Sunteți pe pagina 1din 156

1.

Norme de protecie a muncii n laboratorul de


microbiologie. Exemple de echipamente care pot fi
utilizate n laborator

1. 1. Cuvinte cheie
Laborator de microbiologie
Norme de protecie
Accident de lucru
Mnui
Microscop
Hote microbiologice (cabinete de siguran biologic)
1. 2. Introducere
Laboratorul de microbiologie are ca scop furnizarea unor rezultate corecte i de calitate care s poat
fi utilizate de clinician pentru a diagnostica i trata pacientul. Primul pas este recoltarea corect a
produsului patologic (p.p.); i p.p. ulterior se poate face identificarea agentului patogen responsabil de
mbolnvire.
Laboratorul de microbiologie poate fi organizat diferit in funcie de localizare i de complexitatea
testelor pe care le poate realiza: laborator al unui spital public, laborator al unui cabinet medical,
laborator particular, laborator independent, laborator de cercetare, etc.). n general n laboratorul
standard de microbiologie ntlnim apte secii:

Bacteriologie aerob i anaerob

Micologie

Micobacteriologie (sau bacteriologia tuberculozei)

Virusologie

Serologie

Diagnostic molecular (tehnologia amplificrii genice prin PCR)


Rezultatele obinute in cadrul laboratorului de microbiologie trebuie sa fie reproductibile i s respecte
normele de calitate stabilite de Asociaia de Acreditare din Romnia (RENAR).
n cursul lucrrilor practice (L.P.) de microbiologie, studenii vor avea posibilitatea s realizeze unele
etape din algoritmul de diagnostic de laborator bacteriologic sau serologic pentru diferitele
microorganisme studiate, conform programei universitare. Toate aceste manevre trebuie
efectuate corect i n siguran n vederea prevenirii unor infecii, iar ntreaga activitate va fi
supravegheat de asistentul de grup. Este obligatoriu ca studenii s i nsueasc normele de
protecie a muncii !
1. 3. Norme de protecie a muncii
Diagnosticul microbiologic pornete de la recoltarea produsului patologic (prescurtat p.p.) care poate
conine microorganisme patogene i potenial periculoase. Exemple de produse patologice: Exsudat
nazal/faringian, snge, urin, materii fecale, sput, puroi, LCR, diferite alte secreii, etc. Pentru a
identifica agentul patogen, de exemplu o bacterie, acesta va fi izolat n cultura pur, ceea ce
echivaleaz cu o concentrare a agentului patogen. Pentru prevenirea infeciilor, regulile urmtoare
trebuie aplicate, strict.
1. Este strict interzis accesul persoanelor strine n laborator. Pentru a putea intra studenii trebuie
mai nti s i nsueasc aceste informaii i s semneze un proces verbal privitor la aceast prim
activitate de la L.P.
2. Toate produsele patologice recoltate n vederea stabilirii unui diagnostic sunt considerate potenial
infecioase.

3. Este obligatorie purtarea halatului n laborator. Echipamentul de protecie cum ar fi: mnusile de
latex, ochelarii, masca, cotierele sau chiar lucrul n incinte speciale, vor fi stabilite n funcie de situaie
de ctre asistentul responsabil de grup.
4. n laborator nu se alearg, se merge atent. Prul lung trebuie purtat strns n coad.
5. Este interzis s se mnnce sau s se bea n laborator i n sala de lucrri practice; de asemenea
este interzis mestecarea gumei de mestecat.
6. Pipetarea se realizeaz cu pipete speciale, nu cu gura, iar n cazul pipetelor de unic folosin, de
plastic sau sticl, se utilizeaz dispozitivele de pipetare,(Figura nr. 1). Este interzis introducerea n gur
a oricrui tip de obiect.
7. n cazul contaminrii trebuie anunat asistentul de grup care hotrte cum trebuie procedat.
8. Toate activitile de prelucrare a microorganismelor se realizeaz n vecintatea becului de gaz
aprins.
9. nsmnrile se efectueaz la flacr; nu se poart mnui de latex in apropierea flacrii care nu
trebuie lsat nesupravegheat.
10.Ansa bacteriologic se sterilizeaz pn la incandescen, la rou, att bucla ct i firul ansei (iar
portansa se flambeaz) nainte i dup folosire; ansa trebuie s se rceasc nainte de utilizare.
11.nainte de nceperea oricrui experiment sau nainte de nceperea oricrei manevre, trebuie studiate
toate etapele; nimic nu se execut far aprobarea asistentului de grup.
12.Materialele de lucru refolosibile, lame de microscop, pipete, etc., contaminate nu se
decontamineaz la rou; trebuie introduse n containerul cu substane dezinfectante pregtit special
de personalul catedrei (care este pus pe masa de lucru nainte de nceperea lucrrii practice).
13.Se vor verifica etichetele tuturor reactivilor ce urmeaz a fi utilizai pentru a evita amestecarea unor
substane ce pot exploda, nu se privete n tuburi al cror coninut a fost nclzit.
14.n cazul unui accident de lucru (de ex. contaminarea accidental a suprafeei de lucru cu substane
diverse, cu reactivi, cu produse patologice sau culturi) trebuie anunat imediat asistentul de grup;
acesta va ndruma studenii n procesul de decontaminare, dup caz.
15.Se recomand punctualitate la lucrarea practic. Majoritatea indicaiilor se dau la nceputul
experimentelor i sunt importante pentru evitarea accidentelor.
16.n timpul experimentelor este obligatoriu s se noteze observaiile, pentru a putea fi utilizate
ulterior.
17.La sfritului lucrului n laborator sau oricnd este necesar minile se vor spla cu ap i spun.
Respectarea acestor norme de protecie este obligatorie i strict necesar.
1. 4. Echipamente care se utilizeaz n laboratorul de microbiologie
Echipamente fixe:
Dulapuri de laborator, trepiede, stelaje, hote microbiologice (Figura nr. 2), frigidere, congelatoare,
termostate, bi de ap sau de nisip, centrifugi, balane, agitatoare mecanice, dispozitive de triturare a
esuturilor, aparate pentru distilarea sau demineralizarea apei, spectrofotometre, aparatur de
sterilizare, containere pentru deeuri, microscoape, pH-metre, arztoare Bunsen (Figura nr. 3) etc.
Echipamente mobile si consumabile:
Truse de colorani (Figura nr. 4), sticlrie (eprubete, lame i lamele pentru microscopie), anse
bacteriologice, pipete, lupe, inventar de material plastic i cauciuc (plci Petri, vrfuri, pipete de unic
folosin, tuburi eppendorf, diferite tampoane, etc), site de azbest (Figura nr. 5).

n laboratorul de microbiologie se efectueaz diagnosticul de laborator n cazul multor infecii iar paii
care alctuiesc acest algoritm se efectueaz n hote microbiologice (cabinete de siguran biologic,
incinte, boxe, nie), clasificate dup cum urmeaz:
Hota microbiologic de clas I (Figura nr. 2); este o incint aseptic cu flux de aer vertical care foloseste
un filtru pentru a curta aerosolii produi dinspre persoana care lucreaz i care se afl n laborator
ctre mediul exterior asigurnd un mediu de lucru steril. n plus, fluxul de aer creat previne
ptrunderea n spaiul de lucru a impurittilor din mediul inconjurtor.

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Hota microbiologic de clas II, (Figura nr. 6), folosete dou filtre. Unul dintre filtre asigur un curent
de aer steril n spaiul de lucru i cel de al doilea filtru purific aerul evacuat din hot. Aceast hot
asigur protecia total mpotriva particulelor strine si a contaminrii biologice.
Hota microbiologic de clas III, (Figura nr. 7), ofer protecie maxim personalului din laborator i
mediului deoarece toate materialele periculoase sunt coninute ntr-o incint nchis total i
ventilat. nzona de lucru sunt prevzute dou mnui prin care utilizatorul poate manipula produsele
patologice i aparatura de laborator n siguran realiznd o izolare total fa de agenii patogeni i
de materiale toxice infecioase utilizate.
1. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1.http://www.microbiologyonline.org.uk/teachers/safety-information/safety-guidelines
http://d.umn.edu/~rhicks/genmicro/Microbiology20Lab20Safety.pdf
http://www.mbio.ncsu.edu/mb452/safety/safety.html
http://dmcampus.webs.com/documents/lab20equipment20study.pdf
http://www.homeworkassignmenthelp.com/MicrobiologyOnline.aspx
http://microeguide.com/equipment/index.asp
1. 6. Povestire adevrat
Laboratoarele de microbiologie pot fi considerate i locuri periculoase. Cele mai multe dintre ele sunt
aprovizionate cu substane de tot felul, de la acizi sau alte chimicale cu poteniale efecte negative
asupra celuleui vii, la neurotoxine. n fiecare laborator de microbiologie exist becuri Bunsen ce
utilizeaz gaz natural i aparate care sterilizeaz la temperaturi nalte i presiune (autoclave).
Sunt multe povestiri privind aspecte n laborator. Un astfel de exemplu este cel al laborantei care nu a
calibrat corect centrifuga atunci cnd a centrifugat snge infectat HIV i tuburile centrifugate s-au
spart, trebuind s o curee (dar dac se mai i tia cu cioburile !?). Sau, un alt exemplu, cel al studentei
care nu a respectat normele de protecie i nu i-a legat prul i s-a ars la arztorul Bunsen. i s nu-l
uitm pe doctorul neatent ce a facut impetigo pentru c nu a manipulat corect o cultur
de Streptococcus pyogenes. Din fericire, toate acestea au fost accidente minore.
Iat ns i unul dintre cele mai grave accidente de laborator, din istorie.
n data de 2 aprilie 1979 , un focar de antrax a izbucnit lng oraul sovietic Sverdlovsk; a condus la
decesul a cel puin 64 de persoane. La momentul respectiv s-a dat vina pe un transport de carne
contaminat. Adevrul a fost dezvluit 13 ani mai trziu, cnd preedintele n funcie a recunoscut
cepidemia a avut ca surs un laborator de microbiologie din apropierea oraului. La un interviu dat
presei, fostul ef adjunct al departamentului Biopreparate care a mrturisit c sursa real a
contaminrii populaiei a fost laboratorul de microbiologie. Se pare c n cadrul unor manevre, nu au
fost respectate normele de protecie i nu a fost schimbat la timp un filtru de la sistemul de ventilaie.
Dei greeala a fost observat rapid, o mic cantitate despori de antrax a fost elibera i a infectat
populaia. Medicul a spus de asemenea c "n cazul n care vntul ar fi btut n direcie opus n acea zi
- spre oraul Sverdlovsk - rata de deces ar fi putut fi cu mult mai mare.
1. 7. De reinut
Normele de protecie sunt importante i trebuie respectate de toat lumea.
1. 8. Verificai-v cunotinele
1. Urmatoarele afirmaii sunt adevrate:
A. n laboratorul de microbiologie se poate mnca

B. Dac o lam este spart nu o folosi


C. Nu v uitai direct n tuburile nclzite
D. Prul poate fi purtat despletit
E. n laboratorul de microbiologie se poate mesteca gum.
2. Urmtoarele afirmaii sunt false:
A. Experimentele nu trebuie studiate nainte de nceperea lucrului
B. Nu punei etichete pe tuburi
C. Lang arztor nu se lucreaz cu mnui
D. Este interzis introducerea n gur a oricrui tip de obiect
E. Este interzis s alergi in laborator.
3. Urmtoarele echipamente sunt consumabile:
A. Hota microbiologic
B. Sticlria
C. Tuburile Eppendorf
D. Centrifugile
E. Lupele.
4. Urmtoarele echipamente sunt fixe:
A. Aparatele pentru distilarea sau demineralizarea apei
B. Spectrofotometrele
C. Aparatura de sterilizare
D. Sitele de azbest
E. Trusele de coloraii
5. Hota microbiologic de clas I:
A. Este o incint aseptic cu flux de aer vertical
B. Folosete un filtru
C. Folosete dou filtre
D. Este o incint aseptic cu flux de aer orizontal
E. Folosete trei filtre
1. 9. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Un microorganism atenuat nu poate determina niciodat boli severe.
2. Recomandrile de biosiguran trebuie respectate ntotdeauna.
3. Laboranii cu experien ndelungat nu pot pi nimic chiar dac nu respect regulile.
4. Orice boal survenit la un membru al personalului de laborator trebuie raportat conducerii i
medicului curant.
5. Mirosirea culturilor microbiene nu implic nici un risc.

2. Sterilizare i dezinfecie. (Gabriela-Loredana Popa,


Loredana-Sabina Manolescu)

2. 1. Cuvinte cheie
Sterilizare
Dezinfecie
Cldur umed
Cldura uscat
Dezinfecie chimic
2. 2. Introducere (definiii)
Curarea reprezint ndeprtarea materiei organice de pe instrumente sau
echipamente. Sanitarizarea reprezint reducerea numrului de ageni patogeni din locurile publice
(restaurante, toalete publice, etc.) n vederea prevenirii transmiterii bolilor.
Septic = contaminat cu ageni patogeni. Aseptic = lipsit de ageni patogeni i nepatogeni.
Prin asepsie se evit contaminarea mediului cu microorganisme i se menine sterilitatea esuturilor,
mediilor de cultur, medicamentelor etc.
Antisepsie = ndeprtarea / distrugerea formelor vegetative bacteriene de pe esuturi vii. Se realizeaz
cu ajutorul substanelor antiseptice (substane chimice).
Bacteriostatic = inhib creterea bacteriilor far a le distruge. Bactericid = distruge bacteriile (fr a
distruge ntotdeauna i sporii). Sporicid = agent capabil s distrug sporii. Fungicid = agent chimic
capabil s distrug fungii.Virucid = agent chimic capabil s distrug virusurile.
2. 3. Sterilizarea
Prin sterilizare se distrug toi agenii (patogeni, nepatogeni, forme vegetative sau spori) de pe o
suprafa sau din orice tip de mediu.
2. 3. 1. Sterilizarea prin cldur
Cldura este o metod fizic prin care se distrug agenii patogeni.
2. 3. 1. 1. Sterilizarea prin cldur uscat
Mecanism = oxidarea, denaturarea proteinelor sau carbonizarea structurilor bacteriene.
Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint meninerea n flacra becului
Bunsen, pn la nroire, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat. n acest mod se sterilizeaz ansa
bacteriologic (cu bucl sau fir); exersm la LP.
Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de 2-3 ori) a unui obiect, fr a se atinge temperatura de
incandescen. n acest mod se procedm n cazul portansei, lamelor, gtului unui recipient de sticl
(eprubet, etc). Nu reprezint sterilizare !
Incinerarea reprezint arderea complet, la temperaturi ntre 870-980C a unor materiale de unic
folosin, unor materiale infectate (infectele), reziduuri organice solide, gunoi. Incinerarea se realizeaz
n crematorii (incineratoare).
Cuptorul cu aer cald (pupinel, etuv, cuptor Pasteur) este o cutie metalic cu perei dubli n care se
obine i se menine o temperatur constant i uniform pentru sterilizare. Este necesar i un sistem
de ventilaie pentru uniformizarea temperaturii n interiorul aparatului. Temperatura este de 180C, iar
durata o or. Acest tip de sterilizare este recomandat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan,
pulberi inerte i termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (preferabil sterilizat n autoclav)
etc. Pupinelul nu trebuie suprancrcat; aerul trebuie s poat circula printre obiectele puse la sterilizat.
Sticlria i obiectele de porelan trebuie splate i uscate complet nainte de sterilizare i nvelite n
hrtie special. Nu se vor steriliza n pupinel soluiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc,
alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.
2. 3. 1. 2. Sterilizarea prin cldur umed
Mecanism = coagularea proteinelor i degradarea enzimelor. Se consider a fi cea mai eficient
metod de sterilizare.
Fierberea se realizeaz la 100C, 30 minute; distruge formele vegetative bacteriene dar nu i sporii.

Tindalizarea (sterilizare intermitent) se realizeaz la la 100C, cte 30 minute, 3 zile consecutiv. Se pot
steriliza medii de cultur i mediile care conin zaharuri i gelatin. n prima zi sunt omorte formele
vegetative bacteriene iar n a doua i a treiazisunt omori sporii care germineaz.
Pasteurizarea se realizeaz la trei nivele: nalt, mediu i jos. Este o metod de conservare a alimentelor
fr a distruge calitatea acestora. Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile n form vegetativ dar nu i
sporii. Pasteurizarea joas se realizeaz la 63C, 30 secunde. Pasteurizarea nalt (ultra-hightemperature / UHT), se realizeaz la 140C, 3 secunde. Se utilizeaz frecvent pentruprodusele lactate.
Autoclavarea este cea mai folosit metod de sterilizare. Folosete aburul sub presiune (de ex. la o
temperatur de 121C, 15 minute). Autoclavul este un cazan metalic de presiune care se nchide etan
cu un capac. Capacul este prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul lui vaporii de ap
sunt comprimai la presiunea necesar sterilizrii. Vaporii de ap ajung la 121C, la 1 atmosfer.
Prin autoclavare se sterilizeaz medii de cultur, obiecte de cauciuc, bumbac, diferite substane n
soluie, unele obiecte de sticlrie, materiale contaminate din laborator, instrumentar chirurgical
(metalic), aparate de filtrat etc.
Controlul sterilizrii prin autoclavare se poate realize prin metode biologice (hrtii de filtru ce conin o
6
cantitate de 10 spori de Bacillus stearothermophilus; hrtiile sunt puse in autoclav odata cu materialele
ce urmeaz a fi sterilizate i ulterior sunt puse la incubat pe medii de cultur; dac bacteria se dezvolt
n urma incubrii nseamn c sterilizarea nu a fost eficient).
2. 3. 2. Sterilizarea prin filtrare
Reprezint o metod fizic de sterilizare. Bacteriile pot fi reinute mecanic i electrostatic n porii unui
filtru. De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porelan, sticl poroas, azbest
impregnat cu caolin, pmnt de infuzori). Acum se folosesc mai frecvent membrane filtrante din esteri
de celuloz sau ali polimeri precum acetatul de celuloz (pori ntre 8 i 0,025mm). Unele dintre cele
mai bune filtre de sterilizare sunt filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters), filtre care se
utilizeaz pentru sterilizarea aerului n hotele microbiologice. Sterilizarea prin filtrare este utilizat
pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultur (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a
unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse n cazul sterilizrii prin cldur etc.
2. 3. 3. Sterilizarea prin intermediul radiaiilor
Se realizeaz prin doua tipuri de radiaii: neionizante (UV) sau ionizante (X etc). Mecanism = ruperea
legturilor de hidrogen sau oxidarea legturilor duble.
2. 3. 3. 1. Radiaiile neionizante
Acest tip de sterilizare este similar cu sterilizarea cu aer cald; poate fi utilizat pentru a steriliza seringi
preambalate sau catetere. Se pot utiliza i microundele.
Un alt exemplu sunt radiaiile ultraviolete, UV. Ele au lungimi de und diferite. Cele de 250-260 nm
sunt utile n sterilizarea suprafeelor de lucru, a aerului, (pentru repartizarea mediilor de cultur, alte
manevre aseptice etc) n cazul n care nu exist hote microbiologice cu flux laminar. Distrug bacteriile
dar nu pot penetra sticla, apa sau unele substane. Pot arde pielea i ochii. Lmpile cu UV sunt
numite lmpi germicide. Radiaiile UV cu lungimi de und de 200-390 nm sunt cele mai eficiente.
2. 3. 3. 2. Radiaiile ionizante
Sunt un tip de radiaii cu putere mare de penetrare (ex. razele X, gamma i razele cosmic). Este o
60
sterilizare similar sterilizrii la rece. Radiaiile gamma cu surs Co sunt mai eficiente dect radiaiile
UV. Radiaiile ionizante se utilizeaz n sterilizri industriale (pentru alimente, medicamente, mnui,
recoltoare, plci Petri, etc).
2. 4. Antiseptice i dezinfectante
Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative bacteriene (uneori i a sporilor) din anumite
medii (lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul
substanelor dezinfectante. Este important att concentraia, durata aplicrii, ct i remanena
dezinfectantului.
2. 4. 1. Hipocloriii

clorinarea descoperit in Suedia (1744), din 1890 se folosete n dezinfectare;

soluiile de hipoclorit se prepar proaspt (n fiecare zi de lucru);

concentraia n clor activ este poate s difere n funcie de scopul urmrit;


au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor (100
ppm, n o or), virusurilor (200 ppm, n 10 minute);

se pot utiliza pentru purificarea apei;

efectul este diminuat n prezena substanelor organice (ex. proteine).


2. 4. 2. Derivaii fenolici

distrug membrana plasmatic, inactiveaz enzimele, denatureaz proteinele;

se folosesc sub form de derivai fenolici;

soluiile fenolice se prepar proaspt (n fiecare zi de lucru); efectul nu este diminuat n prezena
substanelor organice;
au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV inactivat
de soluia 0,5%).
2. 4. 3. Glutaraldehida

cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2% la un pH alcalin (efect asupra bacteriilor n form
vegetativ, endosporilor, fungilor, virusurilor);

efectul nu este diminuat n prezena substanelor organice;

se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice;

nu poate fi folosit pentru suprafee (este nevoie de un timp mare de expunere pentru a fi
eficient); ideal pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate, imersate n containere meninute
nchise (ex. endoscoape etc).
2. 4. 4. Iodoforii

sunt substane care elibereaz iodul n soluii apoase;

inhib sinteza proteic;

au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor, unor
virusuri (ex. virusuri cu nveli lipidic);

sunt inactivai de substane organice (ex. proteice), mase plastice, detergeni;

1.
2.
3.
4.

pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor, dezinfecia pipetelor contaminate.


2. 4. 5. Dezinfectarea cu etilenoxid

distruge bacteriile, nu i sporii (ex. sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrui);

se utilizeaz pentru materiale puin rezistente la temperaturi ridicate sau radiaii (ex. materiale din
cauciuc, plastic, echipament electronic etc);

este exploziv (pentru evitarea exploziei, de ex. utilizm etilenoxidului n camere speciale, cu
presiune negativ);

pentru siguran trebuie respectate toate recomandrile productorului;

exist inconveniente (efecte carcinogenetice, efecte la nivelul sistemului nervos etc);

sterilizarea este influenat de concentraie, temperatur, umiditatea relativ i timpul de expunere


(o dublare a concentraiei reduce la jumtate timpul necesar).
2. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
http://www.microrao.com/micronotes/sterilization.pdf
http://www.cdc.gov/hicpac/disinfection_sterilization/13_10othersterilizationmethods.html
http://www.ific.narod.ru/Manual/Clean.htm
http://www.health.qld.gov.au/endoscopereprocessing/module_2/2_1.asp

5. http://generalbacteriology.weebly.com/sterilization-and-disinfection.html
6. http://www.diffen.com/difference/Disinfect_vs_Sterilize
2. 6. Povestire adevrat
n urma infectrii unei plgi abdominale cu Mycobacterium chelonae (dup o liposucie), a fost
declanat o investigaie. Liposucia a fost realizat n ambulatoriu (realizat sub anestezie local).
Investigaiei a ncercat s determine dac au avut loc i alte cazuri de infecii cu mycobaterii atipice,
anterior liposuciei, n respectivul cabinet medical.
M. chelonae este rspndit n sol i ap, inclusiv n apa de la robinet. n literatur au mai fost raportate
infecii ale pielii i esuturilor moi, inclusiv infecii dup intervenii chirurgicale cosmetice. Sursa posibil
a infeciei raportate putea fi contaminarea echipamentelor i/sau dezinfectarea sau sterilizarea lor
inadecvat. S-a descoperit c n acest caz canulele de liposucie au fost cltite cu ap de la robinet i
unele echipamente au fost dezinfectate cu soluie cuaternar de amoniu. Investigaia a artat c n acel
cabinet medical existau nereguli n curarea corespunztoare, dezinfecia i sterilizarea
echipamentelor de liposucie. Cu excepia medicului, ntreg personalul din cabinet lucra far licen.
Att asistenii medicali ct i restul personalului fuseser instruii pentru curarea i sterilizarea
echipamentelor de liposuctie dar nu existau protocoale scrise pentru sterilizarea n autoclav a
materialelor reutilizabile i nici nu era inut evidena utilizrii acestuia. n plus, nu se foloseau
controale biologice pentru verificarea bunei funcionri a autoclavului aa cum stipulau instruciunile
productorului. Cabinetul nu avea protocoale scrise de dezinfecie i sterilizare. Asistentele amestecau
ce rmnea n sticlue mici de povidon iodat i apoi foloseau amestecul pus ntr-o sticl mare. De
asemenea foloseau tampoane de vat nmuiate n alcool i inute ntr-un recipient n loc de tampoane
ambalate individual. O alt neregul identificat a fost utilizarea soluiei de alcool izopropilic 70%
dintr-o sticl nesteril deschis, n locul unei soluii sterile de irigare, pentru a cura canula de
liposucie, mai exact pentru a disloca esutul de pe ea n timpul liposuciei.
Ancheta epidemiologic nu a mai descoperit i alte cazuri de infecii cu micobacterii atipice n acest
cabinet. Testele de laborator efectuate pe probe de ap de la robinet i aer din sistemul de ventilaie
au fost negative pentru M. chelonae. n acest situaie cabinetul nu a putut fi incriminat pentru
mbolnvirea pacientei.
S-a recomandat implementarea unor protocoale corecte pentru curare, sterilizare i dezinfecie,
conform indicaiilor productorilor. S-a recomandat utilizarea unor controale biologice pentru
verificarea bunei funcionri a autoclavului. Cadrelelor medicale far licen le-a fost suspendat dreptul
de practic. Cabinetul a fost nchis pn la remedierea neregulilor.
2. 7. De reinut
n orice laborator trebuie s existe protocoale scrise ale procedurilor de sterilizare i dezinfecie.
Laboratoarele trebuie s fie afiliate la un sistem de control i management al bolilor infecioase i toi
care lucreaz n laborator trebuie s cunoasc modul de funcionare al sistemelor de sterilizare, al
autoclavului i a substanelor dezinfectante.
2. 8. Verificai-v cunotinele
1. Sterilizarea distruge:
A. Agenii patogeni
B. Agenii nepatogeni
C. Formele vegetative
D. Sporii
E. Endosporii
2. Dezinfecia:
A. Reprezint distrugerea formelor vegetative bacteriene
B. Reprezint distrugerea tuturor sporilor
C. Este eficient independent de cantitate
D. Se realizeaz cu ajutorul substanelor dezinfectante
E. Este eficient independent de timp
3. Prin autoclavare se sterilizeaz:

A. Articole de cauciuc
B. Medii de cultur
C. Diferite substane n soluie
D. Pipete i lame
E. Materiale contaminate din laborator
4. Iodoforii:
A. Sunt substane care elibereaz iodul n soluii apoase
B. Nu inhib sinteza proteic
C. Au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ
D. Au efect asupra unor spori bacterieni
E. Nu pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor
5. Urmtoarele afirmaii sunt corecte:
A. Autoclavarea se realizeaz la otemperatur de 121C timp de 15 minute
B. Tindalizarea se realizeaz la 100C, 30 minute, 3 zile consecutive
C. Septic nseamn neinfectat
D. Aseptic nseamn infectat cu ageni nepatogeni
E. Agentul bacteriostatic este un agent care distruge bacteriile
2. 9. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Argintul are propriei antimicrobiene. O moned de argint pus n mediu de cultur inoculat va
inhiba creterea bacterian.
2. Clorura de mercur este bactericid dar este inactivat de materia organic.
3. Afumarea este o metod de sterilizare foarte eficient.
4. Fierberea timp de 10 minute distruge sporii.
5. Radiaiile ultraviolete pot produce leziuni la nivel ocular.

3. Schema general a diagnosticului de laborator


microbiologic. (Gabriela-Loredana Popa, LoredanaSabina Manolescu)

3. 1. Cuvinte cheie
Recoltare i Transport
Produse patologice
Antibiogram
Diagnostic direct
Diagnostic indirect
3. 2. Introducere
Diagnosticul de laborator n microbiologie este un diagnostic complex i este diferit funcie de agentul
patogen ce trebuie identificat. Astfel diagnosticul de laborator n microbiologie poate
fi direct (urmrete identificarea agentului patogen direct din produsul patologic), bacteriologic,
micologic, parazitologic, virusologic; poate fi indirect (urmrete evidenierea rspunsului imun la
aciunea agentului patogen), sau poate fi o combinaie ntre cele dou (direct i indirect).
Principalele etape ale diagnosticului microbiologic respect un algoritm general, logic, aplicat pentru
fiecare microorganism n parte. nainte de a ncepe aceste etape este necesar o suspiciune de
diagnostic bazat pe examenul clinic obiectiv i anamnez. Coroborarea acestor informaii obiective i
subiective primite de la pacient cu informaii concrete provenite din cunoaterea patologiei infeciilor
bacteriene pot direciona tipul de diagnostic de laborator ce trebuie efectuat.
3. 3. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic
Acest tip de diagnostic cuprinde 5 etape, exist ns i excepii (de exemplu n cazul diagnosticului
bacteriologic al infeciilor cu Treponema pallidum se realizeaz numai primele dou etape). Iat care
sunt cele 5 etape.
3. 3. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic (p.p.) urmeaz cteva reguli pe care este
foarte bine s le reinei n aceast succesiune:
Se recolteaz p.p. n care avem cele mai mari anse s decelm agentul etiologic (ex. urin ntr-o
infecie urinar, LCR n meningit etc);
Recoltarea se realizeaz rapid i ct mai aproape de debutul simptomatologiei, nainte de a administra
antibiotice, prin manevre aseptice bine determinate, corecte (vezi capitolul 4);
Dup recoltare se va eticheta corespunztor recipientul care conine p.p.;
Transportul p.p. se realizeaz ct mai rapid posibil, uneori este indicat s se foloseasc i mediu de
transport (dac se depete un anumit timp); temperatura de transport se stabilite n funcie de tipul
produsului patologic (vezi capitolul 4) i este n cele mai multe cazuri sczut (container izoterm 04C); poate fi i o temperatur crescut (ex. 37C);
La recoltarea p.p. se va completa un formular specific care s conin urmtoarele informaii: numele,
prenumele, vrsta pacientului, data i locul recoltrii (+ ora recoltrii), diagnosticul prezumtiv, natura
p.p., analiza solicitat, data debutului bolii, ce medicaie antimicrobian a fost administrat
respectivului pacient, cine i cum a fcut recoltarea, cum a fost asigurat transportul p.p.
Nerespectarea tuturor acestor reguli poate justifica respingerea p.p.
3. 3. 2. Examinarea macroscopic i microscopic a produsului patologicrmne o etap foarte
important, chiar i dup apariia tehnicilor moderne.
3. 3. 2. 1. Examinarea macroscopic a p.p. poate orienta etapele ce urmeaz dar exist i situaii n
care nu aduce informaii importante.
3. 3. 2. 2. Examinarea microscopic a p.p. reprezint uneori o etap orientativ, util dar exist
situaii n care reprezint o etap esenial (ex. n gonoree sau n meningita cu meningococ).
Recomandm realizarea a minim 2 frotiuri din p.p. Un frotiu va fi colorat cu albastru de metilen (AM) i
al doilea prin metoda Gram. n cazul n care p.p. se recolteaz mai dificil se recomand realizarea a 3
frotiuri. n suspiciunea de tuberculoz (TB) se realizeaz minim 3 frotiuri, colorate AM, Gram i Ziehl-

