Sunteți pe pagina 1din 16

Analiza cafeinei din bauturi energizante

Introducere
Cafeina este cea mai veche si larg consumata, drogurile psihoactive, fiind prezente n
mod natural n cafea i boabe de cacao, piuliele kola, guarana de pdure, frunzele de ceai etc.
care sunt utilizate n ntreaga lume n multe culturi. Principalele efecte fizice de cafeina includ
anduran, reducerea oboselii i mbuntirea vigilenei mintale.
Din cauza ei activitatea este pozitiva pe sistemul cardio respirator i creierul funcional, din
anul 1984 in anul 2004 cafeina era inclusa n lista de medicamente antidoping, detectata in urina
peste 12 mg/mL. Stimularea fizic i mental exercitat de cafeina ndeplinete tendintele
moderne de generaii tinere spre utilizarea de stimulenti, n loc de traditionala dar ilegala cocaina
si amfetamina. De asemenea, trebuie sa adaugam ca disponibilitatea de cafeina s-a extins din
acest compus si este prezent ca aditiv n "energy drinks" i suplimentele dietetice, adesea
perceput ca "sigur", dar nu lipsite de efectele adverse relevante.
Foarte recent, diferite preparate care contin cafeina au devenit disponibile prin internet i n
aa-numitul "smart magazin",disponibile cu uurin stimulentele drogurilor.
n ultimii ani, utilizarea de alcool in combinatie cu cafeina,buturi sau droguri a devenit
destul de populara, compensarea capacitatii cafeinei i-o reda efectul alcoolului pentru a spori
concentrarea.
Pe de alta parte, au fost raportate numeroase dovezi de sindroame clinice ale cafeinei
overdosing dependena i intoxicaiile i chiar decese.
Metodele curente de analizare a cafeinei sunt bazate pe: cromatografie gaz-spectrometrie de
mas (GC-MS) i HPLC-MS . Din pacate, aceste tehnici sunt disponibile numai n laboratoare
specializate, dar rareori in laboratoarele de chimie clinic i toxicologie clinic, provocnd o
subestimare a fenomenului de cafeina abuzului n populaie.
O mai mare flexibilitate si usurinta pentru a comuta ntre diferite condiii analitice,
capilara electroforeza(CE) poate arta preferabil la tehnicile mai sus menionate pentru analiza
cafeinei, care n prezent sunt rareori solicitate n laboratoarele clinice i de medicin legal
toxicologica.

n ultimii ani, ntr-adevr, CE metoda de determinare a cafeina a fost raportata pentru


caracteristicile moleculei neutre de cafeina care excludea orice taxa-de-masa pe baza raportului
separarii, de obicei micelar electrokinetic cromatografic (MEKC) metoda ce a fost propusa. n
MEKC analitii sunt separati pe baza apoasa pozitionarea lor ntre un tampon de separare de
origine petrolier hidrofob, care acioneaz ca o pseudo staionara faza hidrofoba.
Mai recent, microemulsion electrokinetic cromatografic (MEEKC) a fost introdus ca o
alternativ la atragerea MEKC pentru separarea de neutru, precum i de moleculele incarcate.
MEEKC tampon de separare este o microemulsie n care un solvent organic miscibil in
apa cu forme de core de microdroplets, care sunt stabilizate printr-un agent tensioactiv situat la
suprafata lor, care le confera o ncrcare electric net i n consecin o mobilitate
electroforetic. n funcie de acest regim, de separare a compusilor neutri n MEEKC se bazeaz
pe partiionarea analitului ntre deplasarea ncrcat "ulei" i picturi de tampon faza apoasa. n
special, ulei-in-apa (o/w) microemulsions miceliile sunt similare pentru abilitatea lor de origine
petrolier hidrofob solubilizand compui, dar afieaz o mult mai mare capacitate datorit
picturii cu mai mare dimensiune. Mai mult, in comparatie cu MEKC, MEEKC, deoarece are o
mai mare complexitate de tampon, este mai flexibil i poate fi mai fin reglat pentru a optimiza
separari.
Cele mai comune aplicaii de MEEKC sunt n domeniul farmaceutic, doar dou au fost
raportate pentru aplicarea acestei metode de separare, modul de determinare a cafeina in ceaiul
verde sau pentru detectarea de cafeina, adulterant ilicit in preparate de heroina si amfetamine.
n prezent funcionarea era menita pentru dezvoltarea si validarea unei rapide si simple
MEEKC metoda de analiza cantitativa de cafeina in bauturi comerciale i n "smart drogurilor"
preparate.

