MATERIALES Y REACTIVOS

Portas y Cubres

Placas de petri estriles

Torundas

Bistur y pinzas de diseccin

Esptulas de siembra

Asas de siembra

Pipetas estriles y no estriles

Papel celo

Cinta adhesiva

Guantes

Laca de uas para sellar portas

REACTIVOS

Suero salino

KOH (Hidrxido potsico) Dimetil Sulfxido

Azul Algodn Lactofenol: colorante para el examen directo o para teir hongos de un medio de cultivo.

Tinta china

Alcohol de 70.

MEDIOS DE CULTIVO
Para el aislamiento primario de los hongos, se utilizan diversos medios de cultivo. Estos medios hay que seleccionarlos en funcin del
hongo que se sospeche y del tipo de muestra.
Los medios de cultivo se pueden utilizar en tubos cerrados con tapn de rosca o en placas de petri. La gran superficie de estas ltimas
facilita el aislamiento y la dilucin de sustancias inhibitorias en las muestras. Es importante que el medio no se deseque por lo que el
espesor de las mismas debe ser por lo menos de 25 mm, aproximadamente 35-40 mL de medio. Las placas se contaminan con facilidad
durante la incubacin por lo que es aconsejable sellarlas con cinta adhesiva. Los medios en tubo tienen la ventaja de que no se
deshidratan y se contaminan menos, pero en cambio tienen menos superficie.
Si la muestra es de una zona contaminada se deben incluir medios que contengan Cloranfenicol y Cicloheximida. El primero inhibe
los contaminantes bacterianos y el segundo inhibe el crecimiento de hongos saprofitos. Hay algunas especies patgenas que pueden
ser inhibidas por ambos, por esta razn es importante usar medios con y sin agentes inhibidores. Las muestras de zonas estriles
pueden inocularse en medios sin sustancias inhibitorias.
La temperatura de incubacin debe ser seleccionada teniendo en cuenta el tipo de hongo, en general, los medios deben incubarse a
25C y a 37C durante 4 semanas antes de considerarse como negativos. Si se emplean tubos con tapn de rosca deben estar flojos
para permitir la entrada de aire.
Medios ms utilizados

Agar Dextrosado de Saboureaud con Cicloheximida y Cloranfenicol: se utiliza para el aislamiento e identificacin de
dermatfitos y Cndidas.

Agar Dextrosado con Cloranfenicol sin Cicloheximida: se utiliza para el aislamiento e identificacin de patgenos ambientales
y oportunitas.

Agar de harina de maz (Corn Meal Agar):

Suplementado con Tween 80: para diferenciar distintas especies de Cndida y para realizar subcultivos ya que
estimula la esporulacin de hongos miceliales.

Suplementado con 10 gramos de Glucosa: para diferenciar Trichophyton

Agar de Urea: se utiliza para diferenciar entre levaduras e identificar diferentes especies de Trichophyton.

TCNICA DE SIEMBRA Y PROCESAMIENTO

El procesamiento debe ser inmediato. Muchas muestras se pueden sembrar inmediatamente tras su recogida.
Se debe sembrar la muestra en su totalidad. En caso de aspirado de abscesos, mdula sea, lquido cefalorraqudeo, etc, el volumen
deber ser de al menos 2 mL.
En el caso de que la muestra proceda de exudados vaginales: agitar la torunda en 0,5 mL de agua y sembrar, o bien sembrar con la
torunda directamente.
En el caso de lquidos corporales se debern tomar ms de 2 mL y si en los lquidos hay cogulos o material membranoso, ser
necesario fragmentarlos con el bistur y luego realizar la siembra.
Cuando la muestra son pelos y raspados: depositar directamente en el medio, presionando para que queden adheridos. En caso de
uas se pueden pulverizar o cortar en fragmentos.
Por ltimo, cuando se trata de cepillados bronquiales, hay que mezclar con agua destilada y sembrar el volumen total (ms de 1 mL).
Siembra con concentracin
Se realizan siempre que la muestra es lquida y se hace por centrifugacin a 1500-2000 r.p.m. durante 10 minutos. El sedimento se
utiliza para un examen directo o bien para cultivo.

En lquidos corporales: el volumen tiene que ser mayor de 2 mL. Se fragmenta y se centrfuga. Si las muestras son muy
densas, hay que diluirlas con agua destilada y centrifugar.

En orina: volumen superior a 2 mL

En LCR: centrifugar el LCR durante 10 minutos a 1500-2000 r.p.m. Retirar el sobrenadante con una pipeta estril y
resuspender el sedimento con el lquido que ha quedado. Sembrar.

Siembra con machacado u homogeneizacin

Se realiza en biopsias, muestras procedentes de tejidos y uas. Se realizan con el fin de aumentar la superficie de la muestra, para lo
cual cortamos en pequeos fragmentos que depositamos en una placa de petri estril que contiene una cantidad de agua destilada
estril.
En el caso de las biopsias, homogeneizar en un triturador de tejidos. Primero cortamos la muestra, la mezclamos con agua destilada,
trituramos y sembramos los medios con el homogeneizador y con pequeos fragmentos de tejido.
Incubar a 37C durante 3 semanas. Un error habitual es tirar los medios una vez que se ha conseguido el aislamiento de algn hongo,
ya que puede haber otros de crecimiento ms lento.
EXAMEN MICROSCPICO DIRECTO
Se realiza a partir de muestras obtenidas de lesiones. Es el mtodo ms simple y ms rpido para establecer un diagnstico presuntivo
de micosis, ya que no necesita de incubacin. Si la muestra no es abundante hay que dar prioridad al cultivo, frente al examen directo.
Preparacin de la muestra:

En el caso de tejidos: cortar, trocear, machacar, etc.

