Prima revolutie verde, initiata dupa cel de al doilea razboi mondial

de Norman Borlaug pentru a incerca sa rezolve o parte din
probleme grave ale nutritiei omenirii .

Cercetari dezvoltate in Mexic, India si Filipine la

Grau, orez, porumb, sorg, mei etc.

A doua revolutie verde = Biotehnologiile moderne

Ultima oar cnd s-a murit de foame n Europa Occidental a

fost la sfritul anilor 1840. Dezastrul a fost disproporionat
de mare n Irlanda, unde au murit de foame n jur de un milion
de oameni i nc un milion au emigrat n America. Europa
Continental nu a scpat nici ea, unii istorici considernd c
aceast foamete, care a afectat n special pturile srace ale
populaiei i din cauza creia au murit n jur de o sut de mii
de oameni, a fost pictura care a declanat revoluiile de la
1848.

Ultima oar cnd s-a murit de foame n Europa de Est a fost

dup al doilea rzboi mondial, cnd guvernele comuniste, n
plin perioad de secet, n lupta lor contra lcomiei celor
care ncercau s fac profituri vnznd mncare, au introdus
controale ale preurilor la produsele agricole, efectul fiind
dispariia de pe pia a produselor agricole. Din cauza
politicii economice comuniste, ncepnd din 1945 producia
agricol a Romniei a sczut brusc la 38%, iar n 1947
dezastrul a lovit din nou Romnia, aproximativ 30.000 de
persoane murind de foame, dup o relativ prosperitate de
un secol.

Ultima oar cnd s-a murit de foame n China a fost n

1958-1961, cnd au murit ntre 30 i 40 de milioane de
oameni, victime colaterale ale Marelui Salt nainte
Ultima oar cnd s-a murit de foame n Africa a fost ieri.
Aproximativ 25 de mii de oameni mor de foame n fiecare
zi n zonele srace ale lumii .

Dac n 1943 Mexicul importa jumtate din cerealele folosite,

n 1956 a devenit autosuficient, iar din 1963 a devenit
exportator. n 1961, Borlaug s-a mutat mpreun cu familia n
India, care la momentul respectiv era n pragul foametei. Ca
urmare a muncii lui Borlaug, ntre 1965 i 1970 producia de
gru a Indiei i a Pakistanului aproape s-a dublat, iar cea de
orez a crescut i ea n mod considerabil, fermele de
subzisten de orez fiind nlocuite cu tehnici moderne.

Wheat Production India now occupies the

Second Position in the World
1965: 10 Million t

2000 : 80 Million t

From Green to Gene Revolution in Rice

Potential yield (t/ha)
14
12
10
8
6
4
2
0

8000
BC

1950
1900 1930
Land Pureline Cross
races selection breds

1965 1990
Semidwarfs
(IR8) (IR72)

Public Sector

1995
Indica/
Indica
hybrids

2005
2010
2000
New Indica/ Biotechplant Tropical nology
type japonica
hybrids
Public-Private Sector

Cuprins

Definiie

Scurt istoric

Probleme ce pot fi rezolvate cu ajutorul biotehnologiilor

Justificarea necesitii utilizrii biotehnologiilor n agricultur

Date statistice privitoare la PMG

Metode de transformare genetic

Tendine de cercetare actuale

Ce sunt biotehnologiile?

Biotehnologie provine din doi termeni

bio deriv din grec. bios = viaa
tehnologia studiul mainilor i uneltelor
(termen utilizat inca de Plutarh si Cicero)

Definitie

Biotehnologia este o tiin inginereasc, pluridisciplinar,

ce utilizeaz materia vie pentru degradarea, sinteza i
producerea de materiale noi utilizate n activitile umane.

Foloseste microorganisme, enzime, structuri celulare si subcelulare,

biocatalizatori, tehnici de inginerie genetica etc.

Biotehnologiile clasice

Babilonienii cunosteau din sec. VI iHr. modul de preparare a berii

si transformarea alcoolului etilic in acid acetic (otet)
Sumerienii (sec III iHr.) cunosteau tehnica fabricarii a peste 20 de
tipuri de bere
Majoritatea popoarelor antice foloseau drojdiile pentru fabricarea
unor produse alimentare (paine, vin, bere) si bacterii pentru
obtinerea derivatelor lactate

Scurt istoric
8000 Hr nceputurile agriculturii (cartoful prima plant
cultivat)
4000-2000 Hr Primele aplicaii ale biotehnologiilor
(fabricarea pinii i berii) Mesopotamia i Egipt
500 Hr - n China, este descoperit efectul antibiotic al culturilor
de mucegai, acesta fiind utilizat ulterior n scop terapeutic

Scurt istoric
1595 - Hans Janssen construiete primul microscop.
1663 - Robert Hooke a descoperit o structur rectangular pe
care a numit-o celul.
1665 - Antoni van Leeuwenhoek devine prima persoan din lume
care a observat celule bacteriene.

