FERMENTACION ALCOHOLICA A PARTIR DE PIA

INTRODUCCION
La fermentacin alcohlica es una biorreaccion que permite degradar azucares
en alcohol y dixido de carbono. La conversin se representa mediante la
ecuacin:

Las principales responsables de esta transformacin son las levaduras. La

Saccharomyces cerevisiae, es la especie de levadura usada con ms
frecuencia. Por supuesto que existen estudios para producir alcohol con otros
hongos y bacterias, como la Zymomonas mobilis, pero la explotacin a nivel
industrial es mnima.
A pesar de parecer, a nivel estequiomtrico, una transformacin simple, la
secuencia de transformaciones para degradar la glucosa hasta dos molculas
de alcohol y dos molculas de bixido de carbono es un proceso muy complejo,
pues al mismo tiempo la levadura utiliza la glucosa y nutrientes adi cionales
para reproducirse. Para evaluar esta transformacin, se usa el rendimiento
biomasa/producto y el rendimiento producto/ substrato.
El rendimiento terico estequiomtrico para la transformacin de glucosa en
etanol es de 0.511 g de etanol y 0.489 g de CO 2 por 1 g de glucosa. Este valor
fue cuantificado por Gay Lussac. En la realidad es difcil lograr este
rendimiento, porque como se seal anteriormente, la levadura utiliza la
glucosa para la produccin de otros metabolitos.
I.

II.

OBJETIVOS
Hallar la estquiometrica del crecimiento celular.
Rendimiento de la biomasa.
Descripcin del proceso anaerbico.
Cinetica de reacciones de bioprocesos.
Azucares reductoras.

FUNDAMENTO TEORICO
Variables de la fermentacin alcohlica y sus efectos sobre el proceso
Clase de microorganismo: Los microorganismos ms empleados para la
produccin de etanol a partir de azcares son las levaduras del gnero
Saccharomyces y Kluyveromyces y las bacterias Zymomonas mobilis.
Concentracin del sustrato: El carbono es suministrado por los azcares
contenidos en la materia prima, siendo la concentracin de azcar un valor que
se debe considerar ya que afecta la velocidad de la fermentacin, el
comportamiento y el desarrollo de las clulas de la levadura.

Suele ser satisfactoria una concentracin de azcar del 10 al 18%, el valor ms

corriente es del 12%. Cuando se trabaja con concentraciones de azcar muy
altas, del orden de 22%, se observa una deficiencia respiratoria en la levadura
y un descenso de la velocidad de fermentacin; por el contrario, al trabajar con
concentraciones muy bajas, el proceso resulta antieconmico ya que requiere
un mayor volumen para la fermentacin.
Concentracin de Etanol: La levadura es afectada en alto grado por la
concentracin de alcohol, una concentracin alcohlica del 3% ya influye sobre
el crecimiento; una concentracin de un 5% influye tanto sobre el crecimiento
como en la fermentacin. Cuando la concentracin es del 10%, en algunas
levaduras el crecimiento sufre la paralizacin total.
Temperatura: La seleccin de esta variable es influenciada tanto por factores
fisiolgicos como por problemas fsicos (prdidas debidas a la evaporacin de
etanol al trabajar con temperatura elevada).
Se debe tener en cuenta que para cada levadura existe una temperatura
ptima de desarrollo, en la cual se muestra activa. Adems, se tiene una zona
independiente de la temperatura ptima en la cual la levadura an presenta
actividad; a medida que se aleja de la temperatura ptima su actividad
disminuye notablemente. Por debajo de la temperatura sealada como mnima
y por encima de la mxima, las levaduras continan viviendo en estado
latente, sin embargo, al exponer cualquier levadura a una temperatura de 55
C por un tiempo de 5 minutos se produce su muerte. En el caso de la
Saccharomyces cerevisae se tiene un desarrollo ptimo entre 28-35 C,
recomendable 30 C. pH: Este es un factor importante en la fermentacin,
debido a su importancia en el control de la contaminacin bacterial como
tambin al efecto en el crecimiento de las levaduras, en la velocidad de
fermentacin y en la formacin de alcohol. Durante la fermentacin la levadura
toma el nitrgeno de los aminocidos orgnicos, perdiendo su carcter
anftero y pasando a cidos, lo cual origina una disminucin del pH del medio.
Cuanto ms bajo el pH del medio, tanto menor el peligro de infeccin, pero si
se trabaja con pH muy bajos la fermentacin es muy lenta, ya que la levadura
no se desarrolla de la forma conveniente. Segn estudios se hall que el pH
ms favorable para el crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae se
encuentra entre 4.4 - 5.0, con un pH de 4.5 para su crecimiento ptimo.
Concentracin de nutrientes: Como ya se dijo, la presencia de sustancias
nutritivas adecuadas es una condicin necesaria para el crecimiento y
desarrollo de la levadura, siendo su concentracin un factor primordial en la
actividad vital de la levadura. Las principales sustancias nutritivas y las ms
influyentes son el nitrgeno, fsforo, azufre, vitaminas y trazas de algunos
elementos.

