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G E N E RA R C O M P L E J O S P E R F I L E S
DE ADN UTILIZANDO
M A RC A D O R E S B A S A D O S E N A LU
C O N A P L I C AC I O N E S E N F O R E N S E ,
PAT E R N I DA D , M A P E O G E N E T I C O ,
E S T U D I O S D E P O B L AC I N Y
ANCESTROS
ABSTRACT
Como los sistemas de perfiles de ADN se vuelven cada vez ms complejos, los avances en una
tcnica relativamente sencilla promueven una mejor accesibilidad y utilidad para una variedad de
aplicaciones. En contraste, otras herramientas simples comnmente usadas para ensear a los
estudiantes sobre la ciencia forense y las poblaciones humanas tienen notorios inconvenientes. Dos
sistemas Alutetraplex, utilizados para las variantes de presencia /ausencia de Alu en una reaccin
simple ha sido modificado para proveer una metodologa simple para generar perfiles complejos. Se
presenta un tercer sistema Alutetraplex, aumentando el nmero de genotipos posibles 531,441 con
todos los alelos de 12 marcadores dimorficos relativamente comunes. Se obtuvieron resultados
reproducibles incluso con el uso de prepraciones de ADN crudo almacenado congelado por varios
con multiples deshielos. La incorporacin del tinte para ADN GelRed en vez de el bromuro de
etidio altamente toxico promueve mejor accesibilidad, particularmente en el contexto de una sala de
clases. Este estudio demuestra la efectividad de este sistema para realizar perfiles como una
metodologa simple pero informativa par analizar paternidad, mapeo gentico de caracteres
humanos, y provee informacin para ilustrar su potencial al buscar ancestros u orgenes geogrficos
de un individuo.
Armar un perfil de ADN es complicado asique estos tipos mejoraron la tcnica
para que fuese mpas fcil incluso para una clase. Se usaba un sistema
Alutetraplex para ver el dimorfismo de una secuencia Alu, ahora se presenta
un tercer Alutetraplex que se ve con 12 marcadores altamente comunes,
pudiendo reconocer hasta 531,441 genotipos. El resultado es reproducible
incluso en un ADN crudo que se congelo hace tiempo y se ha descongelado
varias veces. Se usa gelred en vez de bromuro de etilio.
INTRODUCCIN
El numero variable de repeticin en tndem (VNTR= variable number tndem repeat) del D1S80 y
el elemento Alu dimorfico PV92 estn comnmente incorporados en las herramientas para armar
perfiles de ADN con propsitos educativos sobre estudios forenses y estudios de poblacin humana
(1). De todos modos, estas herramientas simples y de bajo costo tienen notorios efectos adversos. El
limite al campo de resolucin dificulta evaluar alelos del locus D1S80, particularmente en los geles
de agarosa; donde los locus PV92 solo consiste en 2 alelos (presencia o ausencia del Alu) o 3
posibles genotipos y por tanto no es muy informativo. PV92 es un ejemplo de un Alu de frecuencia
intermedia (IF), por lo cual tanto la forma que la presenta como la que no, tambin conocido como
dimorfismo, son comunes en la poblacin humana. Estos tipos de variantes resultan de un evento
integrativo relativamente reciente del retrotransposon Alu (figura 1), y por lo tanto no se repara en
el genoma humano. Aproximadamente son dimorficos 1,200 de los ms de 1 millon de elementos
Alu presentes en el genoma humano (2). La presencia o ausencia de alelos puede distiguirse
mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando primers que flanquean el
elemento (figura 1). Se han identificado un numero de variantes IF de Alu (3,4) y , al combinar
varios de estos marcadores en una sola reaccin incrementa exponencialmente el numero posible de
genotipos, sin incrementar la cantidad de reacciones.
Un gran obstculo al generar estos perfiles por PCR multiples es la formacin de heteroduplexes,
son elementos muy similares a Alu, se encuentran en cada variable de presencia, y limita la
capacidad de la Taq ADN polimerasa standard con una variedad de condiciones (5-7). El sistema
Failsafe (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) diseado por la dificultad del PCR multiple ha
demostrado trabajar bien con hasta 4 locis IF Alu en una reaccin simple, conocido como un
Alutetraplex, donde el ajuste primario es modificar las concentraciones de primer (6,7).