Scurt istoric

1859 - Charles Darwin a publicat teoria revoluionar a

evoluiei
1866 Gregor Mendel a descoperit regulile care
guverneaz mo tenirea genetic
1913 Studiind Drosophila melanogaster, Thomas Hunt Morgan
a descoperit o serie de legi ale ereditii.
1909 sau 1919 s-a utilizat pentru prima oar termenul
biotehnologie.

Scurt istoric

1953 Pe baza analizei cristalografice cu raze X a lui

Rosalind Franklin, James Watson i Francis Crick descriu
modelul ADN

1958 Este sintetizat pentru prima oar ADN n eprubet.

1961 USDA nregistrez primul biopesticid - Bt

1963 Prima revoluie verde

1970 Norman Borlaug - Premiul Nobel pentru Pace.

1971 Prima sinteza a unei gene

1976 Primul act normativ privitoare la ADN recombinant

Scurt istoric

1976 - Genentech, prima companie modern de biotehnologie

1982 Insulina uman recombinanta devine primul medicament
obtinut prin biotehnologie
1983 Kary Mullis i colaboratorii si dezvolt PCR
(polymerase chain reaction)
1986 Prima aprobare pentru testarea n cmp a PMG
1990 Porumbul Bt
1994 Prima aprobare pentru consumul uman - FDA

Scurt istoric

1996-97 Comercializarea primelor cultivare rezistente la

atacul insectelor

1997 Oaia Dolly

2000 Prima hart genetic

2001 Prima hart genetic a unei plante cultivate - orez

2003 Secvenierea genomului uman este complet

Prioriti pentru biotehnologiile moderne

Prioriti
- asigurarea necesarului de hran
- producerea de medicamente
- tratament pentru cele 3000 de boli ereditare
- combaterea efectelor polurii etc.

Evolutia populaiei

240.000 ani 10.000 locuitori

4000 iHr.
- 30 milioane
1 dHr.
- 210 milioane
1900
- 1.650 milioane
2009
- 6.8 miliarde
2014
- peste 7 miliarde

Numrul de locuitori (16.09.2014)

rank

country
World

area sq.km. population (16.09)

yearly growth daily increase population today

510,072,000 7,257,175,868

1.10%

215,060

7,257,390,928

1.

China

9,596,960 1,395,717,615

0.61%

22,966

1,395,740,581

2.

India

3,287,590 1,270,865,772

1.24%

42,367

1,270,908,139

3.

USA

9,826,630 323,182,268

0.81%

7,085

323,189,353

4.

Indonesia

1,919,440 253,532,864

1.21%

8,297

253,541,161

5.

Brazil

8,511,965 202,417,002

0.85%

4,649

202,421,651

6.

Pakistan

803,940

185,806,215

1.66%

8,289

185,814,504

7.

Nigeria

923,768

179,460,046

2.78%

13,223

179,473,269

8.

Bangladesh 144,000

158,857,249

1.19%

5,118

158,862,367

9.

Russia

17,075,200 142,465,272

-0.21%

-834

142,464,438

10.

Japan

377,835

-0.08%

-293

127,013,953

11.

Mexico

1,972,550 124,124,887

1.21%

4,055

124,128,942

12.

Philippines 300,000

100,434,623

1.71%

4,618

100,439,241

56

Romania

21,630,267

-0.26%

-155

21,630,113

237,500

127,014,246

http://www.geohive.com/earth/population_now.aspx

Declinul cresterii productiei agricole

Percentage per year

19671982
19821994
19952020

Developing countries

World

Developed countries

Source: C.S. Prakash, Center for Plant Biotechnology Research, Tuskegee University, Alabama

Benefits of biotechnology More food

Ponderea populatiei pe continente

Distribuia contribuiei la creterea populaiei

pn n 2020

Former Soviet Union 0%

Europe 0%
North
America 5%

Asia 51%

Africa 35%
South America 8%

Benefits of biotechnology More food

Consumul de calorii n lume

Tendinte actuale in agricultura

Masuri diversificarea cultivarelor si a speciilor

cultivate
Introducerea

biotehnologiilor

(10% din necesarul de forta de munca din agricultura

pentru producerea aceleiasi cantitati de proteine)
Fixarea

azotului atmosferic



Valorificarea solurilor saraturoase

Prevenirea efectelor toxice ale pesticidelor

(anual la cele 200 mii de produse chimice se adauga 1-2 mii noi, 1 mil
intoxicatii acute- 20 mii morti )