Rezultate si discutii
Pe baza literaturii existente, pentru separarea de cafeina, zona capilara electroforeza
capilara simpla (CZE) cu o baz electrolit (15 mM tetraborate sodiu la pH 9,5 -11,0 ) Au fost
iniial testate. Cu toate acestea era mai clar ca la aceste valori de pH, cafeina gresit ionizata i, n
consecin migrata aproape de EOF, nu rezulta din compui neutri prezenti n probe.
Astfel, cu scopul de a rezolva aceast problem, introducerea unui nou mecanism de
separare, n plus fa de electroforez, este necesar. n acest scop, MEEKC este atractiv, din
cauza capacitii sale de a trata, incarca. n fundal MEEKC electrolitul este compus dintr-o
dispersie a dou lichide nemiscibile, constand fie in "ulei" fin apoase dispersate ntr-un buffer
(o/w microemulsion) sau ap dispersat n "ulei" (w/o microemulsion). n acest sistem, picturile
de rezultate sunt formate n prezena unui surfactant neionic lor de suprafa, strat
care reduce tensiunea superficial, permind astfel formarea de o emulsie stabila. De MEEKC
tampon este mai stabilizat prin adaugarea unui scurt-lan alcool, precum butanol sau octanol.
De aplicare a tensiunii capilare, picturi de ulei pe suprafaa rulmentului incarcat de agentul
tensioactiv moleculele migreaza spre electrodul cu polaritate opus. n cazul prezent, picturile
acoperite cu SDS i deci negativ ncrcate se deplaseaza spre anod, adic n direcia opus
electroosmoticului debit (EOF). Cu toate acestea, valorile mari cum ar fi n cazul prezent (din
cauza fazei de tampon electrolit), negativ de picturi sunt trecute pe la catod (adic spre
detector) de viteza predominante de EOF.
In o/w MEEKC, ca n prezent sistemul neutru de substante dizolvate sunt separate pe baza
de solubilitate a acestora n "ulei" faza (log P) cu mai multe insolubilitati in apa substante
dizolvate migrate ultimele.
n acest complex sistemul de separare si condiiile specifice pentru a fi optimizate include
alegerea i concentraia de "ulei" faza, de agent tensioactiv i co-agent tensioactiv. In plus,
trebuie subliniat faptul ca pH tamponului joac un rol important n orice process electroforetic ,
deoarece acesta afecteaz att gradul de ionizare de la analii cat si peretii capilari si deci, EOF
magnitudinea.
n prezent funcioneaz, efectul de pH al tamponului care era cercetat in intervalul 7,5 -10,5
la fix un tampon concentrare (15 mM).

Cele mai bune rezultate, n termeni de rezoluie i de forma varfului s-a obtinut cu ajutorul
tamponului borat la pH 9,5 ;cum era de asteptat, cresterea pH-ului produse mai scurt analizate ori
ca urmare a crescut EOF, dar o separare mai rea de cafeina si ESTE; la valori ale pH mai mic
dect 9,5, separarea era, de asemenea, incorecta, din cauza unei slabe ionizari de analit (datele nu
erau indicate). Pentru a cunoscute influena fortei tampon pe EOF, prin creterea concentraiei n
soluie tampon borat (de la 10 pn la 30 mM) a ordonat creterea timpului de migrare pentru
ambele, cafeina si ESTE a fost observat, cu co-migrare din analit. Pe baza aceasta, 15 ml borat
cu pH 9,5 era n cele din urm aleas ca separare tampon optim.
Dup cum este bine cunoscut, n MEEKC formarea de o microemulsion este afectat de
raportul dintre agent tensioactiv i cosurfactant; pe de alta parte, cantitatea de surfactant n
microemulsion tampon vizeaz puternic separarea.
SDS este cel mai comun surfactant anionic utilizat n MEECK separari. Totui, alti ageni
tensioactivi au fost folositi, printre care sarurilor biliare (de ex. deoxycholic acid) care au un rol
proeminent .
n experimentele noastre preliminare, ambele SDS sau acid deoxycholic au fost testate
atunci cnd adaugi la o soluie tampon constnd din 15 ml tetraborate sodiu pH 9.5, care contin
n-hexan 1,5 % (v/v) i nbutanol 6,6 % (v/v). Cum era de asteptat, cresc concentratiile de agent
tensioactiv de 1 la 5% (w/v) i, n consecin, au condus la reducerea fortei ionice EOF i analiza
marita de cretere a concentraiei de SDS a fost egalata de creterea de migrare ori de cafeina si
etalonul intern. Cu separarea de tampon coninnd 1% SDS, cafeina migrata imediat nainte de
ESTE la aproximativ 4 min; cu 2% SDS, cafeina i ESTE co-migrate n acelai vrf, n timp ce
peste 2% SDS unei inversiuni de migrare a fost observat cu ESTE migrarea naintea cafeinei.
Din cauza concentratiilor ridicate de SDS, a fost observat o marire cu 5% SDS, care duce la
extinderea de vrf de cafeina,din cauza incalzirii excesive. SDS o concentraie de 3,3 % n
tampon de separare a fost n cele din urm ales drept cel mai bun compromis ntre timp i
eficiena analizei de separare.
Deoarece este larg raportat,diferit de alte condiii, de natura "ulei faza" joaca doar un rol
minor n separarea, selectivitatea, hexan, producnd o stabil microemulsion erau doar "ulei
faza" testate. Experimentele au fost efectuate cu MEEKC amortizoarele cu creterea sumelor de
hexan, variind de la 0 la 3 %. O interferen pe varf cafeina s-a dovedit reala la analizarea
probelor cu ajutorul buffer cu mai puin de 1,5 % de hexan. Astfel concentraia de hexan 1,5 % a