III.

MATERIALES Y DESCRIPCION
MATERIA PRIMA
PIA:
CANTIDAD: 2 PIAS

REGULADORES
Azucar rubia:
Acido ctrico (no se utilizo)
Agua
NUTRIENTES:
Sulfato de magnesio
Fosfato acido de sodio
Sulfato de fierro

CATALIZADORES
Levadura de pan fresca
IV.

EQUIPOS Y DESCRIPCION
1. Reactor
Se adecuo un balde para proceder con la fermentacin de la biomasa, este
recipiente fue de una capacidad de 5 litros y se lo sello para que proceda la
fermentacin y se estableci una temperatura constante.

2. Calentador
La funcin de este calentador fue de mantener la temperatura constante del
medio para que pueda realizarse una fermentacin eficiente.Tubos de ensayo,

en los cuales se almacenaron las muestras tomadas durante el transcurso de la

realizacin de la prctica.

3. Centrifugadora, una mquina que pone en rotacin una muestra para

acelerar por fuerza centrfuga la decantacin o sedimentacin de sus
componentes o fases (generalmente una slida y una lquida), en funcin de
su densidad

4. Medicion de Grados Brix

Se denomina refractometra, al mtodo ptico de determinar la velocidad de
propagacin de la luz en un medio/compuesto/substancia/cuerpo, la cual se
relaciona
directamente
con
la
densidad
de
este
medio/compuesto/substancia/cuerpo. Para emplear este principio se utiliza la
refraccin de la luz, ((la cual es una propiedad fsica fundamental de cualquier
sustancia), y la escala de medicin de este principio se llama ndice de
refraccin.

5. Equipo de Destilacion
Se utiliz para obtener el alcohol de la biomasa.
Consta de:

Baln, en el cual se deposit la biomasa final para as empezar con la

primera destilacin.
Refrigerante de Bolas, su funcin es presentar mayor superficie de
contacto entre el vapor de su interior caliente y el agua exterior que
enfra. De este modo se asegura que todo el vapor se condense en
lquido.
Cocinilla, su funcin principal fue de elevar la temperatura del medio
para la obtencin de los alcoholes.

6. Equipos para la titulacin con reactivos Tollens y de Fehling

Bureta, material de vidrio en el cual se cargaron con los reactivos antes
mencionados para la determinacin de azucares reductores presentes.
Bao Mara, El concepto de bao Mara implica el calentamiento
indirecto, por conveccin trmica de la media agua. Para calentar al
bao Mara hay que introducir un recipiente pequeo dentro de otro ms

grande lleno de agua y llevarlo al fuego. De este modo, lo que se

calienta en primer lugar es el agua contenida en el recipiente de mayor
tamao y sta es la que poco a poco va calentando el contenido del
recipiente menor, de un modo suave y constante. Es Indispensable que
en todo tiempo el recipiente interior (ms pequeo), haga contacto con
el agua; de otra forma no se producir la transmisin de calor.

V.

PARTE EXPERIMENTAL Y CONCLUCIONES:

Datos de la parte experimental
Extracto de Jugo de pia = 870 ml
Cantidad de agua = 10 ml
Total de liquido de pia = 880 ml
PH: 3.5
BRIX: 6.9
Tiempo de fermentacin: tres semanas
Temperatura de fermentacin: 30 C

N
1
2

BRIX
13.2
13.6

Ph
3.5
4

3
4
5
6
7
8
9

12.7
11.8
14
12.2
10.3
6.1
5.2

4
3
3
3
3
3
3

comportamiento de los BRIX durante el proceso de fermentacion

12
10
8
BRIX

6
4
2
0
0

6
MUESTRAS

10

12

comportamiento de los BRIX durante el proceso de fermentacion

12
10
8
BRIX 6
4
2
0
0

10

nuestras

FILTRADO:
peso tela seca

64 gr

inicio del
proceso
se utilizo 35g

6.9
20.4

densidad
volumen

3.5
4

217.5
870ml

DATOS PARA LA OBTENCION DE BIOMASA:

Peso de los tubos de ensayo secados en el horno microondas
t

5(min)

5 (min)

10.8

10.8

10.9

10.9

7.9

7.9

10.9

10.9

10.8

10.8

1
2

7.6

7.7

7.7

7.6

Destilacin:
BRIX

16.9
11.5
5.4
3.2
2.1

Volumen
(ml.)
0
50
150
250
255
230

Tiempo
(min.)
0
15
30
60
70
80

Grados BRIX de la mezcla final 14.6

Medida de los grados brix por cada dos horas
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Brix
10.3
8.8
5.6
4.7
2.1
1.6
0.8
0.4
0.1

Volumen de alcohol destilado 305 ml

Segundo Destilado:
Grados BRIX de la primera muestra del destilado 19.7 duro aproximadamente
90 min hasta que la temperatura alcanzara los 92C

VI.