Neelsen. Iniial frotiul se examineaz cu obiectivul 40x pentru o analiz mai general i pentru
stabilirea cmpului microscopic sau al zonei de interes, apoi cu obiectivul de imersie. Se vor evidenia
celulele din esutul respectiv (normale sau patologice), celulele inflamatorii (ex. PMN) i prezena
microorganismelor (interpretarea poate fi realizat n funcie de experien). (Figurile nr. 1-3)
Exist i situaii n care din p.p. se realizeaz preparate native (ntre lam i lamel) n loc de frotiuri
fixate i colorate, de exemplu cnd p.p. este reprezentat de snge, urin sau materii fecale. n cazul n
care p.p. este reprezentat de materii fecale, se realizeaz coprocitograma (se caut leucocite i alte
structuri sugestive). n cazul n care p.p. este reprezentat de urin, se va realiza sedimentul urinar (dup
centrifugare), i se va examina ntre lam i lamel pentru evaluarea prezenei i numrului de
PMN/cmp, prezenei unor celule normale sau patologice, prezenei altor structuri (ex. cristale de
oxalat, citrat, cilindrii leucocitari etc. (Figurile nr. 4-5)
n infeciile micotice se realizeaz de asemenea preparate proaspete (ex. preparatul n soluie de KOHglicerol 10-20%, KOH poate dizolva keratina care maschez prezena fungilor), precum i frotiurile
colorate. (Figurile nr. 6-7)
3. 3. 3. Cultivarea pe medii de cultur a p.p. se face n funcie de situaie (agent etiologic presupus)
respectnd condiiile de cretere ale bacteriei respective (ex. aerobioz sau anaerobioz, o anumit
temperatur, un anumit mediu de cultur).
Cultivarea se realizeaz prin punerea (nsmnarea) p.p. n care se presupune existena bacteriei, pe
un mediu de cultur adecvat, ntr-un incubator, la o temperatur de 35-37C. Pentru fungi trebuie
utilizate mediile potrivite creterii fungilor i o temperatur mai mic dect cea utilizat n cazul
bacteriilor (28C). Scopul cultivrii este obinerea unor colonii izolate (prin nsmnare n
poligon,(Figura nr. 8) n care s creasc doar agentul etiologic incriminat n afeciunea studiat i
respectiv obinerea unei culturi pure, pentru identificare.
3. 3. 4. Identificarea agentului etiologic se realizeaz numai pornind de la colonii izolate , n baza
caracterelor specifice fiecrei bacterii, dup cum urmeaz.
3. 3. 4. 1. Caractere morfologice
Din colonia izolat se va realiza un frotiu; acesta va fi colorat Gram sau Ziehl-Neelsen (dup caz);
examenul microscopic va evidenia forma, dimensiunile i tinctorialitatea (culoarea) bacteriilor din
colonie. De obicei bacteriile studiate la microscop sunt similare i au caracteristici comune pe frotiul
examinat dar exist situaii n care pe frotiu se pot observa aspecte morfologice diferite, de la aspecte
cocobacilare pn la forme filamentoase (ex. bacterii cu polimorfism, cum ar fi Proteus spp.). n cazul
levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, de dimensiuni mai mari. (Figura nr. 9-11)
3. 3. 4. 2. Caractere de cultur
Sunt caracterele n urma crora se poate realiza identificarea preeliminar. Se vor examina coloniile
izolate aprute pe mediile de cultur i se va caracteriza aspectul morfologic (forma, dimensiunea,
marginile, culoarea coloniei). Coloniile pot fi de tip S pentru levuri i majoritatea bacteriilor studiate, de
tip R (ex. Mycobacterium tuberculosis i Bacillus anthracis) sau de tip M (la bacterii capsulate,
ex. Klebsiella pneumoniae) i respectiv un aspect pufos n cazul mucegaiurilor. Pentru mediile lichide se
va examina tipul de cretere, modul n care tulbur mediul sau se sedimenteaz. (Figurile nr. 12-16)
3. 3. 4. 3. Caractere biochimice (sau metabolice)
Aceste caractere sunt foarte utile n cazul diferenierii enterobacteriilor (introducerea n practic a
mediilor multi-test permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, citrat, etc)
i pot fi foarte variate de la o specie microbian la alta. (Figura nr. 13) De asemenea se pot evidenia
producerea de pigment endogen sau exogen sau producerea de hemolizine pe agar snge i tipul de
hemoliz. (Figurile nr. 14-15)
n cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma.
3. 3. 4. 4. Caractere antigenice
Caracterele antigenice pot fi evideniate datorit structurii antigenice a bacteriilor + capacitii Ag de a
cupla anticorpi (Ac) specifici pereche (reaciile Ag-Ac) (vezi cap. 9). Se utilizeaz Ac cunoscui pentru a
identifica Ag necunoscute. Reaciile Ag-Ac folosesc principii simple n care una din componente e
cunoscut i cealalt necunoscut. Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea direct pe lam, aglutinarea
indirect, coaglutinarea, etc. Sunt tehnici comerciale accesibile i eficiente, sau tehnici in house. De

1.
2.
3.
4.
5.

exemplu, prin reacii de aglutinare direct se pot identifica Ag din genul Shigella, Salmonella, iar prin
reacii de aglutinare indirect se pot detecta n p.p. streptococii de grup A sau B etc. Aceste teste se
folosesc i pentru detectarea unor Ag fungice (ex. Cryptococcus neoformans, Candida
albicans, Aspergillus spp).
3. 3. 4. 5. Caractere de patogenitate (ex. testul coagulazei pentru S. aureus)
Caracterele de patogenitate evideniaz capacitatea bacteriilor de a declana n organismul gazd
fenomene morbide. Patogenitatea este un atribut de specie i este determinat genetic. De exemplu
bacteriile pot elabora anumite substane cum ar fi coagulaza (o enzim produs de Staphylococcus
aureus) care produc fenomene patogene (in acest caz coagulaza produce coagularea plasmei). (Figura
nr. 16)
Prin inocularea unei bacterii patogene la animalul de laborator se poate declana infecia
experimental evideniind caracterul de patogenitate al respectivei bacterii.
3. 3. 4. 6. Lizotipie (sensibilitatea la bacteriofagi specifici)
Bacteriofagii (fagii) sunt virusuri care paraziteaz bacteriile. Au fost descoperii n 1915. Lizotipia
reprezint stabilirea sensibilitii la un anumit bacteriofag i este una dintre cele mai fine metode de
identificare (inclusiv din raiuni epidemiologice, ex. pentru determinarea originii unei epidemii).
3. 3. 5. Antibiograma (respectiv antifungigrama) reprezint testarea sensibilitii la antibiotice i
chimioterapice anti-bacteriene / respectiv anti-fungice, n vederea alegerii tratamentului etiologic
corect. Se realizeaz cel mai frecvent prin metode difuzimetrice. n anumite situaii (ex. n infecii grave,
la pacieni care au o capacitate de aprare redus, n infecii cu bacterii care au potenial ridicat de
rezisten la antibiotice i chimioterapice) se vor efectua i alte determinri, de ex. determinarea
concentraiei minime inhibitorii (CMI) i concentraiei minime bactericide (CMB).
n infecii cu potenial fatal este necesar determinarea eficienei antibioticului utilizat, respectiv
stabilirea nivelul de eficien inhibitorie (NEI) i nivelului de eficien bactericid (NEB).
3. 4. Diagnosticul de laborator imunologic (serologic i / sau imunobiologic)
3. 4. 1. Diagnosticul serologic urmrete determinarea prezenei Ac necunoscui, din serul
pacientului, utiliznd Ag cunoscute. Se bazeaz pe specificitatea reaciilor Ag-Ac. n vederea
identificrii unei infecii acute, se determin anticorpii specifici de tip IgM. n vederea identificrii unei
foste infecii sau unei infecii cronice se determin (de regul) Ac specifici de tip IgG. n unele situaii
este necesar doar un test calitativ, ce va determina prezena sau absena tipului de anticorpi dar n alte
situaii este necesar testarea cantitativ pentru a determina titrul (concentraia) de Ac din serul
pacientului. Tot cu ajutorul acestor teste cantitative vom analiza evoluia titrului de anticorpi n
dinamic. n acest sens se vor realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10 zile; astfel
putem s difereniem o afeciune acut (titrul Ac este mai crescut la a doua determinare, n mod clasic
de 4 ori), de o afeciune n covalescen (titrul Ac la a doua determinare va fi mai sczut) sau de o
afeciune cronic (titrul Ac va fi asemntor sau foarte apropiat la cele dou determinri succesive).
(Figura nr. 17)
3. 4. 2. Diagnosticul imunobiologic evideniaz rspunsul imun celular, de exemplu reactivitatea
pacientului fa de un anumit Ag. Intradermoreacia la tuberculin (IDR cu PPD/derivat proteic
purificat), reprezint un exemplu n acest sens. (vezi cap. 11)
3. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
http://www.idsociety.org/uploadedFiles/IDSA/GuidelinesPatient_Care/PDF_Library/Laboratory%20Diagnosis%20of%20Infectious%20Diseases%20Guideline.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8014/
http://www.chop.edu/service/laboratories/explore-chop-labs/labs-microbiology/home.html
http://www.cdc.gov/meningitis/lab-manual/chpt05-collect-transport-specimens.pdf
https://www.boundless.com/microbiology/immunology-applications/preparation-for-diagnosinginfections/specimen-collection/

6. http://www.atousante.com/risques-professionnels/risques-infectieux/tuberculose/intradermo-reactionidr/

3. 6. Povestire adevrat
ncepnd cu 30 decembrie 2012, n 19 state din America a fost raportat un total de 35 pacieni infectai
cu o tulpin de Escherichia coli productoare de toxin Shiga (STEC O:121 ). 82 % din pacieni aveau n
jur de 21 de ani sau mai puin i 31 % au fost spitalizai. Doi din cei 35 pacieni au dezvoltat
un sindrom hemolitic uremic (SHU) i insuficien renal (IR) dar nu au fost raportate
decese. Sursa acestei epidemii a fost un lot de produse alimentare congelate. Firma productoare a
retras de pe pia toate produsele care puteau fi contaminate, adic produse alimentare congelate
produse n perioada 1 iulie 2011 si 29 martie 2013, din cauza unei posibile contaminri cu E.
coli O:121.Produsele retrase aveau date de expirare cuprinse ntre 1 ianuarie 2013 i 29 septembrie
2014. Datorit acestui fapt, dei epidemia a fost stopat, exist oricnd posibilitatea unei recurene,
deoarece unele produse ar putea fi nc n congelatoarele populaiei. S-a recomandat consumatorilor
s verifice congelatoarele i nu mnnce produsele din loturile retrase. Recomandarea vizeaz n
special copii sub 5 ani, adulii peste 60 de ani i persoanele cu imunodeficien, deoarece aceste
persoane sunt mult mai susceptibile s dezvolte o complicaie. E. coli nc reprezint o cauz
important de mbolnvire n Statele Unite ale Americii.
Iniial pacienii infectai cu aceast tulpin au prezentat crampe abdominale i diaree hemoragic la
aproximativ 3 sau 4 zile dup ingestia produselor contaminate. Perioada de stare a fost n jur de o
sptmm pentru cazurile uoare sau mai mult pentru cele complicate cu IR. Persoanele cu risc
crescut pentru SHU i IR sunt copii sub 5 ani, adulii peste 60 de ani i persoanele cu imunodeficien.
Simptomele de SHU includ febr, dureri abdominale, paloare, oboseal i iritabilitate, vnti mici,
sngerri inexplicabile din nas si gur i disurie. Toate persoanele care prezint aceste simptome
trebuie s solicite imediat asisten medical de urgen.
Diagnosticul de laborator microbiologic a pornit de la recoltarea produsului patologic cel mai
potrivit i cu ansele cele mai mari de a conine bacteria incriminat n simptomatologia descris i
anume un eantion de materii fecale, ns nu toate laboratoarele pot efectua acest tip de diagnostic,
mai ales dac se urmrete identificarea E. coli O:121. Pentru a dovedi c pacienii au fost contaminai
cu STEC O:121 din produse alimentare congelate, au fost testate i produsele alimentare consumate de
cei ce prezentau simptomatologia aferent. De asemenea pacienii au fost intervievai de ctre
persoane abilitate pentru a obine informaii cu privire la alimentele pe care le-ar fi mncat i alte
expuneri n sptmna de dinainte de boal. 24 pacieni au raportat consumul produselor alimentare
congelate iar tulpina epidemic STEC O:121 a fost identificat n dou produse congelate colectate din
congelatoarele a doi pacieni din New York i Texas. Identificarea tulpinii epidemice STEC O:121 a fost
posibil numai datorit coroborrii analizelor efectuate de mai multe organisme epidemiologice i
laboratoare: CDC (Centre for Disease Control and prevention), oficiali din domeniul santii publice
din mai multe state americane, Departamentul Agriculturii pentru Sigurana Alimentar din SUA i de
Serviciul de Control al alimentelor i medicamentelor (Food and Drug Administration / FDA).
Investigatorii au folosit teste de biologie molecular. Au fost folosite de asemenea date provenite de la
PulseNet, o reea internaional (care efectueaz supravegherea moleculara a infeciilor alimentare).
3. 7. De reinut
Colaborarea ntre departamente este esenial pentru succesul dignosticului de laborator microbiologic.
Corelarea noiunilor nvate n capitolele 1-8 i respectiv 9-11 au utilitate nu doar pe parcursul pregtirii
academice de microbiologie, dar i n viaa de zi cu zi.
3. 8. Verificai-v cunotinele
1. Care din urmtoarele sunt etape ale diagnosticului de laborator microbiologic:
A. Recoltarea i transportul p.p.
B. Examinarea macro i microscopic a p.p.

C. Cultivarea p.p.
D. Identificarea agentului etiologic
E. Antibiograma
2. Din urmtoarele p.p. se realizeaz preparate native i nu frotiuri colorate:
A. Snge
B. Urin
C. Materii fecale
D. Puroi
E. Sput
3. Caracterele de patogenitate evideniaz:
A. Capacitatea bacteriilor de a declana fenomene morbide
B. Capacitatea bacteriilor de a declana incapacitatea funcional
C. Un atribut de specie
D. Determism genetic
E. Virulena.
4. Antibiograma
A. Reprezint testarea sensibilitii la antibiotice
B. Se realizeaz prin metode difuzimetrice
C. Evideniaz CMB
D. Evideniaz CMI
E. Evideniaz NEI
5. Diagnosticul imunobiologic
A. Evideniaz rspunsul imun celular
B. Evideniaz reactivitatea pacientului fa de un anumit Ag
C. Reprezint intradermoreacia la tuberculin
D. Urmrete determinarea prezenei anticorpilor (Ac) necunoscui
E. Se bazeaz pe specificitatea reaciilor Ag-Ac
3. 9. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Dup splare pe mini cu spun obinuit sau spun antibacterian vom obine prin cultivare pe medii de cultur
un numr similar de colonii bacteriene
2. Fixarea frotiurilor ne protejaz deoarece omoar bacteriile.
3. Toate bacteriile cresc iniial sub form de colonii de tip S.
4. Un test IDR cu PPD negativ exclude un diagnostic pozitiv de TB.
5. Prezena anticorpilor de tip IgG semnific ntotdeauna cronicizare.

4. Prelevarea i transportul produselor patologice. (MI


Popa, Violeta Cristea, Gabriela-Loredana Popa)

4. 1. Introducere i cuvinte cheie


Recoltare
Transport
Produs patologic (p.p.)
Stabilitate
Medii de transport
Recoltarea (prelevarea) i transportul p.p. este o etap esenial. Personalul din laborator i
concentreaz atenia asupra prelucrrii corespunztoare a probelor primite la laborator dar ceea ce se
ntmpl nainte ca proba s ajung la laborator este cel puin la fel de important n obinerea unui
rezultat corect.
Exist o serie de reguli care, respectate riguros, permit obinerea rezultatelor dg. i vindecarea
pacientului.
4. 2. Condiii generale legate de recoltarea i transportul p.p.

Instruciunile de recoltare i condiiile de transport ale p.p.trebuie ntocmite de catre medici


transmise ulterior persoanelor implicate - asistentelor de recoltare, respectiv pacienilor n cazul
probelor recoltate la domiciliu. Recoltarea p.p. prin mijloace invazive (LCR, aspiratul bronho-alveolar,
aspirat medular) este efectuat strict de ctre medic.

Prelevarea p.p. trebuie s aib loc nainte ca pacientul s primeasc antibiotice sau chimioterapice
(nerespectarea acestei reguli, foarte frecvent din pcate, constituie o problem semnificativ n
diagnostic i permite selecia de microorganisme rezistente; chiar i n cazul unei boli grave,
amenintoare de via, este suficient timp pentru recoltarea p.p. nainte de administrarea
medicamentului). n cazul pacienilor transferai ntre diferite uniti spitaliceti (pacieni care au primit
antibiotice) recoltarea p.p. se face naintea dozei urmtoare n aa fel nct n momentul recoltrii
cantitatea de antibiotic din organism s fie ct mai mic.

Recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze ct mai rapid, n momentul optim (ex. frisonul
i accesul febril dicteaz recoltarea sngelui pentru hemocultur).

Produsul patologic din care am putea izola agentul etiologic poate fi reprezentat de o secreie de
la nivelul porii de intrare (ex. secreie nazal/faringian n difterie sau secreie din plag n infecii
stafilococice), un produs de la nivelul cilor de eliminare din organism (ex. urin n infeciile tractului
urinar/ITU) etc.

Din p.p. se vor preleva fragmentele sau prile reprezentative, din care avem cea mai mare ans
de izolare a germenilor (ex. zonele cu mucus i puroi, din materiile fecale).

Trebuie s recoltm o cantitate de p.p. suficient pentru efectuarea diagnosticului, n condiii de


asepsie (nu trebuie infectat pacientul, nu trebuie s ne infectm, nu trebuie s contaminm p.p.)
respectnd precauiunile universale.
Aceste reguli este bine s fie cunoscute de toi cei care formeaz comunitatea din sistemul sanitar, dar,
unele dintre recomandri sunt uor de neles i de aplicat chiar i de persoanele fr o pregtire
medical. Mai trebuie subliniat c:

Instrumentele pentru recoltare trebuie s fie sterile i adecvate tipului de recoltare efectuat (ex.
tampon cu alginat de calciu i nu cu vat pentru recoltarea de secreii n care se presupune
prezenaBordetella pertussis).

Recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie marcate corespunztor, iar datele de
identificare s fie riguros consemnate n registre/sistem electronic, formulare i buletine de analiz
pentru a evita erori care pot fi dramatice (este cunoscut exemplul unui transplant de organe de la un
pacient HIV pozitiv, n Italia, 2007, situaie care a fost identificat numai dup ce transplantul a avut loc
la trei receptori, pentru c pe buletinul de analiz a aprut HIV negativ, printr-o eroare de notificare).

Proba se trimite la laborator nsoit de o trimitere pe care se noteaz datele de identificare ale
pacientului, diagnosticul prezumtiv, tip de produs patologic i determinrile solicitate.

Produsele patologice trebuie s ajung n laborator n cel mai scurt timp posibil. Dac n anumite
situaii (microorganismului nu rezist n mediul exterior) recomandm recoltarea i prelucrarea p.p. la
patul bolnavului.Probele recoltate pe recipiente fr mediu de transport au o stabilitate de 1-2 ore de
la recoltare iar folosirea recipientelor adecvate cu mediu de transport crete aceast stabilitate la 24-48
de ore. Mediile de transport cel mai frecvent folosite n bacteriologie sunt Amies, Cary Blair i Stuart.
Pentru urin exist o posibilitate de conservare, la rece, prin meninerea la temperatura de +4C.

4. 3. Exemple de recoltare i transport pentru principalelep.p.


4. 3. 1. Exsudatele otice, conjunctivale sau nazale

pacientul st pe scaun, cu faa spre sursa de lumin (preferabil lumina natural);

utilizm tampoane cu vat sterile (1 tampon pentru frotiu, 1 tampon pentru nsmnare);

tamponul se ncarc bine cu p.p. iar prelucrarea trebuie fcut imediat; dac nu este posibil,
folosim un mediu de transport.
4. 3. 2. Exsudatul faringian

se recolteaz preferabil dimineaa (pacientul nu mnnc, nu bea, nu se cltete, nu se spal pe


dini); st pe scaun, cu faa spre sursa de lumin i gtul n uoar extensie;

ne aezm puin lateral fa de pacient (ca s nu fim infectai i chiar i n aceste condiii trebuie s
purtm masc i ochelari);

apsm baza limbii, examinm faringele posterior, pilierii, amigdalele i recoltm secreia (fr a
atinge baza limbii sau palatul moale), n special din zonele cu puroi; utilizm tampoane cu vat
obinuite (folosim 1 tampon pentru frotiu i 1 tampon pentru cultivare);

cel mai bine utilizm p.p. imediat, n cel mult 1-2 ore (sau folosim mediu de transport).
4. 3. 3. Sputa

sputa, recoltat pe ci naturale, dup tuse i expectoraie, este un p.p. contaminat;

p.p. care permit evitarea contaminrii orofaringiane sunt aspiratul transtraheal, transtoracic i
bronhoscopic (prin cateter protejat, lavaj bronhoalveolar, biopsie transbronic, biopsie pulmonar pe
torace deschis etc); se pot face i hemoculturi;

sputa rmne un p.p. frecvent recoltat; pacientul trebuie s neleag diferena dintre "a
expectora" i "a tui i scuipa"; naintea recoltrii se recomand periajul dinilor, cltirea gurii i gargara
cu soluie salin fiziologic;

dac proba este n principal din saliv, trebuie s solicitm imediat prelevarea unei noi probe (ex.
mucopurulent, n cantitate de 2-3 ml, cel puin);p.p. ar trebui prelucrat n maxim 1-2 ore (nu se
recomand utilizarea mediilor de transport).
4. 3. 4. Puroiul

puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologic, pipeta Pasteur, cu o spatul, prin biopsiere etc.,
sau, prin puncie i aspirare (folosim tampoane cu mediu de transport doar cnd transportul ctre
laborator depete 1-2 ore);

cnd suspicionm o infecie cu microorganisme anaerobe recoltm i transportm cel puin n


seringa care se nchide cu dop prin care nu trece oxigenul sau transportul ctre laborator se va
realiza utiliznd medii de transport sau containere specialepentru asigurarea condiiilor
de anaerobioz(Figura nr. 1).
4. 3. 5. Materiile fecale
n multe dintre infeciile nsoite de sindrom diareic, utilizm coprocultura;
se pot recolta scaunul emis spontan (m. f. sunt eliminate ntr-un recipient de carton sau ntr-un
container din material plastic de unic ntrebuinare; utilizm pentru prelevare linguria recoltorului
alegnd fragmente mucopurulente, poriuni cu snge etc., n cantitate de circa 1 gram, suspensionat n
mediul de transport), tamponul rectal (n cazul unei infecii cronice cu Shigella spp., atunci cnd
suspicionm portajul deShigella spp. sau Salmonella spp.) sau putem utiliza sonda Nelaton (cnd
urmrim recoltarea p.p. de la nivelul colonului sigmoid);
n cazul n care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau n maxim 1 or, utilizm mediul de transport
(Cary-Blair) sau transportul la rece (+4C); se asigur supravieuirea enterobacteriilor patogene timp de

24-48 de ore, inhibnd n acelai timp multiplicarea florei de asociaie; n suspicionareaV. cholerae, apa
peptonat alcalin este n acelai timp mediu de transport i mediu de mbogire.
4. 3. 6. Urina
colonizarea microbian a uretrei distale explic motivul pentru care de regul realizm urocultura
5
cantitativ; atunci cnd demonstrm prezena a 10 bacterii/ml, este o infecie a tractului urinar (ITU)
n aproximativ 80% dintre cazuri;
dac nu putem recolta prima urin de diminea, ateptm 3-4 ore dup miciune;
recoltarea se realizeaz dup igiena organelor genitale i a perineului, ntr-un recipient steril (Figura nr.
2) atunci cnd proba poate fi dus ctre laborator n mai puin de 2 ore sau ntr-un recipient special ce
conine acid boric i menine stabilitatea probei 24 ore la temperatura camerei (Figura nr. 3). Erorile de
recoltare i nerespectarea timpului de transport vorconduce la rezultate eronate);
recoltm urina din mijlocul jetului (prin miciune se elimin circa 100 ml urin, ndeprtnd o parte a
germenilor de la nivelul uretrei distale, apoi se recolteaz 20-50 ml urin n recipient steril, dup care
miciunea continu;

exist i alte tehnici de recoltare (ex. puncie i aspiraie suprapubian);

dup recoltare pe recipientul fr conservant, n cazul n care urina nu este prelucrat imediat p.p.
trebuie meninut la temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +4C.
4. 3. 7. Sngele
se recomand recoltarea a minim 2, preferabil 3 probe de snge, n momente diferite, pe parcursul a
24 de ore;
deoarece numrul de uniti formatoare de colonii (UFC)/ml de snge este redus, trebuie s recoltm
un volum de snge adecvat (circa 20 ml de snge la aduli i 1-5 ml de snge la nou-nscui, sugari i
copii mici);
n snge pot exista factori antimicrobieni (diminum impactul acestora prin diluarea 1/10 a sngelui
cultivat n raport cu volumul mediului de cultur);
folosim medii de cultur lichide, mbogite, n condiii de incubare potrivite.
4. 3. 8. Lichidul cefalo-rahidian

se recolteaz n cazul suspicionrii unui sindrom meningean; suspiciunea poate fi ridicat i de un


student bine pregtit sau de un tnr medic, dar examenul clinic trebuie executat i de medicul de
specialitate (boli infecioase, neurologie etc); recoltarea se face la patul bolnavului de exemplu prin
puncie lombar n condiii de strict asepsie;

recoltm 5-10 ml LCR n 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi supuse centrifugrii iar din al 3-lea tub
realizm teste biochimice);

LCR trebuie prelucrat imediat, prelucrarea p.p. trebuie s nceap la patul bolnavului;

dac transportul nu poate fi evitat, trebuie s se fac foarte rapid, la o temperatur apropiat de
temperatura corpului uman (nu la +4C).
4. 3. 9. Secreiile recoltate de la nivelul aparatului genital
n cazul secreiei uretrale, la brbat

recoltarea p.p. trebuie s se fac dimineaa, nainte de miciune, sau la cel puin 2 ore dup
aceasta; sunt necesare tampoane de vat sterile (un tampon pentru examenul microscopic i al doilea
pentru cultivare); se observ penisul i meatul urinar precum i dac exist secreie uretral; dac exist
secreie uretral, aceasta este recoltat cu tamponul;

n cazul n care nu se evideniaz spontan secreia uretral n mod, cu mna protejat de o


mnu, exprimm uretra utiliznd degetul mare i indexul i recoltm secreia care apare;

dac nici aa nu putem obine p.p. recurgem la recoltarea intrauretral; sunt necesare tampoane
de dimensiuni mai mici (din alginat de calciu sau dacron); dup introducerea blnd (circa 2 centimetri,
cu rotire intrauretral) a primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu aproximativ 1 centimetru mai
profund;
n cazul secreiilor cervicale, la femei recoltarea se face preferabil n primele 10 zile dup ciclu, pe masa
ginecologic, dup introducerea valvelor i examinarea vizual a vaginului i colului uterin; dac se
remarc o secreie purulent, cu ajutorul unor comprese sterile se ndeprteaz secreia de la nivelui

colului extern; folosim 3 tampoane sterile introduse i rotite uor 1-2 centimetri, n colul uterin (2
dintre tampoane le transferm pe frotiuri, al treilea pentru cultivare);

n suspiciunea de gonoree se recomand cultivarea imediat dup recoltare pe mediul de cultur


nclzit la 37C; n cazul n care acest lucru nu se poate realiza, tamponul cu p.p. va fi transmis
laboratorului n mediu de transport (ex. mediul Stuart pentru Neisseria gonorhoeae sau alte variante
pentru Chlamydia spp. sau Mycoplasma spp.)
4. 3. 10. Diferite p.p. recoltate n suspiciunea unor infecii fungice

n cazul leziunilor umede i inflamate de la nivelul mucoaselor sau din zonele pliurilor (axilar,
mamar, crural) recoltarea se face cu ajutorul tampoanelor 1 tampon pentru frotiu i 1 tampon pentru
cultivare);

n micozele cutanate superficiale, raclm tegumentul i utilizm pentru examinare scuamele


produse; n cazul leziunilor multiple se alege pentru recoltare un element recent, scuamele vechi n
curs de detaare fiind de cele mai multe ori improprii pentru diagnostic;

mpachetm scuamele n hrtie steril care se introduce ntr-o cutie Petri i se trimite pentru
prelucrare i examinare n laborator (n maxim 48 de ore);

n micozele profunde, n funcie de localizare, recoltm p.p. i l transmitem ctre laborator avnd
grij s prevenim deshidratarea produsului;

se recomand prelucrarea i examinarea imediat (unii fungi sunt fragili); dac recomandarea nu
poate fi respectat, adugm penicilin, streptomicin i cloramfenicol pentru inhibarea multiplicrii
bacteriene i meninem p.p. la +4C.
4. 4. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3892603/
2. http://cid.oxfordjournals.org/content/54/suppl_2/S140.full
3. http://www.ijmm.org/article.asp?issn=02550857;year=2006;volume=24;issue=4;spage=249;epage=2
51;aulast=Marais
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3206327/
5. http://vdi.sagepub.com/content/23/1/95.long
4. 5. Povestire adevrat
Un brbat n vrst de 69 de ani se prezint la medic (n serviciul ambulatory). El prezint de 10
zile stare general alterat, debut brusc cu febr, durere la nivel faringian i artralgii la nivelul
genunchiului drept.Antecedentele personale arat un istoric de lobectomie pulmonar dreapt (s-a
extirpat lobul superiordatorit unui carcinom pulmonarcu celule scuamoase; cu un an mai devreme).
Pacientul declar c n urm cu doua sptmni a avut un contact sexual neprotejat i c a folosit
(automedicaie) de 5 zile Levofloxacindar starea general nu s-a ameliorat.
La examenul clinic pacientul a prezentat TA = 149/83 mmHg, AV = 98 de bti /
min.puls regulat, saturaia n oxigen 96% i temperatur de 37,9C.
Examenul clinic al genunchiului pune n eviden o articulaie mrit n volum cu semne de inflamaie
prezente.
3
Examenele de laborator: leucocitoz de (8.080/mm ), proteina C reactiv (1,07 mg/dL). Alte teste
biochimice de rutin i sumarul urinar au fost n limite normale.
S-a decis prelevarea de probe pentru hemocultur i culturi din lichidul articular. n 30 de minute de la
recoltarea lichidului s-a primit rezultatul de laborator preliminar care evidenia prezena unor coci
Gram negativi intra i extra leucocitari pe frotiu.
Culturile din lichidul articular precum i hemoculturile au ramas negative diagnosticul stabilindu-se
strict pe baza examenului microscopic pe frotiu.
Diagnosticul de internare al pacientului a fost: infecie gonococic diseminat. Tratamentul a fost
schimbat cu ceftriaxon 1g pe zi i.v.

Dup 3 zile de tratament simptomele pacientului inclusiv febra, faringitaiartralgiaau diminuat i a fost
externat, fr sechele, n ziua a 7-a.
La externare pacientul a fost informat de necesitatea testrii ulterioare pentru alte afeciuni
transmisibile pe cale sexual.
4. 6. De reinut
Probele recoltate dup administrarea de antibiotic pot fi negative n cultur dei la examenul
microscopic pe frotiu microorganismele se pot vizualiza. Datele prezentate n anamnez de pacient
mpreun cu aspectul morfologic i tinctorial al microorganismelor observate pot fi de folos n
stabilirea diagnosticului.
Mai mult de 60% dintre tulpinile de Neisseria gonorrhoeae sunt rezistente la quinolone.
4. 7. Verificai-v cunotinele
1. Pentru care din urmtoarele microorganisme este obligatorie recoltarea p.p. pe tampon cu alginat
de calciu?
A. Propionibacterium acnes
B. Haemophilus influenzae
C. Salmonella spp.
D. Bordetella pertussis
E. Shigella spp.
2. Care din urmtoarele p. p. sunt considerate invazive?
A. Secreia uretral
B. LCR
C. Aspiratul bronho-alveolar
D. Scuamele tegumentare
E. Aspiratul medular
3. n cazul suspiciunii unei infecii cu Neisseria gonorrhoeae (p.p. de la nivel genital) mediul de
transport recomandat este:
A. Cary-Blair
B. Apa peptonat
C. Chapman
D. Stuart
E. nici un rspuns nu este corect.
4. Recoltarea sngelui pentru hemocultur se recomand a fi facut:
A. n cantitate corespunztoare vrstei
B. La pacieni spitalizai
C. n timpul frisonului
D. n convalescen
E. Dup o dezinfecie riguroas a tegumentelor
5. Transportul anaerobilor n laborator se poate face cu:
A. Tamponul cu mediu de transport
B. Sering cu acul ndoit
C. Ser fiziologic nclzit
D. Containere speciale
E. 1-2 ore de la recoltare fr mediu
4. 8. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)

1. Urina este un p.p. care poate fi conservat la frigider dac se ntrzie procesarea.
2. Niciodat nu se recolteaz probe bacteriologice dup administrarea de antibiotice.
3. Probele patologice neetichetate ntotdeauna sunt respinse de ctre laborator.
4. Urocultura este o metod care folosete de rutin o tehnic semicantitativ.
5. Mediul de transport recomandat pentru cultivarea materiilor fecale este Cary-Blair.