Folosirea biotehnologiilor in ameliorarea plantelor

Schimbarea treptata a tuturor modelelor de productie

Promovarea conceptului de dezvoltare durabila

Modificarea legislatiei privitoare la OMG

Raportul dintre plantele transgenice si cele non-transgenice

Global Adoption Rates (%) for Principal

Biotech Crops (Million Hectares) 2007
M Acres

396

160

346

140

297

120

247

100

198

80

148

60

99

40

49

20

148

Conventional
Biotech

91

35
27

64%

43%

24%

Soybean

Cotton

Maize

Source: Clive James, 2008

20%

Canola

Raportul dintre plantele transgenice si cele non-transgenice

Suprafee cultivate cu OMG (mil. ha)

ar

2011

2012

2013

Plantele cultivate

SUA

69,0

69.5

70,1

Porumb, soia, bumbac, rapita, papaya,

lucerna, sf. de zahr

Brazilia

30,3

36,6

40,3

Porumb, soia, bumbac

Argentina

23,7

23,9

24,4

Porumb, soia, bumbac

India

10.6

10,8

11.0

Bumbac

Canada

10.4

11.6

10,8

Porumb, soia, rapi, sfecl de zahr

China

3.9

4.2

Bumbac, plop, rosii, petunii, ardei, papaya

rile UE

2011

2012

Spania

0.1

0.1

0.1

Porumb

Portugalia

<0,1

<0,1

<0,1

Porumb

Republica Ceh <0,1

<0,1

<0,1

Porumb

Romnia

<0,1

<0,1

<0,1

Porumb

Slovacia

<0,1

<0,1

<0,1

Porumb

Sursa: Raportul ISAAA 2014

2013

Plantele cultivate

Suprafete cultivate cu plante modificate genetic

Ameliorarea traditionala
Cultivar

Donor

Cultivar nou
(mai multe gene sunt transferate)

X
(hibridare)

Gena dorita

Gena dorita

Biotehnologii
Gena dorita

Cultivar comercial

Cultivar nou

(numai gena de interes )

=
(transfer)
Gena de interes

What is plant biotechnology?

 Ingineria genetica

Teosinte
What is plant biotechnology?

Porumb actual

Ingineria genetica poate fi definita ca un ansamblu de metode si

tehnici care permit fie introducerea in patrimoniul genetic al unei
celule a uneia sau mai multor gene noi, de interes, fie modificarea
expresiei unei/unor gene prezente, deja, in celula. Genele transferate
sunt denumite transgene. Ingineria genetica mai este numita, uneori, si
modificare genetica, transformare genetica sau transgeneza, iar
produsele obtinute poarta numele de organisme modificate genetic
(OMG) sau organisme transgenice.

CE SUNT ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC

In Romania), organismul modificat genetic este un organism care

contine o combinatie noua de material genetic, obtinut prin tehnicile
biotehnologiilor moderne care ii confera noi caracteristici.

AUTORITATI IN DOMENIUL BIOTEHNOLOGIEI

In SUA, obtinerea prin biotehnologii si utilizarea organismelor modificate genetic se afla sub
controlul strict al US Food and Drug Administration (USFDA).
USFDA stabileste cadrul de lucru pentru regimul de siguranta al alimentelor si realizeaza
evaluarea stiintifica a riscului, in scopul aprobarii si imbunatatirii eficientei procedurilor de
autorizare pentru alimentele modificate genetic. Procedurile analizeaza influenta alimentatiei
asupra mediului, sanatatii umane si animale. Etichetarea, care se aplica la toate produsele
obtinute prin modificari genetice, asigura consumatorii ca pot alege un produs modificat genetic
sau unul nemodificat genetic. Combinata cu evaluarea stricta a sigurantei, etichetarea reasigura
consumatorii ca pot avea incredere in aceasta noua tehnologie.
In CANADA, cadrul legislativ este axat asupra proprietatilor produsului si nu asupra
procesului prin care acesta a fost obtinut. In prezent, autoritatea canadiana Canadian General
Standards Boards (CGSB) lucreaza pentru dezvoltarea unui standard in vederea etichetarii
voluntare.

EUROPA Sectorul agroalimentar al Comunitatii Europene ocupa un loc major pe piata

globala, fiind, in acelasi timp, un producator, exportator si importator de alimente.
Comunitatea Europeana prezinta un interes vital pentru asigurarea unor produse
alimentare de calitate ridicata, larg acceptate de consumatori, a caror sanatate este
protejata in acest mod.
Pe baza modelului USFDA, a fost stabilit un cadru de lucru pentru regimul de
siguranta al alimentelor in Europa. Legea pentru infiintarea autoritatii in domeniu,
European Food Authority (EFA), a fost aprobata de catre Ministerele Consiliului si
Parlamentului European.
Summit-ul European de la Nissa (decembrie 2000) a impus ca EFA sa fie
operationala din 2002. Autoritatea este o entitate legala separata, independenta de alte
institutii ale Comunitatii.

SARCINILE EFA - EFA are 6 sarcini principale:

Furnizeaza opinii stiintifice independente (pentru aspectele de siguranta
alimentara, nutritie, sanatate/bunastare a animalelor, sanatatea plantelor,
organisme modificate genetic) la cererea Comisiei, Parlamentului European
(PE), Statelor Membre sau organismelor nationale pentru alimentatie in scopul
acordarii suportului pentru managementul riscului;
Furnizeaza opinii asupra aspectelor de tehnologie alimentara pentru a
sprijini dezvoltarea reglementarilor si legislatiei problemelor de siguranta in
fluxul alimentar;
Colecteaza si analizeaza datele asupra modelelor dietetice, expune articole
din programele monitorizate si orice alte date relevante pentru orice risc
potential in vederea monitorizarii sigurantei de-a lungul lantului alimentar in
UE;
Identificarea si avertizarea timpurie a riscurilor potentiale;
Functionarea unui sistem de alertare rapid care acopera atat alimentele, cat
si furajele;
Comunica publicului general toate sarcinile care i-au fost alocate.