En el caso de lquidos: concentrar por centrifugacin.
En el caso de uas: trocear, repartir en fragmentos, etc.
Si son otras muestras como escamas, pelos, etc, no es necesaria una preparacin previa, sino que se hace directamente el examen.
TCNICAS Y TINCIONES PARA EL EXAMEN DIRECTO
Examen Directo con Solucin Salina
Colocamos una gota de la muestra lquida en un porta y aadimos una gota de solucin salina. Ponemos el cubre y observamos al
microscopio con poca luz y variando el aumento.
Los hongos se observan refrctiles o brillantes, ligeramente verdosos. En el caso de las levaduras pueden aparecer inclusiones.
Tambin se pueden observar burbujas de diferentes tamaos. No debemos confundir las levaduras con hemates y con burbujas de aire.
Se diferencian porque las levaduras presentan pequeas inclusiones en la clula y las burbujas van a ser siempre de diferentes
tamaos.
Hidrxido Potsico con Dimetil Sulfxido
No es necesario calentar la preparacin, de esta forma no aparecen precipitados. Las muestras de pelos, escamas y biopsias se
observan con poca luz.
Es importante no confundir artefactos como fibras de tejidos, granos de polen, etc, con hongos. Otra causa de error es lo que se
denomina hongos en mosaico, que suele aparecer cuando las muestras estn muy queratinizadas. Suelen ser acmulos lipdicos que
desaparecen cuando se calienta la preparacin.
Colocamos la muestra en pequeas porciones sobre un porta y aadimos varias gotas de KOH + Dimetil y ponemos el cubre.
Observamos los elementos fngicos (hifas, levaduras, etc).
Si la muestra observada son uas muy queratinizadas, el tiempo que acta del KOH es de varias horas. Es conveniente dejar el porta
en una cmara con ambiente hmedo (placa de petri con un algodn empapado en agua dentro).
Azul Algodn de Lactofenol
Se realizan las preparaciones a partir de cultivos. El fenol destruye la flora acompaante y organismos; el cido lctico conserva las
estructuras fngicas y el azul algodn tie la quitina de las paredes fngicas.
Aadimos una gota de la muestra o una porcin del hongo en un porta. Sobre ella colocamos una gota de azul algodn y ponemos el
cubre. Observamos al microscopio.
Blanco de Calcofluor
Se realiza un examen directo sea cual sea la muestra. Es til en cortes de tejidos.
Colocamos en un porta la muestra + 1 gota de KOH dimetil sulfxido + 1gota de calcofluor. Mezclamos y ponemos el cubre. Despus de
varios se ha producido la clarificacin, y se observa en un microscopio de fluorescencia (verde brillante o blanco azulado). Las fibras
elsticas y colgeno se observan con fluorescencia amarillo verdosa. Estas se pueden confundir con hongos y levaduras y se
diferencian en la fluorescencia.
Hay algunos hongos (hongos dematiaceos) que producen enfermedades como micetomas que se tien con gran dificultad usando el
blanco de calcofluor.
Colorante de Cobre ( tinta parker-KOH)
Para el diagnstico de Malassecia furfur se tien intensamente de color azul. La tinta china se utiliza en muestras de LCR y exudados.
La usamos siempre que busquemos Criptococcus neoformans.
La tcnica consiste en aadir 1gota de tinta china junto con 3 gotas de la muestra, dejar reposar, apareciendo un color marrn (la
cpsula se rodea con un halo blanco).
Tincin de Gram

Se realiza para la identificacin de hongos. Suelen ser Gram+ y la nica consideracin a tener en cuenta es que el cristal violeta hay que
mantenerlo por ms tiempo.
Otras tcnicas histolgicas o tinciones: Plata Metalamina; Hematoxilina; Tincin Wright.
EXAMEN DIRECTO Y CULTIVO
Las muestras a partir de las cuales se realizan son:

Exudados ticos

Secreciones respiratorias

Biopsias

Cepillados esofgicos

Escamas

Pelos y uas

NO EXAMEN DIRECTO PERO S CULTIVO

Exudado balanoprepuciales

Exudado bucal-lingual

IDENTIFICACIN DE HONGOS MICELIALES

La identificacin se hace en base a su morfologa, que puede ser macroscpica y microscpica y que vara en funcin del medio de
cultivo, tiempo y temperatura de incubacin.
La velocidad de crecimiento vara segn el hongo:
Hongos miceliales:
No dermatfilos ! crecen rpido 3-5 das
Dermatfilos ! 1-3 semanas
CARACTERSTICAS MACROSCPICAS

Textura de la colonia (mirar fotocopia 1):

o

Algodonosa: micelio denso y largo

Glabra: consistencia crea. No micelio areo

Aterciopelada: micelio areo corto

Pulverulenta: gran cantidad de esporas y conidias

Coloracin

CARACTERSTICAS MICROSCPICAS
TCNICA CON PAPEL DE CELO CON AZUL

Cogemos un trozo de celo tocamos suavemente la parte superior del hongo del que queremos observar sus caractersticas
microscpicas y lo colocamos sobre un porta al que anteriormente habamos aadido una gota de colorante azul algodn de lactofenol.
Observamos al microscopio con el objetivo de 40x o 100x.
CULTIVO O MICROCULTIVO EN PORTA
No se alteran las estructuras fngicas. Se utiliza un medio Saboraud que se vierte sobre una placa de petri (capa delgada). Una vez
solidificado cortamos cuadrados con un bistur estril de 1-3 cm y los colocamos en un porta estril o flameado. El porta estar colocado
en una placa de petri estril, sobre un soporte. En el fondo de la placa aadiremos unas gotas de agua para evitar la desecacin durante
la incubacin.
Inoculamos o bien las esquinas, o bien los bordes del agar con el hongo a estudiar. Tomamos la muestra con un asa estril humedecida
con agua. Sellamos las placas con parafilm y llevamos a incubar.
EXAMEN DE FRAGMENTOS DE COLONIAS AL MICROSCOPIO
Mediante esta tcnica se rompen los conidios y las esporas. Consiste en cortar con el asa un fragmento de la colonia en el borde (asa
en forma de cua) y depositarlo sobre un porta con una gota de azul de lactofenol. Si se ha incluido agar, calentar suavemente para
fundirlo y aplastar el cubre.
TCNICA PARA CONFIRMAR EL DIMORFISMO
Consiste en incubar la misma muestra a 25C, temperatura a la que crecen los hongos miceliales, y a 37C temperatura a la que crecen
las levaduras (tejidos o medios especiales).
Las especies ms importantes dimrficas son: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Paracoccidioides brasiliensis,
Coccidiodes imitis. Penicillium marneffei, Slorothrix schenckii.
Para la confirmacin es necesario convertir la fase filamentosa en levaduriforme. Para ello incubamos parte de la colonia micelial en una
placa de Agar Sangre (3-4 fragmentos). Sellamos e incubamos a 37C. Examinamos peridicamente el crecimiento buscando levaduras.
Si crece colonia micelial repetimos la siembra hasta conseguir fase levaduriforme.
MEDIOS DIFERENCIALES