5. Preparate microscopice, frotiuri i principalele coloraii


utilizate n microbiologie. Examenul microscopic.
(Gabriela-Loredana Popa, Andrei-Alexandru Muntean)

5. 1. Cuvinte cheie
preparat microscopic nativ
frotiu
coloraii
Albastru de metilen
Gram
Ziehl-Neelsen
fluorescen
5. 2. Introducere
Pentru a putea vizualiza microorganismele, avem nevoie de o putere de mrire de cel puin 900-1000X,
ntruct acestea au dimensiuni de ordinul micronilor. n mod practic, nu este suficient s vizualizm
simpla prezen a microorganismelor la locul de infecie (unele fcnd parte din flora normal), ci s
ncercm s demonstrm implicarea lor n boala suspectat. Astfel, avem nevoie s evideniem att
microoganismele ct i rspunsul pacientului fa de acestea (ex. prezena celulelor inflamatorii),
pregtind diferite preparate microscopice.
5. 3. Preparate microscopice proaspete (ntre lam i lamel)
Este de preferat s folosim lame i lamele noi. Pentru a ndeprta orice murdrie lamele pot fi curate
n prealabil cu alcool i degresate suplimentar prin flambare. n mod practic, vom avea grij s atingem
lama doar pe margini. Vom trece lama prin flacra becului Bunsen aprins de 2-3 ori. Depunem pe lam
o pictur din produsul care urmeaz a fi studiat:

p.p. cu consisten lichidian (ex. urin, materii fecale, LCR, etc) vor fi descrcare utiliznd de ex.
ansa microbiologic sau pipeta Pasteur direct pe lam; putem aduga o pictur de albastru de
metilen, lugol, etc;

p.p cu consisten solid (ex. dintr-o colonie microbian) - nti folosim un pipetor pentru a pune
o pictur de soluie salin fiziologic pe lam i apoi o ans microbiologic pentru a descrca din
colonia respectiv.
Acoperim cu o lamel produsul patologic descrcat i presm uor lamela pentru a elimina
bulele de aer.
n microscopia optic (cmp luminos) aezm preparatul pe platina microscopului i examinm
iniial cu obiectivul 10X, apoi cu obiectivul 40X (Figurile nr. 1-2).
5. 4. Frotiuri (preparate fixate i colorate)
Reexaminnd schema general a diagnosticului de laborator (vezi cap. 3) vom observa c
efectum examinarea frotiurilor n dou momente; astfel, putem realiza frotiuri din p.p. sau din culturi
efectuate pe mediul solid sau lichid. Trebuie s ne asigurm c avem la bancul de lucru toate
ustensilele necesare [p.p. sau cultur de interes, bec Bunsen, ans microbiologic, lame i lamele,
etanol, ap distilat (AD) i/sau soluie salin fiziologic (SSF), pipetor dar i trus pentru colorare] i le
organizm pentru a le avea la ndemn (Figura nr. 3). Frotiul trebuie bine ntins, n strat subire
(preferabil un singur strat).
NB: Nu vom purta mnui datorit riscului atunci cnd lucrm lng becul Bunsen.
Vom avea grij s atingem lama doar pe margini. Dorim s subliniem faptul c tehnica prin care
fixm frotiul depinde de tehnica de colorare pe care dorim s o aplicm (vezi 5. 5.). Fixarea are rolul de
a inactiva germenii de pe lam i a le crete aderena de lam.
5. 4. 1. Frotiuri din p.p. cu consisten lichid sau din culturi n mediu de cultur lichid (Film
nr. 1)
flambm lama (o trecem de 2-3 ori prin flacra becului Bunsen i o aezm cu partea flambat
n sus pe stativul din trusa de coloraie);

sterilizm ansa bacteriologic i ateptm s se rceasc;


prelevm aseptic p.p./cultura i depunem n centrul lamei;

ntindem prin micri de haurare, pe axul lung al lamei p.p./cultura, n strat ct mai subire,
fr a ne apropia de marginile lamei (scdem riscul de contaminare);

lsm lama s se usuce, pe un alt stativ, lng becul de gaz;

fixm frotiul prin cldur (l trecem prin flacr cu partea opus de 3 ori);

suntem gata s ncepem procesul de colorare.


5. 4. 2. Frotiurilor din p.p. cu consisten solid sau din culturi n mediu de cultur solid (Film nr. 2)

flambm lama (ca la 4. 4. 1.);

depunem n centrul lamei o pictur de SSF sau AD;

sterilizm ansa bacteriologic i ateptm s se rceasc;

prelevm aseptic p.p./un fragment din colonie i depunem produsul n pictura de fluid de pe
lam;

folosim ansa pentru a omogeniza p.p./fragmentul din colonia de interes foarte bine (n aa fel
nct s rezulte o pictur tulbure omogen);

ntindem prin micri de haurare, pe axul lung al lamei p.p., n strat ct mai subire, fr a ne
apropia de marginile lamei;

lsm frotiul s se usuce lng flacr;

fixm frotiul prin cldur (l trecem prin flacr cu partea opus de 3 ori);

suntem gata s ncepem procesul de colorare.


5. 5. Colorarea frotiurilor
Exist numeroase metode de colorare, dar acest capitol nu i dorete o prezentare exhaustiv a
acestora. Este necesar o trus pentru colorare (stativ de colorare, colorani, AD pentru splare, stativ
de uscare). Pentru colorareafrotiurilor din produs patologic folosim cel mai frecvent coloraiile cu
albastru de metilen (A.M.), Giemsa, Gram i dup caz, Ziehl-Neelsen. Chiar i coloraia cu A.M. se poate
realiza n mai multe variante (ex. o coloraie A.M. special pentru bacilul difteric).
5. 5. 1. Coloraia cu albastru de metilen
Examenul frotiului colorat cu albastru de metilen relev informaii de bun calitate privind citologia
frotiului (se pot observa detalii privind tipul de celule eucariote surprinse pe frotiu, relaia dintre
acestea, eventualele anomalii morfologice ale citoplasmei i nucleului). Este o coloraie de uz general,
fiind folosit alturi de coloraia Gram pentru a oferi o imagine de ansamblu a frotiului.

fixarea frotiului se face prin cldur

acoperim frotiul cu soluie A.M., 3-4 minute; splm cu ap distilat;

aezm frotiul n stativ pentru uscare;

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm.


Fiind o coloraie simpl, n care se utilizeaz un singur colorant, vom putea observa celule
eucariote (epitelii pavimentoase, leucocite, limfocite, etc.) ct i microorganisme (coci, bacili) colorai n
albastru. (Figura nr. 4)
5. 5. 2. Coloraia Giemsa
Este o alt coloraie n care structurile celulare pot fi decelate facil, n special n ceea ce privete
celulele inflamatorii. Astfel, putem clasifica leucocitele n neutrofile, bazofile, eozinofile. Se pot observa
i microorganisme (coci, bacili) colorai n albastru-violet. (Figura nr. 5)
5. 5. 3. Coloraia Gram
n primul rnd, ne asigurm c avem toate componentele necesare pentru efectuare coloraiei, n
special:
fucsin diluat (1/10);

amestec alcool-aceton (1 parte aceton/3 pri alcool de 96);


Paii care trebuie urmai pentru efectuarea coloraiei:

fixarea frotiului se face prin cldur, trecnd lama de 3 ori prin flacra becului Bunsen (cu partea
opus frotiului);

acoperim frotiul cu violet de metil, 1-3 minute; scurgem colorantul;

acoperim frotiul cu lugol (fixator), 1-3 minute; ndeprtm lugolul;

acoperim frotiul cu un amestec de alcool-aceton, rapid, 7-8 secunde;


splm insistent cu ap distilat;
acoperim frotiul cu fucsina diluat pentru 1 minut; splm cu ap distilat;
aezm frotiul n stativ pentru uscare;
examinm la microscop, notm observaiile, interpretm.
Coloraia Gram este cea care ofer informaii privind structura microorganismelor. Nucleul i
citoplasma celulelor eucariote sunt colorate n rou

celulele cu citoplasm bogat rou-pal i nucleu cu dimensiuni reduse, tahicromatic sunt


epitelii pavimentoase.

celulele cu citoplasm relativ restrns, cu un nucleu de dimensiuni considerabil mai mari,


polilobate, cu multiple septuri fine, sunt leucocite.
Microorganismele sunt colorate, n funcie de structura lor:
violet bacterii Gram pozitive;
roz-rou bacterii Gram negative. (Figura nr. 6)
5. 5. 4. Coloraia Ziehl-Neelsen
Este o coloraie util n identificarea prezenei de bacili acid-alcool rezisteni (BAAR). n primul rnd, ne
asigurm c avem toate componentele necesare pentru efectuare coloraiei, n special:
fucsin bazic nediluat (filtrat proaspt)
amestec acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool etilic 90-95);
Paii care trebuie urmai pentru efectuarea coloraiei:

punem frotiul uscat i fixat prin cldur pe un suport situat deasupra tviei de colorare;
acoperim complet lama cu fucsin bazic nediluat;

trecem becul de gaz aprins pe sub lam, pn la emiterea de vapori;

pe parcursul a 10 minute repetm de 3 ori operaia de nclzire a lamei pn la emiterea de vapori;


adugm colorant, la nevoie;

splm insistent cu ap distilat;

adaugm amestecul decolorant acid-alcool, 2-3 minute; splm cu ap distilat;

recolorm cu albastru de metilen, 1 minut; splm cu ap distilat;

aezm frotiul n stativ pentru uscare;

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm.


Microorganismele BAAR sunt roii, n timp ce cele non-AAR sunt albastre. Celulele eucariote sunt i ele
colorate n albastru. (Figura nr. 7)
5. 5. 5. Coloraii fluorescente
Exist mai multe variante. Spre exemplu, coloraia fluorescent cu auramin O (A.O.) este util n
vizualizarea BAAR.

colorm cu soluie de A.O. (A.O./alcool etilic/fenol/A.D.), 15 min.; splm cu A.D.;

decolorm cu amestec de acid-alcool, timp de 5 minute; splm cu ap distilat

contracolorm cu soluie de permanganat de potasiu, timp de 2 minute;

splm cu ap distilat;

aezm frotiul n stativ pentru uscare;

examinm la microscop, notm observaiile, interpretm.


Microorganismele acid-alcool-rezistente au o culoare galben-roiatic. Dei coloraia cu auramin
nu este la fel de specific pentru BAAR precum coloraia Ziehl-Neelsen, aceasta este mai ieftin i
prezint o sensibilitate mai bun, fiind utilizat ca o variant de screening.
5. 6. Tehnica examenului microscopic
Microscopul este strict necesar n diagnostic microbiologic direct. Cel mai frecvent utilizat n
laboratorul de microbiologie este microscopul optic. Exist i alte tipuri de microscoape: cu fond
negru, cu contrast de faz sau cu fluorescen, etc.
5. 6. 1. Microscopul optic; microscopia n cmp luminos(Figura nr. 8)
Microscopul optic permite formarea unor imagini virtuale, mrite i rsturnate ale obiectului cu
ajutorul unui sistem de lentile obiectiv i delentile ocular. Distana minim dintre dou puncte ale
unui obiect care mai pot fi vzute separat unul de celalalt prin microscop respect o formul, n funcie

de lungimea de und a radiaiei folosite, indicele de refracie al mediului strbtut de radiaie ntre
obiect i ocular i unghiul dintre axa optic i razele cele mai ndeprtate de ax care mai ptrund
n obiectiv. Pentru a micora aceast distan (pentru a mbunti performanele microscopului)
putem utiliza radiaii cu lungime de und mai mic (ex. radiaia ultraviolet) sau un mediu (ntre obiect
i obiectiv) cu un indice de refracie ct mai mare (ex. n cazul microscopului cu imersie).
5. 6. 1. 1. Prile componente ale microscopului optic
Microscopul optic include:
Piciorul microscopului (mas metalic cu rol de susinere, pe care se sprijin platina microscopului;
pe platin aezm preparatul microscopic / lama / frotiul). Prin orificiul central al platinei trec razele
luminoase. Platina se poate deplasa pe 2 direcii perpendiculare.
Tubul microscopuluisusine ocularul i obiectivul. La captul superior al tubului montm ocularele
(de ex. cu puterea de mrire 10x).
Obiectivul se monteaza n revolver, situat la captul inferior al tubului. Obiectivul este compus
dintr-un sistem centrat de lentile aezate ntr-un tub metalic care se nurubeaz la revolver. Exist
obiective uscate (ex. 10x sau 40x) i cu imersie (ex. 90x sau 100x). Dispozitivul de iluminare este
format din oglind i condensator.
Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumin spre axul optic.
Condensatorul este format din 2-3 lentile cu ajutorul crora lumina reflectat de oglind este
concentrat asupra obiectului; fascicululul paralel de raze de lumin care cade pe condensator devine
convergent.
Razele de lumin, nainte de intrarea n condensator, trec printr-un suport de filtre i o diafragm iris
(diafragm de apertur). Condensatorul contribuie n mod esenial la luminozitatea imaginii.
5. 6. 1. 2. Examinarea folosind microscopul optic n cmp luminos
A. Examinarea unui preparat proaspt (ntre lam i lamel)
Depunem pe lam o pictur din produsul de examinat, acoperim cu o lamel, aezm pe platina
microscopului i fixm cu ajutorul cavalerilor. Plasm condensatorul la 1,5 cm sub platin, diafragmul
semi deschis i coborm obiectivul 40x pn deasupra lamelei. Privim prin oculare, rotim foarte ncet
macroviza pn vedem cmpul microscopic. Clarificm imaginea cu ajutorul microvizei i sistemului
luminos. Putem examina sedimentul urinar, materii fecale provenind de la un pacient cu diaree,
suspensii de bacterii care se presupune c sunt mobile, preparate umede recoltate din micoze cutanate
superficiale etc, spre exemplu:

n sedimentul urinar vedem celule epiteliale, leucocite, hematii, cilindrii urinari, cristale urinare,
levuri etc. (Figura nr. 9)

n preparatul montat n soluie KOH vedem levuri, blastoconidii, atroconidii etc.

n preparatul colorat cu tu de India vedem levuri capsulate (cu halou) etc.

pentru a diferenia mobilitatea microorganismelor de micarea brownian urmrim diferite repere


din cmpul microscopic. (Film nr. 3)
B. Examinarea unui preparat fixat i colorat
Punem frotiul pe platin i fixm cu ajutorul cavalerilor. Centrm zona de examinat. Procedm aa
cum am artat, utiliznd iniial obiectivul 40x; dup ce am ales un cmp ridicm tubul microscopului,
punem o pictur de ulei de cedru pe lam. Ridicm condensatorul pn sub platin; diafragmul este
deschis.
Privind din lateral, folosim macroviza i coborm (cu mult grij) obiectivul cu imersie (90x sau 100x)
pn atingem suprafaa lamei realiznd contactul i cu uleiul de cedru. Privim prin oculare i rotim
foarte ncet macroviza ridicnd foarte ncet tubul microscopic; prindem imaginea; clarificm imaginea
cu ajutorul microvizei.
Examinm morfologia celulelor din p.p., prezena i aspectul PMN, prezena bacteriilor i dispunerea
acestora (n grmezi, n lanuri etc), poziia fa de PMN (intra sau extra-leucocitar), morfologia
microorganismelor etc., cu mici diferene n funcie de coloraie. (Figura nr. 10)
5. 6. 1. 3. ntreinerea microscopului
La pornirea microscopului, ne asigurm c poteniometrul care controleaz sursa de lumin este la
minim. Pornim sursa de lumin i o ajustm n funcie de necesar.

Dup terminarea examenului microscopic:


nchidem sursa de lumin;
ridicm cu tubul microscopului;
coborm condensatorul;
scoatem lama de pe platin.
Este obligatoriu ca dup examinare produsele nefixate (preparate ntre lam i lamel) s fie puse n
flaconul cu amestec dezinfectant.
Frotiurile interesante pot fi pstrate (trecute iniial prin xilol, apoi uscate i stocate ntr-o cutie special).
tergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hrtie special, pentru a o cura de
uleiul de cedru (periodic, tergem aceast lentil cu tifon foarte curat, mbibat n xilol). Curm platina
i lentila condensatorului cu tifon curat mbibat n xilol. Acoperim microscopul cu o hus (l ferim de
praf). Ar fi recomandabil ca microscopul s fie inut n ambalaj de polietilen mpreun cu o substan
desicant (ex. silicagel).
5. 6. 2. Microscopul cu fond ntunecat
Folosim un microscop la care s-a adaptat o surs de lumin cu intensitate mare i un condensator
cardioid. Condensatorul pentru cmp ntunecat oprete accesul spre obiectiv al razelor de lumin
directe iar obiectul este iluminat oblic. Obiectul studiat apare luminos pe fondul ntunecat al cmpului.
(Figura nr. 11)
Obiectul este imersat ntr-o pelicul de glicerin pentru a evita reflexia total a razelor. Lamele trebuie
s aib grosimea de 1 milimetru.
Tehnica de examinare
Examinm iniial frotiul n folosind condensatorul pentru cmp luminos, uitndu-ne cu obiectivul cu
mrire 10x pentru a repera structurile de interes. nlocuim apoi cu condensatorul cardioid (cu
diafragma nchis). Ridicm condensatorul pn la nivelul platinei i punem pe lentila condensatorului
o pictur de glicerin.
Pregtim preparatul ntre lam i lamel i l plasm pe platin astfel nct s vin n contact cu
glicerina de pe lentila condensatorului. Fixm preparatul cu ajutorul cavalerilor.
Examinm iniial cu obiectivul 10x, apoi 40x cobort pn aproape de suprafaa lamelei; clarificm
imaginea cu ajutorul microvizei. Cnd obinem imaginea curgerii unui curent de lichid tim c
suntem n cmpul microscopic. Utilizm microviza i clarificm detaliile.
Utilizm acest microscop pentru examinarea morfologiei i mobilitiiTreponema pallidum n
serozitatea din ancru sau pentru alte spirochete (p.p. sau cultur).
5. 6. 3. Microscopul cu fluorescen
Acest microscop are o surs de radiaii (ex. o lamp care emite radiaii UV), setul de filtre (caloric, de
excitaie, de baraj), condensatorul pentru fond ntunecat. Sursa de radiaii emite att radiaii UV ct i
radiaii calorice. Filtrele absorb radiaiile calorice emise i permit trecerea spre preparat a radiaiilor cu
lungime de und mic (ex. UV) care sunt radiaiile de excitaie. Filtre de baraj asigur protecia ochiului
celui care examineaz, fr a permite trecerea radiaiilor de nocive. Alegem filtrele (de excitaie i baraj)
n funcie de fluorocromul utilizat astfel nct lumina emis de fluorocromi s poat trece. Lichidul de
imersie utilizat pentru examinare prin obiectivele speciale trebuie s nu aib fluorescen (ex. glicerin
tamponat neutr), iar lamele folosite s aib grosimea de 1 milimetru.
Examinarea folosind microscopul cu fluorescen
Compuii organici care prezint proprietatea ca dup iradiere cu radiaii ultraviolete s absoarb
radiaia excitant, intr n stare de excitaie iar, atunci cnd revin n starea normal pierd energia
acumulat i emit radiaii luminoase se numesc flurocromi. Exist mai muli fluorocromi, spre exemplu
auramina O, acridin-oranj R, rhodamina B, tripaflavina etc. Culoarea luminii emise depinde de
fluorocromul (ex. culoarea este galben pentru auramina O, galben-portocalie pentru combinaia
de auramin O - rhodamin B etc). Pentru examinarea cu ajutorul microscopului cu fluorescen,
preparatele trebuie s fie tratate cu fluorocromi.
Substanele (fluorocromi) care se pot lega covalent de anticorpi. Astfel, definim:
imunofluorescena direct, caz n care folosim anticorpi intii mpotriva unor antigene (componente
bacteriene de interes) marcai cu fluorocromi;

imunofluorescena indirect, caz n care folosim o reacie ce are loc secvenial. n prim faz, folosim
un anticorp intit ctre antigenele de interes. n a doua faz, folosim anticorpi marcai cu substane
fluorocrome mpotriva primilor anticorpi.
Aceste complexe Ag-Ac pot fi foarte utile n diagnosticul microbiologic, att n prima etap (frotiu din
p.p.) ct i n identificare. Dac marcajul se realizeaz cu izotiocianat de fluorescein, lumina emis va
avea culoare verde; dac marcajul se realizeaz cu lisamin-rhodamin, lumina emis va avea
culoare portocalie.
Putem utiliza microscopia cu fluorescen n diagnosticul microbiologic al tuberculozei, leprei, tusei
convulsive etc.
5. 7. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2835776/
2.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3805368/
3.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3733684/
4.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3510232/
5.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3350602/
5. 8. Povestire adevrat
Prezentm o situaie n care examinarea microscopic a p.p. pune diagnosticul i ajut la urmrirea eficacitii
tratamentului.
Tuberculoza (TB) este o boal infecioas ce are ca agent etiologic Mycobacterium tuberculosis (cauz major de
morbiditate i morbiditate la nivel mondial); se estimeaz c exist aproximativ 2 miliarde de persoane infectate i
aproximativ 1,7-2 milioane de decese n fiecare an. n 2010, se estima o inciden a de TB 8,8 milioane de cazuri la
nivel global (echivalentul a 128 de cazuri la 100.000 de locuitori), i o prevalen de 12 milioane de cazuri (cca.
o

178 /oooo).
Orientrile actuale de Organizaiei Mondiale a Sntii OMS) i Uniunii Internaionale mpotriva Tuberculozei i
Bolilor Pulmonare afirm c pasul esenial n investigarea pacienilor suspeci de a avea TB pulmonar ar trebui s
fie examinarea microscopic a sputei. Pentru orice pacient ar trebui s fie examinate cel puin 2 (preferabil 3)
probe de sput. Cu toate acestea, n epoca diagnosticului molecular, care este rolul examinrii microscopice
a frotiului de sput? Este important s se atribuie acestui test importana cuvenit, n special n contextul recentei
aprobri OMS a unui test automat de amplificare ADN, Xpert MTB/RIF.
Ipotetic, ar fi necesar un test accesibil, rapid i universal care s nu fie afectat de patologii asociate (inclusiv
infecia HIV/SIDA). Ideal, pentru a putea diagnostica eficient TB, testele ar trebui s fie disponibile i n centre
rurale (cu resurse limitate). Ar trebui s nu necesite nici electricitate, nici refrigerare, sau acces la ap curent. Ar
trebui s fie disponibile pe scar larg, uor de utilizat, cu o cerin de pregtire minim. Rezultatele trebuie s fie
disponibile ntr-o or, i ar trebui s aib o sensibilitate, specificitate i valori predictive pozitive i negative
ridicate. n prezent, un astfel de test diagnostic nu exist.
Pentru moment, cel mai apropiat test de testul ideal = examinarea microscopic a frotiului de sput. Pn la
apariia unui test mai eficient, disponibil la locul de diagnostic, diagnosticul microscopic al frotiului de sput
rmne unul din instrumentele cele mai importante de lupt mpotriva infeciilor cu M. tuberculosis.
5. 9. De reinut
Microscopul este una dintre cele mai importante unelte (tool) n diagnosticul bacteriologic direct, dar nu
putem stabili un diagnostic de certitudine doar pe baza examenului microscopic.

Variantele tehnice ale microscoapelor faciliteaz diagnosticul n cazul diferitelor tipuri de p.p. i de infecii
suspectate. Examinarea produselor ntre lam i lamel ct i a frotiurilor colorate, att din produs patologic ct i
din cultur pur ofer informaii necesare caracterizrii proceselor inflamatorii i a microorganismelor implicate.
Microscopul trebuie ngrijit periodic pentru a-l menine n perfect stare de funcionare.
5. 10. Verificai-v cunotinele
Urmtoarele ntrebri au rspuns unic:
1. Care este obiectivul folosit pentru examinarea iniial a unui frotiu colorat Gram la microscopul optic cu fond
luminos:
A. Obiectivul 100x utiliznd ulei de imersie
B. Obiectivul 100x fr a folosi ulei de imersie
C. Obiectivul de 40x utiliznd ulei de imersie
D. Obiectivul de 10x
E. Obiectivul de 40x fr a folosi ulei de imersie
2. La examinarea unui frotiu colorat Gram:
A. Putem vizualiza cu acuratee diferenele ntre diferitele tipuri de leucocite
B. Nucleul celulelor eucariote este colorat violet, iar citoplasma rou-pal
C. BAAR sunt colorai rou
D. Microorganismele Gram negative sunt roii, iar cele Gram pozitive sunt violet
E. Microorganismele Gram pozitive sunt roii, iar cele Gram negative sunt violet
Urmtoarele ntrebri au rspuns multiplu la alegere:
3. n cadrul protocolului coloraiei Gram:
A. Dup fixarea chimic a frotiului, adugm violet de genian
B. Adugm lugol, ca fixator, pentru 1-3 minute
C. Adugm acid-alcool pentru 8 secunde i splm cu ap abundent
D. Adugm fuxin bazic nediluat pentru 1-3 minute
E. Adugm fuxin diluat 1/9 pentru un minut
4. La examinarea unui frotiu colorat Zeihl-Neelsen:
A. Celulele eucariote sunt colorate albastru

B. Microorganismele non-AAR Gram pozitive sunt colorate rou


C. Microorganismele non-AAR Gram negative sunt colorate rou
D. BAAR sunt colorate rou
E. Celulele eucariote sunt colorate rou
5. n ceea ce privete microscopul cu fluorescen:
A. Sursa de lumin emite att radiaii calorice (nocive) ct i radiaii cu und mare (ultraviolete)
B. Se folosesc filtre speciale pentru protecia examinatorului
C. Examinarea se face folosind ulei de cedru
D. Prepararea frotiului necesit folosirea de fluorocromi
E. Coloraia cu auramin O este util n vizualizarea BAAR
5. 11. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Examenul nativ ntre lam i lamel caut s evidenieze microorganismele prezente la nivelul unui p.p.
2. Examinarea unui frotiu colorat Ziehl-Neelsen poate pune diagnosticul unei infecii urinare cu Escherichia coli.
3. Examinarea unui frotiu colorat Gram poate pune diagnosticul unei meningite acute bacteriene.
4. Examenul microscopic necesit aproximativ o zi pentru a fi efectuat.
5. Ustensilele necesare pentru a efectua un frotiu, a-l colora i a-l examina microscopic sunt disponibile doar n
laboratoarele specializate.

6. Medii de cultur. Cultivarea microorganismelor.


(Gabriela-Loredana Popa, Andreea-Georgiana Tnase)
6. 1. Cuvinte cheie
Colonie
Cultur
nsmnare
Inoculare
6. 2. Introducere
Cultivarea microorganismelor are ca scop obinerea de colonii izolate pentru a identifica (pe baza a
diferite caractere), agentul infecios dintr-un anumit produs patologic (p.p.) recoltat de la un pacient cu
o boal infecioas.
Coloniile izolate alctuiesc cultura pur (bacterian, fungic) (Figura nr. 1) care se obine nsmnnd
p.p. pe diferite medii de cultur (solide sau lichide) ce asigur substanele nutritive i conditiile
necesare creterii i multiplicrii microbiene.
Obinerea coloniilor izolate mai este util i pentru testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice.
6. 3. Medii de cultur
Mediile de cultur se clasific dup diferite criterii. Aa cum am explicat i n volumul Microbiologie
Medical, acestea pot fi: necelulare (artificiale, medii de cultur) i celulare (includ celule vii de ex.
animale de laborator, ou de gin embrionate sau culturi de celule). Majoritatea bacteriilor i fungilor
se pot cultiva pe medii de cultur (necelulare, artificiale). Exist i microorganisme (ex. virusuri,
Rickettsii, Chlamydii) care nu se pot cultiva dect pe gazde vii.
6. 3. 1. Medii celulare (vii)
Din categoria mediilor celulare (vii) (Figura nr. 2) fac parte: animalele de experien, oul de gin
embrionat i culturile de celule.
Animalele de experien pot fi utilizate pentru inocularea produselor patologice care includ
microorganisme ce nu se dezvolt n alte condiii; totodat mai pot fi utilizate n studii de patogenitate
(ex. oarecele alb, cobaiul, obolanul, hamsterul, iepurele etc.). Aceast metod necesit un cost ridicat
deoarece e nevoie de existena unei biobaze care s respecte regulile GMP (Good Manufacturing
Practices).
Oul de gin embrionat are un cost mai sczut (dar mult mai mare dect preul unui ou obinuit), este
steril (produs n condiii de GMP), nu prezint factori antimicrobieni n primele 6-14 zile de incubaie.
Se examineaz la ovoscop
(evaluarea strii embrionului) (Figura nr. 3) i se poate inocula intraembrionar, la nivelul membranei
chorioalantoidiene, n sacul alantoidian sau n sacul amniotic (Figura nr. 4). Se introduce n incubator
(37C) timp de una sau mai multe zile.
Putem utiliza i culturi de organ sau culturi de celule (de ex. culturi primare). Culturile primare deriv
din dispersia celulelor unui organ proaspt recoltat i pot fi meninute in vitro 3-5 pasaje.
6. 3. 2. Medii necelulare (artificiale)
Acestea sunt mai ieftine, se prepar uor i sunt cel mai frecvent folosite (Figura nr. 5).
Ele trebuie s fie sterile, nutritive, s aib un anumit pH (de regul 7,2-7,6), s aib umiditatea
favorabil multiplicrii germenilor etc.
6. 3. 2. 1. Clasificarea mediilor de cultur artificiale
Mediile de cultur artificiale se pot clasifica astfel:
dup starea de agregare [solide (agar/geloz, agar-snge, AABTL, Bordet- Gengou, Lffler,
Lwenstein, Mueller-Hinton, Sabouraud etc.), lichide (ap peptonat alcalin, bulion Mueller-Hinton,
bulion-snge etc.), semisolide (MIU, MILF etc.)];

dup compoziie [simple (agar, bulion simplu etc.), complexe (agar-snge, gelozchocolat, agar cu factori X i V, Mueller-Hinton etc.)];
dup scopul urmrit [de transport (Cary-Blair etc.), de izolare (Bordet-Gengou, Lwenstein,
Sabouraud etc.), de identificare (TSI, MIU etc.), de conservare];
exist i medii speciale [elective (Lffler etc.), selective (agar-snge, BSA, Chapman, Mac Conkey,
medii cu antibiotice etc.), de mbogire (ap peptonat alcalin, bulion selenit, O.C.S.T. etc.),
difereniale (AABTL, agar-snge, MIU, TSI etc.).
Mediul electiv conine substanele care sunt cele utile pentru multiplicarea unei bacterii (de exemplu
mediul Lffler pentru bacilul difteric). Mediul selectiv inhib dezvoltarea unor bacterii, dar permite
multiplicarea bacteriei pe care dorim s o izolm. Putem folosi medii n care includem antibiotice (de
ex. dac Mycobacterium tuberculosis este rezistent la penicilin i dorim s izolm aceast bacterie,
putem pune n mediu penicilina la care ali germeni sunt sensibili). Mediul de mbogire favorizeaz
nmulirea anumitor bacterii, n timp ce inhib dezvoltarea altor microorganisme din p.p. Mediul de
mbogire este n acelai timp mediu selectiv i mediu electiv. Mediul diferenial permite diferenierea
bacteriilor/fungilor (dup caz). De ex. mediul geloz-snge permite diferenierea n funcie de tipul
hemolizei. Alte medii difereniale conin un substrat (ex. lactoz / glucoz etc.) care poate fi sau nu
metabolizat; mai conin i un indicator de pH. Dac zaharul este metabolizat va avea loc modificarea
pH-ului i respectiv a culorii (pentru c indicatorul de pH are culori diferite la pH neutru, pH alcalin sau
la pH acid. De ex., agarul cu albastru de brom- timol lactozat (AABTL) permite diferenierea bacteriilor
lactoz-pozitive (ex. E. coli) de bacteriile lactoz-negative (Shigella, Salmonella etc.) (Figura nr. 6). Alte
exemple sunt TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree) etc.
Mediile de cultur pot fi preparate n laborator conform unor reete, se pot cumpra medii
deshidratate (rehidratate cu ap distilat, demineralizat etc.) dar exist i medii gata pentru utilizare,
condiionate n plci Petri, tuburi etc. Toate mediile sunt supuse controlului de calitate, pentru fiecare
lot n parte. Mediile pe care urmeaz s le folosim trebuie s fie sterile.
Mediile de cultur pot fi stocate pentru un timp la frigider (+4C), n folie de plastic nchis ermetic.
Mediile pentru cretere n anaerobioz (bulion tioglicolat, alte medii) se pstreaz n dulapuri, la
ntuneric i la temperatura camerei.
6. 3. 2. 2. Cteva exemple de medii de cultur
Agar-snge: mediul conine agar care se dizolv la temperatur n ap distilat steril; autoclavm (15
minute la ) i rcim pn la . Fr a se rci n continuare, adaugm 5% snge defibrinat de animal.
Distribuim aseptic mediul n plci Petri.
Agar-chocolate: pn la obinerea amestecului de agar-snge procedm exact ca mai sus. n
continuare avem nevoie de o baie de ap la care temperatura e stabilit la . Introducem flaconul cu
agar-snge n baia de ap i meninem timp de 10 minute (eritrocitele se lizeaz i elibereaz factori
nutritivi). Cnd temperatura revine la turnm mediul n plci Petri.
Amies: este un mediu de transport. Conine agar, tioglicolat de sodiu, crbune
neutru (permite supravieuirea microorganismelor sensibile, ex. Neisseria gonorrhoeae) i o soluie
tamponat de sruri anorganice. Poate fi stocat timp de 12 luni la +4C.
Ap peptonat alcalin: este un mediu utilizat atunci cnd suspectm prezena Vibrio cholerae.
Conine pepton i clorur de sodiu dizolvate prin nclzire n ap distilat, cu ajustarea pH-ului la o
valoare de 8,6-9,0. Este repartizat n tuburi. Sterilizm prin autoclavare (15 minute, ). Poate fi stocat
timp de 6 luni la +4C.
Cary-Blair: este un mediu de transport de ex. pentru germeni Gram negativi. Conine agar, tioglicolat
de sodiu i o soluie tamponat de sruri anorganice dizolvate (prin nclzire i agitare) n ap distilat.
Poate fi stocat mai multe luni la +4C.
Lwenstein-Jensen: este utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis.