This is the official website of the "Community

Reference Laboratory for GM Food and Feed" that has
been established in the context of Regulation No (EC)
1829/2003 on GM Food and Feed.
The core task of the CRL is the scientific assessment
and validation of detection methods for GM Food and
Feed as part of the European Commission authorisation
procedure. The Joint Research Centre (JRC) of the
European Commission and - more precisely - the
Biotechnology and GMOs Unit within the Institute for
Health and Consumer Protection, has been given the
mandate for the operation of the CRL.
It does so in collaboration with a European Network of
National Control Laboratories, assembled in the
European Network of GMO Laboratories (ENGL).
The Community Reference Laboratory for GM Food
and Feed operates according to a quality management
system fulfilling the requirements of standard ISO
9001:2000 and ISO 17025:2005.
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/default.htm

ROMANIA este prima tara din Balcani care a stabilit legea organismelor modificate
genetic. Ordonanta Guvernului nr. 49/2000 a stabilit infiintarea Comisiei Nationale
pentru Securitate Biologica (CNSB), care a fost abilitata sa puna in aplicare dispozitiile
legislatiei nationale si internationale referitoare la regimul activitatilor care implica
utilizarea organismelor modificate genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne, numai
dupa avizarea scrisa, emisa de Punctul Focal National.

UNGARIA detine cea mai restrictiva lege, care reflecta toate pozitiile principale ale
directivelor UE in domeniul organismelor modificate genetic.

Organismele implicate n reglementare n

Romnia (Legea 214/2002)

Atribuii

Ministerul Mediului

Emite autorizaii/acorduri, controleaz,

informeaz i consult publicul, solicit
avize celorlalte autoriti.

Comisia Naional pentru Securitate

Biologic (autoritate tiinific)

Emite o concluzie tiinific

Avizeaz

Ministerul Agriculturii i Dezvoltrii

Rurale

Avizeaz i controleaz

Ministerul Sntii

Avizeaz i controleaz

Agenia Naional pentru Protecia

Consumatorilor

Avizeaz i controleaz

Dogma centrala a geneticii

Replicatie
ADN-ARN-proteine

ADN
Transcriere
ARN
Translatie

Nucleu

Proteina
Citoplasma

Structura acizilor
nucleici

Compozitia chimica a ARN

Baze azotate: adenina (A), guanina
(G), citozina (C), uracilul (U)

Riboza (monozaharid)

Radicali fosfat
Compozitia chimica a ADN

Baze azotate: adenina (A), guanina
(G), citozina (C), timina (T)

Dezoxiriboza (derivat mai stabil al
ribozei)

Radicali fosfat
Bazele purinice: A, G (dublu nucleu
aromatic)
Bazele pirimidinice: C, T, U (un singur
nucleu hexagonal)

Caracteristicile codului genetic

1. UNIVERSAL - in toate organismele aceeasi codoni
codifica aceeasi aminoacizi.
2. NEACOPERIT
/ NESUPRAPUS - 2 codoni vecini nu au
.
nucleotide comune.
3. FARA VIRGULE - nu exista spatii libere intre nucleotide si
nici alte semne de punctuatie.
4. DEGENERAT - un acelasi aminoacid poate fi codificat de
mai multi codoni.
5. AMBIGUU - un anumit codon poate sa includa mai multe
tipuri de aminoacizi intr-o proteina in functie de pozitia lui
in catena.

Structura genelor la eucariote

Plasmid
Bacterian

Pentru modificarea genetica a plantelor este nevoie de:

- gene de interes;
- metode care sa permita patrunderea si integrarea transgenelor in nucleul
celulei care va fi la originea unei noi plante;
- selectia plantelor in care transgena se exprima la un nivel adecvat
scopului urmarit (toleranta la erbicid, rezistenta la atacul unui daunator
etc.).

Structura unei gene

intrerupator
PROMOTOR INTRON

Sinteza proteinei

Semnal stop

Secventa codificatoare

poly A signal

Expresia genica
Transcriptia si translatia genereaza expresia genica
Informatia genetica codificata in ADN unui embrion include toate
genele necesare pentru a mentine si dezvolta organismul
Diferite tipuri de celule exprima diferite tipuri de gene
Expresia genica diferita in timpul dezvoltarii stabileste rolul celulei in
corp

Initierea transcriptiei

Promotor
ADN

GG

Gena ce va fi transcrisa

TATA
TATA box Inceputul transcriptiei

Transcriptia
Prin intermediul ARN polimerazei se sintetizeaza o molecula de ARN m
complementara