Resistencia a Cicloheximida Actidiona:

o

Dermatofitos y hongos dimrficos ! resistentes a 30C

Zigomicetos, algunas levaduras, mayora de agentes micetomas! inhibidos

Agar Maz (patata, arroz): permite la esporulacin de hongos

Desdoblamiento de urea: permite identificar especies de Trichophyton incubando a 25C / 7 das.

IDENTIFICACIN DE LEVADURAS
Test de filamentacin
Preparamos una suspensin de levaduras en 0.5-1 mL de suero de conejo e incubamos a 35-37C no ms de 3 horas.
Transcurrido el tiempo observamos al microscopio la presencia o ausencia de tubos germinales, es decir, de filamentos que no
constrien su punto de origen en la levadura.
El test ser POSITIVO si se observan los tubos germinales (C. albicans)
El test ser NEGATIVO cuando no encontremos los tubos germinales ((otras especies de Cndida).
Medio diferenciador para levaduras
Posee cromgenos que colorean las colonias segn la especie. En el caso de la Cndida albicans, las colonias son de color azul.
Asimilacin de azcares (API)

Tcnicas inmunolgicas y moleculares

Se utilizan para el estudio de hongos que producen micosis invasivas. Detectan Ag del Criptococo (hongo que produce una cpsula con
el Ag en su interior) en LCR o suero del paciente.
ESTRUCTURAS REPRODUCTORAS
ESQUEMA (Fotocopias)
Los hongos pueden propagarse en la naturaleza de dos formas:

Sin clulas especializadas ! elementos propagadores de rendimiento bajo ! Clamidiosporas (*)

Con clulas especializadas

o

Elementos de propagacin Asexual

Zygomycota

Ascomycota

Basidiomycota

Deuteriomycota (HONGOS IMPERFECTOS)

Elementos de reproduccin Sexual

Zygomycota

Ascomycota (HONGOS PERFECTOS)

Basidiomycota

ELEMENTOS DE PROPAGACIN ASEXUAL (Fotocopias)

Forma Interna: Esporas o Endoesporas, que pueden ser:

Mviles

Inmviles: Esporangioforo (hifa especializada) ! Apfisis ! Esporangio !

Esporangiosporas.(*)

Forma externa: Conidias, que pueden ser:

Conidias Tlicas: se forman por segmentacin o diferenciacin de hifas preexistentes.

o

Artroconidias (*)

Aleuroconidias (*)

Conidias Blsticas: se forman por gemacin a partir de las hifas o de las clulas conidigenas especializadas. Segn el
origen de la pared de la conidia se clasifican en:

Holoblsticas: toda la pared de la hifa o de la clula coridigena participa en la formacin de la conidia.

o

Blastoconidias (*)

Simpodioconidias (Conidiosporas)

Aneloconidias (Conidiosporas)

Enteroblsticas: slo participa la pared interna de la hifa o de la clula coridigena.

Poroconidias (*)

Fialoconidias (*)

Otra forma de estructurar la clasificacin de la Reproduccin Asexual

Gemacin; Esporulacin-Germinacin; Fragmentacin
Esporulacin-Germinacin:

Talosporas
o

Artrosporas

Blastosporas

Clamidiosporas

Formas especializadas

Esporangios

Conidiosporas

Terminologa til
Coridio: polvo
Aleurio: harina de trigo
Artro: articulacin
Blastos: yema
Clamidio: manto
Esporangio: vaso
(*) Son los de mayor importancia para nosotros
REPRODUCCIN SEXUAL . CRITERIO DE AGRUPACIN PARA HONGOS
ZIGOSPORA: Clula grande y rodeada de una gruesa pared. Se produce por la fusin de dos clulas morfolgicamente semejantes
(mirar dibujo en fotocopia).
ASCOSPORAS: Se forman por la fusin nuclear de dos clulas morfolgicamente similares o distintas. Estas esporas se forman dentro
de una estructura en forma de saco llamada Asca (mirar dibujo en fotocopia).
BASIDIOSPORA: Se forman externamente sobre una base llamada basidio.
CLNICA
Agrupamos los hongos, en funcin de la situacin preferente de las lesiones producidas por ellos, en los siguientes grupos:
HONGOS PRODUCTORES DE MICOSIS SUPERFICIALES

DERMATOFITOS: Son hongos filamentosos, septados, con afinidad por la queratina, resistentes a la cicloheximida o actidiona.
En base a las caractersticas morfolgicas en cuanto a la reproduccin asexual se clasifican en tres gneros:

Microsporum

Trichophyton

Epidermophyton

Microsporum
Presenta abundantes macroconidias con pared gruesa y rugosa con septos transversales en nmero que oscila de 3 a 15. Su aspecto
suele ser fusiforme. Las microconidias son escasas o incluso ausentes, tienen forma piriforme.
Desde el punto de vista clnico, microsporum se puede encontrar infectando la piel, el cabello y excepcionalmente las uas.
El principal representante de este grupo es el Microsporum canis, que en un medio de cultivo presenta colonias planas, con un micelio
cereo corto, de color amarillento en la periferia y blanquecino en el centro. El reverso que es inicialmente amarillo, pasa posteriormente
anaranjado.
Trichophyton
Presenta unas macroconidias de pared delgada y lisa que se observa de forma individual o en racimos que presenta forma de maza con
un nmero de septos que depende de la longitud de la conidia.
Las microconidias son muy numerosas con forma esfrica, oval o periforme y aparecen formando racimos a lo largo de las hifas.
Las especies del gnero Trichophyton pueden infectar la piel, el pelo y las uas.
El principal representante de este grupo es el Trichophyton mentagrophytes que crece dando colonias planas, con el centro ligeramente
elevado, de superficie pulverulenta o algodonosa.
Epidermophyton
No presenta nunca microconidias. Desarrolla abundantes macroconidias con pared y septos delgados, completamente lisas, en forma
de mazas y dispuestas en racimos. No suelen presentar ms de 4 septos. Se encuentran infectando la piel, en ocasiones las uas y
nunca el pelo.
El principal representante de este gnero es Epidermophyton floccosum que presenta colonias de aspecto pulverulento o aterciopelado
de color amarillo-verdoso o de color marrn. El reverso es tambin de color amarillo-marrn.
Caractersticas morfolgicas de los dermatofitos
Microscpicamente observamos un micelio con hifas tabicadas, abundantes y ramificadas. Entre ellas aparecen hifas que generan
elementos de propagacin asexual y que pueden ser:

Macroconidias: clulas pluricelulares, grandes, en forma de huso o maza. Presentan septos transversales y paredes que
pueden ser finas o gruesas y lisas o rugosas.

Microconidias: unicelulares, pequeas, redondas, ovales o piriformes.

Manifestaciones clnicas de los dermatofitos

o

Tias: afectan al cuero cabelludo ! Trichophyton - Microsporum

Tonsunantes

Fvicas

Inflamatorias

Epidermofitias:

Herpes circinado

Lesiones de grandes pliegues

Lesiones interdigitoplantares y palmares ! T. Mentagrophytes y T. Rubrum (pie de atleta)

Foliculitis y perifoliculitis ! T. rubrum

o

Onixis inflamatorias: infecciones de las uas.

Epidemiologa de los dermatofitos: agrupamos los dermatofitos en funcin de las diferentes adaptaciones parasitarias en:

Geoflicas: se adquieren por contacto con el suelo o manipulacin de tierra.

Zooflicas: contacto con animales parasitados (Conejos: T. Mentagrophytes; perros-gatos: M. canis

Antropoflicos: contacto directo entre humanos y fmites, etc.

HONGOS PRODUCTORES DE MICOSIS SUBCUTNEAS

o

Cromomicosis o Cromoblastomicosis ! Phialophora verrucosa / fonsecae

Producidas por un grupo de hongos que se denominan dermatiaceos (pigmentados negros). El hongo penetra en el tejido subcutneo,
generalmente por un traumatismo y queda localizado en el lugar de la lesin en los tejidos cutneos y subcutneos. La respuesta del
husped se caracteriza por la aparicin de ndulos verrucosos que sobresalen entre 1 -3 cm sobre la piel.
o

Esporotricosis ! Sporothrix schenckii

Suele ser una lesin crnica que se caracteriza por el desarrollo de ndulos en los tejidos cutneos y subcutneos que llegan a
ulcerarse y producir supuracin, acompandose de una afectacin de los ganglios linfticos de la zona. El hongo penetra generalmente
por traumatismos subcutneos con rboles y plantas, aunque tambin se puede producir la infeccin por mordedura de animales,
picaduras de insectos, etc.
o

Micetomas ! Actinomicetales / hongos

Se caracterizan por la aparicin de tumoraciones mltiples y deformantes en las que se produce una fistulizacin por las que drena un
lquido que contiene el hongo infectante.
HONGOS PRODUCTORES DE MICOSIS SISTMICAS
Son infecciones fngicas de tejidos profundos del cuerpo que pueden afectar a distintos rganos. Suelen estar causadas por hongos
saprofitos que viven en el suelo y cuya transmisin se produce por inhalacin. Suelen comenzar de forma caracterstica en los pulmones
desde donde se extienden a otros tejidos. Por regla general no suele producirse el contagio del animal al hombre.
Micosis primarias: afectan a individuos inmunocompetentes

Histoplasmosis ! Histoplasma capsulatum

Es un hongo dimrfico, es decir, que se puede encontrar como parsito en estado levaduriforme (30-37C) o como saprofito en estado
filamentoso o micelial (25C). Se localiza primariamente en los pulmones y puede producir lesiones en diferentes rganos del cuerpo.
La sintomatologa es poco clara y se desarrolla de forma subclnica. Esta micosis se contrae por inhalacin de las conidias transportadas
por el aire, las cuales se han formado bajo condiciones particulares de humedad y pH. Estas condiciones suelen producirse cuando se
acumulan excrementos de aves que por su alto contenido en nitrgeno favorecen el desarrollo del hongo.

Blastomicosis ! Blastomyces dermatitidis

Se trata de un hongo dimrfico (igual que el anterior). La infeccin comienza en los pulmones y se disemina a otros rganos.
Frecuentemente aparecen lceras cutneas con formacin de abscesos y destruccin de tejidos. El m.o puede aislarse del pus y de las
biopsias de tejidos.