Conine o soluie de sruri i amidon, soluia de verde malachit i omogenizat de ou. Dup filtrare
mediul se repartizeaz n tuburi (cu capac nurubat). Este coagulat n pant.
Mac Conkey: este un mediu slab selectivo-diferenial. Componentele sunt dizolvate n ap distilat i
autoclavate 15 minute la . Stocarea poate dura 4 sptmni la +4C.
Mediul Sabouraud: este un mediu pentru fungi. Conine glucoz, digestie pancreatic de cazein i
agar. Se aduce la pH 5,6 urmnd fierberea, filtrarea i repartizarea n plci Petri. nainte de utilizare,
plcile cu mediu Sabouraud pot fi stocate la temperatura frigiderului circa 2 luni. Prin adugare de
antibiotice (ex. cloramfenicol etc.) obinem mediul selectiv.
6. 4. Tehnici de cultivare
Prin cultivare urmrim s obinem o populaie microbian necesar i suficient pentru diagnostic. n
timpul cultivrii nu este permis contaminarea p.p. Coloniile bacteriene izolate dintr-un produs
patologic se obin prin epuizarea inoculului pe medii de cultur, folosind ansa bacteriologic, pipeta
Pasteur, tamponul de vat sau alte tehnici.
6. 4. 1. Obinerea coloniilor izolate folosind ansa bacteriologic (Film nr. 1)
nsmnarea n pentagon deschis pornind de la un p.p. adus n laborator se desfoar lng becul
de gaz, n urmtoarele etape:
notm pe placa cu mediu datele de identificare;
sterilizm ansa (bucla i firul) la rou i flambm portansa;
lum eprubeta cu p.p. n mna stng, scoatem dopul eprubetei utiliznd degetele 4-5 de la mna
dreapt; flambm gura eprubetei (trecere prin flacr de 2-3 ori);
introducem ansa n eprubet fr s atingem partea superioar i rcim bucla pe pereii interiori n
vecintatea p.p., ncrcm bucla cu p.p. i scoatem ansa ncrcat, fr s atingem pereii sau gura
eprubetei;
flambm gura eprubetei; punem dopul eprubetei i aezm eprubeta n stativ; cu mna stng lum
o plac Petri pe care o aezm pe mas cu capacul n jos i mediul n sus; prima latur a unui viitor
pentagon deschis; apoi nchidem placa Petri;
relum procedura de sterilizare, flambare i rcire a ansei (ex. atingem mediul ntr-o zon
nensmnat, pe interiorul plcii Petri);
nu mai ncrcm ansa cu p.p. i trasm a doua latur a pentagonului intersectnd-o pe prima;
sterilizm din nou ansa; repetm pentru urmtoarele laturi i avem grij s nu se uneasc ultima latur
cu prima latur;
punem placa Petri nsmnat n termostat, la 35- ( pentru fungi); dup circa 18-24 ore de incubare,
pe prima latur rezult o cantitate mare de cultur, n timp ce pe urmtoarele laturi cultura e n
cantitate din ce n ce mai mic i pe ultimele laturi, sau cel puin pe ultima latur a pentagonului
deschis vedem colonii izolate (Figura nr. 7).
6. 4. 2. nsmnarea cu ansa calibrat
putem utiliza anse de platin sau anse de unic folosin cu calibrul de 0,01 sau 0,001 ml, pentru
urocultur; urina se omogenizeaz prin rsturnarea de cteva ori a recipientului de recoltare nchis
etan; apoi nclinm recipientul astfel nct s putem tot cu mna stng deschidem placa iar cu ansa
ncrcat cu p.p. trasm cteva linii ca un zig-zag (fr s ridicm ansa de pe mediul de cultur);
rezult astfel pune bucla ansei, paralel pe suprafaa urinei i s prelevm p.p.;
descrcm p.p. n striu, pe unul dintre diametrele unei plci Petri, epuizm inoculul pe toat suprafaa
plcii n striuri perpendiculare pe primul striu (prin micri n zig-zag);
dup incubare, n urmtoarea zi numrm coloniile aprute (i nmulim numrul de colonii cu 1.000
dac am utilizat pentru nsmnare ansa de 0,001 ml).
6. 4. 3. nsmnarea prin nepare a mediului turnat n tuburi/eprubete
metoda se poate utiliza pentru conservarea culturilor pure ale tulpinilor de colecie sau pentru

nsmnarea unor medii multitest (TSI, MIU etc.);


preferm utilizarea unei anse-fir;
spre exemplu dac facem cultivarea pe mediul TSI:
utilizm tuburi de dimensiuni mici (3 ml mediu pentru un tubuor);
nsmnm partea dreapt prin nepare, fr a se atinge baza tubului;
apoi nsmnm partea nclinat prin realizarea unor striuri n zig-zag, atingnd suprafaa
mediului.
Studenii vor urmri demonstrarea modului n care se execut tehnicile de nsmnare i vor executa
unele dintre aceste tehnici.
6. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cei care doresc s
citeasc mai mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri
corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23667677
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20436722
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19144796
6. 6. Povestire adevrat
Un biat n vrst de 26 de ani se prezint la un spital local pentru dureri la nivelul articulaiilor mari i
coloanei, debutate cu 2 luni n urm. Din istoricul pacientului menionm ca relevant o pneumonie
nsoit de pleurezie al cror agent etiologic s- a suspectat a fi Mycobacterium tuberculosis fr a
putea fi pus n eviden prin metode directe de bacteriologie. A primit medicamente antituberculoase
iar simptomatologia s-a ameliorat, remarcndu-se totui hipogamaglobulinemia persistent.
La internare, pacientul prezenta febr (38,2C), dureri la nivelul articulaiilor i hipogamaglobulinemie
de cauz necunoscut. A fost eliminat diagnosticul de artrit septic ntruct n urma recoltrii i
cultivrii de lichid sinovial de la nivelul articulaiei oldului stng nu a crescut nicio bacterie pe mediile
de cultur folosite. Pacientul a fost transferat la alt spital unde, n urma semnelor menionate
(hipogamaglobulinemie, redoare matinal, sensibilitate la nivelul articulaiilor oldului, genunchilor,
umerilor, minilor i la nivelul articulaiei proximale a mediusului de la mna dreapt fr roea sau
cldur local), s-a pus diagnosticul de artrit reumatoid. S-a nceput tratamentul cu prednisolon dar
dup o sptmn a reaprut febra (38,5C). S-a recoltat lichid sinovial de la nivelul articulaiei oldului
drept, utiliznd de data aceasta un mediu de cultur special. Dup mai mult de 5 zile s-a identificat
Mycoplasma hominis dar ntre timp pacientul a dezvoltat meningit iar diseminarea bacterian nu a
putut fi oprit i evoluia a fost nefast, spre deces.
Discuii
n cazul de fa hipogamaglobulinemia nsoit de artit cu ngustarea spaiului articular au condus la
diagnosticul fals de artrit reumatoid, excluzndu-se (eronat) etiologiile infecioase cel mai frecvent
ntlnite. Izolarea Mycoplasma hominis nu se realizeaz de rutin deoarece este nevoie de medii de
cultur speciale i un timp mai ndelungat de cretere.
Concluzii
La pacienii care prezint hipogamaglobulinemie se impune luarea n considerare a prezenei
Mycoplasma hominis folosind medii de cultur specifice.
6. 7. De reinut
Pentru a identifica agentul infecios dintr-un p.p. recoltat de la pacient este necesar nsmnarea
p.p. respectiv pe o plac Petri, urmnd ca dup o anumit perioad de timp, variabil n funcie de
diferitele bacterii, s creasc pe mediul respectiv culturi pure (colonii).
Exist mai multe tipuri de medii de cultur (celulare/ necelulare) la fel cum exist mai multe metode

de nsmnare a p.p. recoltat.


6. 8. Verificai-v cunotinele
Citii cu atenie urtoarele ntrebri i alegei o singur variant de rspuns:
1. Urmtoarele medii de cultur fac parte din categoria mediilor necelulare, cu excepia:
A. Cary-Blair
B. Mac Conkey
C. TSI
D. oul de gin embrionat
E. agar-snge
2. Despre mediul diferenial nu este adevrat urmtoarea afirmaie:
A. conine un indicator de pH
B. permite diferenierea anumitor bacterii prin metabolizarea sau nu a unui substrat
C. AABTL permite diferenierea bacteriilor glucoz-pozitive de cele lactoz- pozitive
D. dac substratul coninut n mediu se metabolizeaz are loc modificarea culorii
E. dac substratul coninut n mediu se metabolizeaz are loc modificarea pH-ului
Pentru urmtoarele ntrebri sunt corecte mai multe variante de rspuns:
3. Putem identifica agentul etiologic dintr-un anumit produs patologic prin:
A. testarea sensibilitii coloniilor la antibiotice i chimioterapice
B. nsmnarea produsului patologic pe diferite medii de cultur
C. inocularea produsului patologic la anumite animale de laborator, dup caz
D. nsmnarea p.p. pe o plac Petri, formnd un pentagon nchis
E. cultivarea p.p. pe medii de cultur, obinnd culturi pure sau parial pure.
4. Alegei afirmaiile adevrate:
A. mediul Lwenstein-Jensen este utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis
B. mediul Cary-Blair este un mediu de transport
C. mediul agar-snge este lichid
D. mediul geloz este folosit pentru Ricketsii
E. mediul Lffler pentru bacilul difteric este un mediu electiv
6. 9. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. M voi contamina dac voi atinge un mediu de cultur nsmnat n prealabil cu un p.p. recoltat de
la un pacient.
2. Flambarea (trecere prin flacr de 2-3 ori) n scopul sterilizrii este, de cele mai multe ori, ineficient.
3. Cultivarea unui p.p. pe orice mediu de cultur va permite dezvoltarea coloniilor astfel nct vom
putea identifica agentul etiologic al bolii respective.
4. Este indicat folosirea mediilor celulare n detrimentul celor necelulare datorit sensibilitii crescute
a celor dinti.
5. Cultivarea microorganismelor este o metod indispensabil n practica de zi cu zi a unui laborator de
bacteriologie.

7. Examinarea caracterelor fenotipice. Teste de


identificare. (Gabriela-Loredana Popa, Mara-Mdlina
Mihai)

7. 1. Cuvinte cheie
Colonii de tip S, R, M
Fenomenul de invazie i linia de demarcaie
Cap de meduz/ coam de leu
Pigmentogenez i hemoliz (, , , )
Teste fenotipice
Auxanograma
7. 2. Introducere
Coloniile izolate se pot obine prin diferite tehnici. Majoritatea speciilor bacteriene se multiplic i
formeaz culturi n 18-24 de ore de incubare la temperatura optim de dezvoltare (ex. 35-37C). Pentru
bacteriile care necesit 3-5% CO2, plcile se pun n exsicator, mpreun cu o lumnare aprins. Pentru
bacteriile strict anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz. Fungii se dezvolt la 28-30C.
Examinarea coloniilor izolate este foarte util. Se poate realiza cu ochiul liber i cu ajutorul unei lupe
sau a unui stereomicroscop (dac sunt foarte mici).
7. 3. Aspectul culturilor pe medii lichide
Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se vor dezvolta n toat masa de lichid, iar mediul va deveni
tulbure. n schimb, bacteriile strict aerobe se dezvolt la suprafaa mediului (Figura nr. 1). Ca i idee
generic, n majoritatea cazurilor, tulpinile care pe mediile solide formeaz colonii de tip S tulbur
omogen mediul n timp ce tulpinile care formeaz colonii de tip R realizeaz o tulburare mai puin
omogen. Variantele R pot lsa mediul limpede, formnd flocoane care se depun sau un strat (vl) la
suprafaa mediului (ex.Mycobacterium tuberculosis) (Figura nr. 2).
Exemple de cretere pe medii de cultur lichide (Tabelul nr. 1):

mediul este tulburat omogen (ex. Staphylococcus spp.);

mediul este clar, cu depozit grunjos pe perei i la baza tubului (ex. Streptococcus pyogenes);

mediul este clar, cu vl la suprafa (ex. Vibrio cholerae);

mediul este clar, iar la suprafa se dezvolt o membran groas, plisat (ex. Mycobacterium
tuberculosis).
7. 4. Aspectul culturilor pe medii solide
Aspectul coloniilor variaz n funcie de microorganismul cercetat, dar nu este att de specific nct s
permit un diagnostic. Exist un caracter orientativ.
7. 4. 1. Atunci cnd descriem coloniile ar trebui s notm diferite proprieti:

dimensiunea
o coloniile pot fi mari (ex. Klebsiella pneumoniae sau levuri) (Figura nr. 3)
o medii (majoritatea bacteriilor studiate)
o mici, sub (ex. Streptococcus viridans)
o foarte mici (ex. Mycoplasma spp., Ureaplasma spp.);

marginile - regulate, neregulate, circulare, zimate, ondulate, lobate, filamentoase, acoperite cu


miceliu pufos, etc. (Figura nr. 4);

forma - punctiform, circular, neregulat, filamentoas, etc. (Figura nr. 5);

relieful - plat, convex, ombilicat, papilat (Figura nr. 6);

suprafaa - neted, lucioas, mat, rugoas, mucoid, pufoas (Figura nr. 7);

culoarea - pigment la nivelul coloniei sau/i al mediului (Figura nr. 8);

opacitatea - transparente, semitransparente, opace (Figura nr. 9);

consistena, aderena la mediu (Figura nr. 10).


7. 4. 2. Tipuri de colonii

Colonia S (smooth) are suprafaa bombat i neted, iar marginile sunt circulare. Microorganismele
din colonie pstreaz structura antigenic; nu aglutineaz spontan cu soluie salin fiziologic.
Germenii capsulai i pstreaz capsula. Virulena este conservat. Majoritatea bacteriilor studiate
formeaz colonii de tip S (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, E. coli, Candida albicans etc)
(Figura nr. 11).
Colonia R (rough) este plat, mat, uscat, cu margini crenelate (zimate) i o suprafa ce prezint
rugoziti. Structura antigenic i capsula nu sunt pstrate. Virulena nu este conservat
(excepii Bacillus anthracis,Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae) (Figura nr. 12).
Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare, umed, mucoas, cu aspect de curgere pe mediu. Este
produs de bacteriile care prezint capsul (ex.Klebsiella pneumoniae) (Figura nr. 13).
7. 4. 3. Aspecte particulare
Datorit mobilitii, Proteus spp. formeaz pe mediile solide colonii cu un aspect particular. n
funcie de tehnica de nsmnare pot fi observate

fenomenul de invazie: o tulpin din genul Proteus nsmnat la periferia unei plci cu mediu de
cultur simplu se va dezvolta n valuri concentrice pe toat suprafaa mediului (Figura nr. 14)

fenomenul liniei de demarcaie: prin cultivarea a 2 tulpini diferite de Proteus, n 2 puncte


diametral opuse, vom observa invazia pn n apropierea unei linii de ntlnire, denumit linie de
demarcaie (Figura nr. 15)

fenomenul de crare: cultivm un produs patologic (n care exist o tulpin de Proteus spp.) la
baza unui tub cu geloz nclinat, iar cultura se va dezvolta pe tot mediul din tubul respectiv (Figura nr.
16).
Bacillus anthracis produce colonii n cap de meduz sau n coam de leu, de tip R: mari, culoare
alb-cenuiu, cu prelungiri ondulate n periferie (Figura nr. 17).
7. 5. Caractere metabolice
7. 5. 1. Pigmentogeneza
Pigmentogeneza poate fi util n identificare. Uneori este necesar s respectm unele condiii speciale
de cultivare pentru a obine pigmentarea coloniilor.
Bacteriile pot produce un pigment care coloreaz colonia bacterian (ex. pigmentul auriu la S. aureus);
sau pot colora i coloniile i mediul (pigmentul este difuzibil n mediu- ex. la Pseudomonas aeruginosa)
(Figura nr. 18).
i fungii pot produce pigmeni. Coloniile de Candida albicans au culoare alb, n schimb mucegaiurile
produc o varietate mult mai mare de pigmeni:Aspergillus flavus - colonii galben verzui pn la verde
nchis, dar privite pe partea cealalt a plcii apar roii-brune, A. fumigatus - colonii iniial albe care
devin albastre-verzui sau albastre, iar privite pe cealalalt parte a plcii sunt colorate brun sau n alte
culori, A. niger - colonii iniial albe, devin brun negre, iar privite pe cealalalt parte a plcii sunt colorate
n galben etc (Figura nr. 19).
7. 5. 2. Producerea de hemolizine
Unele microorganisme produc enzime (hemolizine) care lizeaz hematiile din mediile de cultur cu
snge. Hemoliza poate avea aspecte diferite (Figura nr. 20):
hemoliz (hemoliz viridans): produc liza incomplet a hematiilor i culoarea verzuie
(ex. Streptococcus viridans,Streptococcus pneumoniae);
hemoliz: hematiile sunt complet lizate, zona de hemoliz fiind clar (ex. Streptococcus
pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes).
7. 5. 3. Producerea altor enzime

catalaz (ex. Staphylococcus spp.);

gelatinaz (cultura microbian lichefiaz gelatina, ex. Clostridium perfringens);

lecitinaz (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.);

oxidaz (ex. N. meningitidis, N. gonorrhoeae, P. aeruginosa, V. cholerae).


7. 5. 4. Alte caractere metabolice

tolerana la un anumit pH (ex. V. cholerae se multiplic la pH alcalin);

tolerana la o anumit concentraie de NaCl (ex. Staphylococcus aureus);


sensibilitatea la optochin (ex. S. pneumoniae) sau la bacitracin (ex. S. pyogenes).
7. 6. Caractere de patogenitate
Caracterele de patogenitate pot fi evideniate in vitro sau in vivo.
7. 6. 1. Teste efectuate in vitro

Examinarea coloniilor cu rol orientativ (majoritatea speciilor bacteriene sunt patogene n forma
S; excepie bacilii antraxului, difteric i tuberculos);

Efectuarea anumitor teste biochimice ori metabolice cu rol orientativ (ex. fermentarea manitei,
testul coagulazei, producerea de hemolizine);

Evidenierea producerii unor toxine (endotoxine, ex. prezena endotoxinei produce gelificarea unui
lizat de Limulus polyphemus) sau exotoxine.
7. 6. 2. Teste efectuate in vivo
Sunt utilizate animale de laborator sensibile fa de infecia experimental cu diferii germeni sau fa
de anumite toxine microbiene.
7. 6. 2. 1. Toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxiinfecii alimentare (TIA) cuClostridium botulinum
Iniial, se obine un supernatant dup triturarea i centrifugarea alimentelor incriminate. n
continuare se vor utiliza 2 preparate: supernatantul rezultat i supernatantul meninut timp de 15
minute la 100C (toxina botulinic este termolabil, urmrindu-se astfel obinerea unui martor negativ).
Cele 2 preparate se vor inocula n urmtoarele variante la 4 loturi de oareci (0,5 ml/ oarece) sau cobai
(1 ml/ cobai): lotul 1-supernatant ca atare, lotul 2- supernatant inactivat, lotul 3- 0,1 ml ser antitoxin
A, urmat de adugarea supernatantului (dup 30 minute), lotul 4- 0,1 ml ser antitoxin B urmat de
adugarea supernatantului (dup 30 minute). Dac, spre exemplu, animalele din loturile 1 i 4 mor, iar
animalele din loturile 2 i 3 supravieuiesc, n produsul patologic exist toxin botulinic de tip A.
(Figura nr. 21)
7. 6. 2. 2. Testarea patogenitii unor levuri (ex. pentru Candida albicans)
Pornind de la o cultur de 24 de ore n mediul Sabouraud lichid, se separ sedimentul, urmat de
realizarea unei suspensii 0,2% a acestuia n soluie salin fiziologic steril. Se inoculeaz preparatul n
venele cozii la un lot de oareci (cte 0,2-0,8 ml pentru fiecare animal) i se urmrete evoluia
animalelor timp de 4-10 zile. Dac este implicat o tulpin de C. albicans patogen, animalele vor muri
dup circa 1 sptmn, fiind posibil evidenierea unor abcese miliare dup disecie.
7. 7. Cteva exemple de teste de identificare
Este interesant att studierea exemplelor ct i nelegerea necesitii controlului intern de calitate,
prin utilizarea martorilor (pozitiv i negativ) pentru fiecare test.
7. 7. 1. Utilizarea unui carbohidrat ca unic surs de carbon (auxanograma)
Principiu Levurile prezint un echipament enzimatic care le permite s utilizeze un anumit carbohidrat
ca surs unic de carbon. Dezvoltarea unei levuri pe un mediu n care este inclus un singur carbohidrat
demonstreaz utilizarea acestuia. Similar se poate verifica asimilarea unor substane azotate, de ctre
levuri.
Tehnica de lucru Se efectueaz o suspensie din cultura microbian n ap distilat steril. Mediul de
cultur se nclzete pn la topire i apoi se rcete la 50C pentru asimilarea carbonului. ntr-un tub
steril se introduc 20 ml de mediu, 2 ml soluie de vitamine i 0,25 ml din suspensia levuric, iar apoi se
toarn amestecul ntr-o plac Petri steril, ateptndu-se solidificarea.
Se depun 5 rondele din hrtie de filtru, una n centru i 4 spre periferia fiecrui cadran al plcii i
imediat, utiliznd o ans cu diametrul buclei de , se depun pe fiecare dintre rondele prelevatele din
diferite (5) soluii de carbohidrai, cel puin din glucoz. Dup incubarea la 28-30C pentru 24-48 ore se
urmrete apariia culturii n jurul rondelelor. (Figura nr. 22)
Interpretare Dac testul s-a efectuat corect, ar trebui s existe multiplicare levuric (cultur prezent)
n jurul rondelei pe care s-a depus soluie 5% glucoz, deoarece toate levurile pot folosi glucoza drept
unic surs de C. Apoi se noteaz dezvoltarea culturii n jurul celorlalte rondele, urmat de stabilirea
speciei implicate.
Control de calitate

tulpina de referin de Cryptococcus laurentii

tulpina de referin de Candida pseudotropicalis.

7. 7. 2. Testul sensibilitii la bacitracin


Principiu Multiplicarea a 99% din streptococii de grup A este inhibat de bacitracin (antibiotic
produs de Bacillus licheniformis).
Materiale necesare colonii -hemolitice izolate pe geloz-snge i microcomprimate de
bacitracin cu 0,04 U i cu 0,1 U.
Tehnica de lucru Prelevm 3-4 colonii -hemolitice i nsmnm omogen pe o jumtate de
plac Petri cu geloz-snge. Plasm n centrul ariei nsmnate un microcomprimat cu bacitracin i
incubm pentru 18-24 ore la 35-37C.
Interpretare Testul este pozitiv (bacteria este sensibil la bacitracin) n cazul n care rezult o
inhibiie a creterii bacteriene (indiferent de diametru), n jurul microcomprimatului cu 0,04 U
bacitracin sau rezult o inhibiie a creterii bacteriene cu diametrul , n jurul microcomprimatului cu
0,1 U. (Figura nr. 23)
Control de calitate

Martor pozitiv Streptococcus pyogenes

Martor negativ Streptococcus agalactiae.


7. 7. 3. Testul bilolizei (Neufeld)
Principiu Pneumococii (Streptococcus pneumoniae) capsulai sunt lizai n prezena bilei sau
srurilor biliare prin activarea unei enzime autolitice (Figura nr. 24).
Materiale necesare Colonii izolate a-hemolitice, soluie de dezoxicolat de sodiu 10%, soluie
salin izoton, ap distilat.
Tehnica de lucru Se prepar n soluie salin fiziologic o suspensie pornind de la coloniile ahemolitice izolate. Apoi se repartizeaz cte 0,5 ml din suspensie n 2 eprubete de sticl. n primul tub
se adaug 0,5 ml dezoxicolat de sodiu, iar n al doilea tub 0,5 ml ap distilat. Se incubeaz timp de 2
ore la 35-37C.
Interpretare
Test pozitiv: clarificarea suspensiei doar n tubul n care s-a adugat dezoxicolat (bacteriile au fost
lizate, fiind S. pneumoniae);
Test negativ: ambele tuburi au rmas opace.
Control de calitate
Martor pozitiv Streptococcus pneumoniae
Martor negativ Streptococcus viridans.
7. 7. 4. Testul producerii de catalaz
Principiu Catalaza descompune peroxidul de hidrogen n ap i oxigen.
Materiale necesare Colonii izolate dezvoltate pe medii fr snge, soluie de peroxid de hidrogen
3%, ap distilat.
Tehnica de lucru Se realizeaz o suspensie bacterian dens n 1-2 ml de ap distilat la care se
adug 1-2 picturi de soluie de peroxid de hidrogen. Se observ imediat i dup trecerea a 5 minute
apariia bulelor de oxigen. (Figura nr. 25).
Interpretare

Test pozitiv: apariia bulelor de gaz (bacteria produce catalaz)

Test negativ: absena bulelor de gaz.


Control de calitate:

Martor pozitiv Staphylococcus aureus

Martor negativ Streptococcus pyogenes.


7. 7. 5. Testul coagulazei
Principiu Stafilococii coagulaz-pozitivi produc o enzim care activeaz coagularea plasmei. Exist
2 tipuri de coagulaz: coagulaza liber i coagulaza legat de peretele celular (clumping factor).
Stafilococii coagulaz pozitivi sunt considerai Staphylococcus aureus.
Materiale necesare Colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmeaz s fie testat,
plasm de iepure, lame, tuburi.
Tehnica de lucru este diferit n funcie de suportul utilizat.
7. 7. 5. 1. Testul coagulazei pe lam (Figura nr. 26).

Se verific prezena coagulazei legate. Pe o lam se depune o pictur de ap distilat, urmat de


adugarea a 1-2 colonii, de suspensionarea i omogenizarea acestora pn la obinerea unui lichid
tulbure omogen.
Dac dup aproximativ 10 secunde se observ apariia unei eventuale autoaglutinri, nu mai
putem continua i n acest caz n care se va efectua testul coagulrii n tub. Dac pictura rmne
tulbure omogen se adaug 1 pictur de plasm i se urmrete apariia coagulilor timp de 10-15
secunde.
Interpretare

Test pozitiv: apariia coagulilor n 10-15 secunde

Test negativ: absena coagulilor.


NB: 5% din S. aureus dau reacii fals negative.
7. 7. 5. 2. Testul coagulazei n tuburi (Figura nr. 27).
Se verific prezena coagulazei libere. Se pipeteaz 0,5 ml de plasm ntr-un tub steril. Apoi se
preleveaz o colonie care se descarc n plasma din tub. Se incubeaz tubul timp de 4 ore la 35-37C,
perioad n care acesta va fi examinat prin nclinare, din 30 n 30 de minute. Dac reacia este negativ
la 4 ore, se reincubeaz pn la 24 ore.
Interpretare

Rezultat pozitiv: formarea unui cheag

Rezultat negativ: absena cheagului.


Control de calitate

Martor pozitiv S. aureus

Martor negativ S. epidermidis.


7. 7. 6. Testul filamentrii (pentru Candida albicans)
Principiu Dup cultivare n ser uman, ser bovin, ser de berbec ori altele timp de 2-4 ore, la 3537C, blastoconidiile individuale de C. albicans produc filamente scurte (tubi germinativi) (Figura nr.
28).
Materiale necesare Colonii izolate, n scopul identificrii, ser uman, ser bovin, ser de berbec, ser
fetal de viel ori serumalbumin bovin, aplicatoare de lemn sau pipete Pasteur sterile cu vrful efilat,
lame i lamele, tuburi mici.
Tehnica de lucru ntr-un tub de dimensiuni mici se introduc 0,5-1 ml de ser uman sau alt tip de
ser. Cu un aplicator steril (ca un beiga) se atinge colonia care trebuie identificat, iar apoi aceasta se
introduce n tub. Se incubeaz timp de 2-4 ore, la 35-37C i se examineaz la microscopul optic
preparatul ntre lam i lamel.
Interpretare

Test pozitiv: prezena unor tubi germinativi cu un calibru mai ngust, dar cu o lungime de 3-4 ori
mai mare dect diametrul celulei de origine, care continu direct, fr nici o strangulare sau sept
blastoconidia;

Test negativ: absena aspectului menionat mai sus sau prezena unor pseudotubi germinativi care
sunt delimitai printr-o strangulare i un sept de blastoconidie.
Control de calitate

Martor pozitiv C. albicans

Martor negativ C. tropicalis.


7. 7. 7. Mediul multitest MIU (mobilitate indol uree)
Principiu: MIU conine uree, triptofan, rou fenol (indicator de pH) i este condiionat n tuburi de
dimensiuni mici. Geloza este moale permind mobilitatea microorganismului nsmnat; hidroliza
ureei va duce la alcalinizarea mediului cu modificarea culorii de la galben la rou; producerea de indol
din triptofan va fi indicat de nroirea reactivului Ehrlich (Figura nr. 29).
Materiale necesare Tuburi cu mediul MIU, hrtiue indicator cu reactiv Ehrlich, colonii de
identificat (colonii izolate), ans fir etc.
Tehnica de lucru Seutilizeaz pentru nsmnare ansa fir. Dup ce se preleveaz o prob dintr-o
colonie izolat pe un mediu neselectiv, se nsmneaz mediul prin nepare, ncercnd s se realizeze
o nsmnare n linie dreapt. Apoi, se fixeaz de dop hrtiua indicator n aa fel nct s ajung

deasupra coloanei de mediu, fr s o ating. Se incubeaz la 35-37C timp de 24 ore. n cazul n care
nu are loc virarea culorii mediului, se prelungete durata de incubare pn la 48 de ore.
Interpretare

Mobilitate prezent: opacifierea este uniform n coloana de mediu

Mobilitate absent: opacifierea apare numai pe traiectul de nsmnare

Ureaz negativ: culoarea coloanei rmne galben

Ureaz pozitiv: culoarea coloanei devine roie

Indol pozitiv: schimbarea culorii hrtiei la rou-violet

Indol negativ: hrtia rmne alb.


Control de calitate

Martor pozitiv Proteus mirabilis M+ U+ I+

Martor negativ Shigella spp. M- U- I-.