DNA coding strand

5

DNA

GT CA TT CGG
3
G UC AUUCG G

C AG T AAGCC

DNA template strand

RNA

Translatia

Procesul citirii ARN mesager si transformarea informatiei in proteine

se numeste translatie

ADN

ADN
Transcriptie

ARN
Mesenger

ARNm
Codon

Codon

Codon

Translatie

Proteine

Lizina

Serina

Valina

Polipeptide
(amino acid
sequence)

Constructia unei transgene

intrerupator
PROMOTOR INTRON

Sinteza proteinei

Semnal stop

Secventa codificatoare

poly A signal

Gena de interes

Gena marker pentru

selectia plantei

Plasmid ADN
Construct
Gene bacteriene
antibiotic marker
replication origin

Transgeneza presupune parcurgerea a trei etape:

- pentru identificarea, izolarea si clonarea genelor de interes;
- transferul genelor de interes la plantele de cultura ;
- selectia plantelor care exprima, la un nivel optim, caracterul transferat
si testarea acestora in camp pentru evaluarea stabilitatii expresiei
transgenei in timp, in conditii naturale.

Identificarea si izolarea genei de interes

Etapele realizarii unui construct

Principalele metode utilizate pentru transferul genelor de interes



2


METODE INDIRECTE TRANSFORMAREA MEDIATA

1. Transformarea mediat de bacterii:
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rhizogenes
2. Transformarea mediat de virusuri
METODE DIRECTE
1. Metoda biolistics mpucarea direct a ADN n celule
2.Transformarea protoplastelor
a.Microinjectarea
b.Electroporarea
c.Sonicarea
3. Electroforeza
4. Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu

A. tumefaciens

A. rhizogenes

Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de

plante chiar dac unele dintre acestea nu formeaz tumori. Dei spectrul de gazde
pentru aceast bacteriei este limitat la plantele dicotiledonate s-au obinut tulpini
supervirulente, capabile s infecteze eficient i celulele plantelor
monocotiledonate. Eficiena transformrii celulei vegetale de ctre A. tumefaciens,
variaz destul de mult n funcie de specie, genotip sau chiar de esutul int. Este
foarte important, totodat, ca esutul supus transformrii s fie totipotent i deci
s regenereze plante transformate genetic.
Ca esuturi int pot fi utilizate: discuri sau fragmente foliare,
fragmente de rdcini, hipocotile, peiol, cotiledoane sau semine ntregi.
Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost
regenerate n 1983, succesele iniiale limitndu-se la solanacee, n particular la
sistemul model tutunul (Nicotiana tabacum L.). Ulterior au fost transformate: soia,
bumbacul, orezul, ovzul, sorgul, trestia de zahr, grul i multe altele.

Eficiena transformrii variaz foarte mult de la o specie la alta n funcie de:

- identificarea metodei optime de cultur a esutului int
- condiiile de cultur a materialului surs
- sua bacterian utilizat.
Aceti factori afecteaz i numrul de copii de ADN-T care se integreaz n
genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de
plante, integrarea unei singure copii de ADN-T. Mai recent, cercetrile au vizat
descifrarea mecanismelor implicate n colonizarea esuturilor vegetale de ctre
bacterii, relevndu-se noi detalii privind controlul genetic al virulenei
bacteriene .

Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oar pentru transformarea

plantelor de tutun n anul 1977.
- transfernd ADN-T de pe plamida Ri determin formarea rdcinilor firoase pe
diferite organe ale plantelor, rdcini care pot purta gene de interes, dac acestea
au fost integrate n ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic.
- O etap intermediar, n procesul de transformare mediat de A. rhizogenes, este
cultura rdcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi i ramifica. Astfel,
prin cultura rdcinilor firoase se pot obine metabolii secundari sau pot fi
realizate studii fundamentale privind creterea i dezvoltarea rdcinilor. Acest
sistem experimental este foarte potrivit i pentru analize biochimice, rdcinile
prezentnd ci biochimice mai simple i, deci, mai uor de analizat. Rdcinile
firoase pot fi cultivate uor, folosind un echipament simplu i ieftin iar, comparativ
cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile din punct de vedere
genetic.

A. rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Ri

i un vector binar, de obicei o plasmid mai mic.
Aceasta din urm poate purta n ADN-T o gen marker, de
exemplu o gen care confer rezisten la un antibiotic, o
gen raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipic
i o gen cu importan economic. Avantajul acestui
sistem este acela c cele dou tipuri de ADN-T, cel care
determin dezvoltarea rdcinilor firoase, i ADN-T de pe
vectorul binar, se integreaz de obicei pe cromozomi
diferii n plantele transformate i deci, vor segrega
independent n descenden. Un avantaj aparte al
sistemului de transformare Ri este faptul c toate celulele
vegetale care integreaz ADN-T de pe plasmida Ri pot fi
uor identificate i selectate prin prezena fenotipului de
rdcin firoas.