VNTR= numero variable de repeticin tndem. Generalmente para ensear la
tcnica se usan el VNTR del D1S80 y el Alu dimorfico del loci PV92, pero su
reconocimiento est limitado en el gel de agarosa porque por ejemplo en el
PV92 solo hay 2 alelos (Alu /) asiqeu no da mucha . El Alu del PV92 es
de frecuencia intermedia (IF), osea es dimorfico. Hay ms de 1 millon de
Alu, de esos ~1.200 son dimorficos, si estn o no se puede ver por PCR. Como hay muchos Alu
dimorficos, cuando se combinan en una sola reaccin da muchos genotipos posibles, pero no
aumenta la cantidad de reacciones. Un problema con los PCR multiples es que se forman
heteroduplexes, son cosas similares a Alu que estn en los lugares en que hay Alu dimorfico. Asique
se creo el sistema Failsafe que permite trabajar con hasta 4 Alus dimrficos en una sola reaccin,
eso se conoce como Alutetraplex, la gracia es que cambian las concentraciones de primer.
Los Alutetraplexes ofrecen una tecnologa de costo relativamente bajo que es simple de usar,
requiere solo el equipamiento estndar de un laboratorio y oermite elaborar perfiles de DNA
relativamente complejos.Esta tcnica entrega a cada estudiante la eportunidadd de realizar anlisis
forenses al utilizar muestras de ADN y aparearlas con una desconocida seleccionada por el
instructor (7). Junto con una base de datos construida con envios annimos (8), tambin le permite a
los estudiantes determinar la proporcin de individuos con el mismo genotipo, asi como tambin
realizar una variedad de anlisis de poblacin tales como distancias genmicas y asesoras de
equilibrio de Hardy-Weinberg. Los 2 Alutetraplexes desarrollados (7) generan 6.561 genotipos
posibles (34 x 34), que excede por lejos los 435 posibles genotipos para D1S80. Adicionalmente, se
encontr un locus de Alu IF que consiste en 4 alelos (9) ofreciendo una herramienta nica para
estudiar poblaciones humanas, particularmente considerando que se puede determinar el orden
evolutico de la generacin de alelos. Junto con los anlisis forenses y poblacionales, esta simple
tcnica demuestra como los marcadores de DNA pueden usarse en la paternidad (7).
FIGURA 1
MATERIALES Y METODO
MUESTRAS DE ADN
Crudo, las preparacines de ADN se obtuvieron utilizando el Epicentre BuccalAMP ADN
Extraction Kit protocol (protocolo del kit de extraccin de ADN bucal) del interior de mejillas. La
aprobacin se obtuvo mediante sujetos humanos que revisaron el panel
MAPEO GENETICO
2 familias, en las cuales el padre y 2 nios tenan el sndrome ACHOO, pero no la madre, ofrecieron
voluntariamente sus muestras de ADN para este estudio. Las condiciones del PCR Alutetraplex y
los primers se obtuvieron en un estudio previo [7]. Las variantes Alu que eran heterocigotas en el
padre y homocigotas en la madre habran sido tiles para asesorar sobre la descendencia. Los
puntajes de carga para las medidas estadsticas se determinaron al usar la formula Log0 [(1/2 (1)nr x r)/(0,5)n+r+ (1/2 (1-)nr x r)/(0,5)nr+r] [12], donde nr son los no-recombinantes y r los
recombinantes, asumiendo que un alelo estligado con la caracterstica en el mismo cromosoma,
y que con nr y r se refiere alos no-recombinantes y recombinantes respectivamente, al asumir que
los alelos alternaticos estn inicialmente en el mismo cromosoma que el alelo de la caracterstica.
reproducibles. Alutetraplex 3 se gener por amplificacin PCR usando Buffer E 1x (Failsafe buffer
que contiene dNTPs y MGCL; Epicentre Biotechnologies, Madison, EI), primer (secuencias en la
tabla 1) con concentraciones de 270 nM (109F), 270 nM (109R), 270 nM (65F), 270 nM (65R),
230nM (201F), 230nm(201R), 340 nM (241F), 340 nM (241R), 1u FailSafe enzima (Epicentre
biotechnologies) y 1 l de preparado de ADN crudo en un volumen de 25 l usando las siguientes
condiciones de ciclado: 94C por 2m, seguidos de 32 ciclos de 94C por 30s, 58C por 30s, 72C
por 1 m 30s, con una extensin final a 72C por 5m. Los productos amplificados se separaron en un
gel de agarosa 2% en buffer TAE 1x con tinte GelRed (Biotium, Madison, WI) incorporado en el
gel. Los geles se corrieron a 135 volts hasta que la banda de azul bromofenol estuvo en el fondo o
justo apenas salindose del gel.
RESULTADOS