7. 7. 8. Mediul multitest TSI (triple sugar iron)
Principiu Mediul este agarizat i condiionat n dou zone relativ distincte ale coloanei: baza i
panta. Mediul conine glucoz (n raport de 1/10 fa de celelalte zaharuri), lactoz, zaharoz, citrat
feric i un indicator de pH (rou neutru). Partea dreapt (coloana) nu vine n contact cu aerul i ofer
condiii relative de anaerobioz. Partea nclinat (panta) ofer condiii de multiplicare n aerobioz.
Concentraia glucozei este mai mic, pentru ca fermentarea acestui zahar s poat fi detectat
chiar dac este singurul zahar metabolizat. Dac o bacterie se dezvolt n partea dreapt vor fi eliberai
aminoacizi, care n zona aerob vor fi decarboxilai oxidativ i vor modifica pH-ul spre alcalin. n cazul
n care lactoza i/sau zaharoza nu sunt fermentate, cantitatea de acid produs prin fermentarea
glucozei (toate enterobacteriile fermenteaz glucoza) este suficient de mic pentru ca pH-ul de la
nivelul pantei s revin rapid la neutru. n acelai timp, pH-ul rmne acid (i culoarea mediului rmne
galben) la nivelul coloanei pentru c n condiii de relativ anaerobioz nu are loc decarboxilarea
oxidativ. Dac zaharurile de la nivelul pantei sunt fermentate, cantitatea de acid produs este suficient
de mare pentru ca pH-ul de la acest nivel s rmn acid i respectiv culoarea pantei s rmn
galben. Prezena citratului feric, n cazul n care bacteria produce H 2S duce la apariia unei culori
negre (se formeaz sulfit feros). La nivelul coloanei se nregistreaz i producerea de gaz (apariia unor
bule pe traseul de nsmnare, fragmentarea sau ruperea coloanei etc) (Figura nr. 30).
Materiale necesare tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI; colonii de identificat (colonii izolate);
ans fir etc.
Tehnica de lucru Se utilizeaz pentru nsmnare ansa fir. Se preleveaz din colonia izolat pe
mediu neselectiv, iar apoi se nsmneaz coloana prin nepare, urmat de retragerea ansei i de
trasarea unui zig-zag la suprafaa coloanei. Se incubeaz la 35-37C timp de 24 ore.
Interpretare

Glucoz pozitiv: culoarea coloanei este galben

Glucoz negativ: culoarea coloanei rmne roie (glucoza nu este fermentat, iar microorganismul
nu este o enterobacterie)

Fermentarea glucozei poate fi nsoit de producere de gaz

Lactoz/zaharoz pozitiv: culoarea pantei devine galben

Lactoz/zaharoz negativ: culoarea pantei rmne roie

Producere H2S: culoare neagr la nivelul coloanei.


Control de calitate

Martor pentru pH acid la nivelul coloanei i pantei, fr producere de H 2S E. coli

Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei i producere de H 2S


Salmonella typhimurium.
7. 7. 9. Testul producerii de citocrom oxidaz
Principiu: Unele bacterii produc citocrom oxidaz (lipsete la bacteriile strict anaerobe). Aceasta
acioneaz asupra tetra-metil p-fenilendiaminei rezultnd un compus de culoare purpurie. Dintre
bacteriile oxidaz-pozitive amintim Vibrio spp., majoritatea speciilor de Pseudomonas, Alcaligenes
spp,Neisseria spp. (dintre germenii Gram negativi) i Micrococcus spp. (dintre germenii Gram pozitivi).

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Materiale necesare Soluie apoas de tetra-metil p-fenilendiamin 1% conservat n sticl de culoare


brun (n frigider) sau fii de hrtie indicator impregnate n reactiv, hrtie de filtru, ans cu fir de
platin sau pipet Pasteur (cudat), colonii izolate dezvoltate pe agar-snge, agar Mueller Hinton etc.
Tehnica de lucru ntr-o cutie Petri se aeaz un fragment de hrtie de filtru pe care se depun 1-2
picturi de soluie apoas de tetra-metil p-fenilendiamin 1%. Se preleveaz dintr-o colonie izolat i
se descarc ansa pe hrtia de filtru prin micri circulare de mic amplitudine. Se urmrete apariia
unei reacii de culoare n primele 10 secunde.
Interpretare (Figura nr. 31)

Test pozitiv: apariia unei zone de culoare purpurie n 10 secunde

Test negativ: absena culorii purpurie.


NB Apariia zonei colorate mai tardiv nu permite interpretarea testului (probabil este un rezultat
negativ).
Control de calitate

Martor pozitiv Pseudomonas aeruginosa

Martor negativ Escherichia coli.


7. 7. 10. Testul sensibilitii la optochin
Principiu Majoritatea tulpinilor de pneumococi (Streptococcus pneumoniae) sunt sensibile la
concentraii sczute (< 5 g/ml) de optochin (hidroclorid de etil-hidrocuprein) (Figura nr. 32).
Materiale necesare Discuri cu optochin (5 g / disc), cu diametrul de 6 milimetri, plci cu agar-snge,
tampoane sterile, colonii -hemolitice izolate, care urmeaz a fi testate.
Tehnica de lucru Sepreleveaz cu un tampon steril 2-3 colonii, urmat de nsmnarea pe jumtatea
unei plci cu agar-snge, n aa fel nct s rezulte o cultur confluent. Se plaseaz un disc cu
optochin n centrul zonei nsmnate, presndu-l uor pentru ca discul s adere uniform. Se incubeaz
timp de 18-24 ore la 35-37C n atmosfer de 5% CO2.
Interpretare

Test pozitiv: apariia unei zone de inhibiie cu diametrul mai mare de 14 mm

Test negativ: absena inhibiiei n jurul discului.


Control de calitate

Martor pozitiv Streptococcus pneumoniae

Martor negativ Streptococcus viridans.


Testele prezentate reprezint doar cteva exemple. Testele fenotipice utilizabile n diagnosticul de
laborator microbiologic sunt mult mai numeroase.
nelegerea principiilor i mai ales a necesitii controlului intern de calitate, necesar pentru orice
test i n orice laborator, sunt foarte utile.
7. 8. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23927648
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18628099
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23576536
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23712433
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8444012
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24512075
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24426177
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24415346
7. 9. Povestire adevrat (Candida spp. i hemolizinele)
Utilizarea frecvent a antibioticoterapiei i a medicaiei imunosupresoare, accesul facil la intervenii
chirurgicale, numrul din ce n ce mai mare al persoanelor cu tulburri metabolice i diabet zaharat
sunt doar o parte dintre factorii ce au determinat o cretere a incidenei infeciilor cu Candida spp., fapt
asociat cu o morbiditate semnificativ i costuri ridicate de tratament. Candida albicans este specia cel

mai frecvent izolat, dar nu ar trebui neglijate infeciile cu specii non- albicans, a cror prevalen a
crescut progresiv. La pacienii cu imunosupresie, precum aceia suferinzi de SIDA, se ridic problema
supravieuirii unei infecii fungice diseminate sistemic.
Producerea de hemolizine reprezint un important factor de patogenitate alCandida spp., fiind
raportate toate cele 3 tipuri dehemoliz (, , ), cu o predominan a subtipului . Astfel,prin
degradarea hemoglobinei, microorganismele extrag fierul pentru a-l utiliza n procesele metabolice, n
cretere i invazie.La nivelul cavitii bucale fierul este prezent att intracelular, n depozitele de feritin,
ct i extracelular, n saliv, unde este legat de lactoferin.
Candida spp. fac parte din flora microbian oral, dar prin exprimarea unor factori de virulen precum
enzimele proteolitice sau hemolizinele aceste microorganisme pot deveni patogene.
Un studiu efectuat de Rossoni i colaboratorii au evideniat faptul c aproximativ 92% dintre speciile
de Candida izolate de la nivelul cavitii bucale, la pacieni cu HIV, sunt productoare de hemolizine,
jumtate dintre ele avnd o activitate hemolitic intens. Aceste rezultate depesc semnificativ
valorile pacienilor imunocompeteni sugernd tranziia comensal/patogen n condiii de
imunosupresie. Dintre speciile non-albicans, 86% au fost productoare de hemolizine, izolatele
de Candida glabrata prezentnd ntr-un procent de 92% activitate hemolitic intens, superioar
izolatelor Candida albicans.
Concluzii
Att Candida albicans, ct i speciile non-albicans sunt productoare de hemolizine. n condiii de
imunosupresie, speciile comensale pot exprima factori de virulen devenind patogene.
7. 10. De reinut

nelegerea principiilor i mai ales a necesitii controlului intern de calitate, necesar pentru orice
test i n orice laborator, sunt foarte utile.

Hemoliza reprezint un factor de patogenitate adesea evaluat n cazul unei infecii streptococice.

Mediile multitest MIU i TSI permit identificarea enterobacteriilor.


7. 11. Verificai-v cunotinele
1. Formeaz colonii de tip R urmptoarele speci bacteriene:
A. Mycobacterium tuberculosis
B. Staphylococcus aureus
C. Corynebacterium diphteriae
D. Escherichia coli
E. Bacillus anthracis
2. Alegei rspunsurile corecte cu privire la nsmnarea pe mediul multitest MIU:
A. Mobilitate prezent: opacifierea este uniform n coloana de mediu
B. Mobilitate absent: opacifierea este uniform n coloana de mediu
C. Ureaz negativ: culoarea coloanei devine roie
D. Ureaz pozitiv: un inel de culoare roie la suprafaa mediului
E. Indol pozitiv: schimbarea culorii hrtiei la rou-violet
3. Alegei rspunsurile corecte cu privire la nsmnarea pe mediul multitest TSI:
A. Glucoz pozitiv: culoarea coloanei este galben
B. Glucoz pozitiv: culoarea coloanei este roie
C. Lactoz/zaharoz pozitiv: culoarea pantei este galben
D. Producere H2S: culoare roie la nivelul coloanei
E. Producere H2S: culoare negr la nivelul coloanei
4. Hemoliza determin modificarea aspectului mediilor de cultur cu snge astfel:
A. Streptococcus pneumoniae determin hemoliz
B. hemoliz implic hemoliza complet, fr s se observe modificarea de nuan a mediului
C. hemoliza este observat n cazul Streptococcus pyogenes
D. hemoliza indic absena hemolizei
E. hemoliza este observat n cazul Streptococcus pneumoniae.
5. Urmtoarele teste sunt efectuate pentru identificarea fungilor
A. Testul sensibilitii la bactracin

B. Testul coagulazei
C. Auxanograma
D. Testul bilolizei
E. Testul filamentrii.
7. 12. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Sucul de merioare inhib motilitatea i aderena Proteus spp., fiind util att n tratamentul infeciilor
de tract urinar, ct i n profilaxia acestora.
2. Identificarea n laborator a microorganismelor este un proces facil i ieftin. De aceea ar trebui s
recomandm ntotdeauna prelevarea de probe, indiferent de patologie i de tabloul clinic.
3. Sucul de merioare previne aparia cariilor dentare prin inhibiia aderariiStreptococcus mutans de
smalul dentar.

8. Testarea sensibilitii/rezistenei la antibiotice i


chimioterapice. (Gabriela-Loredana Popa, LoredanaSabina Manolescu)

8. 1. Cuvinte cheie
Antibiogram
Antibiotice
Chimioterapice
Concentraia minim inhibitorie/bactericid
Nivel de eficien inhibitorie/bactericid
8. 2. Introducere
Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice este necesar datorit posibilitii prezenei
rezistenei agenilor patogeni la aceste medicamente. Rezistena poate fi natural (determinat
genetic) sau dobndit (achiziionat de anumite subpopulaii microbiene n anumite circumstane).
Exist diferene ntre efectul medicamentelor in vitro i in vivo. Din acest motiv, metodele de testare a
sensibilitii pot fi difereniate n:
1. metode de testare a sensibilitii in vitro;
2. metode in vivo, care in cont de relaia medicament-infecie.
8. 3. Metode de testare a sensibilitii in vitro
Antibiograma reprezint o metod de laborator prin care se apreciaz sensibilitatea la antibiotice a
bacteriilor dup cultivare pe medii dedicate acestei analize (ex. agar Mueller-Hinton) i izolare n
cultur pur, adic dup obinerea unei singure tulpini bacteriene, acea tulpin responsabil de
mbolnvire. Se poate realiza prin tehnici calitative i cantitative
Tehnici calitative (antibiograma difuzimetric comun, antibiograma difuzimetric comparativ,
antibiograma difuzimetric standardizat etc) i
Tehnici cantitative (metoda diluiilor n mediu lichid, metoda diluiilor n agar, metoda microdiluiilor n
agar, testul E, metode i sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.).
8. 3. 1. Antibiograma difuzimetric comun
Aceast este o metod calitativ (rspunsul este de tip da sau nu). Se realizeaz n medii de cultur
solide (ex. agar Mueller-Hinton). Cel mai frecvent nsmnarea se realizeaz prin inundarea plcii
urmat de aspirarea aseptic a excesului de inocul bacterian dar exist i alte variante. (Film nr. 1) Placa
nsmnat se las pe masa de lucru 20 minute dup care se aplic discurile speciale pentru testare a
susceptibilitaii (sunt produse comercial); acestea conin medicamentul antimicrobian i sunt marcate
cu o prescurtare a numelui substanei active ce o conin (ex. P pentru penicilin). Aplicarea discurilor se
realizeaz cu ajutorul unui distribuitor de discuri automat, n mod automat (antibiotic dispenser), sau cu
ajutorul unei pense. (Film nr. 2; Figura nr 1)
ntr-o plac Petri de 9 cm diametru se pot pune 6 discuri cu 6 antibiotice (recomandarea este pentru 5)
diferite iar n cea de 15 cm se pot pune 12 discuri cu antibiotice. Regula este s fie dispuse la minim 3
cm distan ntre ele i minim 1,5 cm de marginea plcii (Figura nr. 2). Exist o gam larg de
distribuitoare de antibiotice, de la distribuitoare unice, pentru un singur antibiotic pn la
distribuitoare pentru plci ptrate, de 12 cm latura, unde pot fi puse chiar si 16 discuri de antibiotice.
Aceste discuri cu antibiotice trebuie s vin n contact perfect cu mediul de cultur (se preseaz uor n
cazul aplicrii manuale). Dup aplicare pe placa inoculat discurile se las n contact cu mediul de
cultur pe masa de lucru nc 20 minute ca apoi s se incubeze peste noapte n termostat [la 28
(pentru fungi) sau la 35-37C (pentru majoritatea bacteriilor)].
Antibioticul din disc este eliberat i difuzeaz n mediu realiznd zone de inhibiie n care coloniile
microbiene nu se dezvolt (dac populaia bacterian este sensibil). Cu ct diametrul zonei de
inhibiie este mai mare, cu att bacteria va fi considerat mai sensibil. (Figura nr. 3)
Dac n interiorul zonei de inhibiie (indiferent de valoarea diametrului) se dezvolt colonii
(subpopulaii rezistente), bacteria va fi considerat rezistent. (Figura nr. 4)

Aceast metod folosit n multe dintre laboratoarelor, permite de fapt numai eliminarea antibioticelor
complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor foarte active (tehnica nu este standardizat).
8. 3. 2. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Bal)
Se efectueaz pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de referin, din
aceeai specie (sau o specie asemntoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram pozitivi putem alege
pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. Tulpina de referin are o sensibilitate cunoscut la
antibioticele pe care le utilizm (cunoatem inclusiv concentraia minim inhibitorie/CMI).
Se va mpri o plac ptrat n 3 zone egale i se va inocula n treimea medie tulpina de referin iar
n treimile exterioare 2 microorganisme diferite de testat. Inoculul trebuie s fie astfel realizat nct s
conduc la apariia dup incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care s nu fie confluente.
Discurile cu antibiotice se vor plasa pe liniile de demarcaie dintre culturi. Ulterior se va incuba peste
noapte la 35-37C. (Figura nr. 5)
Rezultatele se exprim cu termenii: sensibil, intermediar, rezistent, n funcie de diametrul zonelor
de inhibiie a multiplicrii microorganismelor de testat, fa de acelai antibiotic. Putem aprecia CMI
(vezi i 8. 3. 4). (Figura nr. 6)
8. 3. 3. Antibiograma difuzimetric standardizat (Kirby-Bauer)
Reprezint antibiograma difuzimetric comun (8. 3. 1.) care a fost standardizat. Este singura metod
difuzimetric recunoscut pe plan internaional, rezultatele sunt reproductibile i corelabile ntre
laboratoare.
Elementele necesare standardizrii sunt:

Mediul. Cel mai frecvent se utilizeaz agar Mueller-Hinton; pH-ul mediului este frecvent ntre 7,27,4 iar grosimea mediului trebuie s fie de 4 mm.
Inoculul. Seobine prinsuspensionarea a 2-3 colonii izolate n soluie salin fiziologic, urmrindu-se
turbiditatea suspensiei. Turbiditatea poate fi apreciat cu ajutorul unui dispozitiv portabil destinat sa
msoare turbiditatea suspensiilor microbiene conform standardelor McFarland, (nefelometru), sau cu
8
tuburi etalon (Figurile nr. 6 i 7; Film nr. 3). Se ajusteaz la 0,5 McFarland (1,5x10 UFC/ml), adic trebuie
8
s aib o turbiditate corespunztoare standardului 0,5 McFarland (circa 10 uniti formatoare de
colonii/ml) n multe dintre cazuri.
Incubarea. Timpul de incubare n majoritatea cazurilor este 16-18 ore la 35-37C, n cazul germenilor
pretenioi pn la 20-24 de ore. Atmosfera de incubare este n funcie de specia bacterian: n
atmosfera obinuit sau in atmosfer de CO2 (de ex.streptococi, neisserii.)
Concentraia de antibiotic. Discurile cu antibiotic conin determinate de substan activ;
dimensiunea lor este standard (6 mm diametru).
Alegerea antibioticelor. Se aleg antibioticele care trebuie testate in funcie de specia bacterian
testat si n funcie de localizarea infeciei.
Utilizarea tulpinilor de referin pentru controlul de calitate.
Interpretarea rezultatelor (Sensibilitatea sau rezistena sunt apreciate prin citirea diametrelor zonelor
de inhibiie. Aceste diametre se compar cu diametre standard n funcie de antibiotic, cantitatea de
antibiotic din disc, specia bacterian testat. Rezultatul se raporteaz: sensibil (S), intermediar (I) sau
rezistent (R) la antibioticul testat. Nu se raporteaz diametrul citit, metoda fiind calitativ. Rezultatele
citirii pot fi influenate de lumina reflectat la citire, de apariia coloniilor izolate, de prezena
marginilor crenelate ale coloniilor etc.
Aceast metod nu permite aprecieri cantitative (nu putem afla CMI sau CMB).
8. 3. 4. Metoda diluiilor n mediu lichid
Se realizeaz pentru a determina CMI (concentraia minim inhibitorie) pentru fiecare antibiotic
testat (la care bacteria este sensibil). CMI reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic, n
micrograme/ml, cu aciune bacteriostatic.
Pentru fiecare antibiotic testat se utilizeaz mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton n concentraii
descrescnde (diluii binare) pornind spre ex. de la 64 micrograme / ml i pn la 0,125 micrograme /
ml, n total 9 tuburi, plus 2 tuburi martor, fr antibiotic (1 ml n fiecare tub, n final). (Figura nr. 8)
Se prepar inoculul standardizat turbidimetric i se inoculeaz toate cele 11 tuburi, cu cte 1 ml de
inocul. Se agit tuburile pentru a omogeniza compoziia.

Se incubeaz cele 9 tuburi cu antibiotice i 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37C iar al doilea tub
martor se pstreaz la frigider.
Pentru controlul de calitate se utilizeaz i o tulpin de referin (pentru care trebuie s obinem
rezultate corespunztoare datelor oferite de productor).
Citirea i interpretarea se fac a doua zi. Deoarece se utilizeaz o cantitate de inocul egal cu cantitatea
de mediu, concentraia final de antibiotic se va njumti (de ex. n tubul n care diluia iniial a fost
de 64 mg / ml, diluia final va fi 32 mg / ml). n tubul martor meninut la +4C nu trebuie s existe
cretere n timp ce n tubul martor la 35-37C creterea trebuie s fie evideniabil. (Figura nr. 9)
n tuburile de testat, ultima diluie care a inhibat dezvoltarea microorganismului reprezint CMI. Se
consider (cu diferene ntre specii diferite) c microorganismele n cazul crora CMI este 2 mg/ml
pot fi eficient inhibate de ctre antibioticul respectiv i in vivo.
8. 3. 5. Determinarea CMB (concentraia minim bactericid)
Se bazeaz pe cunoaterea CMI. Se folosesc drept surs de inocul tuburile n care dezvoltarea
microbian a fost inhibat.
Se mparte o plac Petri (cu agar Mueller-Hinton) n sectoare, attea sectoare cte tuburi n care
dezvoltarea microbian a fost inhibat (de ex. 6 sectoare dac inhibiia g a avut loc n ultimele 6
tuburi). Se nsmneaz din fiecare tub fr cretere microbian, sectorul de plac corespunztor.
(Figura nr. 10)
Se incubeaz 16-18 ore la 35-37C.
Interpretare: CMB corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele
nsmnate (sectoare de plac fr apariia culturii). (Figura nr. 11) Se consider c antibioticul va fi
eficient in vivo dac n serul pacientului se pot atinge concentraii de antibiotic care s depeasc de
4-8 ori CMB.
Determinarea CMI i CMB se face pentru aprecierea eficacitii unui antibiotic asupra unei tulpini
bacteriene. Ofer date suplimentare privind sensibilitatea/rezistena. n tratamentul infeciilor severe
(ex. endocardite, meningite, septicemii) i la imunodeprimai, efectuarea acestei metode este
indispensabil.
8. 3. 6. Determinarea CMI prin testul E (E test)
E test reprezint o alt metod de testare a sensibilitii la antibiotice pentru diferite bacterii, inclusiv
pentru bacteriile pretenioase sau anaerobe. Se aseamn metodei diluiei n agar; dar este mai uor
de utilizat i permitedeterminarea valorii CMI (n schimb, are un cost mai ridicat).
Principiu
Modul de inoculare este similar. Benzile E test (langhete) conin un gradient de antibiotic ce acoper
un ir continuu de concentraii ntre 0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. Aceste
benzi se aplic dup nsmnare i se incubeaz 16-18 ore la 35-37C. Dac bacteria este sensibil, se
formeaz o zon eliptic de inhibiie (E vine de la epsilon). Valoarea CMI se citete acolo unde
creterea bacterian intersecteaz banda E test. (Figurile nr. 12 i 13)
NB. Banda trebuie s fie n contact perfect cu suprafaa mediului; odat aplicat nu se deplaseaz
n alt poziie (eliberarea medicamentului are loc imediat, la fel ca i n cazul discurilor cu antibiotic de
la antibiogram).
Interpretarea rezultatelor

Rezultatele se citesc atunci cnd cultura este confluent sau aproape confluent.

Valoarea CMI corespunde liniuei n care creterea bacterian intersecteaz banda E test; pe
geloz-snge se citete zona de inhibiie a creterii bacteriene nu zona de inhibiie a hemolizei.
(Figurile nr. 12 i 13)

Se raportez rezultatul obinut pentru tulpina testat numai dup verificarea rezultatului obinut
pentru tulpina de referin (control de calitate).
8. 4. Metode de testare a sensibilitii in vivo i aprecierea eficienei terapeutice
De multe ori eficiena terapiei cu antibiotice se apreciaz clinic i prin teste de laborator (ex.
leucogram, sediment urinar, VSH, proteina C reactiv etc.). Dar aceasta nu este cea mai corect
variant.

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Exist dou metode ce pot aprecia eficacitatea tratamentului. Acestea pot fi utilizate i pentru
evaluarea eventualei nociviti a antibioticelor.
1. Determinarea NEI (nivel de eficien inhibitorie), se realizeaz pentru ser, LCR (se pot utiliza i
alte umori). Se calculeaz asemntor CMI, doar c vom utiliza umorile pacientului pentru a
urmri care este nivelul la care (datorit antibioticului din respectivul lichid) inhib dezvoltarea
microbian.
2. Determinarea NEB (nivel de eficien bactericid) pentru ser, LCR sau alte umori. Puterea
bactericid a serului celor tratai (NEB) msoar capacitatea diluiilor din serul unui bolnav tratat
cu antibiotice de a inactiva un inocul coninnd bacteria infectant; se determin diluia cea mai
nalt de ser care mai manifest capacitate bactericid. Se calculeaz asemntor CMB.
Utilizarea acestor metode este indicat n infecii grave (endocardite, osteomielite, fibroz chistic sau
sepsis) i la pacienii cu variate grade de imunodepresie; produsele se recolteaz de obicei la o or
dup administrarea unei doze i cu cteva minute nainte de administrarea urmtoarei doze de
antibiotic.
8. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
http://www.analimed.ro/analize-medicale/microbiologie/antibiograma/
http://www.webmd.com/a-to-z-guides/antibiotic-sensitivity-test-topic-overview
http://amrls.cvm.msu.edu/microbiology/detecting-antimicrobial-resistance/test-methods/examples-ofantibiotic-sensitivity-tesing-methods
http://inst.bact.wisc.edu/inst/index.php?module=book&func=displayarticle&art_id=135
http://cid.oxfordjournals.org/content/49/11/1749.full
http://www.biomerieux-diagnostics.com/servlet/srt/bio/clinicaldiagnostics/dynPage?doc=CNL_CLN_PRD_G_PRD_CLN_22
8. 6. Povestire adevrat (enterococii vancomicino-rezisteni)
Enterococii au atras atenia cercettorilor n anii 1980 datorit capacitii lor de a infecta omul i
animalele dar i a abilitii de a prelua diverse metode de eludare a sistemului imun ale altor bacterii.
Cu toate c bacteriile din genulEnterococcus nu sunt aa celebre precum cele din
genul Staphylococcus sau specia Escherichia coli, infeciile cu aceti germeni sunt printre cele mai
frecvente infecii achiziionate de ctre pacienii spitalizai. Enterococii pot complica i prelungi
spitalizarea pacienilor. Teoretic, persoanele care pot dezvolta infecii cu Enterococcus spp. sunt cele
deja bolnave (ex. persoanele aflate n seciile ATI, persoanele n vrst, bolnavii de diabet zaharat,
bolnavii cu insuficien renal cronic etc).
Dar de fapt enterococii pot fi foarte periculoi mai ales pentru c sunt capabili s dezvolte rezisten la
antibiotice, inclusiv la vancomicin, antibioticul de ultim linie n infectiile cu microorganisme
rezistente.
Infeciile enterococice umane cu tulpini de enterococi rezistente la vancomicin (VRE) pot fi fatale. n
cursul anului 2004 CDC a raportat c una din trei infecii achizitionat n seciile de terapie intensiv a
fost determinat de VRE.
n 1984, enterococii au fost ncadrai n genul Enterococcus. n 1986 au aprut primele tulpini VRE n
Europa iar n 1989 a fost raportat primul caz de VRE n SUA. ntre 1989-1993 procentul de mbolnviri
cu VRE a crescut de la 0,3% la 7,9%.
Cercettorii caut noi soluii terapeutice pentru aceste infecii precum i o mai bun nelegere a
caracteristicilor genetice a VRE i a modului n care se transmit genele de rezisten ale enterococului
ctre alte bacterii.

Numai n 2007 SUA au raportat apte cazuri de infecii cu Staphylococcus aureus vancomicin rezistent.
ntr- unul din cazuri, oamenii de stiin au confirmat transferul unei gene cheie de rezistent la
antibiotice de laEnterococcus la Staphylococcus.
Riscuri ale mbolnvirii cu VRE
Enterococii pot supravieui luni de zile. Habitatul lor normal este n primul rnd tractul digestiv uman i
tractului genital feminin, enterococii fiind o parte semnificativ a populaiei bacteriene saprofite. Cu
toate acestea, colonizarea cu VRE poate progresa spre diverse infecii, n special la persoanele cu
anumii factori de risc. Astfel se pot produce infecii ale tractului urinar, septicemii, endocardite i
meningite, precum i infecii grave ale rnilor deschise. Persoanele cu risc sunt:
Persoanele tratate extensiv cu vancomicin i combinaii de alte antibiotice;
Persoanele spitalizate, mai ales atunci cnd primesc tratament cu antibiotice pentru perioade lungi de
timp;
Persoanele cu un sistem imunitar slbit, cum ar fi pacienii din unitile de terapie intensiv, cancer
sau secii de transplant;
Persoanele care au suferit proceduri chirurgicale;
Persoanele cu dispozitive medicale neschimbate de mai bine de o lun, cum ar fi catetere urinare sau
catetere intravenoase centrale.
Infeciile enterococice sunt mai frecvente la persoanele n vrst, n special persoanele din centrele
pentru persoane n vrst i cminele spital, deoarece acestea au mai multe anse de a fi expuse
factorilor de risc.

8. 7. De reinut
Metodele de igien sunt importante n profilaxia infeciilor cu enterococi.
Programul de control al acestor infecii n spitale includ:
Instruirea personalului spitalului n ceea ce privete rezistena la vancomicin;
Depistarea precoce i raportarea prompt a rezistenei la vancomicin a enterococilor i a altor
microorganisme Gram-pozitive;
Implementarea imediat a msurilor adecvate de control a infeciei pentru a preveni transmiterea VRE
de la persoan-la-persoan.
8. 8. Verificai-v cunotinele
1. Tehnicile calitative de testare a sensibilitii in vitro includ:
A. Antibiograma difuzimetric comun
B. Antibiograma difuzimetric comparativ
C. Antibiograma difuzimetric standardizat
D. Metoda diluiilor n mediu lichid
E. Metoda diluiilor n agar
2. Tehnicile cantitative de testare a sensibilitii in vitro includ:
A. Metoda microdiluiilor n agar
B. Testul E
C. Metode i sisteme comerciale, automatizate de testare
D. Antibiograma difuzimetric comparativ
E. Antibiograma difuzimetric standardizat
3. Determinarea CMB:
A. Se bazeaz pe cunoaterea CMI.
B. Corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate
C. Reprezint cea mai mic concentraie de antibiotic, n micrograme/ml, cu aciune bacteriostatic
asupra microorganismului testat
D. Este o tehnic calitativ
E. Este o tehnica cantitativ
4. E test:
A. Reprezint o metod complex de testare a sensibilitii la antibiotice
B. Nu poate fi utilizat pentru bacteriile pretenioase sau anaerobe

C. Se aseamn metodei diluiei n agar


D. Permite determinarea valorii CMI
E. Are un cost mai ridicat
5. Elementele necesare standardizrii antibiogramei difuzimetrice standardizate sunt:
A. Mediul
B. Inoculul
C. Antibioticele
D. Utilizarea tulpinilor de referin
E. Interpretarea rezultatelor
8. 9. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. n cursul unei infecii care nu rspunde la tratament nu mai este necesar refacerea antibiogramei.
2. Utilizarea antibioticelor fr recomandare medical determin rezistena bacteriilor la antibiotice.
3. Antibiograma se poate realiza n anumite situaii i dac pacientul a luat o doz de antibiotic.
4. CMI nu are aceeai valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. Adevrat/Fals
5. Stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA) a fost identificat numai n infecii nosocomiale.

Reacii antigen-anticorp. Evaluarea RIC.


Reacia dintre antigen (Ag) i anticorp (Ac) necesit interaciunea epitopului (de pe Ag) cu paratopul
Ac. Factorii care condiioneaz interaciunea Ag-Ac sunt:
-complementaritatea structural (reacia este specific);
-complementaritatea electrochimic, consecin a complementaritii structurale (se adaug fore
intermoleculare, EX . legturile de hidrogen etc.); energie de legare mai mare = complexe Ag-Ac mai
stabile (Figura nr. 1).
Interaciunea dintre epitop i paratop este definit (i msurabil) de 2 parametri:

Afinitatea (msoar fora de legare dintre un epitop i un paratop); are ca substrat


complementaritatea structural i electrochimic menionate mai sus; o interaciune cu afinitate
nalt presupune structuri perfect complementare, n timp ce complementaritatea imperfect a
gruprilor reactante determin o afinitate sczut,

Aviditatea (suma de interaciuni Ag-Ac; rezult din multivalena Ag); cele mai multe Ag
posed mai mult dect un epitop; energia total de legare a epitopilor multipli ai unui Ag cu paratopii
specifici este mult superioar energiei individuale de interaciune dintre epitop i paratop; complexele
Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificil, deoarece este
necesar ruperea tuturor legturilor existente.
Cu toate c didactic discutm despre specificitate ca i cum ar fi absolut, trebuie s cunoatem c
exist i reacii ncruciate (datorit faptului c anumite Ag posed anumii epitopi comuni; EX . Ag
care aparin unor specii diferite de enterobacterii).
Etape n cadrul reaciilor antigen-anticorp

Interaciunea primar (Figura nr. 2) reprezint legarea Ac de Ag potrivite; depinde de


cantitatea i afinitatea Ac; poate fi pus n eviden doarprin nefelometrie, deoarece complexele Ag-Ac
sunt de dimensiuni mici, solubile i se pot desface uor;

Interaciunile secundare (Figura nr. 3) apar dup 30 de minute (Ag poate avea mai muli
epitopi iar Ac are minim 2 paratopi; complexele primare se reunesc, formeaz complexe secundare,
respectiv o reea tridimensional, insolubil, care devine vizibil);

Interaciunile teriare (Figura nr. 4) sunt efectele biologice mediate in vivo de complexele
Ag-Ac rezultate fie n urma interaciunii primare, fie n urma interaciunii secundare (EX . fagocitarea
complexelor de ctre macrofage, etc).
Formarea complexelor Ag-Ac depinde de atingerea unei unui anumitraport de echivalen dintre
Ag-Ac. Aceasta reprezint punctul dintr-o reacie Ag-Ac realizat in vitro n care raportul dintre Ag i
Ac este practic egal cu 1, Ac i Ag libere n supernatant sunt minime, iar complexele formate au
dimensiunea cea mai mare (Figura nr. 5).