DESARROLLO TEORICO
1. ESTEQUIOMETRIA DEL CRECIMIENTO CELULAR
Reaccin de la fermentacin:
Estequiometria del crecimiento molecular

Crecimiento Molecular de las clulas Saccharomyces cerevisiae no nos

referimos al aumento del tamao de una clula si no a la poblacin de la
misma es decir q aumente la cantidad de clulas para esto proceso necesita
sientes requisitos biolgicos:
Requerimiento Fsicos:
Temperatura
presin Osmtica
concentracin de hidrogeniones (pH)
Requerimientos Qumicos
Carbono
Oxigeno
Fuentes de Nitrgeno , Azufre fosforo y otros minerales segn la exigencia
de la clula

Materia Prima:
Extracto de pia

Agente Biolgico:
Saccharomyces cerevisiae

Producto:
Principales productos de a fermentacin

Biologa de las fermentaciones con levaduras ( Saccharomyces cerevisiae)

El etanol producido es por la ruta de Embden-Meyerhof-Pamas (EMP), en la que
el piruvato producido durante la glicosilacion se convierte en acetaldehdo y
etanol siguiendo la siguiente reaccin global

Glucosa+2 ADP Etanol+2 C O2+ 2 ATP

Siendo esta reaccin la reaccin de energa no calculada en este
experiencia.
Determinando las constantes estequiometrias donde su RQ
C H 1.64 O0.52 N 0.16 : Formaquimica de lalevadura Saccharomyces cerevisiae

Aerobia
Anaerob
ia

Aumento de clulas
(Reproduccin)
Producto Secundario (Fermentacin
alcohlica)

terico

C H 3 O 0.5+ A O2 + B N 2 C C H 1.704 O0.408 N 0.149 + DCO 2 + E H 2 O

1=C + D

Balance de Carbono (C):

3+3 B=1.704 C +2 E

Balance de Hidrogeno (H):

0.5+2 A=0.408C +2 D+ E

Balance de Oxigeno (O2):

Balance de Nitrgeno (N2):
R QTerico=

B=0.49 C

D
=0.66
A

A 1.457
0.0057
B 0.038
0.962
C 1.48
D
E
C H 3 O 0.5+ 1.457O2 +0.0057 N 2 0.038C H 1.704 O0.408 N 0.149 +0.962 CO2 +1.48 H 2 O

2. RENDIMIENTO DE BIOMASA
Escrito
3. PROCESO ANAERBICO

4. CINETICA DE REACCION DE BIOPROCESOS

MILE
5. DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORAS

CONSUMO DE SUSTRATO
Los azcares que la levadura no ha consumido, azcares residuales, se
miden al emplear el mtodo de Fehling. Se tomaron 5 mL de muestra de
cada tiempo tomado de la fermentacin y se colocaron en un matraz
aforado de 100 mL, al cual se le agreg 20 mL de agua y 5 mL de cido
clorhdrico concentrado. El siguiente paso es calentar la muestra a
ebullicin durante 5 minutos, pasado ese tiempo se aaden 1.5 mL de
hidrxido de amonio y se lleva a 100 mL con agua destilada. Con esta
solucin se titula el reactivo de Fehling, el cual se prepara con 5 mL de
Fehling A y 5 mL del Reactivo de Fehling B, con una gota de azul de
metileno.
De las determinaciones anteriores se obtuvieron los siguientes datos:
MUESTRA
0
1
2
3
4
5
6

Gasto de la titulacion
7.9
8.6
10.8
11.1
15.0
15.0
15.8

El contenido de azcares reductores se calcula con la siguiente expresin matemtica:

Donde:
F = Factor de Fehling = 0.05 g de dextrosa (glucosa) equivalentes a 10 ml de
la mezcla de reactivos de Fehling.
V = Volumen del aforo = 100 ml
m = Masa de la muestra = 5 ml
g = Gasto de la titulacin.