fost alesa, de asemenea, cu scopul de a minimaliza solventul organic utilizat ct mai mult posibil.
n acord cu literatura, un procent de 6,6 % n-butanol a fost aleas pentru stabilizarea formarii
microemulsion. Sub conditiile optimizate descrise mai sus, s-au dovedit a fi microemulsion fizic
stabil pentru cel puin o zi, peste care era necesar inca 15 min.
Metoda analitic era complet validata n termeni de linearitate, limita de detectare si
cuantificare, n-zi i ntre-zi variabilitate i precizie.
Limita de detectare (LIMITA), calculata a cafeinei oferind cea mai mica concentratie a
raportului semnal/zgomot (S/N) 3 a fost de 2 mg/mL.
Limita inferioar de cuantificare (LLOQ), definita ca cea mai mic concentraie de cafeina
care pot fi determinate cu o precizie sub 20 %, a fost 5 mg/mL (n = 10).
Sub conditiile optimizate, de linearitate era evaluat n intervalul 5-100 mg/mL prin
injectarea soluiilor apoase coninnd cunoscute concentratii de cafeina. Trei replici de ase
puncte de calibrare au fost analizate timp de 7 zile consecutive.
De MEEKC-TATA metoda descrisa ofer o rapid i nonexpensiva determinare a
dispozitivului pentru determinarea cafeina n produse comerciale i clandestine preparate de
drogurile stimulente.
Disponibilitatea de un cost redus i uor de utilizat arat ca metoda este deosebit de
importanta pentru monitorizarea prezenei de cafeina in pietele destul de obscure ale "smart
drogurilor".
Cafeina, caramelul i fluorescenta riboflavin nativa n soluie apoas. Suprapunerea de
cafeina i caramel previne determinarea direct de la analii, astfel nct sincron fluorescenta era
folosita pentru a reduce aceast suprapunere. Varful cafeinei ivarful caramelului erau mai bine
separate pentru DkP90 n. m, n timp ce al doilea varf al cafeinei si al caramelului au fost
rezolvate n mod similar pentru toate valorile de Dk. n plus, ambele cafeina fluorescenta la
kmax de al doilea vrf i caramel fluorescenta la kmax de riboflavin au scazut cu creterea
valorii de Dk. Vazind ca sensibilitatea scade cu creterea valorii de Dk, toate soluiile au fost
msurate la Dk = 90 n. m. Sincron spectra fluorescenta(Dk = 90 nm) de cafeina, Clasa III
caramel, Clasa IV , riboflavin, coca-cola si bautura energizanta. Fluorescenta maxima de
bautura cola au fost amplasate la 288 i 331 n. m. Aceasta fluorescenta provine din cofeina i
Clasa IV caramel.Spectra fluorescenta de butur energizant expune o banda cu maxim relativ
intens la 292 nm i mai puin intens cu o banda maxima la 322 n. m. Aceste benzi erau atribuite

cafeinei si Clasa III caramel. n plus, o banda distincta cu maxim la 442 nm a fost observat
pentru butur energizant, care corespundea riboflavinei.
Modelul a fost dezvoltat in modul PLS PLS1 (adic PLS fost executat pentru fiecare
compus separat) i modul PLS2 (adic PLS fost executat pentru toti compusii simultani) cu
ajutorul calibrrii/predicie setului de date. Calibrarea/predicia blocului spectral matricea cu cota
16 401 i concentraia matricei blocului cu cota 16 2 au fost folosite pentru modelele
calibrare/predicie.
Traversa metodei de validare, numit i lsai-o-transversal-validare, era utilizata pentru a
selecta numarul optim de factori. Odat ce numrul optim de factori s-a stabilit, de calibrare
finala, folosind toate probele de calibrare cu numrul optim de factori, a fost efectuat.
Rezultatele de calibrare ale caracteristicilor, numrul de factori (variabile latente, LV), total %
din variaia spectral explicata pentru blocul concentratiei, cu radacina medie regresiei ptrate
eroare de calibrare (RMSEC), cu rdcina medie eroare regresiei ptrate cruce-validare
(RMSECV), coeficientul de determinare de calibrare (R2 Cal) i coeficientul de determinare a
cross-validare (R2 CV). Modelele PLS1 i PLS2 au fost folosite pentru prognoza concentratiei
de analit ntr-o predicie a seturilor. Rezultatele de predicie,caracteristicile, eroarea standard de
predicie (SEP), predicia bias (Pred Bias) i coeficientul de determinare de predicie (R2 Pred),
sunt prezentate. Nu au fost observate diferente semnificative ntre rezultatele obinute n
modelele PLS1 si PLS2. Mici erori de calibrare, cruce-validare i predicie mare R2 valorile
(aproape de una) indica o buna precizie a propus modelele PLS pentru determinarea simultana
de cafeina si caramel clasa IV, model mai bine la caracteristicile de cafeina.
PLS1 si PLS2 au fost aplicate pentru determinari simultane de cafeina, caramel clasa III
i riboflavin de aceeai manier discutate mai sus. Calibrarea, cruce-validare i predicie a
caracteristicilor indica din nou adecvari propuse modelelor PLS pentru determinarei simultane
de cafeina,caramel clasa III i riboflavin, de ex. R2 Pred valori n toate cazurile si sunt foarte
aproape de 1, care este o indicaie de similitudine.
PLS1 si PLS2 ambele modele au fost utilizate pentru a determina analitii din probele de
cola iar valorile concentratiei au fost comparate cu cele obtinute din HPLC, spectrofotometrie i
coulometrie . n general, nu era un acord bun ntre rezultatele obinute prin metode diferite. Toate
rezultatele au fost analizate statistic utiliznd testul F i student test. A F test nu au aratat

diferente semnificative ntre variaiile mecanismului de SFS/PLS (spectrofotometrie sau