Sistemul a fost aplicat unui mare numr de specii de plante (n jur de 200 nc
n 1989), rspunsul optim variaz n funcie de specie, genotip sau sua
bacterian. Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes
sunt: fragmente de tulpin de la plante tinere, fragmente de peiol, fragmente
foliare, segmente de hipocotile sau cotiledoane, sau fragmente ale unor
organe de rezerv cum ar fi rdcinile de morcov sau tuberculii de cartof.
Uneori astfel de explante prezint un rspuns polar, formnd rdcini firoase
numai la una din extremele explantului, rdcini capabile s ignore fora
gravitaional. Mai mult, exist date experimentale care sugereaz efectul de
piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulen, rolA, de la A.
rhizogenes, efect cu importan practic mai ales pentru unele plante horticole

Metoda discurilor pentru transformarea mediata de Agrobacterium

Pregatirea discurilor

Regenerarea

Co-cultivarea cu Agrobacterium

Selectia transformantilor

Aclimatizarea in sera
Photographs by Dr. Paul Bottino

Transformarea mediat de virusuri

Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, n ciuda

numeroaselor eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Dei, n
1984 a fost posibil transferul unei gene de rezistena la antibiotic cu ajutorul unui
virus ADN cercetrile ulterioare au demonstrat c genomul viral nu poate
accepta i transfera fragmente mai lungi de ADN strin. Descoperirea faptului c
virusurile ARN pot genera ADN prin transcripie invers a generat sperana c,
mult mai numeroasele virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene
pentru celula vegetal. Din pcate, ns, s-au ntmpinat alte dificulti. ADN
viral nu se integreaz n genomul vegetal iar meristemele, principala surs de
celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai
rar utilizai n experimentele de transformare genetic a plantelor.

METODE DIRECTE DE TRANSFORMARE

1. Metoda biolistics mpucarea direct a ADN n celule

Metoda biolistic (biolistics) sau particle gun, de mpucare direct a

ADN n esuturi int este cea mai spectaculoas metod de transformare
genetic a plantelor. Metoda const n accelerarea unor particule foarte mici
(1m diametru) din tungsten, wolfram sau aur coloidal, pe care a fost
precipitat ADN, n esuturi vegetale int.

Aceast tehnic are numeroase avantaje

- este o metod uor de aplicat,
- printr-o mpuctur pot fi intite mai multe celule,
- celulele supravieuiesc dup mpucare,
- genele purtate de particule i pstreaz activitatea biologic,
- particulele pot fi mpucate n straturile superficiale sau n profunzimea unui
organ vegetal.
Celulele int pot fi foarte diferite: polen, celule n suspensie, embrioni imaturi,
celule din esuturi difereniate sau chiar meristeme.
A permis transformarea cu succes a unor plante pentru care alte metode nu
au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovzul, orezul, sorgul, trestia de
zahr, grul, plante forestiere etc.
O aplicaie aparte a fost utilizarea mpucrii de microproiectile pentru
rnirea apexurilor la floarea soarelui, eficientiznd astfel transformarea
mediat de Agrobacterium tumefaciens. Mai mult, s-a reuit mpucarea
direct n esuturi vegetale a celulelor bacteriene ntregi

BioRad Particle Gun

Helios Gene Gun

2. Utilizarea protoplastelor pentru transferul direct de ADN

Protoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezint limita de
expresie a totipotenialitii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste
izolate pn astzi numrul plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit
posibil a crescut permanent, ajungnd actualmente la aproximativ 400 de specii de
plante.
Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN i selecia
transformanilor. Indeprtarea peretelui celular elimin principala barier n calea
ptrunderii ADN strin n celula vegetal. Izolarea enzimatic a protoplastelor
acioneaz ca un factor de stress care induce reacii de rspuns la rnire reacii
presupuse a declana starea de competen att de important pentru transformarea
eficient. Mai mult, suspensia de protoplaste se aseamn cu o suspensie bacterian
avand avantaje similare prin posibilitatea de a cultiva populaii mari de celule
individuale n medii de cultur bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au n
general origine clonal provenind din celule individuale. Eficiena seleciei
transformanilor este deci maxim n cazul protoplastelor deoarece se evit formarea
de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare. Pentru transferul
ADN, de obicei plasmidial, n protoplastele izolate se pot utiliza diferite metode, i
anume:

a. Microinjectarea const n introducerea cu ajutorul unei micropipete a

ADN direct n protoplaste, acestea fiind fixate cu o alt micropipet.
Microinjectarea celulei vegetale ntregi sau a esuturilor este, de asemenea
posibil, dar se realizeaz mai greu din punct de vedere tehnic. Un sistem
eficient a fost utilizat mai recent i const n imobilizarea protoplastelor
recipiente de tutun ntr-un strat foarte subire de mediu solidificat cu agaroz
sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile care a permis
localizarea i monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate,
respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea.