Coccidiodormicosis ! Coccidiodes inmitis

Se trata de un hongo dimrfico. Se produce por inhalacin de las conidias transportadas por el viento. Da lugar a una infeccin
respiratoria y se manifiesta con dolor torcico y a veces fiebre, aunque la mayora de las veces inaparentes
Micosis secundarias: afectan a individuos inmunodeprimidos (oportunistas)

Candidiasis ! Cndida albicans, C. tropicalis, parasilopsis

Criptococosis ! Criptococcus neoformans (levaduriforme)

Lo caracterstico de Criptococcus es la presencia de una cpsula que se observa mediante una tincin con tinta china. Se desarrolla
bien en los medios de cultivo habituales. Es caracterstica la infeccin pulmonar, que a menudo es asintomtica.
Formas filamentosas:

Aspergilosis ! Aaspergillus fumigatus, A. Nger, A. Flavus

El mecanismo de transmisin es por inhalacin de las conidias. Puede producir 3 cuadros:

Aspergilosis pulmonar alrgica: asma, aumento de las IgE, eosinofilia

Aspergiloma: crece en una cavidad preexistente (como tuberculosas)

Aspergilosis invasiva: pulmn y diseminacin secundaria.

Zigomicosis o mucormicosis ! gneros Rhizopus y Mucor

Se caracterizan porque producen infecciones muy graves en las cuales el hongo invade paredes arteriales produciendo embolias y
necrosis tisular.
CANDIDIASIS - CANDIDOSIS - CNDIDA
Las candidiasis son las infecciones agudas o crnicas, superficiales o profundas, causadas por levaduras del gnero Cndida.
Son clulas redondeadas u ovaladas que aparecen de forma individual o asociadas formando pseudomicelios. Son Gram+ y su
metabolismo es principalmente aerobio. Forman parte de la flora saprofita mucocutnea existiendo un equilibrio entre su virulencia y los
mecanismos de defensa del husped. Cndida albicans se encuentra habitualmente formando parte de la flora gastrointestinal y bucal
y tambin como parte de la flora vaginal.
Manifestaciones Clnicas

Candidiasis Cutneas:
o

Intertrigo. Axilas, pliegue interglteo, surco submamario, etc.

Oniquia y paroniquia: uas y lecho ungueal

Candidiasis de las mucosas:

Candidiasis oral: muget bucal ! recin nacidos cuando hay un descenso del pH y la flora habitual normal an no es
completa.

Candidiasis genitourinarias:

Vaginitis: eritema, prurito, leucorrea.

Balanitis: afectacin del glande y del surco balanoprepucial.

Candidiasis gastrointestinal: muy infrecuente

Candidiasis sistmicas: invasin de tejidos (localizacin renal, SNC, pulmonar, endocarditis, afectacin cardiaca, etc.)

ACTINOMICETOS
Son bacterias Gram+ que se asemejan a los mycobacterias. En la observacin al microscopio se presentan con morfologa variable, que
puede ser cocobacilar o filamentosa. El aspecto macroscpico de las colonias puede ser similar al de una bacteria o presentar hifas
areas recordando la morfologa de los hongos filamentosos. Se encuentran principalmente en suelos, plantas y vegetales, aunque
tambin se pueden aislar de la piel, orofaringe, y tracto gastrointestinal del hombre y de los animales. El hombre puede infectarse por
este tipo de bacterias por inhalacin o por contacto directo con una herida o traumatismo abierto.
ESPECIES DE IMPORTANCIA CLNICA
Gneros: Nocardia, Nocardiopsis, Streptomyces, Actinomadura, Rhodococcus.
N. asteroides, N. brasiliensis: mayor parte de las infecciones sistmicas
N. brasiliensis, Streptomyces somaliensis, Actinomadura madurae: micetoma
Rhodococcus: infecciones de heridas abiertas, abscesos, infecciones pulmonares, osteomielitis.
IDENTIFICACIN
Nocardia y Rhodococcus tienen tendencia a fraccionarse y aparecen al microscopio con morfologa cocobacilar.
Actinomadura y Streptomyces se presentan como masas filamentosas.
No hay un medio especfico para el aislamiento de estos microorganismos. Se puede emplear cualquier medio general como el
Saboraud con o sin antibiticos, Agar Sangre, etc.
Las especies de Nocardia sobreviven a menudo a los procesos de descontaminacin de mycobacterias, por lo que pueden crecer en
dichos medios.
Las placas para el aislamiento de Actinomices se incuban a 30C.
Los gneros Streptomyces y Nocardia se desarrollan en un tiempo que oscila entre 2 - 10 das, y las especies de Actinomadura pueden
tardar en desarrollarse hasta 3 semanas.
PRUEBAS BIOQUMICAS

PATOLOGA

Hidrlisis de Aminocidos: Casena, Tirosina y Lisina. Se utilizan medios slidos que contengan los aminocidos.
Alrededor de la colonia parece una zona clara.

Resistencia de la enzima Lisozima: los microorganismos resistentes no se lisan cuando se ponen en contacto
con ella. Esto les sucede a las especies que poseen la caracterstica de AAR (Nocardia y Rhodococcus).

Produccin de Ureasa

Licuefaccin de la Gelatina

Reduccin de Nitratos

Degradacin de Etilenglicol

Actividad - galactosidasa

La infeccin producida por este tipo de bacterias depende en gran medida del estado inmunolgico del husped. En individuos
inmunocompetentes son frecuentes los procesos alrgicos y el micetoma. En personas inmunodeprimidas es ms frecuente que se
produzcan infecciones pulmonares y sistmicas.

Enfermedad respiratoria alrgica: producida como una reaccin de hipersensibilidad frente a Ag de los Actynomicetos.