coulometry) i metoda HPLC convenionale. Valorile calculate ale F (1 F 9) pentru trei repetarea
erau mai puin dect valoarea F tabelare la 95% nivel de ncredere (F0,05/2,2 = 19,2 ). n mod
similar, Student t-valori la 95% nivel de ncredere (0,04 t 3,06 ) nu depete valorile teoretice
(t0,05/2,2 = 4,3 ), indicnd nr. statistic diferena ntre rezultatele a SFS/PLS (spectrofotometrie
sau coulometry) i HPLC convenionale. Aceste rezultate indica adecvarea spectrofluorimetric
propuse metoda pentru determinarea simultane de cafeina, caramel i riboflavin n cola-tip i
butur energizant.
Bautura energizanta de tip cola conine niveluri ridicate de carbohidrati si multi alti compusi
ca acid fosforic, acid citric, clorura de sodiu, acid pantothenic, niacin, aspartam i acesulfam K,
care nu interfereaza, deoarece nu sunt fluorescente. Compuii de vitamina B grup care poate
contribui la fluorescenta,iar concentraia lor poate atinge un mg/l 1 nivel (Aranda & Morlock,
2006).
PLS este foarte avantajos pentru o tratare matematic sincron de fluorescen spectra
deoarece permite cuantificarea corect a intei analit, chiar i atunci cnd este necunoscut (adic
non-calibrat) interferenele sunt prezente, cu conditia ca o proba suficient eterogena este
disponibila pentru calibrare.
O calibrare simpl multivariata spectrofluorimetric metoda cu ajutorul standard plus
metoda a fost dezvoltata pentru determinarea de cafeina, caramel i riboflavin larg disponibile
in bautura de tip cola i butur energizant. Caracteristicile statistice pentru calibrare i predicie
au fost excelente. n plus, a fost dezvoltata procedura prevzuta pentru compararea rezultatelor
cu cele obtinute prin HPLC metoda de referinta. Economisind astfel timp i cheltuieli fr
pierderi semnificative astfel poate fi obinut prin metoda propus.
Riboflavin ( >99.5 %) a fost obinut din Serva (Heidelberg,Germania), ninhydrin ( >99
%) i cafeina ( >99 %) de la crt (Buchs, Elveia), taurinelor ( >99 %) i rubrica privind
nicotinamida ( >99.5 %) de la Merck (Darmstadt, Germania) i pyridoxine clorhidrat ( >98 %) de
la Sigma (Steinheim, Germania).
Cloroform, 2-propanol, etanol, metanol, aceton, acid acetic, acid formic, i amoniac (25 % ),
toate achiziionate de la Merck, erau de calitate HPLC sau distilat nainte de utilizare. Ultrapure
apa (18M /cm2) a fost produs de Sinergia Sistemului (Millipore GmbH, Schwalbach,

Germania). S-a efectuat Cromatografie pe silicagel 60 F254 sticla HPTLC susinut plci de la
Merck, 20 cm 10cm, 200 m n grosime. De energie i de alte buturi buturi au fost cumparate
de pe piata locala.
Dou miligrame de riboflavin,25mg nicotinamida, 15 mg de cafeina, piridoxine i 20
mg taurina au fost ponderate n balon volumetric de 100ml i umplut pn la 100ml cu ap ultra
pur. Solutiile refrigerate i protejate de lumina erau stabile cel putin 10 zile. Ca soluie
derivatizare (pentru scufundare) 0,3 g ninhydrinwas dizolvate n 100mL 2-propanol i acid acetic
95:5 (v/v).
Probele au fost lasate timp de 20 min. intr-o baie cu ultrasunete.
Pentru cuantificarea B2, B6, rubrica privind nicotinamida si cafeina probele au fost transferate la
un galben i eantionarea flaconului utilizat direct pentru cromatografie. Pentru analiza
taurinelor, 2mL de esantion s-a diluat la 25ml cu metanol i ap 7:3 (v/v).
Plcile de HPTLC erau spalate (pre-cromatografie) cu metanol i uscate pentru 15 min la
120 C. Proba i soluii standard au fost aplicate cu TLC Prelevare Automat 4 (ATS 4, CAMAG
Muttenz, Elveia) cu urmtoarele setri: lungime band 6 mm, distana de la marginea plcii din
stnga 10 mmi din marginea plcii inferioare 10 mm, rezultnd 21 pini pe placa, dozarea
velocity 120 nL/s, ca aplicaia de prob volume 10 L pentru vitamina B2, B6 i B3, 2,5 L de
cofein i 1 L pentru taurinelor, ca standard de cerere volumele 1-5 L.
Cromatografia s-a efectuat ntr-un 20 cm nr 10 cm twin camera jgheabul (CAMAG) pn
la o migrare distana de 80mm (de la marginea plcii inferioare) cu ajutorul unui amestec de
cloroform, etanol, acid acetic, acetona i ap 54:27:10:2:2 (v/v) ca faz mobil. Apoi, placa a fost
uscat timp de 3 min ntr-un curent de aer cald. Optional cromatografie ar putea fi realizate n
Automated Dezvoltarea Camera (ADC2, CAMAG). RAZELE UV i Vis in situ spectra au fost
nregistrate cu ajutorul TLC Scanner 3 (CAMAG) si fluorescenta spectre n soluie cu ajutorul
FluoroMax-2 spectrofluorimeter din Jobin Yvon-Spex (NJ, SUA). Multi-detectare unda s-a
efectuat prin CCM Scanner 3 cu o deschizatura cota de 4mm0,2 mm i o vitez de scanare de
100 mm/s. n UV-modul absorbanta, rubrica privind nicotinamida era msurat la 261 nm la 275
nm si cafeina, fluorescen n modul, riboflavin i pyridoxine au fost scanate la 366/ >400 nm i
313/ >340 nm, respectiv i inVis-modul absorbanta, taurinelor s-a detectat la 525 nm, dup postcromatografic cu derivatizare ninhydrin soluia folosind un dispozitiv TLC Imersiune