9. Reaciile de precipitare i reaciile de aglutinare.


(Gabriela-Loredana Popa, Alexandru-Andrei Muntean)
9. 1. Cuvinte cheie

antigen (Ag)

anticorp (Ac)

precipitare

aglutinare

raport de echivalen

imunodifuzie
9. 2. Introducere
Reaciile Ag-Ac sunt elemente eseniale att n diagnosticul bacteriologic direct ct i n diagnosticul
serologic a infeciilor (dar, bineneles i in vivo, n aprarea gazdei fa de infecii!). Astfel, putem
evidenia n mod direct reacia dintre Ag-Ac (reacii de precipitare, reacii de aglutinare) sau putem
folosi sisteme indicator (reacia de fixare a complementului, reacia de seroneutralizare)
(vezi capitolul 10). n acest capitol vom prezenta reaciile de precipitare i de aglutinare utilizate n
microbiologie, subliniind faptul c acestea formeaz o baz a diagnosticului serologic modern.
9. 3. Reaciile de precipitare utilizate n microbiologie
Reacia de precipitare poate avea loc n mediu lichid sau solid. Unirea Ag cu Ac specifici conduce la
formarea de complexe Ag-Ac care devin insolubile i stabile (vizibile, cu ochiul liber). Reacia de
precipitare este sensibil i specific pentru evidenierea prezenei Ag. Metodele clasice prezentate n
cadrul acestui capitol stau la baza testelor moderne folosite n practica curent.
NB: Pe parcursul capitolului, ne vom referi la Ag i Ac, dar cititorul este avizat c i imunoglobulinele
(de EX . anticorpii provenii de la o alt specie) pot juca rol antigenic.
9. 3. 1. Reacii de precipitare n mediu lichid
9. 3. 1. 1. Reacii de precipitare n amestec
Reacia Ag-Ac este cuantificabil. Permite, de EX . titrarea toxinei difterice (metoda
Ramon) punnd n contact (n amestec, n tuburi), cantiti egale din toxina difteric, cu cantiti
variabile de Ac anti-toxin, al cror titru este cunoscut. Cantitatea maxim de precipitat se gsete n
tubul unde existraportul de echivalen. Tubul care prezint cantitatea cea mai important de
precipitat se poate observa relativ uor (Figura nr. 6). Cunoscnd titrul Ac, se afl titrul toxinei (1 Lf =
1 limes floculans = cantitatea de toxin care se combin cu o unitate de antitoxic = 1 UA). Dac
spre EX . precipitarea maxim apare n tubul n care titrul anticorpilor este de 15 UA, titrul toxinei este
de 15 Lf.
9. 3. 1. 2. Reacii de precipitare n inel
Punem n contact Ag i Ac astfel nct s nu se amestece. Reacia apare la limita dintre Ag i Ac (inel de
precipitare).
n activitatea de la LP exemplificm prin reacia Ascoli utilizabil pentru identificarea prezenei Ag
crbunos (din Bacillus anthracis). Soluia de Ag se prepar din extract de organ (EX . splin) recoltat
de la un animal care a decedat cu suspiciunea de antrax (infecie generalizat cu Bacillus anthracis).
Reacia este una calitativ, prin care putem preciza doar prezena sau absena Ag. Utilizm 3 tuburi (1
pentru reacie i 2 tuburi martor). n primul tub martor pipetm 0,5 ml ser anticrbunos i 0,5 ml
soluie salin fiziologic iar n al doilea tub martor pipetm 0,5 ml ser normal de cal i 0,5 ml soluie de
Ag. n aceste dou tuburi, nu trebuie s apar precipitare, scopul acestor martori fiind verificarea
reactanilor. n tubul de reacie pipetm nti 0,5 ml din serul anticrbunos, urmnd ca soluia de

antigen (n cantitate de 0,5 ml) s fie pipetat foarte lent, pe peretele interior al tubului, n aa fel nct
cele 2 soluii s nu se amestece. n cazul reaciei pozitive (prezena Ag crbunos n soluia Ag), dup
circa 2-5 minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare (Figura nr. 7).
9. 3. 2. Reacii de precipitare n mediu gelifiat
Utilizarea gelozei (o anumit concentraie de agar n soluie, n care cei doi reactivi pot s migreze)
permite vizualizarea reaciei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.
9. 3. 2. 1. Imunodifuzia radial simpl (IDRS Mancini)
IDRS se bazeaz pe difuzia Ag din proba de cercetat, ntr-un gel care conine o cantitate constant de
Ac. Difuzia n gel a Ag se face pornind de la godeul n care se pipeteaz soluia de cercetat, care poate
fi ser cu Ac (iar n gel sunt anti-Ac, IgG, IgM, IgA etc), sau un ser/soluie cu alt substan pe care
dorim s o cuantificm (fraciunea C3 a complementului, siderofilina, alfa-1 antitripsina, un antigen
microbian n LCR etc.). Complexele Ag-Ac vor precipita. Rezult un cerc de precipitare format din
puncte foarte apropiate (complexe Ag-Ac) cu diametrul direct proporional cu concentraia de Ag din
prob. Metoda permite determinricantitative. (Figura nr. 8)
Sunt necesare plcue n care se toarn gelul care include Ac anti structura pe care vrem s o
determinm. Plcile sunt cumprate gata turnate i prezint mici godeuri n care punem serurile de
cercetat i serul de referin (folosit ca un etalon, ntruct cunoatem concentraia componentei
studiate). Dilum serurile de cercetat (EX . pentru IgG, IgA i siderofilin), la fel i serul de referin.
n fiecare godeu introducem 5 ml din fiecare reactiv (referin i cercetat).
inem plcua pe mas 10 minute, apoi incubm la termostat (37C), 48 ore pentru IgA i IgM i 24 de
ore pentru celelalte componente testate. Citim cu ajutorul unei rigle speciale, pe care o vom utiliza la
LP. nti msurm diametrul cercului de precipitare din jurul godeului n care se afl serul de referin
(rezultatul trebuie s corespund indicaiilor productorului). Dac rezultatul este corespunztor, citim
direct diametrelor pentru serurile de cercetat (altfel, trebuie s facem corelarea cu rezultatul pentru
martor). nregistrm valorile diametrelor, comparm cu rezultatele din tabele preformate i nmulim
valoarea cu diluia probei. Am obinut rezultatul final. (Tabelul nr. 1)
9. 3. 2. 2. Imunodifuzia dubl radial (Ouchterlony)
n aceast variant tehnic, Ag i Ac difuzeaz unul spre cellalt. Dup ntlnire complexele Ag-Ac
precipit i rezult linii de precipitare vizibile. Prin folosirea acesteia, putem alege Ac dintr-un stoc
disponibil i nu este necesar includerea acestuia n agar.
Tehnica poate fi folosit ca o metod de determinare calitativ sau semi-cantitativ. Astfel, ne permite
s evideniem, de EX . prezena sau absena unei structuri proteice. Putem determina semi-cantitativ
alfa-fetoprotein, protein C reactiv, beta-2 microglobulin, produi de degragare ai fibrinogenului
etc. n micologie putem identifica exoantigene fungice (Histoplasma capsulatum, Coccidioides
immitis etc), etc.
Pe o lam de microscop se toarn un gel de agar 1% (pstrat n camer umed, la frigider). Dup
ntrirea gelului, perform 1-3 grupe de godeuri, 7 godeuri n fiecare grup (1 godeu central, 6 godeuri
periferice). De EX . pentru determinarea proteinei C reactiv (C reactive protein, CRP, reactant de faz
acut) la pacieni, utilizm un ser cu Ac anti-CRP, seruri de la pacieni i un ser de referin cu CRP. n
godeul central pipetm Ac anti-CRP, n godeurile 1 i 4 pipetm ser de referin cu CRP, iar n celelalte
godeuri pipetm serurile de cercetat. Incubm (37C, 24 de ore) n camer umed.
Verificm dac ntre godeul central i godeurile 1 i 4 (martori pozitivi) au aprut linii (arcuri) de
precipitare. Dac este aa, urmrim situaia pentru serurile de testat. Acolo unde apare linie de
precipitare, rezultatul este pozitiv (Figura nr. 9).
9. 3. 2. 3. Dubla difuzie (Elek)
Este o metod calitativ util pentru depistarea tulpinilor toxigene
deCorynebacterium diphteriae (apariia liniilor de precipitare demonstreaz elaborarea toxinei) (Figura
nr. 10).
Mediul este turnat n placa Petri, ateptm s se ntreasc i apoi decupm un an pe unul din
diametre. n acest an pipetm 0,5 ml ser antidifteric (cu Ac anti-toxin difteric, concentraia fiind
1.000 UI/ml). Ac anti-toxin difteric difuzeaz n mediu. Dup 2 ore nsmnm perpendicular pe
acest an i de fiecare parte a anului, 1 tulpin toxigen (martor pozitiv), 1 tulpin ne-toxigen

(martor negativ) i cteva tulpini de cercetat. Incubm timp de 48 de ore, la 37C, timp n care
tulpinile nsmnate se dezvolt. Din striurile cu tulpin toxigen, toxina difuzeaz n mediu i apare
reacia de precipitare a complexului Ag-Ac. Cnd examinm placa, urmrim apariia culturii i a
precipitatului (linii de precipitare n unghiurile dintre cultur i anul cu Ac anti-toxin) care trebuie s
apar cel puin la martorul pozitiv.
9. 3. 3. Reacii de precipitare n combinaie cu migrarea n cmp electric
9. 3. 3. 1. Electroforeza proteic n gel
Tehnica este folosit n laboratorul de imunochimie pentru decelarea unor proteine patologice.
Deplasarea proteinelor n gel (supus cmpului electric) se face difereniat (n funcie de greutatea
molecular i ncrctura electric a fiecrei proteine, n parte).
9. 3. 3. 2. Imunoelectroforeza
Electroforeza este asociat cu imunodifuzia dubl. Proteinele sunt nti separate prin electroforez apoi
are loc imunodifuzia dubl. Putem utiliza un ser monovalent sau polivalent, cu Ac anti-structura a crei
prezen dorim s o determinm. Reacia Ag-Ac devine vizibil sub forma unor arcuri de precipitare
(Figura nr. 11).
9. 3. 3. 3. Contraimunoelectroforeza (CIE)
Este o dubl difuzie. Deplasarea Ag i Ac este accelerat de cmpul electric. Turnm gel de agar pe o
lam de microscop, perform 1-3 grupe de perechi de godeuri, fa n fa (EX . Ag migreaz spre
anod). Astfel, n unul din cele 1-3 grupuri de godeuri pereche opuse catodului (polul negativ) pipetm
Ac cunoscui iar n godeurile opuse anodului (polul pozitiv) pipetm Ag cunoscute. Tehnica este mai
rapid i mai sensibil dect dubla difuzie, prin amplificarea datorat cmpului electric. Linia de
precipitare poate deveni vizibil dup 30-90 minute (Figura nr. 12). Se poate utiliza pentru identificarea
Ag K n LCR la pacieni cu meningit acut (H. influenzae, N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae),
facilitnd un diagnostic rapid.
9. 4. Reaciile de aglutinare utilizate n microbiologie
Reacia de aglutinare sunt similare cu reaciile de precipitare, cu meniunea c Ag sunt de natur
corpuscular. Aglutinareaeste mai sensibil dect precipitarea.
Exist mai multe tipuri de aglutinare:
Aglutinarea direct reprezint aglutinarea Ag naturale (bacterii, celule) de ctre Ac specifici. Se poate
utiliza n diagnosticulbacteriologic (EX . pentru identificarea enterobacteriilor), n
diagnosticul serologic al febrei tifoide etc.;
Aglutinarea indirect este o reacie n care diferite particule (hematii formolizate, latex, cristale de
colesterol etc) sunt cuplatein vitro cu Ag sau Ac i sunt astfel pregtite s participe la reacia de
aglutinare prin combinare cu Ac sau Ag corespunztoare, din proba de cercetat (EX . determinarea
CRP);
Inhibarea aglutinrii (vezi i HAI de la LP virusologie) etc.
9. 4. 1 Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul microbiologic direct
Executm aceast tehnic (aglutinare pe lam) pentru identificarea tulpinii bacteriene implicate
etiologic n respectiva boal infecioas. Se pot face i aglutinri n tuburi, pentru confirmarea
rezultatului obinut pe lam. Unele laboratoare i pot sintetiza in house reactivii necesari.
n cursul identificrii unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp., E. coli etc) sau a unei alte tulpini (EX
. Vibrio spp.), dup cultivarea p.p. pe diferite medii (vezi capitolele 13 i 14) i dup ce obinem colonii
izolate, putem face reacia de aglutinare. Aadar, avem nevoie de cultura de identificat (cultur
proaspt, de 18-24 de ore, cu colonii de tip S), soluie salin fiziologic, Ac cunoscui fa de Ag pe
care dorim s le identificm (Ac polivaleni, Ac monovaleni de grup, Ac monovaleni de tip, dup caz),
lame de microscop, amestec dezinfectant etc.
Pe o lam punem o pictur de soluie salin fiziologic, n care descrcm un fragment din colonia de
identificat, amestecm pn obinem o suspensie tulbure. Dac pictura devine limpede, cu grunji,
nseamn c apare autoaglutinare i nu mai putem s identificm tulpina prin reacie Ag-Ac (ar putea
fi, de EX . o tulpin din colonie de tip R, care i-a modificat structura). Dac suspensia rmne tulbure,
putem continua aplicarea tehnicii. Pe aceeai lam, la cealalt extremitate, punem o pictur de ser cu
Ac cunoscui (polivaleni). Descrcm un fragment din colonia de identificat n pictura de ser cu Ac i

amestecm pn obinem o suspensie tulbure. Prin nclinare, n mai multe direcii, favorizm contactul
dintre Ag-Ac mici i apar complexe mici, apoi reele de complexe Ag-Ac. Apar grunjii de aglutinare.
Citim reacia pe un fond negru. Lamele pe care am executat reacia de aglutinare conin
microorganisme vii i trebuie s le introduce n amestecul dezinfectant, dup examinarea rezultatelor
reaciei.
Reacia de aglutinare indirect se poate folosi pentru determinarea grupului streptococic, pentru
detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri
i pentru detectarea prezenei Ag n lichide biologice. Tot prin tehnici de aglutinare indirect se pot
identifica exotoxine.
9. 4. 2. Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul serologic
n diagnosticul serologic, n mod obinuit, reaciile utilizate permit detectarea prezenei Ac n serul de
cercetat dar i stabilirea titrului. Totui exist i cteva exemple de reacii de aglutinare calitative.
9. 4. 2. 1. Aglutinarea pe lam
Reacia de aglutinare pe lam (Huddleson; diagnosticul brucelozei) a intrat n istoria medicinei. Avem
nevoie de lame de microscop, Ag brucelos inactivat (colorat n violet) i ser de cercetat. Pe lam
depunem o pictur din soluia de Ag brucelos i o pictur de ser de cercetat. Amestecm i
omogenizm cei 2 reactani. Reacia este pozitiv n cazul n care se remarc prezena aglutinatelor.
Reacia pozitiv pe lam trebuie confirmat prin aglutinare n tuburi.
9. 4. 2. 2. Aglutinarea n tuburi
Tehnica poate fi folosit n diagnosticul serologic al brucelozei (Wright), n diagnosticul serologic al
infeciilor produse de Cryptococcus neoformans, n diagnosticul serologic al febrei tifoide
(reacie Widal - ca nume istoric) etc.
Pentru diagnosticul serologic al febrelor enterice vom folosi seruri recoltate n dinamic, la 7-10 zile
distan, Ag cunoscute (Ag O i Ag H), 4 iruri de eprubete (dou iruri pentru anti-O, dou iruri
pentru anti-H (pentru c vom lucra n cele dou probe, n dinamic, pentru fiecare tip de Ac). Pentru
fiecare ir de tuburi dilum binar serul de cercetat. n final, pentru fiecare ir avem: un tub martor
(tampon pentru diluie + Ag, fr ser) i tuburi cu serul diluat, de EX . 1/40, 1/80, 1/160 etc (un ir de
tuburi pentru serul recoltat de la pacient astzi i altul la 10 zile, pentru titrarea Ac anti-O i nc
dou iruri pentru titrarea Ac anti-H). Incubm cele 2 iruri de tuburi cu Ag O timp de 20 ore la 52C iar
cele 2 iruri de tuburi cu Ag H le incubm 2 ore la 52C plus 10 minute la temperatura camerei.
Evaluarea o facem pentru fiecare tub n parte, ncepnd de la diluiile mari, prin examinare i uoar
agitare, pentru a surprinde aglutinatele. Ultimul tub care prezint aglutinare vizibil stabilete titrul
reaciei (pentru fiecare ir de tuburi, n parte). Un titru care crete de 4 ori n dinamic stabilete
diagnosticul n mod cert.
n cazul unor pacieni care se afl n convalescen sau n cazul persoanelor care ar putea fi purttori
ncercm s stabilim titrul Ac anti-Vi.
9. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3570367/
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC321732/
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC87684/
9. 6. Povestire adevrat
Iat att o situaie de urgen n pediatrie ct i modul n care ar trebui condus diagnosticul i
comunicarea dintre echipa de clinicieni i medici de laborator, astfel nct diagnosticul i tratamentul
s fie obinut ct mai repede, n favoarea pacientului.
Un copil de 19 luni este adus la camera de gard a unui spital de pediatrie n urma unei crize comiiale.
Din anamneza mamei, aflm c n urm cu 2-3 zile s-au instalat simptome de rceal (tuse, congestie
nazal, i febr), care s-au agravat n cursul zilei n care se prezint la spital. Copilul a fost agitat, nu a
mncat i a dormit cea mai mare parte a dimineii (sau cel puin aceasta a fost impresia mamei). Au

urmat dou crize comiiale (grand-mal). Copilul nu avea istoric de convulsii. Mama a afirmat c nu s-au
fcut toate vaccinrile. La examenul clinic starea copilului este grav, temperatura de 38,1C, alura
ventricular 110 bti pe minut. Nu rspunde la vocea mamei, i nu retrage extremitile la stimuli
dureroi. Copilul prezint grimase atunci cnd se ncearc hiperflexia gtului. Nu prezint erupie
cutanat. Examenul ORL (nas, gt, urechi), cardiovascular, pulmonar i abdominal sunt normale.
Examenele paraclinice noteaz un numr mare de celule albe n snge. Se ia decizia de a efectua o
puncie lombar.
Se recolteaz 3 eprubete cu LCR (aspect intens tulbure). Examinarea a 2 frotiuri din LCR, colorate AM i
Gram, evideniaz frecvente celule PMN, rare hematii i multiple microorganisme cocobacilare roii
(coloraia Gram) dispuse intra i extracelular.
Se comunic rezultatele colegilor din clinic i este nceput tratamentul cu o cefalosporin de
generaia a treia, administrat intravenos.
Se nsmneaz pe: 1. agar-snge (pe care se aplic i 2 microcomprimate cu factorii de cretere X i
V), 2. agar-chocolat, 3. McConkey i 4. Mueller-Hinton.
Se efectueaz CIE din LCR confirmnd prezena antigenelor pentru H. influenzae, tip b. Rezultatele sunt
imediat transmise colegilor din clinic. Dup 1 zi, rezultatele culturilor efectuate confirm creterea pe
mediile mbogite, caracteristic H. influenzae. Se efectueaz o reacie de aglutinare pe lam care
confirm tipul b.
n ziua urmtoare, copilul a nceput s mnnce i s se joace n mod normal. Nu mai prezint febr i
rigiditatea gtului este mult diminuat. Tratamentul este continuat 7 zile, iar copilul este externat cu
diagnosticul de meningit acut bacterian cu H. influenzae tip b, vindecat. La vizitele de control,
mama nu mai raporteaz nici un episod de criz comiial, iar copilul se dezvolt normal.
9. 7. De reinut
Reaciile Ag-Ac au un rol important att in vivo ct i in vitro, pentru diagnostic i tratament. Exist
multe variante tehnice prin care aceste reacii pot fi puse n eviden. Aceste reacii pot fi folosite att
n diagnosticul bacteriologic direct (detecia Ag prezente la nivelul unei bacterii, util n identificarea
microorganismului) ct i n diagnosticul serologic (detecia n serul pacientului a Ac ndreptai
mpotriva unui anume Ag).
9. 8. Verificai-v cunotinele
1. Etapele reaciei antigen-anticorp sunt:
A. Interaciunea primar reprezint legarea anticorpilor de antigenele specifice
B. Interaciunea primar poate fi vizualizat sub form de flocoane de aglutinare
C. Interaciunea secundar implic formarea unei reele tridimensionale vizibile
D. Interaciunea secundar apare dup circa 10 de minute
E. Interaciunea teriar implic activitatea in vitro a complexelor Ag-Ac
2. Reacia de precipitare Elek:
A. Este folosit pentru a determina toxigeneza unei tulpini de Clostridium botulinum
B. Se efectueaz pe mediul Muller-Hinton
C. Necesit aproximativ 2 ore pentru ca Ac anti-toxin difterice s difuzeze n mediu
D. Implic nsmnarea a 2 martori (negativ i pozitiv) i a tulpinilor de investigat
E. Toxinogeneza se evideniaz prin apariia liniilor de precipitare n unghiurile dintre cultur i anul
cu Ac anti-toxin
3. Contraimunoelectroforeza:
A. Este o metod mai rapid dect imunoelectroforeza
B. Ac vor migra spre catod
C. Tehnica poate fi utilizat doar dac Ag investigat migreaz spre anod
D. Poate fi folosit n identificarea Ag K
E. Poate identifica Ag de la S. pneumoniae, N. meningitidis, H. influenzae
4. Afirmaiile FALSE despre reacii de precipitare n inel:
A. Este o reacie cantitativ
B. Reacia Ascoli este folosit pentru identificarea prezenei Ag crbunos
C. Pentru a efectua reacia, avem nevoie de 4 tuburi (3 martori i o prob)

D. Ag i Ac se amestec n eprubeta prob


E. Dup circa 5 minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare
5. n reaciile de aglutinare putem folosi:
A. Ag solubile, precum exotoxinele secretate de Corynebacterium dyphteriae
B. Ag corpusculare naturale (bacterii, celule)
C. Particule pe care s-au cuplat in vitro cu Ag
D. Eritrocite, n scopul determinrii grupei ABO
E. Particule de latex pe care s-au alipit Ac
9. 9. Myth busters (alegei ntre Adevrat i Fals)
1. Folosind reaciile de precipitare, putem determina cantitativ titrul unei exotoxine n serul pacientului.
2. Reaciile de aglutinare pe lam pot contribui la diagnosticul meningitei acute bacteriene naintea
obinerii culturilor primare.
3. Toxinogeneza tulpinilor de Clostridium botulinum este evideniat de testul Elek.
4. Folosind reacia de aglutinare indirect putem determina grupul streptococic.
5. Atunci cnd dorim s evideniem caracteristicile antigenice ale unei culturi bacteriene, vom lucra
mereu cu culturi proaspete deoarece microorganismele btrne nu i pstreaz caracteristicile
antigenice.

10. Reacii antigen-anticorp care nu sunt vizibile, direct.


(Gabriela-Loredana Popa, Alexandru-Andrei Muntean)
10. 1. Cuvinte cheie

fixare a complementului

seroneutralizare

ASLO

boli poststreptococice

radioimunoanaliza

analiz imunoenzimatic

Imunofluorescen

10. 2. Introducere
Exist i reacii Ag-Ac care nu pot fi vizualizate direct; n aceast situaie este necesar utilizarea unui
artificiu tehnic (EX . utilizarea unui sistem hemolitic, etc).
10. 3. Reacii n care folosim un sistem hemolitic indicator
10. 3. 1. Reacia de fixare a complementului (RFC)
Rezultatul reaciei nu este vizibil n absena folosirii un sistem hemolitic indicator. Reaciile Ag-Ac,
aadar i RFC, se pot folosi att pentru identificarea Ag ct i n diagnosticul serologic (identificarea
Ac). Cu toate c RFC este o tehnic laborioas, executat corect este foarte exact, cu sensibilitate i
specificitate ridicat.
RFC cantitativ se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infeciilor produse de Brucella
spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp.,Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., n
diagnosticul serologic al unor viroze, etc.
Vom lua ca exemplu RFC Bordet-Wassermann (RBW). Aceasta este o metod calitativ de identificare a
Ac mpotriva T. pallidum (atenie, Ag este nespecific!).
Principiu
Se inactiveaz C endogen (cel prezent n serul pacientului) deoarece poate prezenta variaii
cantitative (EX . n lupus eritematos sistemic; unele infecii duc la scderea nivelului C; unele
neoplazii determin nivele crescute ale C). Se adaug C exogen (cantitate stabilit conform
protocolului). a.Dac n serul de cercetat exist Ac specifici, rezult un complex Ag-Ac pe care se
fixeaz C(Cnu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul indicator hematii-Ac anti-hematii,
adugat n a doua etap). b.Dac n serul de cercetat nu exist Ac specifici, nu se formeaz complex
Ag-Ac i C rmne liber. Dup adugarea sistemului indicator, dac exist C liber, acesta se va lega
de complexele Ag-Ac ai sistemului indicator i va conduce la apariia hemolizei.
Tehnica de lucru
Utilizm ser de cercetat, seruri de referin (martor pozitiv i negativ), Ag cunoscut, C, sistemul
hemolitic indicator, baie de ap pentru inactivarea serului propriu (la 56C) etc.
n RBW folosim 2 eprubete cu diluii diferite ale serului pacientului i eprubetele martor (sigur pozitiv,
sigur negativ, martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C, martor pentru
sistemul hemolitic); nprima etap punem n reacie serul de cercetat, C i Ag cunoscut; n a doua
etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie).
Interpretare

Verificm nti rezultatele aprute pentru martori (EX . n tubul martor sigur pozitiv nu trebuie s
apar hemoliz). (Figura nr. 1)
Testul este pozitiv atunci cnd n tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliz, hematiile se depun
formnd un buton n partea inferioar a tubului (n serul de cercetat exist Ac). Pentru a stabili
diagnosticul este obligatoriu ca un rezultat pozitiv s fie confirmat prin reacii specifice (deoarece
cardiolipina este un Ag nespecific!).
10. 3. 2. Reacia de neutralizare (seroneutralizare; RSN)
Ag are o proprietate biologic (EX . toxic) care poate fi blocat/neutralizat prin cuplarea cu Ac
specific. RSN se poate utiliza n:

diagnosticul bacteriologic (EX . identificarea Clostridium perfringensprin metoda plcilor


semineutralizate, toxinotipia n cazul suspicionrii TIA cuClostridium botulinum, pe animale de
laborator);

diagnosticul serologic (EX . reacia ASLO, n bolile post-streptococice);

prevenirea unor boli infecioase prin vaccinare;

evaluarea eficacitii vaccinale (titrarea prezenei Ac anti-toxine, testarea prin


intradermoreacie a susceptibilitii fa de o anumit boal infecioas care are la baz drept
mecanism patogenic efectul unei exotoxine, EX . difterie);

tratamentul unor boli infecioase (seroterapie).


10. 3. 2. 1. Reacia ASLO
Se poate utiliza n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau pentru confirmarea
etiologiei bolilor poststreptococice; determinm titrul Ac anti streptolizin O (SLO).
Principiu
SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. Dac n serul pacientului exist Ac
anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat. Prin diluii efectuate n tuburi, determinm titrul
ASLO (cea mai bun tehnic este cea clasic!).
Tehnica de lucru (Tabelul nr. 1)
Utilizmseruri de cercetat n pereche (recoltate la interval de 7-10 zile), SLO liofilizat, snge defibrinat
de iepure, soluie salin izoton, soluie de rivanol 0,3%, eprubete, pipete gradate foarte curate, baie
de ap, centrifug etc.
Respectm cu strictee indicaiile din protocolul de lucru (EX . omogenizm suspensia de hematii,
dilum serul 1/10 i repartizm n tuburi; adugm o cantitate constant de SLO). Nu putem vizualiza
rezultatul reaciei n aceast etap. Este necesar a doua etap (agitm tuburile, adugm suspensia
de hematii, agitm pentru omogenizare; incubm 45 minute, la 37C, centrifugm; inem tuburile la
frigider, pn a doua zi).
Interpretare (Figura nr. 2)
Prin respectarea protocolului, titrul potenial al Ac anti-SLO va fi 12, 50, 100, 125, 166, 250, 333 etc.
Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai mare diluie de ser la care lipsete complet hemoliza. n ara
noastr se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Exist i alte teste serologice
care pot fi utilizate (EX . anti dexoribonucleotidaza B). S-a demonstrat c dinamica
serologiei (creterea de patru ori a titrului ntre dou determinri succesive) este mai important dect
valoarea absolut a titrului, nregistrndu-se nivele crescute (titru de >1900 uniti ASLO) n absena
simptomatologiei sau a dovezii microbiologice a unei infecii cu streptococ beta hemolitic de grup A
timp de mai mult de 2 ani. De asemenea, exist i situaii n care, dinamica ASLO este constant, n
absena simptomatologiei clinice.
10. 3. 2. 2. RSN n profilaxia i tratamentul unor boli infecioase
Vaccinarea n scopul obinerii unei protecii prin seroneutralizare
Vaccinul DTaP (celular) se face dup urmtoarea schem: primovaccinarea ncepe la vrsta de 2 luni a
nou-nscutului (se administreaz 3 doze la interval de 2 luni, la 2, 4, 6 luni). Pentru meninerea
imunitii se practic revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se practic la
36 de luni de via a copilului. Urmtoarea revaccinare are loc la intrarea n coala primar. Iar mai
departe, se recomand rapeluri cu dT din 10 n 10 ani. (Tabelul nr. 2)
Evaluarea eficacitii vaccinurilor

Este recomandat testarea strii de imunitate indus prin vaccinare. Spre EX . se titreaz Ac antitoxin (difteric, tetanic etc) n seruri prelevate de la persoanele vaccinate. Protecia anti-difteric e
asigurat de un titru de Ac-anti toxin difteric mai mare de 0,03 UAI/ml.
Terapia sau profilaxia specific
Se pot administra de imunoglobuline specifice omologe (de la persoane imunizate), de EX .
imunoterapia infeciei cu Clostridium tetani cnd administrm intramuscular 3-6.000 UAI. Se pot
administra seruri imune heterologe (obinute prin hiperimunizarea cailor) n tratamentul tetanosului,
difteriei, botulismului etc.
Seroterapia poate reprezenta o urgen medical.
10. 4. Reacii n care componentele sunt marcate
Marcarea componentelor se poate face:

izotopic (radio immuno assay, RIA)

enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA)

fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA)


10. 4. 1. Radioimunoanaliza (RIA) (Figura nr. 3)
14
Pentru marcarea Ag se poate utiliza C etc. Se introduce n reacie o cantitate cunoscut de Ag marcat,
Ag nemarcat (dorim s l dozm) i Ac cunoscui corespunztori Ag. Rezult o competiie pentru
cuplarea cu Ac ntre Ag marcat i Ag nemarcat, care se afl n proporii diferite, n funcie de cantitatea
Ag de studiat. Se pot folosi tehnici imunologice, cromatografice sau de faz solid pentru a separa Ag
marcat liber de cel legat n complexele Ag-Ac. Urmrim protocol de lucru i n final msurm
radioactivitatea complexului Ag-Ac. RIA este o tehnic cu foarte mare sensibilitate dar, utiliznd
radioactivitatea, este nlocuit din ce n ce mai mult cu tehnica ELISA/EIA.
10. 4. 2. Analiza imunoenzimatic (ELISA/EIA)
Tehnicile ELISA pot fi utilizate att pentru identificarea Ag ct i pentru identificarea i / sau titrarea Ac,
existnd de principiu urmtoarea succesiune de reacii, n cadrul protocolului: (Figurile nr. 4 i 5)

primul reactiv (fie Ag, fie Ac, depinde de ce urmrim s determinm) este fixat pe un suport
solid (EX . godeurile unei plci speciale, cumprate de la productor);

adugm al doilea reactiv, pe care dorim s l determinm (Ac sau Ag);

dac exist potrivire ntre cei doi reactivi, are loc formarea complexului Ag-Ac; pentru eliminarea
reactivilor care nu au intrat n complex se spal (automat);

se adaug un reactiv marcat (EX . se poate aduga un alt anticorp anti-Ac (anti-Fc), cuplat cu un
conjugat enzimatic); are loc o nou splare (automat);

se adaug un substrat cromogen pentru enzima marcant; modificrile enzimatice duc la o


modificare de culoare vizibil cu ochiul liber (ns interpretarea se face automat, la fel ca i
nregistrarea rezultatelor);

valorile nregistrate pentru prob se compar cu valorile nregistrate pentru martorul pozitiv i
martorul negativ, se aplic o formul (indicat de ctre productor; calculul se realizeaz tot automat);

interpretarea se face conform indicaiilor din protocolul care nsoete trusa ELISA.
Mai frecvent sunt utilizate fosfataza alcalin (substrat cromogen = p-nitro-fenil-fosfat) sau peroxidaza
(substrat cromogen = o-fenilen-diamina n soluie de ap oxigenat).

