
M=
Masa de la muestra en gramos
F=
Factor de dilucin
P=
Porcentaje de Pureza del Estndar dividido por 100
Informar mg/Kg de Tiamina con un decimal.
7.8

Control de Calidad

Se efectuarn controles sistemticos y peridicos para comprobar la validez de los ensayos

realizados con el mtodo analtico recogido en este procedimiento.
a) Nivel I:

Ensayos de intercomparacin, utilizacin de materiales de referencia certificados y

patrones de referencia certificados, segn su disponibilidad.

b) Nivel II: Materiales de referencia sin certificacin externa o muestras fortificadas por el
analista en la validacin cuando se requiera.
c) Nivel III. Durante el desarrollo de la serie de trabajo si es factible se incluir:
- Control de blanco al inicio de la corrida cromatogrfica.
- Inyeccin de uno o ms puntos de solucin patrn conocida.
- Inyeccin de material control de valor conocido (quality control), cuyo
resultado se grafica en una carta de control para su seguimiento.
8.

REGISTROS

8.1
9.

Libro de registro de resultados de anlisis de vitaminas

ANEXOS

No Aplica