(CAMAG) cu o vitez de 3,5 cm imersie/s i o imersie timp de 1 s i nclzit pe placa TLC


nclzire (CAMAG) timp de 2 min la 100 C.
Toate instrumentele au fost controlate prin intermediul platformei software winCats 1.4.1
Planar Cromatografie Manager (CAMAG).
Analiza statistic a fost realizat cu GraphPad Prism 4.0 i 2.1 QSM software.
Dup scanare plcii, poziia de fiecare compus s-a marcat. Cu ajutorul HPLC a pompei
(HP 1100, Agilent Technologies, Palo Alto, SUA) i interfaa ChromeXtrakt din ChromAn
(Holzhausen, Germania) HPTLC placa a fost conectat la VG platforma II singur-miniconector
spectrometru de masa din Micromass (Manchester, MAREA BRITANIE). Compuii au fost
online eluat din strat cu un amestec de metanol i un formiat tampon (10 mmol/L, pH 4,0 ) 95:5
(v/v) la un debit de 0,1 mL/min. TheMSsystemwas operat n modul scanare cu urmtorii
parametri pentru ESI+: sursa temperatura 120 C, tensiunea capilar 3,5 kV, obiectiv HV 0,5 kV,
con tensiune 55V, durat temporizare 0,5 s, inter ntrziere canal 0,02, repet 1, span 0,5, cu
excepia riboflavin nregistrarea pentru care acid acetic i ap 1:9 (v/v) a fost utilizat ca solvent
de eluie capilar i tensiunea con 3,25 kV i 60V.
Dei diferite metode PENTRU TLC au fost publicate despre determinarea vitaminei B
[ 48- 50], cafeina [ 24,51,52] i a taurinelor [ 32,33] utiliznd alt fel de plci i pante, aceast
metod ofer un ciclu izocratic separare pentru toate cele cinci compusi simultan pe o simpla
placa de silicagel cu ajutorul reactivilor comune.
Focuswas stabilite pe dezvoltarea unui mare transfer metoda care ar putea fi aplicate la
orice laborator cu echipament bazice.
Metoda a permis detectarea multiple de cinci compusi dup un singur run cromatografice
si, de asemenea, se dovedi a fi selectiv si robuste impotriva glucide rezistenei parazite, care sunt
prezente la niveluri ridicate in acest fel de buturi. ntr-o a doua etap, fiabilitatea HPTLC/ESIMS pentru confirmarea rezultatelor era prima figur pentru acesti compusi.
Toti au fost compui extrasi din placa i dup ESI, nregistrate n mod pozitiv i negativ
ion. Smochinele uscate. (3) si (4) arata ca ESI+ masa spectra de rubrica privind nicotinamida,
cafeina si pyridoxine n care [M +H]+ ioni au fost detectate la m/z 123, 195 i 170, respectiv,
precum i ESI- spectru de masa pentru taurinelor cu [M-H]- ion la m/z 124. n caz de riboflavin,
fr dezvoltare cromatografice [M + Na]+ ion s-a detectat la m/z 399 i dup dezvoltarea [M-

CH3OH+H]+ la m/z 345 presupunind o metanol pierdere n timpul dezvoltrii cauzate de acide
faza mobil. Molecula de schimbare a fost confirmat de 2D planar cromatografie cu i fr de
acid n faza mobile. Aceast schimbare molecular afectate la ambele, standard i probe, fr
pierdere de intrinseci fluorescenta si deci evaluarea nu a fost afectat.
Pentru a asigura calitatea produsului, de nevoile industriei rapide, fiabile i cost redus sunt
metodele analitice. Din acest punct de vedere,noua metoda HPTLC ofer o fiabilitate nalt
alternativa transferului.
Simultan low-cost de monitorizare de riboflavin, pyridoxine, rubrica privind
nicotinamida, cafeina si a taurinelor coninut n buturile ca bautura energizanta este activat din
cauza de flexibilitate imens de HPTLC privind detectarea. La a cunotinelor noastre, separarea
n una executai i detectarea simultana de toate cele cinci compusi plus identificare prin
HPTLC/MS, precum i cuantificarea pyridoxine prin HPTLC/FLD era realizat cu succes pentru
prima dat.
Cafeina, atinge 3,7% in comparatie - -dihidro-1,3,7-trimetil-1H-purine-2,6-diona, este
anatural alcaloizi care apartin N-metil derivati de xanthine.Deoarece de mare popularitate de
cafea si alte cafeina containingproducts (coca, ceai, bauturi soft i energie, cacao, ciocolata),
acesta isthe psihoactive cele mai frecvent utilizate zilnic in substanta humanlife . Cafeina este cel
mai larg utilizat substanceworldwide psihoactive. Cronica, consumul moderat de cafeina are
beenlinked cu risc redus de vrsta-asociate neurodegenerative dis-ordinele n oameni, inclusiv
bolnavii mi/entali, bolii Alzheimer, i Parkinson boala lui . Mari potentialii epidemiologicstudies
au legat de consumul de cafea pentru un riscde redus ulterior dezvoltarea PD . Cafeina, precum i
mai multe spe-cific antidoturilor de receptor - a fost gsit acum toattenuate neurotoxicitate n
modele experimentale de PD. Faptele menionate mai sus Dueto detectarea i cuantificarea caffeine este important i nu au numai semnificaiei clinice, ce trebuiau controlati poate oferi de
asemenea sfaturi benefice pentru sanatatea oamenilor si viata. Difer-ent metode au fost
dezvoltate pentru determinarea de cafeina.Metodele electrochimice ofer avantaje practice de
include-ing funcionarea simplitate, satisfctoare sensibilitate, linearconcentration larg gam,
mic cheltuial din bord, posibilitatea ofminiaturization, adecvarea pentru timp real detectarea i
mai puin sensi-tivity a efectelor matricei n comparaie cu separare i
spectralmethods.Modificare de suprafaa electrozilor poate grantsome avantaje remarcabile n
reacii electrochimice.