1.
2.
3.
4.

Specificitatea este bun sau foarte bun iar sensibilitatea este comparabil cu cea obinut n cazul
RIA. Tehnica este automatizat, iar ansamblul de instrumente foarte flexibil, permindu-ne practic s
efectum orice test dorim.(Figura nr. 6, Tabelul nr. 3)
10. 4. 3. Imunofluorescena (IF/FIA)
Pentru a efectua aceast tehnic este necesar ca unul dintre reactivi (Ag, Ac sau anticorp anti-Ac) s fie
marcat fluorescent. Imunofluorescena poate fi utilizat att n diagnosticul microbiologic direct (pe
p.p. recoltat de la bolnav sau pe cultura pur) ct i n diagnosticul serologic. (Figurile nr. 7 i 8)
Fluorocromii (EX . auramin O, rhodamin B, etc) sunt compui organici care, dup iradiere cu
radiaii UV absorb radiaia de o anumit lungime de und, intr n stare de excitaie; atunci cnd revin
n starea normal pierd energia acumulat emind radiaii luminoase sub forma de fotoni de o
lungime de und inferioar. Lumina vizibil emis depinde de fluorocrom (EX . culoare galben
pentru auramin O).
10. 4. 3. 1. IF direct (Figura nr. 7)
Principiu
Folosim Ac marcai fluorescent pentru a inti un Ag pe care l bnuim prezent.
Tehnica de lucru
Facem un frotiu pe care l acoperim cu serul care conine Ac marcai fluorescent, incubm, splm
pentru a ndeprta Ac care nu au intrat n complexul Ag-Ac. NB. Putem adapta tehnica pentru a
colora diferite Ag (EX . pentru a decela i alte tipuri celulare prezente), materialul genetic (ex. pentru
a colora nucleul celulelor eucariote). Ateptm s se usuce i examinm cu microscopul cu
fluorescen.
Interpretare
Aceast tehnic are avantajul de a prezenta o discriminare spaial a Ag investigate. Metoda este
rapid i aplicabil pentru frotiuri din p.p. sau din cultur, n anatomia patologic etc. Pentru fiecare Ag
de cercetat trebuie preparat serul care conine Ac specifici, marcai fluorescent. Putem
identificaLegionella pneumophila, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis,Chlamydia
trachomatis, Treponema pallidum, Cryptococcus neoformans,Histoplasma capsulatum, Pneumocystis
carinii etc.
10. 4. 3. 2. IF indirect (Figura nr. 8)
Principiu
Ag este cunoscut i urmrim obiectivarea unui Ac. Vom folosi un al doilea anticorp anti-Ac (intii
mpotriva poriunii Fc a primului anticorp).
Tehnica de lucru
Facem un frotiu, l acoperim cu serul de cercetat. Dup incubaie splm pentru ndeprtarea
reactivilor care nu au intrat n reacia Ag-Ac. Punem apoi un ser cu Ac anti-Ig de om, marcai
fluorescent i incubm. Splm, ateptm uscarea frotiului, examinm la microscopul cu fluorescen.
Interpretare
Dac n serul de cercetat exist Ac specifici Ag cunoscut, are loc formarea complexului Ag-Ac iar n
etapa urmtoare, Ac anti-Ig de om se cupleaz pe complex i n mod indirect, prin IF, identificm Ac.
Metoda poate fi utilizat n diagnosticul serologic al legionelozei, leptospirozei, sifilisului, boreliozei,
infeciilor produse Mycoplasma pneumoniae, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Pneumocystis
carinii etc.
10. 5. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3724245/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2962976/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3372158/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2953097/

10. 6. Povestire adevrat


Cazul 1. Un biat de 6 ani se prezint cu edem generalizat, hipertensiune, hematurie microscopic i
proteinurie. La examenul paraclinic, prezenta disfuncie renal moderat (uree seric 48 mg/dl,
creatinin seric 0,8 mg/dl) i nivele sczute ale complementului (CH50: 17U/ml; C3: 6mg/dl i C4:
4mg/dl). Titrul ASLO a fost normal. S-a pus diagnosticul de GlomeruloNefrit Acut (GNA). A prezentat
impetigo repetat la nivelul membrelor inferioare n lunile premergtoare Una dintre surorile sale (Cazul
3) a fost diagnosticat cu Faringit Streptococic (FS) n momentul diagnosticului de GNA n acest
pacient (Cazul 1).
Cazul 2. O fat de 13 ani, prezint edem generalizat, la 2 sptmni dup debutul GNA n Cazul 1. La
examenul clinic, se mai noteaz hipertensiune. Paraclinic, prezint hematurie microscopic, proteinurie,
disfuncie renal uoar (uree seric 43 mg/dl, creatinin seric 1.0 mg/dl). Cu 2 sptmni nainte de
debutul GNA, a acuzat durere faringian, concomitent cu diagnosticul de FS a Cazului 3. La momentul
diagnosticului, prezint dermatit atopic i impetigo a membrelor inferioare. Titrul ASLO este normal
n limite normale. S-a recoltat Exudat Faringian (EF) din care s-au izolat o tulpin de streptococ beta
hemolitic de grup A. Acesta a fost serotip 49.
Cazul 3. O fat de 9 ani, sora Cazului 1 i Cazului 2 prezint rash maculopapular la nivelul faei i
trunchiului i limb zmeurie. Dup tratamentcu antibiotice timp de 4 zile, a fost adus la spital i s-a
pus diagnosticaticul cu FS. S-a recoltat EF dar nu s-au putut izolat tulpini de S. pyogenes. Titrul ASLO a
fost crescut (542 UI/ml). Nu s-au decelat hipertensiune sau edem. La examenul sumarului de urin se
noteaz hematurie microscopic.
Discuii. Nu exist istoric de boli de renale n familie, iar copiii erau clinic sntoi pn n momentul
declanrii GNA i FS. Proteinuria s-a remis n 2 sptmni de la debutul GNA n Cazul 1 i 2. Nivelul de
creatinin seric a sczut, atingnd 0.3 mg/dl (Cazul 1), respectiv 0.5 mg/dl (Cazul 2). Nivelul de
complement seric s-a normalizat la 2 luni de la debutul GNA. Hematuria microscopic s-a remis dup o
lun n Cazul 3 i dup 4 luni n Cazul 1 i 2. Cazul 3 a fost diagnosticat cu GNA subclinic, datorit
hematuriei microscopice tranzitorii ce au urmat FS.
NB: n aceste cazuri, titrul ASLO s-a interpretat n funcie de titrul maxim admis. Recomandarea noastr
este ca de fiecare dat, titrul de Ac s fie msurat n dinamic.
10. 7. De reinut
Reaciile antigen-anticorp care nu sunt vizibile direct folosesc artificii tehnice (sisteme indicatoare,
component marcate) pentru a pune n eviden complexe Ag-Ac de dimensiuni foarte mici, crescnd
astfel sensibilitatea reaciilor, meninnd specificitatea caracteristic acestor reacii.
Majoritatea variantelor tehnice pot fi folosite att pentru diagnosticul bacteriologic direct ct i pentru
diagnosticul serologic. Reaciile moderne (ELISA/EIA) sunt automatizate i pot oferi rezultate rapide.
10. 8. Verificai-v cunotinele
1. Reacia de fixare a complementului:
A. Folosete complementul endogen
B. Folosete complement adugat exogen, dup inactivarea complementului endogen
C. Poate fi folosit doar calitativ, precum n Reacia Bordet-Wassermann
D. Poate fi folosit att n n diagnosticul bacteriologic direct ct i n diagnosticul serologic
E. RBW este identific anticorpii mpotriva Treponema pallidum
2. Reacia de seroneutralizare ASLO:
A. Testul este folosit pentru identificarea antigenelor SLO n serul pacientulu
B. Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai mare diluie de ser la care hemoliza este complet

C. n Romnia, se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO


D. Interpretarea corect a testului se face avnd dou seruri recoltate n dinamic
E. Necesit snge integral iepure ca sistem indicator
3. n reaciile n care componentele sunt marcate:
3
14
A. Tehnica de radioimunoanaliz implic folosirea de Ag marcate H, C
B. Vom folosi Ag marcate i Ag nemarcat
C. Vom folosi Ac cunoscui corespunztori Ag
D. Tehnica se bazeaz pe formarea de complexe Ag-Ac care vor fi radioactive
E. Radioactivitatea complexelor este corespunztoare Ag fluorescent-Ac
4. Imunofluorescena direct:
A. Poate fi folosit pentru a detecta Ag unui microorganism pe un frotiu examinat corespunztor
B. Poate folosi Ac marcai cu auramin O, caz n care complexele Ag-Ac vor fi de culoare galben
C. Imunofluorescena poate fi utilizat i n diagnosticul serologic
D. Fluorocromii pierd energia acumulat emind radiaii luminoase sub forma de fotoni de o
lungime de und superioar
E. Folosim un ser cu Ac anti-Ig de om, marcat fluorescent
5. Paii generici urmai pentru tehnica ELISA/EIA sunt:
A. primul reactiv Ag sau Ac este liber n godeurile unei plci speciale
B. adugm al doilea reactiv, pe care dorim s l determinm (Ac sau Ag)
C. dac exist potrivire ntre cei doi reactivi, are loc formarea complexului Ag-Ac
D. se adaug un fluorocrom cuplat chimicde un anticorp anti-Ac (anti-Fc)
E. Nu necesit adiia unui substrat cromogen
10. 9. Myth busters (alegei ntre Adevrat i Fals)
1. Fluorocromii excitai de o und de radiaie cu lungime de und superioar, va pierde energia
acumulat emind radiaii luminoase sub forma de fotoni de o lungime de und inferioar.
2. n cadrul reaciei de seroneutralizare ASLO, vom folosi un sistem indicator format din eritrocite i Ac
anti-eritrocite.
3. RBW este o reacie calitativ ce va folosi diluii prespecificate ale serului pacientului pentru a detecta
Ac mpotriva T. pallidum.
4. O valoare a titrului ASLO peste 250 sau peste 500, n Romnia, este clar patologic i necesit
tratament.
5. RIA sunt foarte puin sensibile, dar se folosesc datorit costului sczut i a uurinei de execuie.

11. Testarea imunitii de tip celular. (MI Popa,


Alexandru-Andrei Muntean, Gabriela-Loredana Popa)
11. 1. Cuvinte cheie

rspuns imun celular (RIC)

intradermoreacie (IDR)

purified protein derivate derivat proteic purificat (PPD)

Mantoux

imunodeficien
11. 2. Introducere
Putem folosi testele adresate RIC n cadrul diagnosticului imunobiologic sau n diagnosticul de
laborator pentru anumite boli infecioase (EX tuberculoza produs de Mycobacterium tuberculosis)
dar i n investigarea imunitii de tipcelular pentru un subiect cu suspiciune clinic de imunodeficient
(primar sau secundar).
11. 3. 1. Diagnosticul imunobiologic i imunologic de laborator al infeciei cu Mycobacterium
tuberculosis
11. 3. 1. 1. IDR cu PPD
Principiu
Tuberculina reprezint un amestec de Ag proteice mycobacteriene (nti secultiv M. tuberculosis n
mediu lichid, EX . Sauton; dup o perioad bine stabilit de multiplicare, cultura se filtreaz i apoi
prin mai multe proceduri de selectare-purificare se obine extractul proteic).
Dac o persoan este infectat cu germeni din grupul Mycobacterium tuberculosis, urmeaz
sensibilizarea i proliferarea LT. IDR cu PPD stimuleaz LT i RIC (inclusiv hipersensibilitatea de tip IV).
Rezult vasodilataie, edem i infiltrat cu LT, bazofile, monocite, neutrofile etc. Se cunoate c reacia
maxim este la circa 48 ore. Aria induraiei reflect HS de tip IV. Eritemul nu este interpretat ca reacie
pozitiv.
Procedura
Ne asigurm c dispunem de toate materialele necesare: seringi cu gradaii la 0,1 ml, PPD n fiole cu 2
UI/doz (echivalentul a 5 UI PPD-S) sau 10 UI/ doz, antiseptic etc.
Tehnica pe care o utilizm poart numele de IDR Mantoux (IDR cu PPD). Controlm fiola pentru a ne
asigura c este n termen, dac a fost pstrat corespunztor i o agitm energic pentru omogenizarea
PPD. Se folosete o sering nou pentru fiecare pacient; nu se admite aspirarea de PPD ntr-o sering
i schimbarea acului pentru fiecare pacient (!). Pregtim seringa, aspirm o cantitate suficient de
produs pentru a putea elimina bule de aer i a fi siguri c vom injecta intradermic 0,1 ml, fix.
Antiseptizm de EX . cu alcool medicinal (ateptm 3 minute) o zon situat pe faa anterioar a
antebraului stng, n treimea medie. Ptrundem aproape tangent la suprafaa antebraului, cu bizoul
n sus, pentru a ne situa n derm (Figura nr. 1). Injectm strict 0,1 ml. (Film nr. 1)
Dac am injectat corect, apare o bul uor denivelat cu diametru de circa 5 mm (Figura nr. 2).
Interpretare
La persoanele infectate, la locul injectrii poate aprea o reacie (eritem-edem-induraie) dup circa 6
ore, fiind maxim la 48-72 ore. Totui, cel mai frecvent, citirea rezultatului se face la 72 ore, la lumina
natural.
Recomandm citirea cel puin o dat la 24 de ore, astfel c efectum o prim citire la cel trziu 24 ore
(pentru a surprinde HS de tip umoral fa de Ag inoculat, structur proteic), o a doua citire la 48 ore i
citirea final la 72 de ore.
Zona unde s-a injectat PPD trebuie palpat pentru a delimita zona de induraie de zona de eritem.
Msurm diametrul maxim al zonei de infiltraie (induraie). Citirea reaciei este subiectiv, cu posibile

variaii individuale, totui rmne un element important, care nu trebuie neglijat. (Figura nr. 3; Film nr.
2)
Pentru investigarea infeciei cu M. tuberculosis, n ara noastr se consider drept negative reaciile
cu diametru mai mic sau egal cu 9 mm (analiza statistic a distribuiei valorilor pe eantioane
reprezentative de subieci a artat c plasarea limitei ntre valorile de 9-10 mm separ cel mai bine pe
cei neinfectai de cei infectai). O valoare mai mare de 10 mm recomand analize suplimentare i
investigaii care s elimine riscul tuberculozei-boal, care necesit tratament. Interpretarea corect, n
context clinic i epidemiologic revine membrilor reelei de pneumo-ftiziologie, conform algoritmului
stabilit n Programul Naional de Prevenire, Supraveghere i Control a TB.
11. 3. 1. 2. Testele de eliberare a Interferonului gama (TEIG; IGRA)
n prezent, exist variante tehnice (de laborator) considerate de ctre unii autori mai sensibile i mai
specifice dect IDR cu PPD. Astfel de teste folosite pentru diagnosticul in vitro sunt testele de
eliberare a Interferonului gama(Figura nr. 4). Specificitatea crescut a testului provine din eliminarea
unor reacii fals pozitive la IDR cu PPD, prin faptul c antigenele coninute de PPD sunt prezente i n
structura Bacilului Calmette-Guerin (BCG) i a unor mycobacterii non-tuberculoase.
Principiu
TEIG investigheaz rspunsul fa de peptide sintetice mai specifice pentru M. tuberculosis dect PPD
(early secretory antigenic target-6 (ESAT-6) and culture filtrate protein 10 (CFP-10), iar, n ultima iteraie
a acestor teste, se include i pri antigenice a proteinei TB7.7). Aceste proteine se gsesc n toate
culturile izolate de M. tuberculosis i conduc la o sintez i secreie msurabil a IFN- n majoritatea
persoanelor infectate, fiind absente din tulpina de vaccinare BCG i n majoritatea mycobacteriilor nontuberculoase. Totui, trebuie notat faptul c aceste proteine se gsesc i n M. kansasii, M. szulgai,
and M. marinum. Se folosete un martor pozitiv i un martor negativ, ct i un tub de test.
Procedura
Ne asigurm c dispunem de toate materialele necesare. Materialul biologic necesar de la pacient este
snge proaspt obinut prin puncie venoas periferic. Aceste teste comerciale ofer tuburile care
sunt prencrcate cu antigenele ce vor stimula populaia celular mononuclear i vor determina
secreia de Interferon-. Se identific traseul al unei vene superficiale periferice, se antiseptizeaz zona,
de EX . cu alcool medicinal (ateptm 3 minute) i efectum puncia cu un ac special ce permite
ataarea, pe rnd a mai multor tuburi vidate i extragerea unei cantiti exacte de snge.
Tuburile cu snge se incubeaz 16-24 de ore. Se folosete o tehnic ELISA (vezi capitolul 10) pentru
citirea cantitii de Interferon- n martorul negativ i martorul pozitiv, apoi n proba de investigat.
Interpretare
nti se interpreteaz rezultatele obinute n tuburile folosite ca martor pozitiv i negativ.
Se efectueaz pe baza diferenei dintre nivelul de baz (nivelul de Interferon- aflat n sngele
pacientului n absena stimulrii cu antigene martorul negativ) i nivelul de IFN- produs n cadrul
testului. Se ia n considerare i rspunsul din tubul martor pozitiv.
NB. Majoritatea autorilor sunt de acord cu faptul c n rile endemice pentru tuberculoz, rezultatele
TEIG nu sunt superioare rezultatelor obinute prin IDR cu PPD, ns sunt de multe ori mai scumpe).
11. 3. 2. Investigarea RIC
Un alt scop este reprezentat de utilizarea IDR cu PPD, mpreun cu alte IDR (cu alte Ag, provenind de la
alte microorganisme cu care presupunem c respectiva gazd a luat deja contact), pentru evaluarea
reactivitii n cadrul RIC.
Imunodeficienele primare (nnscute) se ntlnesc n aproximativ 1 din 2.000 de nscui vii, avnd
un spectru clinic foarte larg. Imunodeficienele primare au multe similariti cu imunodeficienele
secundare care pot surveni n cursul vieii, n urma infeciilor virale, dup administrarea de
imunosupresoare pentru a preveni rejetul de gref, n cursul tratamentului bolilor autoimune sistemice
sau dup administrarea de chimioterapie antineoplazic.
Principiu
Investigarea RIC la oricare pacient include:

discuia cu pacientul i anamneza (medicaie primit, momentul debutului suferinei, vaccinri


efectuate, infecii n antecedente etc.),


examenul clinic,

examenul de laborator

numrul elementelor figurate, formula leucocitar, frotiul din sngele periferic,

VSH, ali reactani de faz acut (proteina C reactiv, IL-6, etc.),

studiul subpopulaiilor limfocitare din punct de vedere numeric i funcional prin citometrie de
flux, utiliznd anticorpi specifici pentru a marca suprafaa celular,

determinarea numrului de celule formatoare de Ac fa de Ag timo-dependente,

studiul funciei celulelor fagocitare, evaluarea activitii citotoxice a celulelor NK i K,

studiul secreiei de citokine, etc.,

teste imunobiologice (IDR), folosind Ag care stimuleaz RIC; este recomandat o baterie de Ag,
patru-cinci din Ag (candidin, coccioidin, histoplasmin, Ag extras din virusul urlian,
fitohemaglutinin, lizat din cultur de Staphylococcus aureus, toxoid tetanic, toxoid difteric, tricofitin,
tuberculin etc).
Procedura
Instilarea Ag intradermic se face asemntor IDR cu PPD. Volumul de instilare va acelai, dar
trebuie s inem cont de concentraia Ag utilizate. Este vorba de mai multe instilri, la nivelul
antebraului, la distane diferite.
Interpretare
Pentru investigarea RIC pentru un subiect (am utilizat o baterie de Ag), dac de EX . rezultatul
este negativ (nu apare induraie) pentru niciuna dintre cele 4-5 Ag folosite, presupunem faptul c
subiectul respectiv este anergic n ceea ce privete RIC.
11. 4. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate trebuie nvate ca atare, n
dezvoltarea pe parcursul activitilor universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva link-uri corespunztoare unor
articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2863343/
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3749005/
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3786801/
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3598128/
11. 5. Povestire adevrat
Femeie n vrst de 32 de ani, nefumtoare, fr expunere profesional la noxe
respiratorii, normotensiv, nu are di abet prezint dispnee sever cu debut subacut,
de aproximativ patru sptmni, agravat progresiv, ce asociaz tuse cu expectoraie
hemoptoic. Iniial, a apelat la servicii medicale private, dar fr mbuntirea
simptomatologiei, astfel c s-a prezentat la spital.
La examenul clinic obiectiv, pacienta este contient, cooperant, sub-febril (37,7C), cianotic,
tahipneic, cu frecven respiratorie de 34 respiraii pe minut, puls de 94 bti pe minut i tensiune
arterial de 140/82 mmHg. Saturaia n oxigen a hemoglobinei era 70%. Se deceleaz crepitante
pulmonare bilaterale, cu caracter gros. Restul examinrii a fost normal.
Examenele paraclinice au decelat anemie uoar, leucocitoz, cu neutrofilie, restul formulei leucocitare
fiind normal. Examinarea echilibrului acidobazic i electrolitic a artat pH arterial de 7,34, pO2 de 40
mmHg, pCO2 de 45 mmHg, HCO3- de 22 mEq/L, sodiu i potasiu n limite normale. Pe baza acestor
analize, s-a diagnosticat insuficien respiratorie tip I (hipoxemic, normocapnic). Pe EKG s-a observat

tahicardie sinusal. Radiografiile toracice arat imagini reticulo-nodulare alturi de infiltrate fine
dispuse bilateral. ntrebat, pacienta menioneaz istoric de tuberculoz pulmonar n copilrie.
Datorit strii critice, s-a decis intubarea pacientei i administrarea de antibiotice cu spectru larg, fr
mbuntire marcat n 48 de ore.
S-a recoltat o prim serie de analize serologice, printre care serologia pentru grip i HIV (rezultatele
fiind negative).
Hemoculturile i culturile de urin au fost sterile.
Se recolteaz aspirat traheal, care este examinat n coloraie albastru de metilen, Gram i Ziehl-Neelsen
i demonstreaz celularitate mixt, cu neutrofile, hematii i rar flor bacterian polimorf. Se
efectueaz ecografie abdominal i cardiac la patul bolnavei, care nu indic nici o anomalie. Se
efectueaz un test IDR cu PPD. n paralel, se efectueaz un examen computer tomografic (CT) ce arat
un aspect diseminat, miliar bilateral ct i infiltrate de dimensiuni mari.
Pe baza suspiciunii imagistice i clinice, pacienta ncepe tratament antituberculos. La 48 de ore, zona
de induraie era deja de 15 mm, susinnd diagnosticul. Evoluia pacientei a fost favorabil i, n ziua a
12-a, a fost extubat. Culturile din aspiratul traheal au fost pozitive la 14 zile, ntr-un sistem de detecie
rapid. Diagnosticul a fost de tuberculoz pulmonar cu insuficien pulmonar secundar. Datorit
faptului examenul microscopic al sputei s-a dovedit a fi negativ, pacienta a fost externat n ziua 20,
pentru a urma tratament la domiciliu.

11. 6. De reinut
Rspunsul imun celular poate fi investigat att n cazul suspectrii unei infecii cu
un microorganism care se poate multiplica intracelular ct i pentru a diagnostica o
stare de imunodeficien (primar sau secundar). Este de notat c unele tratamente
aflate n arsenalul terapeutic actual pot cauza o scdere a specific a RIC prin
alterarea lanului de citokine care duce la activarea limfocitelor specifice. IDR este un
test important n diagnosticul tuberculozei pulmonare latente, dar exist i tehnici
mai noi care pot fi folosite.
11. 7. Verificai-v cunotinele
1. Este adevrat despre IDR cu PPD:
A. Tuberculina reprezint un amestec de Ag proteice mycobacteriene specifice
pentru M. tuberculosis, ce nu se regsesc n structura BCG
B. Injectarea corect, intradermic a Ag conduce la apariia unei bule, uor
denivelat cu diametru de circa 5 mm
C. n Romnia, se consider drept pozitive reaciile cu diametru mai mare sau egal
cu 8 mm, citit la 24 de ore
D. Citirile ar trebui efectuate la cel mult 24 de ore, apoi la 48 i 72 de ore
E. Examenul zonei de IDR vizeaz apariia unei unei induraii caracteristice HS tip
IV.
2. Testele de eliberare a interferonului gama (TEIG):
A. Nu este influenat de statusul vaccinal cu BCG
B. Prezint alte antigene fa de cele gsite n tuberculin

C. Este o reacie msurat direct spectrofotometric


D. Folosete o unic reacie martor, cea negativ
E. Prezint sensibilitate i specificitate mai mare dect IDR cu PPD.
3. Privind testarea RIC, urmtoarele afirmaii sunt FALSE:
A. Este suficient s efectum TEIG cu Ag anti-mycobacteriene
B. Se folosesc multiple antigene injectate intradermic
C. Prezena unei reacii locale indic anergia RIC
D. Tratamentul medicamentos al pacientului nu prezint importan pentru
investigarea RIC
E. Pentru dezvoltarea RIC, trebuie ca respectiva gazd s fi luat deja contact cu
Ag respective.
11. 8. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. n ara noastr, testele IDR cu PPD se consider drept pozitive atunci cnd reaciile au diametrul mai
mic sau egal cu 9 mm.
2. TEIG conin antigene proteice purificate, ce se gsesc i n compoziia BCG.
3. IDR pentru investigarea RIC includ 4-5 Ag din urmtoarea list: candidin, coccioidin,
histoplasmin, Ag extras din virusul urlian, fitohemaglutinin, lizat din cultur de Staphylococcus
aureus, toxoid tetanic, toxoid difteric, tricofitin, tuberculin

Microbiologie speciala

12. Diagnosticul de laborator n infecii


produse de coci patogeni i condiionat
patogeni.

12. 1. Cuvinte cheie


Testul coagulazei
Testul catalazei
MRSA
Hemoliza
Testul bilolizei
Sensibilitatea la optochin
Sensibilitatea la bacitracin
12. 2. Introducere
Simpla vizualizare prin microscopia optic a unor coci nu este
echivalent cu stabilirea patogenitii acestora, implicarea acestora
ntr-o anume patologie i nicidelimitarea n microorganisme bune
sau rele. Bacteriile observate pot fi comensale, inofensive sau pot
determina infecii de o severitate variabil. Atunci cnd frotiurile sunt
colorate Gram, microorganismele care rein violetul cristal apar
colorate violet: Staphylococcus, Streptococcus, sau pot fi colorate rozrou (EX . Neisseria spp.). n funcie de dispoziie putem ridica o
anume suspiciune (EX . in diplo n cazul Streptococcus
pneumoniae i Neisseria spp., n lanuri Streptococcus spp. sau n
grmezi Staphylococcus spp.)
12. 3. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genulStaphylococcus
12. 3. 1. Clasificare. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe specii
de microorganisme de interes medical, cele mai cunoscute fiind
reprezentate de:Staphylococcus aureus (prevalena cea mai
mare), Staphylococcus epidermidis iStaphylococcus saprophyticus.

Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili,


nesporulai, catalaz-pozitivi. Stafilococii coagulaz-pozitivi sunt
ncadrati n specia S. aureus.
12. 3. 2. Cale de transmitere. Infeciile stafilococice se transmit cel
mai adesea prin contact direct piele/piele sau piele/obiect contaminat
(pansamente folosite, prosoape, lenjerie intim).
12. 3. 3. Tabloul clinic variaz n funcie de localizarea infeciei i de
mecanismul etiopatogenic. Prin multiplicare i invazivitate
local,Staphylococcus aureus determin infecii supurative (purulente)
ale pielii, mucoaselor i ale esuturilor subiacente, cu apariia de
pustule, furuncule ori abcese (Figura nr. 1). n absena tratamentului,
infecia poate disemina (pot aprea chiar i complicaii severe, sepsis i
chiar evoluia nefast, spre deces). Unele tulpini stafilococice
sintetizeaz exotoxine, provocnd toxiinfecii alimentare, necroliza
toxic a epidermului (Figura nr. 2) ori sindromul de oc
toxic. Staphylococcus saprophyticus poate determina infecii urinare, n
special la femeile tinere active sexual.
12. 3. 4. Diagnosticul de laborator
Principii generale. n cazul infeciilor cu puroi ale tegumentelor i
mucoaselor (EX . abces - Staphylococcus aureus) diagnosticul de
laborator este unul bacteriologic, direct, conform etapelor studiate vezi
capitolul 3.
12. 3. 4. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s
respecte regulile cunoscute (vezi capitolul 4) (ct mai apropape de la
debutul bolii, nainte ca pacientul s primeasc medicaie antibiotic
ori chimioterapic etc). n infeciile stafilococice, produsul patologic
poate fi reprezentat de secreiile purulente de la nivelul lezinilor
cutanate (EX . plgi i arsuri suprainfectate, abcese), de exsudatul
nazal sau faringian, de sput, snge, LCR, urin, secreie vaginal ori
lichid de vrstur etc. Vom discuta recoltarea puroiului.
12. 3. 4. 2. Examinarea macroscopic i microscopic a produsului
patologic. Se efectueaza minim 2 frotiuri: unul colorat Gram i unul cu
albastru de metilen. Prin examinarea la microscopul optic, notam
celulele cu morfologii diferite: celulele epiteliale, celulele
inflamatorii (EX . leucocite PMN) icocii Gram-pozitivi, cu diametrul

de 0.5-1.5 mm, dispui n grmezi neregulate, n lanuri scurte,


perechi sau izolai, localizati intra sau extraleucocitar (Figura nr. 3).
12. 3. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic o
facem pentru a obine colonii izolate (cultur pur). Stafilococii sunt
germeni nepretenioi, motiv pentru care putem folosi medii de
cultur simple. Atunci cnd suspicionm contaminarea probelor este
recomandat utilizarea un mediu selectiv, precum mediul Chapman,
fiind cunoscut faptul c aceste microorganisme se multiplic pe medii
hiperclorurate (Figura nr. 4). Coloniile sunt de tip S, cu dimensiuni de
1-3 mm, pigmentate diferit n functie de specie (Staphylococcus
aureus-auriu (Figura nr. 5), Staphylococcus epidermidis-alb
iStaphylococcus saprophyticus-citrin).
12. 3. 4. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic o
facem pe baza:
Caracterelor morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, 0.5-1.5 mm,
dispui n grmezi neregulate, n lanuri scurte, perechi sau izolai
(Figura nr. 6)
Caracterelor de cultur: colonii de tip S, pigmentate auriu (Figura
nr. 5)
Caracterelor biochimice: Staphylococcus spp. sunt catalaz-pozitivi
si fermenteaz zaharuri cu producere de acid (EX . S.
aureuseste manit-pozitiv)
Caracterelor antigenice
Caracterelor de patogenitate: recomandm ferm
efectuareatestului coagulazei (Figura nr. 7)
Sensibilitii la bacteriofagi (n centrele de referin)
Altele (n centrele de referin, spre exemplu studiul acizilor grai
celulari, teste biochimice extinse, identificarea toxinelor, identificarea
prin biologie molecular a rezistenei la antibiotice etc).
12. 3. 4. 5. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei
prin metode difuzimetrice. n ultimul deceniu atenia ntregii
comuniti medicale s-a concentrat asupra rezistenei la antibiotice n
cretere a Staphylococcus spp.,fiind deja celebru microorganismul
insensibil la antibioticele beta-lactamice: stafilococul meticilinrezistent (MRSA- methicillin resistant Staphylococcus aureus). Acesta se
transmite prin contact direct, iar respectarea msurilor generale de

igien contribuie semnificativ la prevenirea apariiei infeciilor


stafilococice.
12. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genulStreptococcus
12. 4. 1. Clasificare. Streptococii sunt coci sferici Gram-pozitivi care
formeaz perechi sau lanuri n cursul diviziunii celulare. Dintre speciile
cu importan medical amintim: Streptococcus pyogenes (grup
A), Streptococcus agalactiae(grup B) i Streptococcus
pneumoniae (pneumococul). Dei nu a fost stabilit o clasificare
standard a Streptococcus spp., au fost propuse mai multe variante.
Astfel, pornind de la compozitia polizaharic a peretelui bacterian, a
rezultat clasificarea Lancefield, ce mparte streptococii n grupele
serologice A-H i K-U. Mai mult, Streptococcus pyogenes, conform
factorului de virulen-proteina M i a antigenului T, a fost submprit
n alte 100, respectiv 20 serotipuri. Cumulnd variate caractere
microscopice (prezena capsulei) i biochimice, precum hemoliza,
sensibilitatea la optochin ori la bacitracin vom obine o clasificarea
prezentat n Figura nr. 8.
n continuare vom discuta despre diagnosticul de laborator al
infeciilor produse de Streptococcus pyogenes.
12. 4. 2. Cale de transmitere. Este estimat c un procent cuprins ntre
5 i 15% din populaie este purttoare de S. pyogenes la nivel
faringian (prima localizare ca frecven), la nivel cutanat, anal ori
vaginal, fr ca aceste persoane s manifeste semne de boal. Infecia
se transmite de la om la om prin contactul direct al unui tegument
traumatizat ori al unei mucoase cu o secreie contaminat, dar i prin
inhalarea unor aerosoli ori prin ingerarea unor alimente contaminate.
12. 4. 3. Tablou clinic. Streptococii piogeni pot produce afeciuni
foarte variate:
Cu afectarea mucoaselor: faringit, angin streptococic (Figura nr. 9)
Patologii ale tegumentelor i ale esuturilor subcutanate: impetigo,
erizipel (Figura nr. 10), celulit, fasceit necrozant, gangren gazeoas
Afeciuni dezvoltate prin mecanism toxigen: scarlatina, sindromul de
oc toxic