Ejemplo de clculo: Tomemos el ltimo tiempo para ejemplificar el

clculo de los azcares en el medio de cultivo:

De la manera anterior se calculan todos los dems datos de azcares

reductores, tales resultados se concentran en el siguiente cuadro:
MUESTRA

0
1
2
3
4
5
6

TIEMPO DE
FERMENTACION
(HORAS)
0
5.68
22.83
31.67
93.45
99.28
120.66

GASTO DE LA
TITUACION (ml)

%AZUCARES
REDUCTORAS

7.9
8.6
10.8
11.1
15.0
15.0
15.8

12.65
11.62
9.26
9.009
6.66
6.66
6.33

Interpretacin de resultados
Al inicio de la fermentacin los azcares se espera que sean altos ya que la
levadura an no consume el sustrato y el metabolismo es lento. En las
horas siguientes, el metabolismo se acelera y el consumo de sustrato por la
levadura aumenta, este consumo lo hace principalmente para
mantenimiento celular y 7 para generacin de biomasa, adems de que la
levadura al no contar con oxgeno en el medio tiene que fermentar, por lo
tanto genera un metabolito que utiliza como ltimo aceptor de electrones
(acetaldehdo) para formar el etanol. Esto se observa en el grfico de
consumo de sustrato perfectamente ya que en los primeros tiempos de
fermentacin el consumo es elevado y se incrementa a una velocidad
elevada; conforme transcurre la fermentacin el consumo va disminuyendo,
se puede observar que en los ltimos tiempos los azcares reductores no
cambian, esto indica un cese del crecimiento de levaduras, ya no hay
consumo de sustrato, muy posiblemente las levaduras han alcanzado una
fase de muerte celular y no consumen el sustrato.

VII.

OBSERVACIONES
a. La fermentacin alcohlica se puede considerar (desde una
perspectiva humana) como un proceso bioqumico para la obtencin
de etanol, que por otras vas se ha obtenido gracias a procedimientos
qumicos industriales, como por ejemplo mediante la hidratacin de
etileno. La finalidad de la fermentacin etlica (desde una perspectiva
microbiana) es la obtencin de energa para la supervivencia de los
organismos unicelulares anaerbicos.
b. Con la prctica y la investigacin obtenida durante sta, se puede
notar que la fermentacin alcohlica es la base de la vinificacin, sin
embargo, su importancia no est nicamente en la obtencin de
etanol a partir de los azcares, sino que adems durante este
proceso se van a formar una gran cantidad de productos secundarios
que influyen en la calidad del vino.
c.

VIII.

Esta fermentacin sera completamente imposible sin un soluto

como lo es la glucosa, y obviamente variara demasiado sin la
cantidad exacta de sta. Es necesario modificar las variables de
forma en que nos demos cuenta que cambio se genera al modificar
cada una. Algunos microorganismos que realizan la fermentacin
alcohlica son:Levaduras (Hongos unicelulares eucariotas) como
Saccharomyces cerevisiae, Anaerobias Facultativas(pueden o n fijar
el O2 atmosfrico), Bacterias Anaerobias Obligadas que producen la
Fermentacin alcohlica natural en Frutas(Vid y otras).

CONCLUSIONES

REACCION
ESTQUIOMETRI
CA
RENDIMIENTO
DE BIOMASA
DETERMINACIO
N DE
AZUCARES
REDUCTORAS
IX.
X.

C H 3 O 0.5+ 1.457O2 +0.0057 N 2 0.038C H 1.704 O 0.408 N 0.149 +0.962 CO2 +1.48 H 2 O

RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFIA
1. HERNANDEZ, Alicia; ALFARO, Ileana; ARRIETA Ronhald, Microbiologa Indus
trial 1raed .Espaa: Editorial EUNED.

2. INGRAHAM, John; INGRAHAM Catherine, Introduccin a la microbiologa 1ra e

d.Espaa: Editorial Revert
3. PERRY Robert H., Manual del Ingeniero Qumico 7ma ed. Espaa: Editorial Mc
Graw-Hill, 2004.
4. SUAREZ LEPE, Jos Antonio; IIGO LEAL, Baldomero, Microbiologa Enolgi
ca 2 ed.Espaa: Editorial Mundi-Prensa 1992.
5. YUAN KUN, Lee, "Biotecnologa Microbiana: Principios y Aplicaciones" 1ra ed.
Estados Unidos: Editorial Mundo Cientfico, 2006.
6. Guillaume, C., P. Delobel, J. M. Sablayrolles and B. Blondin. 2007. Molecular
basis of fructose utilization by the wine yeast Saccharomyces cerevisiae: a
mutated HXT3 allele enhances fructose fermentation. Appl Environ Microbiol .
73(8):2432-2439.
7.Perez, M., K. Luyten, R. Michel, C. Riou and B. Blondin. 2005. Analysis of
Saccharomyces cerevisiae hexose carrier expression during wine fermentation:
both low- and high-affinity Hxt transporters are expressed. FEMS Yeast Res.
5:351-361.

XI.

ANEXOS