Unul-dimensional (1-D) nanometri i semiconductoare mijlocii mate-rials au atras


considerabil activitile de cercetare din cauza theirgreat potenial pentru studii fundamentale din
rolurile dimensionale-itatea i dimensiunea lor n proprietile fizice, precum si pentru cererile
inoptoelectronic nanodevices funcionale i materiale. ZnO poatefi sintetizate n diferite forme,
cum ar fi un singur cristal subire i este mbogit cu numrul de unul dimensionale morphologies inclusiv nanobelts, nanorods , i nanowires .Aceste nanostructures posed nalt suprafa la
volum ratioand mecanic extraordinar stabilitate care puternic favorizeaza pentrudirecia de
design bazate pe senzori de ZnO nanomaterial .La a cunotinelor noastre, nici un studiu a fost
publicat de raportare merita schimbata simultan electrocatalytic determinarea ofdopamine,
melatonin, metionina si cafeina folosind orice kindof modificate electrozii i ZnO nanorods
pasteelectrode special modificat. Astfel, n prezent funcioneaz, ne descrie prepara-defilare a
unui nou electrod compus din carbon nanorods ZnO pasteelectrode (ZCPE) modificat cu 3- (4amino-3-hidroxi-bifenil-4-yl) -acid acrilic (3,4 AAZCPE) i investigai performanele sale
ndirecia electrocatalytic determinarea dopamina apoase n solu-pricina pentru prima dat.
Avem, de asemenea, evaluarea analitic performanastivuitorului modificate a electrozilor pentru
cuantificarea dopamina in thepresence a melatonin, metionina si cafeina.
Condiii experimentale au fost controlate withNova 1.6 software. UN electrod
convenionale trei celula era folosit la25 1C. O Ag/AgCl/KCl (3,0 M) electrod, un fir de
platin, 3,4 AAZCPE ia erau folosite ca referin, auxiliar i workingelectrodes, respectiv. O
Metrohm 827 pH/Ion-Metru au fost utilizate msurtorile forpH.Toate soluiile au fost proaspt
preparat cu ap dublu distilat.dopamina, melatonin, metionina, cafeina i toate celelalte.
Soluie de cretere s-a pregatit prin modificarea methodreported prin Vayssiers. Pe scurt,
o sinteza involvedthe tipic de pregtire a 100 ml soluie apoas de 0,005 MZn(NO3)2 6H2O i
instabile (hexametilen tetramin HMT) ntr-o closedPyrex expansiune echipat cu un urub cu
cap autoclavable. De abovefibers au fost meninute scufundate n aceast soluie pentru 4 h la
90C. Pre-cipitate au fost colectate prin centrifugare proces la 15.000 rot/min.
Metanol, etanol, acetona, clorura de sodiu, cloroform, tetraclorur de carbon, orice, cu
puritate mai mare dect 99 %, au fost cumparate de la Merck Chemicals (Darmstadt,
Germania). Pure heliu (99.999 %) era din achiziionat Hiwa companii de gaze (Teheranul e,
Iran). Cafeina (P99.0 %) a fost achiziionat de la

crt (St. Gallen, Elveia). O soluie standard stoc de cafeina cu o concentraie de 2 mg mL 1 a fost
pregtit n ap dublu distilat, depozitate in refrigerare si protejat de lumina.
Soluie stoc de standard a fost stabil pentru cel putin 3 saptamani. Soluiile standard de lucru de
0.05-500 lgmL 1 au fost proaspt preparat folosind apa dublu distilata de dilutii adecvate de
stoc soluie standard i utilizate pentru evaluarea i optimizarea metodelor. O curb de calibrare a
fost construite fiecare zi nainte de analiz a probelor.
Centrifugarea a fost realizat de un Hermle Z 200A (Wehingen,Germania). O Eurosonic
4D (, m gndeam la altceva, Italia) cu ultrasunete baia de ap cu o controlul temperaturii i un
cronometru digital a fost folosit pentru bauturi se degazeaza. Injeciile n GC-NPD au fost
efectuate cu ajutorul a 1 lL Hamilton microseringa model 7001 (Bonaduz, Elveia).O 50 lL
Hamilton seringa era folosit pentru a injecta solventi organici.
GC analizele au fost efectuate cu ajutorul unui gaz cromatograf Agilent technologies
(Santa Clara CA, SUA) echipat cu un sistem de detectare i NPD a HP-5 coloana capilara silice
topita (lungime, 30 m; diametru interior, 0,32 mm; film grosimi, 0.25 lm; faza stationara, (5%
fenil) -metil polisiloxani polari). A efectuat GC program de temperatura era dup cum urmeaz:
temperatura iniial era setat la 100 C timp de 1 min, apoi era programat la 30 C min 1 la 250 C
i deinute timp de 5 min. temperatura port injecie era setat la 220 C. detectorul (NPD)
temperatura s-a inut la 250 C cu hidrogen i un debit de aer ratele de 3 i 60 mL min 1,
respectiv. Portul de injecie a fost operat la un split raport de 1:15. Alte condiii de operare au
fost: gaz purttor, heliu (99.999 % ); debitul, 1 mL min 1; i presiunea de admisie, 6.6 psi.
Un enhanced ChemStation G1701 DA versiunea D. 00.01.27 era utilizat pentru colectarea
datelor i prelucrare.
Cinci tipuri de ceai (verde, negru, alb, olong i ceaiul negru earl grey sac), dou tipuri de
cafea (cafea Nescafe (Nestle, Araras, Brazilia) si cafea (Rio, Brazilia)), i opt diferite bauturi
( Coca-cola zero,Pepsi max, Sprite, 7up, Red Bull si Hype) au fost achiziionate de la o piata
locala in Teheran mi (capital de Iran).
0,1 g de ceai (uscat, mcinat i cernut) au fost plasate ntr-un pahar de 100 mL i 20 mL
de ap distilat fiart se adaug la acesta. Solutia a fost pstrat pe o baie de apa in fierbere timp
de 10 min. Dupa care, soluia a fost centrifugat la 4000 rot/min timp de 5 min pentru a separa