Microinjectarea

b. Electroporarea implic permeabilizarea reversibil a membranei plasmatice n

prezena unor pulsuri de curent continuu avnd amplitudine crescut i durat foarte
scurt, porii formai n membran permind intrarea ADN strin n citoplasm .
Electroporarea a devenit o metod de rutin pentru transformarea protoplastelor
vegetale, dar i pentru celulele de mamifere sau bacteriene.
La plante, electroporarea protoplastelor se folosete eficient pentru transformarea
permanent la numeroase specii de plante incluznd cerealele. Mai mult, prin
electroporarea protoplastelor se elimin necesitatea utilizrii unor gene marker, ceea
ce reprezint un avantaj deosebit n condiiile oponenei acerbe a opiniei publice
fat de eliberarea n cmp a unor plante purtnd gene marker.
Avantajele electroporrii constau n
-eficiena crescut a incorporrii ADN strin,
-reproductibilitatea ,
-simplitatea acestei metode.
Singura limitare a aplicrii electroporrii o reprezint capacitatea de regenerare a
protoplastelor, dar i acest dezavantaj a fost depit prin extinderea aplicrii
electroporrii celulelor sau chiar esuturilor ntregi

Electroporarea

c. Sonicarea permeabilizarea membranei protoplastelor n prezena

ultrasunetelor s-a dovedit, de asemenea o metod eficient pentru transferul
ADN n protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fost aplicat i celulelor sau
esuturilor ntregi, dar este utilizat pe scar mai redus comparativ cu
electroporarea

Rezultate obtinute prin sonicare

2.Electroforeza
Migrarea ADN printr-un esut vegetal int a fost aplicat pentru prima oar
embrionilor intaci de orz

3. Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu (silicon carbide technology)

Fibrele de carbur de siliciu se utilizeaz n industrie. Transformarea
genetic prin aceast tehnologie este relativ simpl, constnd n vortexarea
(agitarea) esuturilor mpreun cu ADN i fibre de carbur de siliciu. Astfel, fibrele
penetreaz pereii celulari permind ADN s ptrund n citoplasm.
Metoda a fost aplicat iniial transformrii embrionilor de insecte, iar
ulterior s-a dovedit eficient i n transformarea celulelor vegetale. Cercetrile de
microscopie electronic au relevat penetrarea peretelui celular de ctre astfel de
fibre, sugernd c ADN ader de suprafaa fibrelor i este introdus odat cu acestea
n celul. Avnd proprieti fizice asemntoare azbestului fibrele de carbur de
siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetic a fost raportat folosind
aceast tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovz, tutun i Agrostis
alba. Transformarea stabil a fost, de asemenea posibil folosind suspensii celulare
de porumb i tutun. Datele obinute au indicat transformarea preponderent a
aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun cercetri
ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezint avantajul de a fi
foarte simpl i ieftin, dar datorit riscurilor poteniale pentru sntatea uman se
caut materiale alternative, eventual biodegradabile .

Alte metode de transfer direct al ADN n celulele vegetale:

- mbibarea ADN n esuturi utiliznd semine uscate sau embrioni,
- transformarea polenului sau a tubului polinic,
- macroinjectarea ADN n esuturi s
- utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele celular i
plasmalema.
Astfel de metode se afl, actualmente, n diferite faze de experimentare.
De un interes deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu
necesit faze de cultur in vitro. O astfel de metod, cu potenial deosebit
este transformarea gruncioarelor de polen, dar deocamdat rezultatele
n acest domeniu sunt relativ modeste

Agent de selecie

Gena marker

Marker de selecie

kanamicin, neomicin
geneticin (GA18)

nptII (APH3II)

neomicinfosfotransferaza II

gentamicin

aacC3, aacC4

gentamicin-3-N-acetiltransferaza

higromicin

hph, hpt (APH4)

higromicin-fosfotransferaza

metotrexat

dhfr

dihidrofolatreductaza

spectinomicin
streptomicin

ADNr16S
aadA
SPT

bleomicin, fleomicin

ADNr 16S
aadA
ble

ARNr 16S
aminoglicozid-3-adeniltransferaza
streptomicinfosfotransferaza
ARNr 16S
aminoglicozid-3-adeniltransferaza

blasticidin

bsr

blasticidin S deaminaza

sulfonamid

sul

dihidropteratsintaza

fosfinotricin

bar

fosfinotricinacetiltransferaza

clorsulfuron

als, csr-1

acetolactatsintetaz

bromoxinil

bxn

bromoxinilnitrilaza

glifozat

EPSPS

5-enolpiruvil-3-fosfatsintetaza

2,4-D

tfdA

2,4-diclorfenoxiacetat monooxigenaza

atrazin

psbA

proteina QB

2,2-DCPA

dehalogenaza

4-metil-triptofan

tdc

triptofandecarboxilaza

nitrat

NR

nitratreductaza

S-amonoetil-L-cistein

DHPS

dihidropicolinatsintetaza

lizin/treonin

AK

aspartatchinaza

aminoetil-cistein

ocs

octopinsintetaza

Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizat gena nptII, sau neo, gen izolat din
transpozonul Tn5 de la Escherichia coli K12. Aceast gen codific
neomicinfosfotransferaza enzima implicat n detoxificarea unor antibiotice
aminoglucozidice cum ar fi: neomicina, kanamicina, paramomicina sau geneticina.
Numeroase specii de plante au fost transformate cu gena nptII, cum ar fi tutunul,
cartoful, Arabidopsis, porumbul, orezul, soia, bumbacul.
Pentru aceast gen ca ageni de selecie se utilizeaz cel mai mult kanamicina (50
100 mg/l) sau geneticina. Unele specii de plante, mai ales monocotiledonate s-au
dovedit insensibile la kanamicin, n acest caz geneticina dnd rezultate mai bune. De
asemenea, s-a observat c la unele specii kanamicina poate interfera cu procesele de
organogenez, afectnd eficiena regenerrii plantelor transformate.

