SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
DETERMINACION DE MICROORGANISMOS EN EL AMBIENTE,
SUPERFICIES Y PROCESADORES DE ALIMENTOS

1. INTRODUCCION
Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, agua,
superficie de objetos e incluso sobre nuestra piel. Para asegurar la calidad de los alimentos
debe prestarse atencin tanto a los microorganismos patgenos como a los alterantes, que
pudieran llagar a las materias primas o al alimento terminado, a partir del hombre
(manipulador), de los equipos, tuberas, superficies, aire, etc. Cuando se trabaja en la
industria de alimentos es importante determinar el grado de contaminacin ambiental, ya
que de las condiciones higinicas del lugar de trabajo (utensilios, superficies, etc.) y del
propio manipulador van a depender en parte el nmero y tipo de microorganismos del
alimento, lo cual garantiza la efectividad de las buenas prcticas de manufactura BPM.
Los equipos, utensilios y superficies, utilizados en el procesamiento, fabricacin o
preparacin de alimentos, deben estar diseados, construidos, instalados y mantenidos de
tal forma que se evite la contaminacin del alimento y se facilite el proceso de limpieza y
desinfeccin de los mismos. Igualmente es importante el estudio microbiolgico del aire
(ambiente), ya que este se pone en contacto con los alimentos, por eso se debe estar seguro
de trabajar en un ambiente adecuado, debidamente desinfectado o esterilizado.
2. OBJETIVOS

Evaluar la calidad del ambiente en el que los alimentos son procesados.

Determinar la carga microbiana en las superficies en donde son procesados los
alimentos.
Comprobar el recuento, presencia y/o ausencia de microorganismos patgenos en el
procesador de alimentos.

3. MATERIALES

Yeast Glucose Cloranphenicol (YGC)

Standard Plate Count (SPC)
Eosin Methyl Blue (EMB)
Baird Parker (BP)
Caldo Lactosado
Caldo brilla

Caldo Indol
Caldo BHI
Cajas Petri
Erlenmeyer
Tubos de ensayo
Agua peptonada 0.1%
Hisopos
Plantilla 20cm2

4. METODOLOGIA
4.1. PRUEBA DE AMBIENTES
Mtodo de sedimentacin
El aire, adems de las partculas en suspensin, es portador de bacterias, hongos y sus
esporas. Por ello, puede ser causa tanto de contaminacin de alimentos y superficies como
de infecciones en el hombre (infecciones respiratorias, etc.).
Existen distintos mtodos para el anlisis del aire: sedimentacin, filtracin, choque en
lquidos y precipitacin electrosttica, entre otros. En esta ocasin realizaremos la prueba
por sedimentacin en placa, uno de los mtodos ms sencillos que nos orienta sobre la
densidad poblacional microbiana presente en el aire, ya que los niveles varian en funcin de
las corrientes de aire y del tamao de las partculas en suspensin. Mediante esta prueba,
determinaremos los siguientes grupos microbianos:

Mohos y levaduras
Microorganismos hetertrofos Mesfilos

Para cada grupo microbiano se seguir el siguiente procedimiento:

1. Tome un nmero de cajas con YGC y SPC de tal manera que abarque el lugar a
evaluar.
2. Colquelas sobre una superficie x distantes, ya sea en forma de M, X o Z.
3. Destpelas dejndolas expuestas al ambiente durante 15 min.
4. Selle las cajas y llvelas a incubar: microorganismos hetertrofos a 37C x 24-24
horas y los mohos y levaduras a 25C x 5-7 das.
5. Pasado el tiempo de incubacin realice el respectivo recuento.
4.2. PRUEBA DE SUPERFICIES
Para llevar a cabo una correcta manipulacin de los alimentos es necesario mantener una
limpieza adecuada tanto en las superficies de trabajo como en los utensilios que hay que
emplear. A no ser que los alimentos hayan sido esterilizados, todos los productos llevarn