particulele solide din solutie. n caz de ceai, acesta a fost plasat n 250 mL de ap distilat fiart
timp de 2 min. Apoi, solutia a fost filtrat pe o hrtie de filtru (Whatman grad Nr. 44) pentru a
elimina particulele solide.
Cafea Nescafe era sol la o pudr fin, i apoi 100 mL de ap distilat fiart s-a adugat 1
g. n caz de cafea, 1 g pulbere cafea s-a adaugat 100 mL de ap distilat i era agitat i nclzit
la fierbere. Apoi, soluiile au fost filtrate pe o hrtie de filtru (Whatman grad Nr. 44) pentru a
obine o soluie transparent.
nainte de aplicarea procedurii, bauturi probe au fost degazat intr-o baie de ap cu
ultrasunete pentru 10 min. Apoi, soluiile au fost filtrate pe o hrtie de filtru (Whatman grad Nr.
44) pentru a obine o soluie transparent.
1 ml din soluia de prob a fost plasat ntr-un pahar conic tub test, i 0,1 g de clorur de
sodiu adugat la acesta. Apoi, 200 lL de etanol (dispersia solvent) coninnd 20 lL de cloroform
(solvent de extracie) era injectat n acestuia cu ajutorul unei seringi. In consecinta, o soluie
tulbure (constat de minuscule picturi de cloroform dispersate in faza apoasa) s-a format. n
aceast etap, extract de cofeina din faza apoasa are loc n cloroform. Dup centrifugare a
nnorat soluie la 4000 rot/min timp de 2 min, extractant (cloroform) care contin cafeina
preconcentrated era agar la partea de jos a tubului de testului. n cele din urm, 0,7 lL a agar faza
organic era injectat n GC-NPD. De performan i de robustee ale procedurii au fost examinate
cu coborre volumele de soluie de prob. n acest caz, procedura a fost examinat cu 0,5 ml de
soluie de prob i 100 lL de etanol care contine 10 lL de cloroform cu concentraia de sare de 10
%. Rezultatele confirma posibilitatea de a efectua procedura pentru probe de volum limitat. Desi
procedura poate fi efectuat direct pe probe nediluate, dar proba de pre-diluare poate reduce
consumul de proba si, de asemenea, simplific DLLME metoda prin reducerea matricea de efect.
Pentru a obine cele mai bune performane i cele mai bune condiii de procedura de
extracie a parametrilor de eficienta, metodele propuse au fost investigate i optimizate. n acest
scop, o soluie etalon apoasa de cafeina era preparata din soluia stoc i utilizat ca model soluia
prob. Eficiena metodei de extractie a fost evaluata ca media cromatografiei, zona de vrf a
cafeina din trei injectari succesive. O literatur studiu bazat pe influena pH pe eficienei
extraciei de cafeina s-a aratat ca majoritatea de anchete au fost efectuate la pH natural de probe,

dar n unele studii, rezultatele au fost generate la pH 7 (Jafari et al. , 2011), i n alte cteva
cercetari de experimentele au fost efectuate la valoarea pH 12,5 (Xiong,Chen, El, & Hu, 2010).
Cu toate acestea, n prezent activitatea n scopul de a simplifica procedura i pentru a evita riscul
de care formeaz o tulbure soluia de prob care pot fi produse din adaugarea de acid, baz sau
soluie tampon, era preferat pentru a efectua experimente de fizica faza de probe. Naturale de
valori de pH din probe au fost: 6.5-7.5 pentru ceaiurilor; 5.2-6.0 pentru cafea si Nescafe; i de
2,5 -3,5 pentru alte buturi.
Solventul ar trebui amestecabil cu ambele organice (solvent de extracie) i apos (proba)
faze. Astfel, metanol, etanol, i aceton au fost examinate pentru acest scop. Testele au fost
efectuate cu o solutie de lucru de cafeina (1 lg mL 1) n funcie de procedura propuse.
Rezultatele indica faptul ca etanol i metanol reprezenta aproape acelai eficienei extraciei,
totusi pentru ca un non-toxice solvent este preferat, etanol a fost ales ca solvent de extracie
pentru experimente ulterioare. Volumul de solvent disperser crucial este un parametru care are un
important efect asupra eficienei extraciei. Pentru a evalua efectul de acest parametru, diferite
volume de etanol inclusiv 100, 150, 200, 250 i 300 lL au fost examinate n conformitate cu
procedura. Rezultatele reprezentate n Fig. 1 Arat c eficiena maxim a fost realizat la 200 lL.
La coborre, volume minuscule picturi de solvent de extracie nu poate fi eficient dispersat i
astfel nnorat stat nu este bine format, astfel, extragerea recuperare scade. Cu toate acestea, la
volume ridicate, solubil de cafeina in faza apoasa crete, i, astfel, a se transfera in cloroform
(solvent de extracie) scade rezultnd o cobort eficiena. Prin urmare, volumul de 200 lL a fost
ales pentru disperser solvent n alte experimente.
Solventul de extracie joac un rol important n DLLME.
De solventi organici cu densitate mai mare dect apa au fost preferate, deoarece de
centrifugare rezultatele ntr-o separare de faza rapid.
Nemiscibil cu apa,are mai mare capacitate de extracie, i comportamentul cromatografic bun de
gaze au fost preferate de alte proprieti. Avand in vedere aceste caracteristici, cloroform
(densitate:1,48 g mL 1), tetraclorura de carbon (densitate: 1,59 g mL 1) i orice (densitate: 1,11 g
mL 1) au fost testate. Rezultatele demonstreaz c printre aceti solveni, cloroform cu extracie
mai mare capabilitate a fost cel mai eficient la privind preconcentrarea de cafeina; prin urmare, sa considerat ca solvent de extracie n urmtoarele studii. Volumul de solvent de extracie este o