Genele raportoare, nu confer celulelor rezisten fa de un

anumit compus. Ele codific proteine care pot fi detectate direct
sau catalizeaz reacii specifice ai cror produi pot fi detectai
prin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiul
factorilor de transcripie cis sau trans, n condiiile transformrii
tranziente sau permanente, precum i monitorizarea i
optimizarea tehnologiei de transformare.

gena gus (uidA) codific -glucuronidaza (GUS) i a fost izolat de la E.

coli K12; este gena raportoare cel mai mult utilizat la plante. Exist
pentru aceast hidrolaz compui substat pentru evidenierea prin metode
spectrofotometrice, fluorimetrice sau histochimice la nivelul esuturilor
rezultnd un compus de culoare albastr uor de evideniat. La pH-ul
utilizat pentru determinarea GUS nu exist activitate -glucuronidazic
detectabil n nici un esut vegetal. Toate metodele de determinare se
aplic ns, numai celulelor fixate, nonviabile.
gena raportoare luc pentru enzima luciferaz folosete un sistem substratenzim care produce bioluminescen. Gena luc a fost izolat de la o
specie de licurici din America de Nord, Photinus pyralis, fiind exprimat n
plante. Produsul genei, luciferaza poate fi extras din esuturi iar
activitatea ei poate fi determinat n prezena luciferinei. Dar, exist i o
metod de determinare non-letal i neinvaziv direct n esuturile i
organele plantelor transformate, pentru msurarea bioluminescenei fiind
necesar un luminometru.

gena gfp pentru proteina cu fluorescen verde (GFP) reprezint cea mai
nou gen raportoare i totodat cea mai spectaculoas i avantajoas.
Gena a fost izolat de la o meduz, Aequarea victoria, fiind transferat la
cteva specii de plante. GFP prezint o serie de avantaje i anume: nu
necesit un substrat, proteina se evideniaz n esuturi intacte in vitro i in
vivo, prin excitarea n UV, proteina poate fi fuzionat cu alte proteine
permind monitorizarea traficului proteic i a metabolismului.

gena cat izolat de la E. coli, codific enzima

cloramfenicolacetiltransferaza (CAT), fiind, de asemenea, mult utilizat ca
gen raportoare la plante. Determinarea sa este mai pretenioas
bazndu-se pe monitorizarea acetilrii cloramfenicolului prin marcarea cu
14C fie a acetil-CoA, fie a cloramfenicolului, produii fiind separai prin
cromatografie n strat subire (TLC) i msurai prin densitometrie sau prin
scintilaie. Uneori poate exista activitate CAT i n unele esuturi vegetale,
mai ales la Brassicaceae, ceea ce afecteaz eficiena acestui sistem.

Antocianii sunt pigmeni roii sau purpurii care se acumuleaz n vacuole

n unele esuturi ale plantelor. Sinteza de antociani este controlat de gene
structurale i reglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate i clonate.
Astfel de gene pot fi utilizate ca gene raportoare n esuturile i organele unor
genotipuri care conin gene structurale dar nu sintetizeaz antociani. Utilizarea
antocianilor ca markeri prezint o serie de avantaje: nu necesit un substrat,
se exprim doar n celulele viabile i metabolic active, sunt uor de
vizualizat. Cel mai mult s-au utilizat genele pentru factorii de transcripie R i
C1 de la porumb.

Genele care confer rezisten la streptomicin i/sau spectinomicin

au fost, de asemenea, utilizate ca gene raportoare prin efectul de etiolare pe
care l au, prin inactivarea cloroplastelor.

Pierderile cauzate de diferiti factori (% din productia

potentiala)

13
14

15

63

Productia realizata
Boli
Insecte
Buruieni

Ponderea diferitelor caractere obtinute prin

transgeneza in cadrul suprafetelor total cultivate
cu PMG (2002)
8
17
Toletanta la erbicide(TE)
Rezistenta la insecte(RI)
TE/RI
75

Ponderea diferitelor caractere obtinute prin

transgeneza in cadrul suprafetelor total cultivate
cu PMG (2014)

28

58
24

Toletanta la erbicide(TE)
Rezistenta la insecte(RI)
TE/RI

Cartof ce sintetizeaza fructan - Giessen

Cartof fara amiloza (Amflora)

BASF
2008 -155 ha