Nocardiosis cutnea

Micetoma

Aislamiento
Los gneros que se encuentra con relativa frecuencia en la naturaleza, por ejemplo sobre
los frutos en putrefaccin, semillas, forrajes, cueros, maderas, etc. Tambin se lo
encuentra normalmente en el suelo. Para aislarlo se tiene en cuenta su estado natural,
procediendo luego de acuerdo con las tcnicas siguientes:
Por dilucin en agar: Una serie de 4 a 6 tubos de cultivo, cada uno de los cuales contiene 10 ml de
un medio de agar adecuado (Medio de Czapeck, medio de Sabouraud, medio de malta), se calienta
en bao de agua para fundir el agar. Enfriar el contenido de los tubos a 45 C; se aade a cada uno de
ellos una pequea cantidad del material que contiene el moho agitando cuidadosamente, se lleva una
pequea porcin a un segundo tubo y el resto se vierte aspticamente en una placa de Petri; se agita
el segundo tubo y se separa una pequea porcin para el tercero, vertiendo el resto en la placa de
Petri. Se contina del mismo modo hasta obtener 4 o 6 muestras, y como el cultivo se va diluyendo
de una a otra, en alguna de ellas habr ya un cultivo puro.
Por separacin de esporas de una colonia. Una vez seleccionada una colonia que se presume pura,
se recogen de la misma unas cuantas esporas mediante una aguja esterilizada, llevndolas a un tubo
que contiene un medio favorable para el crecimiento. La operacin se efecta con ayuda de una lupa
o bien con el microscopio.
Mediante el micromanipulador: El micromanipulador ms conocido es el de Peterfi, construdo
por la Zeiss; es de tipo mecnico ya que las agujas, pipetas, ansas y escalpelo se mueven por juegos
de tornillos en todas direcciones. Consta de una camarita en la cual se coloca una gota del material a
aislar; se observa a travs del miscroscopio. Mediante los dispositivos laterales del
micromanipulador se mueven en todo sentido dos microagujas o dos micropipetas que permiten
recoger o aspirar un solo microrganismo de la suspensin.
Por germinacin de una sola espora: Se hace una dilucin de esporas en agua estril o salina hasta
que cada gota contenga solo una espora, lo que puede comprobarse con auxilio del microscopio. Se
ponen entonces varias gotas sobre la superficie de agar, marcando su posicin para poder localizar el
cultivo correcto en el caso de existencia de algn contaminante.
Por modificacin del mtodo de una sola espora de Keitt: Esta modificacin se debe a Ezekial
(1930). Con ayuda de una aguja de extremo plano cargada con el material que contiene las esporas,
se hacen varios trazos paralelos sobre la superficie de un medio agarizado convenientemente, se
invierte entonces la placa incubndola durante 16-24 hs. y observndola a travs del fondo con el

microscopio (objetivo de 16 mm). Una vez descubiertas las esporas, se marca con tinta su posicin.
Por medio de una aguja de punta cilndrica (que obra como sacabocado) se corta el cilindro de
agar que contiene el esporo. Este cilindro se siembra en una caja de Petri y se observa para estar
seguro de que existe un solo elemento, y luego de desarrollado se resiembra en un tubo con medio de
cultivo apropiado. Se incuba y aparecer la colonia de desarrollo monocitogentico.
Mtodo de Hansen: En este mtodo (Hansen 1926) se prepara una suspensin de esporas en agar,
que se aspira en tubos capilares de dimetro no mucho mayor que el de las esporas. Los tubos
capilares se observan al microscopio y cuando se descubre una espora aislada se rompe el tubo de
manera que el segmento contenga solo una espora. El cristal se trata con alcohol y luego se coloca en
un medio fresco. La espora se desarrolla dando lugar a una colonia. Este mtodo resulta eficaz con
esporas grandes y coloreadas, en cambio no lo es con esporas pequeas.

Identificacin preliminar de cultivos de hongos

Para la identificacin de un moho se precisa una descripcin completa del organismo. Para
estudiar sus caractersticas, se prefiere el medio de Czapeck que es un medio satisfactorio
y da muy buenos resultados con fines comparativos.
El examen de los cultivos debe hacerse diariamente, por lo menos durante la primera y
segunda semana de incubacin. Las observaciones macroscpicas deben realizarce con
la ayuda de una lupa. En general es posible determinar, por el examen visual, si una
colonia de hongos es filamentosa o levaduriforme. Las colonias de hongos filamentosos
tienen un aspecto velloso o acordonado, mientras que las levaduras producen colonias
mantecosas con superficies lisas.
Las colonias individuales desarrolladas en el medio Czapeck, se pueden estudiar a simple
vista, con la lupa y al microscopio con poco aumento. Podemos as deducir lo siguiente:
velocidad y forma de crecimiento, tamao y color de los cuerpos fructferos e hifas;
elevacin y densidad de las distintas partes de la colonia, presencia o ausencia de
peritecios, variaciones en la forma y tamao de los ncleos de mohos. Debe observarse la
consistencia de la superficie de la colonia, el plegamiento, la nitidez del borde y la
presencia de pigmentos en la superficie o el reverso o su difusin hacia el medio
circundante
Invirtiendo la placa de Petri puede observarse el color del fondo de la colonia, as como
cualquier coloracin producida en el medio.
Estas observaciones son suficientes para indicar la clase u orden a que pertenece el
hongo, pero para identificar el gnero y la especie es preciso el estudio al microscopio.
Con las esporas se efectan las observaciones siguientes: forma, tamao, color,
caractersticas y colocacin. En las hifas frtiles se examinan: ramas, tabiques, anchura,
color, caractersticas y naturaleza de las paredes (lisas, picadas o rugosas).
A partir de las observaciones as adquiridas y complementadas con las tcnicas de
coloraciones conocidas, puede intentarse la identificacin del moho conociendo la

descripcin de los gneros.