microorganismos. En la manipulacin, el envasado y el almacenamiento de los alimentos,

estos microorganismos deben mantenerse en todo momento en niveles que aseguren la
calidad microbiolgica del alimento.
El objetivo de los anlisis microbiolgicos de superficies es comprobar el estado higinico
del lugar de trabajo, de modo que evitemos contaminaciones cruzadas durante el procesado
de los alimentos. El mtodo del hisopo es uno de los ms antiguos y utilizados ya que sirve
para evaluar superficies planas como no planas, mediante esta prueba, determinaremos los
siguientes grupos microbianos:

Mohos y levaduras
Microorganismos hetertrofos Mesfilos
Coliformes totales y Coliformes fecales (E.coli).

Mtodo 1:
Procedimiento de la plantilla por hisopo
1. Tomar la plantilla estril de 20cm2 y colocarla sobre la superficie a evaluar.
2. Seguidamente humedecer un hisopo estril en agua peptonada estril.
3. Frotar la superficie y realizar de inmediato la siembra masiva en superficie del
respectivo agar (YGC, SPC, EMB).
4. Llevar a incubacin teniendo en cuenta el requerimiento de temperatura para cada
grupo microbiano: Mesofilos a 37C x 24-48 horas, Mohos y levaduras a 25C x 57 das y los Coliformes a 37C x 24-48 horas.
5. Pasado el tiempo de incubacin realice el respectivo recuento.
Nota: Cada vez que se determine un grupo microbiano, deber cambiarse el punto
muestreado en la superficie.
Mtodo 2:
Procedimiento de la esponja o gasa estril.
1. Con la ayuda de una bolsa de plstico, a manera de guante, tomar la esponja estril,
evitando posibles contaminaciones.
2. Verter unos mililitros de Caldo lactosado a la esponja y muestrear el utensilio,
equipo o superficie seleccionada, frotando la esponja por toda el rea.
3. Dejar la esponja en el interior de la bolsa, una vez finalice la operacin y agregar el
resto del Caldo lactosado.
4. Cerrar y marcar la bolsa.
5. Exprimir la esponja varias veces, suavemente.
6. Incubar la bolsa con la esponja a 37C durante 24 horas.
7. Pipetear 1ml de caldo lactosado y transferirlo a un tubo con Caldo brilla.
8. Incubar a 37C durante 24 a 48 horas.
9. Realizar la lectura observando la presencia de gas y turbidez.

4.3. PRUEBA DE MANIPULADORES

Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador quien
lo contamine durante el procesado. La persona que va a manipular un alimento tiene una
abundante carga microbiana en su piel, pero nunca debern aislarse de ella bacterias
patgenas o que indiquen mala higiene. Por lo tanto, resulta evidente la necesidad de que el
manipulador mantenga unas perfectas condiciones de higiene durante el procesado de los
alimentos.
El objetivo de un anlisis de manipuladores es comprobar que la persona que procesa el
alimento no es una fuente de contaminacin de ste. Se pueden estudiar: manos, uas y
fosas nasales.
Dentro de este contexto, se realizara el frotis de manos, fosas nasales y faringe para
determinar S. aureus, Mesfilos, Coliformes totales, Coliformes fecales (E.coli), Mohos y
levaduras, mediante el siguiente procedimiento:
Fosas nasales y Faringe
1. Marcar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) como muestra farngea y
nasal respectivamente.
2. Inmovilizar la lengua con un bajalengua.
3. Frotar con un escobilln los pilares amigdalianos, realizar un frotis y sembrar en el
Agar Baird Parker (Salado de Manitol).
4. Introducir un escobilln en las fosas nasales y frotarlo suavemente en las paredes,
realizar un frotis y sembrar inmediatamente en el Agar Baird Parker (Salado de
Manitol).
5. Incubar por 24-48 horas a 37C.
6. Observar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) y buscar colonias
negras brillantes con un halo blanco rodeadas de halos claros que contrastan con el
medio (Colonias puntiformes amarillas con halos amarillos).
7. Realizar un frotis de cada caja a partir de las colonias de inters y colorearlos con
Gram, se deben observar cocos gram positivos agrupados en racimos.
8. Tomar 3 colonias de cada caja y transferirlas a tubos con caldo infusin cerebro
corazn (BHI), marcados respectivamente como fosas nasales y faringe.
9. Incubar por 24 horas a 37C.
10. Realizar la prueba de la coagulasa: transferir 0.3 ml de cultivo BHI + 0.3ml de
plasma fresco, incubar a 37C en bao serolgico por 4 horas observando cada hora
la formacin de coagulo.
Manos
Evaluacin de contaminacin fecal
Mtodo 1:

1. Frotar un escobilln humedecido con caldo brilla las manos, dedos y uas del
manipulador.
2. Introducir el escobilln dentro de un tubo que contiene Caldo brilla con tubo
durham.
3. Tapar bien el tubo.
4. Incubar a 37C por 24-48 horas.
5. Realizar la lectura (turbidez y produccin de gas indican presencia de coliformes
totales).
6. Confirmar la presencia de coliformes Totales, sembrando en placas de Agar EMB.
7. Incubar a 37C durante 24 horas.
8. Realizar la lectura observando la presencia de colonias sospechosas de coliformes
Totales (Colonias grandes verdosas con brillo metlico).
9. Transferir dos asadas del tubo positivo a un tubo con caldo brilla (con tubo durham)
y a uno con caldo indol.
10. Incubar en bao serolgico a 45C por 24-48 horas, asegurndose de que el nivel del
agua cubra el medio de cultivo.
11. Adicionar 5 gotas del reactivo de Kovacs al tubo con Caldo indol, para la
determinacin de indol.
12. Realizar la lectura (la turbidez y el gas en el tubo de brilla y la produccin de indol
en el Caldo indol, indican la presencia de coliformes fecales). Recuerde que solo la
positividad de ambos tubos, indican la presencia de Coliformes fecales.
Mtodo 2:
1. Tome un hisopo estril y humedzcalo en agua peptonada estril.
2. Seguidamente tome la mano del procesador de alimentos y frote el hisopo en la
mano, uas y espacios interdigitales.
3. Posteriormente, realice la siembra masiva en la superficie de los respectivos agares
(BP, EMB, YGC, SPC).
4. Llevar a incubacin teniendo en cuenta el requerimiento de temperatura para cada
grupo microbiano: Mesofilos a 37C x 24-48 horas, Mohos y levaduras a 25C x 57 das, Coliformes a 37C x 24-48 horas y S. aureus a 37C x 24-48.
5. Pasado el tiempo de incubacin realice el respectivo recuento.
Nota: Cada vez que se determine un grupo microbiano deber cambiarse de hisopo.
5. INTERPRETACIN Y REPORTE
Esta prueba sirve para establecer la eficacia del lavado de las manos en manipuladores y
se reporta la diferencia entre las UFC antes y despus del lavado
6. BIBILOGRAFIA

 ICONTEC. 2009. Norma Tcnica Colombiana NTC 4092. Microbiologa de alimentos y

productos para alimentacin animal. Requisitos generales y directrices para anlisis
microbiolgicos.
INVIMA. 1998. Manual de tcnicas de anlisis para control de calidad
microbiolgico de alimentos para consumo humano.
KONEMAN, Elmer W. y Cols.
Diagnstico Microbiolgico.
Editorial
Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
Acosta de Guevara Emma y Gonzlez Ortiz Lucy. Fundamentos para el anlisis
microbiolgico de los alimentos. Barranquilla, 1995.
MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre
manipuladores, 1997.
ESCOBAR DUQUE Mara Beatriz. Manual de tcnicas y procedimientos.
Programa Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos.
Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez.
Medelln, 1994.