alt cheie parametru semnificativ care vizeaz formarea de nori de stat i extracie performan
(Ge & Lee, 2012). Pentru studiul efectului de solvent de extracie volum pe eficienei extraciei,
diferite volume de cloroform (15, 20, 25 i 30 lL) au fost examinate pe baza procedurii propuse.
Cu volumele mai mic de 15 lL, agar extractant este insuficient din partea inferioar a tubului
conic test s-a format. Probabil ca aceasta este atribuit parial de cloroform solubilitatea n ap.
La volume mai mari dect 30 lL, cloroform nu era dispersat bine de 200 lL etanol n soluie
apoas proba. Fig. 2 Arat c cea mai mare suprafata varfului cromatografica s-a obinut atunci
cnd volumul de cloroform era 15 lL, dar, din cauza volumului mic de agar faza, deviaia
standard la 15 lL este mai mare dect alte volume.
La volume mai mari de 25 lL, efect de dilutie devenit extracie predominant peste
capacitatea de extracie i astfel eficiena erau joase. Luand in considerare cele de mai sus
discuia, 20 lL a fost ales ca optim de volum de cloroform pentru experientele.
Marimea influenteaza esantionul eficient extraciei, au fost evaluate n intervalul de 0,5 -3,0
mL la constant conditiile experimentale.
Furthur Films crete volumul esantionului pn la 3,0 mL cauzeaza o suprafata a varfului
constant (platou a curbei). Prin urmare, volumul eantionului de 1,0 mL a fost selectat pentru
teste ulterioare.
DLLME-GC-NPD a fost dezvoltat pentru determinarea de cafeina in bauturile populare. UN
foarte scurt timp de extracie, simplu procesul de extractie, mic limit de detecie (0,02 lgmL 1),
bun imbogatire factor, gam dinamic larg liniar (104), un sistem de detectare i sensibile
specifice (GC-NPD), i care necesit mic volum eantion (0,5 mL) sunt principalele avantaje
ale metodelor propuse. In plus, metoda este ecologic deoarece consuma volum mic de solvent
organic (20 lL cloroform), i astfel poate fi considerata ca o metoda verde.

Bibliografie

1. Eloisa Liotta , Rossella Gottardo , Catia Seri , Claudia Rimondo , Ivan Miksik
Giovanni Serpelloni d, Franco Tagliaro, Rapid analysis of caffeine in smart drugs
and energy drinks by microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC),
Forensic Science International 220 (2012) 279283
2. Ludovit Z iak, Pavel Majek, Katarina Hrobonova, Frantiek Cacho, Jana Sadecka,
Simultaneous determination of caffeine, caramel and riboflavin in cola-type and
energy drinks by synchronous fluorescence technique coupled with partial least
squares, Food Chemistry 159 (2014) 282286
3. Sergio Armenta, Salvador Garrigues , Miguel de la Guardia, Solid-phase FT-Raman
determination of caffeine in energy drinks, Analytica Chimica Acta 547 (2005) 197
203
4. Mario Aranda, Gertrud Morlock, Simultaneous determination of riboflavin,
pyridoxine, nicotinamide,caffeine and taurine in energy drinks by planar
chromatography-multiple detection with confirmation by electrospray ionization mass
spectrometry, Journal of Chromatography A, 1131 (2006) 253260
5. Amy Peacock ,, Frances Heritage Martin , Andrea Carr, Energy drink ingredients.
Contribution of caffeine and taurine to performance outcomes, Appetite 64 (2013) 1
4
6. M.A. Rostagnoa,, N. Manchona, M. DArrigoa, E. Guillamona, A. Villares a, A.
Garcia-Lafuentea, A. Ramosa, J.A. Martineza, Fast and simultaneous determination
of phenolic compounds and caffeine in teas, mate, instant coffee, soft drink and
energetic drink by high-performance liquid chromatography using a fused-core
column, Analytica Chimica Acta 685 (2011) 204211
7. Elahe Molaakbaria, Ali Mostafavia, Hadi Beitollahic, Simultaneous electrochemical
determination of dopamine, melatonin,methionine and caffeine, Sensors and
Actuators B 208 (2015) 195203
8. Hassan Sereshti , Soheila Samadi, A rapid and simple determination of caffeine in

teas, coffees and eight beverages, Food Chemistry 158 (2014) 813