Medios para hongos

Existe una gran cantidad de medios de cultivos para la propagacin y estudio de hongos,
pero la mayora han sido diseados con alguna finalidad especial, tales como la seguridad
de un crecimiento ptimo o para determinar la necesidad de una sustancia especfica para
un moho determinado.
Los medios para Micologa difieren en varios aspectos de aquellos que se usan en
Bacteriologa. Estos ltimos por lo general son levemente alcalino, mientras que la mayora
de los hongos prefieren un medio cido e incluso muchas especies toleran una acidez
relativamente alta. Los medios de bacteriologa normalmente contienen protenas como
fuente tanto de carbono como de nitrgeno. En cambio para hongos, se usa hidratos de
carbono como fuente de energa, y el nitrgeno se suministra como sales inorgnicas, sea
como nitrato o como sales de amonio.
Los elementos qumicos esenciales para el cultivo de hongos son: C, H, O, S, N, P, K, Mg,
Fe, etc. Tambin son necesarias cantidades mnimas de otros elementos para el
crecimiento de ciertos hongos. La mayora de los medios naturales y de los medios
sintticos preparados con drogas de calidad tcnica, normalmente contienen suficiente
cantidad de los llamados "elementos trazas", pero a veces es necesario agregarlos
deliberadamente cuando se preparan con drogas de calidad analtica.
Muchos vegetales y extractos vegetales son especialmente adecuados como medios de
cultivos sin ningn agregado, o slo con el agregado de azcar y en algunos casos son
tiles para el aislamiento y conservacin de mohos. En algunos tipos de trabajo, tales
como estudios nutricionales o investigaciones bioqumicas, se usa casi exclusivamente
medios sintticos, ya que es necesario conocer la composicin, para poder repetir la
frmula en caso necesario.
El tipo de crecimiento para una especie determinada vara segn el medio de cultivo
utilizado y en consecuencia, es de gran importancia cuando se describe una especie,
registrar las observaciones hechas sobre medios preparados en forma idntica a la de
otros autores.
Los medios de cultivos pueden ser slidos o lquidos. El medio slido puede ser en dos
sentidos, ya sea aquellos medios slidos, normalmente porciones de races, tallos o
semillas o bien medios solidificados con el agregado de gelatina o agar.
Medio de Sabouraud-miel
Principalmente para levaduras y mucorales. Se compone de:

Peptona

20 gr.

Miel de abejas

80 gr.

Agar-Agar

20 gr.

Agua corriente

1000 ml

Modo operativo:
Colocar todos los componentes en un erlenmeyer de 2 litros, dejar reposar unos 10
minutos para que el agar se embeba en agua, llevar a pH 6,5 con cido sulfrico, colocar
primero el erlenmeyer en bao mara o en el microonda hasta que se consiga fundir el
agar, fraccionar en tubos, esterilizar en autoclave 20 minutos a 1 atm., inclinar los tubos y
dejar solidificar en pico de flauta, conservarlos en heladera hasta su uso, aunque es ms
recomendable tenerlos en el laboratorio a temperatura ambiente ya que en la heladera el
medio de cultivo se deseca ms rpidamente. A veces es conveniente, filtrar por algodn
antes de fraccionar.
Medio de Sabouraud-miel lquido
Se prepara igual al anterior, con la diferencia que no se agrega agar ni se inclinan los
tubos al final.
Medio de Czapek Se compone de:

Sacarosa

30 gr.

Nitrato de sodio

3 gr.

Fosfato de potasio

1 gr.

Cloruro de potasio

0,5 gr.

Sulfato de magnesio

0,5 gr.

Sulfato ferroso

0,01 gr.

Agar-Agar

15 gr.

agua corriente

1000 ml

Modo operativo:
Disolver las sales y la sacarosa en el agua, agregar el agar y dejar reposar unos 10
minutos para que el agar se embeba, llevar al microonda para fundir el agar, continuar el
proceso igual para preparar el medio de Sabouraud-miel slido, (al igual que en dicho
medio, hay que ajustar el pH a 6,5) . Algunos autores recomiendan agregar la sacarosa
despus que se hayan disuelto los dems componentes y fundido el agar, en el momento
previo a la filtracin, agitando bien.
Medio de zanahoria cida
Cortar trozos de zanahorias en forma de cua, de un largo de unos 6 a 8 cm. (con un
sacabocados se sacan los cilindros y luego con un cuchillo se les da la forma de cua), se
sumergen los trozos en una solucin acuosa de cido lctico al 3% hasta que estn bien
embebidos. Luego se los coloca en tubos de Roux, un trozo en cada tubo, la zanahoria
descansa en la estrangulacin, y en la ampolla inferior se coloca la solucin de cido
lctico haciendo que cubra la parte inferior de la zanahoria. Si no se dispone de tubos de
Roux, se coloca el trozo de zanahoria en un tubo de ensayo comn al que se le agrega la
solucin de cido lctico hasta una cuarta parte de la altura del trozo para evitar su
desecacin, taponar con algodn y esterilizar 20 minutos a 1 atm. La siembre de la
levadura se efecta en la parte superior del trozo.
De la misma se puede preparar este medio con papa en lugar de zanahoria para ser
utilizada por hongos filamentosos.
Medio de Papas Dextrosa Agar (PDA)
Agregar a 1 litro de agua corriente, 100 gr. de papa rallada y dejar macerar 30 minutos,
hervir durante 30 minutos y filtrar por Buchner o por algodn, 1,5% de agar, disolver el
agar en micoonda y agregar 2% de glcosa (dextrosa), repartir en tubos y esterilizar 20
minutos a 1 atm.

INCUBACIN
Generalmente se incuban a temperatura ambiente o a 30C; algunos hongos pueden

requerir temperaturas de 35-37C, sobre todos en los dimrficos para demostrar su

capacidad levaduriforme. Se puede utilizar un recipiente con agua en la estufa, para
mantener una elevada humedad ambiente.

Preparados para el estudio microscpico de los hongos

Pueden usarse diversos mtodos para el examen microscpico de hongos

MTODO DE MONTAJE CON HOK

El hidroxido de potasio se utiliza para muestras como piel, raspado de uas y pelos
infectados o muestras de esputos.
Se coloca una gota de HOK al 10% que contiene glicerina en un portaobjeto y se mezcla
con una pequea cantidad de material a examinar (piel, pelo, escamas, etc..). Se pasa
suavemente el portaobjeto a travs de la llama baja de un mechero Bunsen para facilitar
el aclaramiento (no hervir). Se coloca un cubreobjeto sobre la gota y se deja reposar a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Se examina en el micrscopio buscando las
hifas micticas.

MTODO DE MONTAJE HMEDO

El procedimiento se lleva a cabo con el ansa de gancho o con una aguja montada sobre un
trozo de varilla, se procede tomando una pequea porcin de la colonia a estudiar (a veces
es necesario ayudarse con otra ansa). La muestra debe tomarse de un sitio intermedio
entre el centro y la periferia de la colonia. Este pequeo fragmento de colonia se transfiere
a una gota de lactofenol azul de algodn en un portaobjeto y se cubre con un cubreobjeto.
Se presiona suavemente directamente sobre el fragmento de la colonia para deprimir las
hifas y otras estructuras y permitir un mejor examen microscpico.

MTODO DE MONTAJE CON CINTA ADHESIVA

Se aconseja usar cinta adhesiva de alta transparencia. Se hace un doblez de una tira de 4
cm, con el lado adhesivo hacia afuera , y se sostiene entre los dedos pulgar e ndice. El
lado adhesivo se presiona firmemente contra la superficie de la colonia del hongo. El
micelio areo se adhiere a la superficie y puede separarse del resto.
Las tiras de cinta inoculadas se colocan en una gotita de lactofenol-azul de algodn en un
portaobjeto.

MTODO DE MICROCULTIVO
El preparado de microcultivo (tambin conocido como cultivo en portaobjeto) se realiza de
la siguiente manera:

En la superficie de una caja de petris se coloca un pedazo de papel de filtro o un trozo de algodon y

dos varillas de vidrio, cortadas de un tamao adecuado. Se coloca un portaobjeto sobre las varillas y
se esteriliza.
Se corta un pequeo bloque de agar papas o similar previamente vertido en una caja de Petris hasta
una profundidad de 4 mm. Esto puede hacerse usando una hoja de bistur estril o un tubo de ensayo
recto estril sin bordes.
Con el mismo bistur estril se coloca el bloque de agar sobre la superficie del portaobjeto.
Con un ansa aguja estril se remueven porciones pequeas de colonia de hongos que se desea
estudiar y se inocula en los cuatros cuadrantes del bloque de agar.
Luego de la inoculacin, se coloca un cubreobjeto estril sobre la superficie del agar.
Se controla que el papel o el trozo de algodn esten hmedo y se incuba.
La colonia crecer por debajo de la superficie del cubreobjeto. Se examina el montaje
peridicamente a simple vista para determinar si la colonia ha madurado y esta lista para su
observacin microscpica.
Cuando es evidente el crecimiento, se retira cuidadosamente el cubreobjeto con pinzas estriles y se
coloca en un portaobjeto que contiene una gota de lactofenol azul de algodn. Si se desea un montaje
permanente, se limpia la superficie del portaobjeto inmediatamente adyacente al borde del
cubreobjeto y se aplica esmalte para uas color claro.
OBSERVACIONES
a) Observacin macroscpica
Colonia gigante:
Sembrar con ansa aguja en el centro de botellas utilizadas en los hemocultivos o tubos
de ensayos con el medio dispuesto en pico de flauta, tambin se pueden usar cajas de
Petri, que contengan un sustrato de por lo menos 3-4 mm de espesor. Incubar.
Describir las caracteres macroscpicos de las colonias (dimetro, elevacin, aspecto
ptico, textura, bordes, color, etc.), haciendo las observaciones a los 3 4 das y luego
cada semana, durante un mes.
b) Observacin microscpica
Del cultivo anterior sembrado, se realiza un montaje y se efectuan las
observaciones correspondientes, respetando los mismos tiempos.

Esquema prctico de trabajo

MOHOS
Hifas no tabicadas hifas tabicadas
Zygomycetes Dematiceos Hialinos

Comnmente
hallados:

Conidios
Conidiforos
multicelulares: que terminan
en una
Rhizopus
Tabiques
vescula
transversales dilatada
Mucor
y
longitudinales Especies de
Encontrados
Aspergillus
rara vez:
Alternaria
A. fumigatus
Syncephalastr Stemphyllum
um
A. flavus
Epicoccum
Circinella
A. niger
Curvularia
Cunninghamel
A. terreus
la
Drechsiera
Conidiforos
Absidia
Conidios
que se
unicelulares:
ramifican en
un "penicilio"
Clasdosporiu
m
Penicillium

Dermatofitos:
Especies de
Microsporum

M. canis
M. gypseum
Especies de
Trichophyton

T. rubrum

T. verrucosum

Actinomyces

T. schoenleinii

Nocardia

Especies de
Epidermophyt
on:

Acremonium
E. floccosum

Produccin de
Peritecios

Gliocladium

Chaetomium

Fusarium

Especies de
crecimiento

Conidios
transportados

Paracoccidiod
es brasiliensis

T. tonsurans

Scopulariopsis T. violaceum

Trichoderma

Coccidioides
innitis

Bacterias
filamentosas
ramificadas:

Aureabasidiu
m (Pullularia)

Phoma

Histoplasma
capsulatum

T.
mentagrophyt Sporothrix
es
schenckii

Paecilomyces

Conidios en
racimos:

Blastomyces
dermatitidis

M. audouinii

Nigrospora

Produccin de
Picnidios:

Mohos
dimrficos:

Streptomyces

lento:

aisladamente

Cladosporium
carrionii

Chrysosporiu
m

Phialophora
verrucosa

Sepedonium

Exophiala
jeanselmei
Fonsecaea
pedrosoi

Scedosporium
(Monosporium
)
apiospermum
(Pseudallesch
eria boydii)

LEVADURAS
Hifas formadas en agar-harina de maz-tween 80
Seudohifas:
Especies de Candida:
C. albicans
C. tropicalis
C. parapsilosis
C. pseudotropicalis
C. krusei
C. guilliermondii

Artroconidios:
Geotrichum
Trichosporon

Hifas no formadas en agar-harina de maz-tween 80:

Cryptococcus

Rhodotorula
Candida flabrata
Saccharomyces*
*Puede haber hifas rudimentarias