Afeciuni mediate imunitar prin reacii de hipersensibilitate,


poststreptococice: reumatismul articular acut, glomerulonefrita acut.
Alegem pentru discuie diagnosticul n faringita streptococic.
12. 4. 3. 1 Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct.
12. 4. 3. 1. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic. Vom
recolta n condiii de asepsie exsudatul faringian (secreia purulent
de la nivelul faringelui), conform regulilor generale, dar respectnd
suplimentar urmtoarele condiii: nainte ca pacientul s se fi splat pe
dini, s fi mncat, s fi utilizat gargarisme cu diferite soluii. Dac
aceste condiii nu au fost respectate, recoltarea se va face dup minim
4 ore. Produsul recoltat trebuie prelucrat ct mai repede posibil, ns n
nici un caz nu trebuie s treac mai mult de 2-3 ore de la recoltare
pn la cultivare (preferabil 1-2 ore, sau mai repede). Dac aceast
recomandare nu poate fi respectat, produsul va fi nsmnat pe un
mediu de transport.
12. 4. 3. 1. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic va
ine cont de caracterul plurimicrobian al acestuia. Se vor colora 2
frotiuri, Gram i albastru de metilen, etap urmat de notarea
prezenei urmtoarelor elemente:celule epiteliale, celule
inflamatorii (EX . leucocite) i a diferitelor microorganisme printre
care i coci Gram-pozitivi aezai separat, n perechi sau n lanuri etc.
12. 4. 3. 1. 3. Cultivarea se realizeaz pe mediul agar-snge, urmat,
dup aproximativ 18-48 ore, de interpretarea rezultatului. n cazul unei
infecii cu streptococ urmeaz s vedem colonii de tip S, de mici
dimensiuni, nconjurate de o zon deb-hemoliz (clar, cu diametrul
mai mare dect diametrul coloniei) (Figura nr. 11).
12. 4. 3. 1. 4. Identificarea se face pe baza urmtoarelor caractere:
morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, dispui n lanuri (Figura nr.
12);
de cultur (mediul agar snge): colonii de tip S, cu diametrul de
0.5-1 mm, nconjurate deb-hemoliz (Figura nr. 11);
biochimice: hemoliz de tip beta, inhibiia multiplicrii
streptococilor de grup A de bacitracin (Figura nr. 13), rezistena la
trimetoprim-sulfametoxazol;

antigenice: determinarea polizaharidului specific de grup,


determinarea tipurilor M etc.
12. 4. 3. 1. 5. Antibiograma. Streptococii beta-hemolitici de grup
Asunt sensibili la penicilin. Doar dac pacienii sunt alergici la
medicamentele din clasa beta-lactaminelor se va efectua
antibiograma.
NB: Mai mult de 80% dintre episoadele de faringoamigdalit sunt de
etiologie viral i nu necesit antibioticoterapie.
12. 4. 3. 2. Diagnosticul de laborator serologic
Dac exist suspiciunea ca pacientul s sufere de o boal
poststreptococic sau se dorete confirmarea unei infecii invazive este
recomandat efectuarea diagnosticului serologic prin reacia ASLO
(vezi i capitolul 10). Acest test este util i n evaluarea evoluiei
pacientului sub tratament medicamentos (Figura nr. 14).
Reacia ASLO identific titrul anticorpilor anti-streptolizin O, o enzim
hemolitic produs de S. pyogenes. Repetarea testrii la un interval de
7-10 zile permite interpretarea serologic n dinamic i observarea
evoluiei pacientului sub tratament. Pentru zona noastr geografic se
accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Este strict
necesar realizarea controlului intern i extern de
calitate. N.B. Metoda cea mai corect este metoda clasic de
determinare.
12. 5. Diagnosticul de laborator n infeciile produse
de Streptococcus pneumoniae
12. 5. 1. Clasificare. Streptococcus pneumoniae se prezint
sub forma unor coci Gram-pozitivi, alungii, dispui n diplo,
ncapsulai, nesporulai, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ
anaerobi, multiplicarea microorganismelor fiind favorizat ntr-o
atmosfer cu 5% CO2. Pe mediul geloz-snge determina-hemoliz.
12. 5. 2. Cale de transmitere. Streptococcus pneumoniae este
condiionat patogen, putnd face parte din flora microbian normal a
tractului respirator superior. Infecia se transmite prin contactul
apropiat cu o persoan purttoare sau bolnav, ori prin inhalarea
picturilor contaminate, eliberate prin tuse ori strnut. Exist anumite
categorii de persoane predispuse spre a dezvolta boala: cei cu vrste
extreme (copiii foarte mici i adulii cu mai mult de 65 de ani),

persoane cu patologii asociate care determin imunodepresie (diabet


zaharat, afeciuni cardio-vasculare, HIV/SIDA) ori cu patologii
pulmonare (astm, defecte anatomice, mari fumtori).
12. 5. 3. Tablou clinic. Infecia pneumococic este principala cauz a
pneumoniilor comunitare (Figura nr. 15) i reprezint una dintre cele
mai frecvente etiologii ale meningitelor la copii i vrstnici. Poate
produce i infecii ale tractului respirator superior, ale urechii medii i
sinusurilor sau, prin diseminare sistemic, endocardit, septicemie.
Vom discuta diagnosticul microbiologic n pneumonia
pneumococic.
12. 5. 4. Diagnosticul pneumoniei este clinic, radiologic
i bacteriologic(direct).
12. 5. 4. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic,
reprezentat desput respect regulile generale, dar i condiii speciale
precum: educarea pacientului n vederea obinerii expectoraiei i nu a
unei probe salivare, necesitatea efecturii igienei cavitii bucale
anterior recoltrii.
12. 5. 4. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic impune
realizarea a dou frotiuri, colorate cu albastru de metilen, respectiv
Gram. Se noteaz prezena celulelor de la nivel alveolar (spre
exemplu macrofage), acelulelor inflamatorii (spre exemplu
leucocitele polimorfonucleare) i acocilor Gram-pozitivi, alungii,
lanceolai, dispui n diplo, cu o capsul comun (Figura nr. 16).
12. 5. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultur. Pneumococii sunt
germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple. Astfel,
nsmnarea se realizeaz pe mediul geloz-snge, cu incubarea ntro atmosfer de 5% CO2 la o temperatur de 35-37C, condiii care
favorizeaz multiplicare germenilor. Se vor observa colonii de tip S sau
de tip M, cu a-hemoliz (Figura nr. 17).
12. 5. 4. 4. Identificarea se realizeaz pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, alungii, lanceolai, n diplo,
capsulai (Figura nr. 16)
de cultur: colonii de tip S sau M, nconjurate de o zon de ahemoliz

biochimice: fermentarea inulinei, autoliza accelerat a srurilor biliare


(testul bilolizei), sensibilitatea la optochin (etil-hidrocuprein) (Figura
nr. 18)
antigenice: folosim seruri specifice polivalente i monovalente ce
intesc antigenul K, n reacia de umflare a capsulei
de patogenitate: inocularea la oarecele alb.
12. 5. 4. 5. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei
prin metode difuzimetrice. Pentru verificarea sensibilitii la penicilin
se utilizeaz microcomprimate cu oxacilin.
12. 5. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Neisseria
12. 5. 1. Clasificare. Familia Neisseriaceae include mai multe genuri,
dar vom discuta n cele ce urmeaz numai despre diagnosticul de
laborator n infeciile produse de meningococ (Neisseria meningitidis)
i gonococ(Neisseria gonorrhoeae). Acetia sunt coci Gram-negativi,
dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular
comun. n funcie de structura capsulei exist mai multe serogrupuri.
12. 5. 2. Neisseria meningitidis
12. 5. 2. 1. Cale de transmitere. Infecia meningococic se transmite
prin contactul apropiat cu o persoan purttoare sau bolnav
(utilizarea n comun a obiectelor de igien personal, srut, tuse).
Microorganismul a fost izolat de la nivel nazo-faringian, la persoane
sntoase (purttor de N. meningitidis).
12. 5. 2. 2. Tablou clinic. N. meningitidis reprezint una dintre cele mai
frecvente etiologii ale meningitei bacteriene, alturi de Haemophilus
influenzaei Streptococcus pneumoniae. Dac la aduli redoarea cefei,
fotosensibilitatea, vrsturile fr senzaie de grea, febra pot sugera
afeciunea, la copii i la bebelui suspiciunea de meningit poate fi cu
greu intuit, acetia prezentnd adeseori un tablou clinic atipic (EX .
iritabilitate, vom, reflexe modificate). Meningita meningococic este o
afeciune cu risc vital, reprezentnd o urgen medical.
12. 5. 2. 3. Diagnosticul n meningita meningococic
Diagnosticul include elemente clinice, ntr-un context epidemiologic.
Pentru stabilirea etiologiei, diagnosticul este bacteriologic (direct)
i urgent. Este recomandat ca primele etape s fie efectuate la patul
bolnavului.

12. 5. 2. 3. 1. Recoltarea produsului patologic (LCR, puncie dup


realizarea examenului fundului de ochi) ar trebui realizat la patul
bolnavului, unde repartizm o cantitate de LCR pentru examenul
citologic i biochimic, iar restul pentru frotiuri i culturi (Figura nr. 19).
Dac transportul este inevitabil, trebuie efectuat fr ntrziere i nu la
temperaturi sczute, ci aproape de temperatura corpului.
Meningococul poate fi izolat i prin hemocultur, din exsudatul nazal
ori faringian.
12. 5. 2. 3. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic
permite vizualizarea celulelor inflamatorii (PMN) i a cocilor Gramnegativi, dispui n diplo, capsulai, situai intra sau extraleucocitar
(Figura nr. 20).
12. 5. 2. 3. 3. Cultivarea o facem pe medii complexe, n atmosfer de
3-5% CO2, la 37C.
12. 5. 2. 3. 4. Identificarea rezult n urma analizei caracterelor:
morfotinctoriale (coci Gram-negativi, n diplo, reniformi);
de cultur: colonii de tip S sau M, cu o dimensiune de aproximativ
1-2 mm;
biochimice: metabolizeaz diferii carbohidrai (EX . glucoza i
maltoza) i produc citocrom-oxidaz (testul oxidazei este test cheie n
identificare) (Figura nr. 21);
antigenice: putem realiza serogruparea (spre exemplu pot aparine
grupului A, B, C, Y sau W-135) (Figura nr. 22).
12. 5. 2. 3. 5. Antibiograma este recomandat i se realizeaz de
obicei prin metode difuzimetrice. Sub un tratament antibiotic adecvat,
instituit prompt, majoritatea pacienilor cu meningit meningococic
se refac complet (a nu se uita c n anumite patologii este necesar
efectuarea CMI/CMB i eventual i NEI/NEB).
12. 5. 3. Neisseria gonorrhoeae
12. 5. 3. 1. Cale de transmitere. N. gonorrhoeae se transmite prin
contact sexual sau de la mam la ft n timpul naterii pe cale natural.
Nu arareori pacienii prezint multiple infecii transmise pe cale
sexual, fiind obligatorie investigarea complet. Gonoreea se asociaz
frecvent cu infecia cu Chlamydia trachomatis, schemele terapeutice
recomandate putnd s acopere ambele patologii.

12. 5. 3. 2. Tablou clinic. La brbai apare uretrita gonococic, iar la


femei, gonoreea se localizeaz endocervical. La nou-nscutul care se
nate pe cale natural din mam cu gonoree, poate aprea oftalmia
gonococic. Gonococul poate disemina cu apariia unor leziuni la
distan. Important de specificat este faptul c aproximativ 80% din
femeile infectate i 10% din brbai sunt asimptomatici, reprezentnd
o cauz de infertilitate.
12. 5. 3. 3. Diagnosticul de laborator n gonoree
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct).
12. 5. 3. 3. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic respect
regulile cunoscute. La brbat recoltm secreia uretral, iar la femeie
recoltarea trebuie efectuat pe mas ginecologic de la nivelul
colului uterin. Secreiile au de obicei un aspect purulent. Este de
preferat cultivarea ct mai rapid, pemedii de cultur complexe (n
atmosfer de CO2). Transportul trebuie realizat foarte rapid n medii de
transport (EX . Amies plus crbune activat).
12. 5. 2. 3. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic poate
pune diagnosticul. Notm prezena celulelor epiteliale, a celulelor
inflamatorii (EX . leucocite) i a cocilor Gram-negativi (n diplo,
situai intra sau extraleucocitar) (Figura nr. 23).
12. 5. 2. 3. 3. Cultivarea se face pe medii selective (spre exemplu
medii cu vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) dac produsul
patologic este contaminat. Recomandm cultivarea att pe medii
selective, ct i pe medii neselective, n atmosfer de 3-10% CO2, la
35-37C. Coloniile apar n 24-48 de ore. Sunt colonii de tip S, de 0,5-1
mm, sau colonii de tip M.
12. 5. 2. 3. 4. Identificarea rezult n urma analizei caracterelor:
morfotinctoriale: coci Gram-negativi, n diplo, eventual nconjurai
de o structur capsular comun;
de cultur: coloniile sunt de tip S sau M (pot exista pn la 5 tipuri
de colonii diferite, ceea ce poate deruta examinatorul neavizat);
biochimice: metabolizeaz diferii carbohidrai (EX . glucoza) i
produc citocrom-oxidaz (testul oxidazei este test cheie n identificare)
(Figura nr. 24); testul catalazei este intens pozitiv;
antigenice;

Altor caractere (de EX . studiate prin metode ale biologiei


moleculare).
12. 5. 2. 3. 5. Antibiograma este recomandat i se realizeaz de
obicei prin metode difuzimetrice. Este necesar testarea producerii
de b-lactamaz. Este necesar testarea prin tehnica diluiei (cel puin
determinarea CMI).
20. 7. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate
trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva
link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se
resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24265940
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23800598
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23793404
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23748454
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23575037
6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23575037
7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22895675
8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22302695
9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19884359
10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23504236
11. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23393147
12. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24243883
12. 7. Povestire adevrat
O pacient n vrst de 27 de ani, aflat n sptmna a 32-a de
sarcin, se prezint la medicul stomatolog pentru o durere intens la
nivelul molarului 2 inferior, drept, amplificat la masticaie i la
percuia de ax, debutat n urm cu aproximativ 2 zile. Mai mult, afirm
sngerare recurent i eliminarea unui lichid purulent de la nivelul
rdcinii dentare. Medicul deceleaz palpatoriu un nodul ferm
submandibular, mobil pe planurile profunde. Decide intervenia
imediat, dar pacienta refuz tratamentul, deoarece se teme c
anestezicul administrat local ar putea avea efecte nocive asupra

dezvoltrii ftului. Decide consultarea medicului ginecolog, peste 5 zile


atunci cnd are programat o evaluare. Medicul i prescrie un
medicament antiinflamator i i recomand s revin de urgen dac
starea ei se nrutete.
Pacienta se prezint a doua zi acuznd agravarea afeciunii, cu apariia
febrei (37,8C) n urm cu 3 ore i a unui edem submandibular
bilateral, predominant drept. Medicul se alarmeaz i, cu suspiciunea
de angin Ludwig, ndrum pacienta la camera de gard a celui mai
apropiat spital.
La camera de gard starea pacientei se agraveaz prin disfagie, cu
imposibilitatea nghiirii secreiei salivare i prin apariia unui placard
dur sublingual. Se decide internarea de urgen, iar la evaluarea
semnelor vitale se deceleaz: febr 38,9C, hipotensiune arterial
90/50mmHg, tahicardie 120/min i o frecven respiratorie de
20/minut. La o saturaie n oxigen de 97% i se recomand
oxigenoterapie, fiind cunoscut faptul c pacienii suferinzi de angin
Ludwig se pot desatura rapid. Trusa de traheostomie se afl la patul
pacientei pentru intervenie ct mai rapid n caz de necesitate.
Dup consultarea unui medic obstetrician se decide intervenia
chirurgical oro-maxilo-facial. Operaia decurge favorabil, pacienta
este echilibrat, iar ecografia Doppler fetal nu prezint anomalii. Pe
durata interveniei s-a prelevat puroi din abcesul mandibular, iar
ulterior examenul bacteriologic a evideniat infecia cu Staphylococcus
aureus. Sub tratament antibiotic, iniial empiric, ulterior conform
rezultatelor antibiogramei, pacienta prezint o evoluie favorabil cu
vindecarea afeciunii. Peste 10 sptmni nate un biat sntos.
Discuii
Pe durata sarcinii, rspunsul imunitar al mamei este semnificativ
diminuat. Din aceast cauz, infeciile progreseaz mai rapid punnd n
pericol att viaa pacientei, ct i a ftului. Mai mult, modificrile
hormonale altereaz fiziologia esuturilor gingivale, care devin mai
sensibile i predispuse spre infecie.
Angina Ludwig este o celulit necrozant, rapid progresiv a planeului
cavitii bucale, cauzat de microorganisme aerobe sau anaerobe,
incluzndu-le pe acelea care fac parte din flora microbana oral,
precum: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Bacteroides spp.

Afeciunea are risc vital, complicaiile majore fiind septicemia i


insuficiena respiratorie. n sarcin, att afeciunea, ct i potenialele
terapii pot pune n pericol starea de sntate a ftului.12. 8. De
reinut
n absena tratamentului, infeciile pot disemina sistemic, cu apariia
complicaiilor severe precum sepsisul i chiar decesul pacientului.
Stafilococii sunt germeni nepretenioi, motiv pentru care folosim
medii de cultur simple, spre deosebire de streptococci i de neisserii
care sunt microorganisme pretenioase.
Meningita meningococic este o afeciune cu risc vital,
reprezentnd ourgen medical.
12. 9. Verificai-v cunotinele
1. Alegei echivalena corect:
A. Gram pozitiv- Neisseria meningitidis
B. Gram negativ- Streptococcus pneumoniae
C. Gram pozitiv- Streptococcus aureus
D. Gram pozitiv- Staphylococcus epidermidis
E. Gram negativ- Neisseria gonorrhoeae
2. Testul catalazei este pozitiv n cazul:
A. Neisseria meningitidis
B. Staphylococcus aureus
C. Streptococcus pneumoniae
D. Staphylococcus epidermidis
E. Streptococcus aureus
3. Sunt caractere biochimice ale Stapylococcus spp.:
A. Beta-hemoliz n mediul agar snge
B. Inhibiia multiplicrii la Bacitracin
C. Testul catalazei pozitiv
D. Rezisten la trimetoprim-sulfametoxazol
E. Testul bilolizei pozitiv
4. Reprezint urgene medicale:

A. faringita streptococic
B. meningita meningogocic
C. furunculoza recidivant
D. angina Ludwig
E. fasceita necrozant
5. Sunt adevrate urmtoarele afirmaii despre reacia ASLO:
A. Semnific Asociaia Studenilor Liberi i Optimisti
B. Semnific Anti-StreptoLizina O
C. Este utilizat n diagnosticul bacteriologic al infeciei streptococice
D. Este utilizat n diagnosticul serologic al infeciei streptococice
E. Un titru antigenic
12. 10. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Infeciile cu MRSA sunt noi i rare.
2. Te poi contamina cu MRSA dac stai aproape de o persoan
infectat pentru c respirai acelai aer.
3. Infecia cu MRSA poate fi prevenit eficient prin igiena corect a
minilor.
4. Tratamentul de elecie al faringitelor este antibioticoterapia,
deoarece acestea sunt ntotdeauna cauzate de streptococul beta
hemolitic de grup A.
5. Voi recomanda mereu tratamentul cu antibiotice unui pacient cu
faringit, ct mai aproape de debutul afeciunii, deoarece acesta are un
risc nalt de a dezvolta reumatism articular acut.
6. Pot contacta infecia cu Neisseria gonorrhoeae dac ntru n contact
cu suprafee/obiecte contaminate( prosop, scaun, lenjerie de pat).
7. Netratat gonoreea poate determina infertilitate att la femei, ct i
la brbai.

13. Diagnosticul de laborator n


infeciile produse de enterobacterii.
(Gabriela-Loredana Popa, Alexandra
Limbu)
13. 1. Cuvinte cheie
Bacili Gram-negativi
Oxidaz-negativi
Catalaz-pozitivi
Boal diareic acut
Febra tifoid
Dizenterie
Pesta bubonic
13. 2. Introducere
13. 2. 1. Clasificare
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un numr foarte important de
genuri i specii, de microorganisme importante n medicin. Aceast
familie include att ageni patogeni (EX . Salmonella spp., Shigella
spp.) ct i condiionat patogeni (EX . E. coli) implicai
n patologia infecioas. Multe bacterii ale acestei familii fac parte din
flora intestinului uman sau animal, altele sunt prezente n ap, pe sol,
pe plante etc.
13. 2. 2. Calea de transmitere
13. 2. 2. 1. Genul Escherichia
E. coli face parte din flora intestinal normal. Este implicat (de
regul) n patologie atunci cnd i modific habitatul (de EX . ajunge
la nivelul tractului urinar). Eliminat n mediul extern cu materiile fecale,
contamineaz apa, solul, alimentele etc.
13. 2. 2. 2. Genul Klebsiella
Klebsiella pneumoniae este rspndit n natur; face parte din flora
normal a tractului gastrointestinal, a tractului respirator superior.
Dup terapia prelungit cu antibiotice (mai ales cu spectrul larg), n

mediul spitalicesc se selecteaz tulpini multirezistente ce pot coloniza


tractul urinar sau respirator la adult i la copil.
13. 2. 2. 3. Genul Proteus
Germenii din genul Proteus sunt rspandii ubicuitar. Se pot gsi pe
sol, n ape reziduale, ape de suprafa, n materiale organice n
putrefacie, n alimente i n produse patologice. Fac parte din flora
intestinal uman.
13. 2. 2. 4 Genul Salmonella
Principalul habitat al salmonelelor este tractul intestinal al
oamenilor i al animalelor. Pentru S. typhi omul este unicul rezervor.
Sursele majore, omul i animalele vor determina poluarea solului, a
apelor reziduale, a apelor de suprafa, n care vor supravieui de la
cateva zile la cteva luni, daca condiiile sunt favorabile.
13. 2. 2. 5 Genul Shigella
Bacteriile sunt ntlnite n intestinul i materiile fecale ale bolnavilor
precum i la purttorii aparent sntoi. Se pot izola din ap, alimente
sau de pe obiecte. Pot fi transmise prin intermediul mutelor i a
minilor murdare,
13. 2. 2. 6 Genul Yersinia
Speciile din genul Yersinia (specia cea mai patogen) au ca rezervor
roztoarele, psrile, mamiferele domestice. Se pot transmite prin
plgi mucate de la o roztoare la alta sau ocazional prin intermediul
puricilor (puricele de obolan, puricele de om).
13. 2. 3 Tabloul clinic
13. 2. 3. 1. Tabloul clinic n infeciile produse de E. coli
Genul Escherichia cuprinde n bun parte germeni comensali. Specia
tip este reprezentat de E. coli. Membrii acestui gen pot determina
infecii intestinale i extraintestinale. n condiiile n care prsete
habitatul natural, colonizeaz epiteliul urinar, fiind implicat n primul
rnd n infecii ale tractului urinar. Infeciile intestinale sau
enterocolitele infecioase sunt determinate de patotipuri (EAEC, EHEC,
EIEC, EPEC, ETEC etc.), fiecare avnd grupe serologice i determinnd
manifestri clinice distincte.
13. 2. 3. 2. Tabloul clinic n infeciile produse de genul Klebsiella
Klebsiella pneumoniae poate fi implicat ntr-o mare varietate de
boli precum toxiinfecii alimentare de tip infecios, infecii ale tractului

respirator superior, infecii urinare etc. Este un microorganism


condiionat patogen. Pneumoniile cauzate de K. pneumoniae sunt rare
dar foarte grave; cel mai des survin la pacienii cu boli debilitante ca
diabet, afeciuni pulmonare cronice, pacieni alcoolici i la cei cu un
sistem de aprare deficitar.
13. 2. 3. 3. Tabloul clinic n infeciile produse de Proteus
Proteus poate deveni patogen prin multiplicare i invazivitate i
poate declana infecii la diferite nivele ale organismului gazd. Sunt
implicai patogenic n afeciuni ce apar n afara tractului digestiv, dar
exist i toxiinfecii alimentare de tip infecios n care aceti germeni au
reprezentat agenii cauzali. Infeciile tractului respirator inferior,
pneumoniile, sunt de cele mai multe ori nosocomiale. Pot suprainfecta
plgile chirurgicale sau pe cele arse, ducnd la apariia abceselor. Sunt
frecvent implicai n infecii la nivelul tractului urinar,
capacitatea Proteus spp. de a descompune ureea joac un rol foarte
important n inducerea litiazei urinare.
13. 2. 3. 4. Tabloul clinic n infeciile produse de Salmonella
Principalele infectii produse de salmonele se pot mpri n
salmoneloze minore (enterocolite) i salmoneloze majore (febra
tifoid). Sunt patogene prin multiplicare i invazivitate. Pacienii
imunocompromii i cei cu boli hematologice sunt mai susceptibili la
infecii cu Salmonella dect adulii sntoi.
n caz de enterocolit (gastroenterit, toxiinfecia alimentar de tip
infecios, salmoneloz), germenii ptrund pe cale digestiv iar boala
apare dup ingestia a 105-108 salmonele. Incubaia dureaz de la
cteva ore pn la cteva zile, microorganismul multiplicndu-se n
epiteliul intestinal, n regiunea ileocecal, provocnd un sindrom
inflamator intestinal cu diaree mucopurulent i nesangvinolent. La
debut diareea este nsoit de greuri i vrsturi, iar n perioada de
stare a bolii simptomele frecvent ntlnite sunt reprezentate de febr,
colici abdominale, mialgii i cefalee. La nou nscut deshidratarea poate
duce la o stare de toxicoz grav. Persoana infectat poate fi
contagioas timp de circa 3 luni.
Febra tifoid (febra enteral) poate aprea dup ingerarea a 103 S.
typhi. Calea de ptrundere este digestiv, transmiterea fiind realizat
de la persoan la persoan. Dup ingestie, urmeaz o perioad de

incubare de aproximativ 1-3 sptmni, n care microorganismul


traverseaz mucoasa intestinal, urmat de multiplicarea n
submucoas i fagocitarea de catre macrofage. De aici, bacilii trec n
circulaia limfatic, apoi n cea sangvin determinnd etapa
bacteriemic a bolii. Simptomele generale se caracterizeaz prin febr
crescut, stare general alterat, stare de oc, nsoit de o
simptomatologie digestiv reprezentat de anorexie, colici
abdominale, constipaie sau diaree. Simptomatologia este cauzat att
de endotoxina, care activeaz diferitele cascade inflamatorii i
producerea de citokine, ct i consecina agresiunii intestinale,
hepatice i asupra vezicii biliare. La sfritul primei sptmni de boal,
salmonele se elimin n materiile fecale, dar excreia se poate prelungi
mult timp n convalescen.
13. 2. 3. 5. Tabloul clinic n infectiile produse de Shigella
Infectiile cu Shigella spp. sunt de regul limitate la nivelul tractului
intestinal, pot produce i toxiinfecii alimentare de tip infecios.
Shigeloza este o boal diareic acut, cu evoluie autolimitant, apare
dupa 2-5 zile de la ingestia a 10-1000 de bacterii. Debutul este brusc,
cu febr, diaree apoas, dureri abdominale intense. n perioada de
stare, pacientul are 30-40 de scaune nefecaloide, cu mucus, puroi i
snge, nsoite de tenesme rectale i stare general alterat. n cazul
unei infecii produse de Shigella shiga, starea general se nrutete,
pierderile hidro-electrolitice i instalarea unui sindrom de deshidratare
acut reprezint, ca i n cazul altor diarei, principala problem.
Evoluia poate fi fatal n lipsa tratamentului corespunztor.
13. 2. 3. 6. Tabloul clinic n infeciile produse de Yersinia
Genul Yersinia include 11 specii dintre care 3 sunt patogene pentru
om: Y. pestis (cauza ciumei), Y. pseudotuberculosis i Y. enterocolitica.
Y. pestis este un microorganism patogen al roztoarelor, oamenii
fiind gazde accidentale infectate prin muctura puricilor de obolan.
Microorganismul inoculat la om este fagocitat, dar se poate multiplica
att intra ct i extracelular. Infecia rezultat se rspndete rapid
ctre nodulii limfatici regionali. La nivelul nodulilor limfatici determin
leziuni caracteristice, ganglionii devin tumefiai, hemoragici, se
hipertrofiaz, sufer o necroz i devin fluctueni (aspect
caracteristic bubon negru). n cursul invaziei, Y. pestispoate ajunge n

torentul sanguin i infecia se poate generaliza. Pesta bubonic poate


produce leziuni hemoragice i necrotice n toate organele; n lipsa
tratamentului, letalitatea este de 50%.
Propagarea infeciei n cazul pestei pneumonice primare (forma
pulmonar) se face rapid, de la om la om, prin inhalarea particulelor
ncrcate cu germeni, fr s se mai treac prin stadiul de bubon. Se
manifest prin pneumonie hemoragic, septicemie, decesul survine n
mai putin de 24 de ore dup instalarea simptomelor clinice, la 90%
dintre pacienii netratai.
Y. pseudotuberculosis include cel puin 6 serotipuri, dar cel mai
frecvent implicat n infeciile umane este serotipul 1. n organismul
uman ptrunde pe cale digestiv, originea contaminrii fiind probabil
alimentar. Microorganismele penetreaz epiteliul poriunii terminale a
ileonului, ajung n ganglionii limfatici ai regiunii ileo-cecale, unde
produc o adenit reticular, nsoit de leziuni asemntoare
tuberculozei intestinale. Foarte rar, se ntlnete septicemie la pacienii
imunocompromii (cirotici si diabetici).
Y. enterocolitica cuprinde mai mult de 50 de serotipuri, cele mai
multe izolate la oameni bolnavi. Infecia oral cu serotipurile patogene
pentru om ale speciei Y. enterocolitica se poate manifesta clinic prin
mai multe tipuri de patologie; transmiterea are loc probabil prin
contaminarea apei i a alimentelor. Enteritele provocate de aceast
specie se manifest cu diaree, frecvent acompaniat de subfebrilitate i
dureri abdominale. Poate determina infecii cu caracter invaziv
localizate pe ileonul terminal cu prinderea ganglionilor mezenterici i
apariia unui sindrom al fosei iliace drepte, n paralel cu o adenit
mezenteric asemntoare celei provocate de Y. pseudotuberculosis. La
copii, simptomatologia poate conduce la punerea eronat a
diagnosticului de apendicit acut. La aduli s-a ntlnit n declanarea
unor artrite reactive sau a unui eritem nodos cu dificulti n ceea ce
privete diagnosticul diferenial.
13. 3. Diagnosticul de laborator
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un mare numr de genuri i
numeroase specii (peste 2400, dac sunt luate n considerare i speciile
din genul Salmonella). Familia include germeni care se pot multiplica
pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizeaz glucoza cu sau

fr producere de gaz, oxidaz-negativi, catalaz-pozitivi. Formeaz


colonii de tip S (R n cazul culturilor vechi) sau M (pentru speciile
capsulate), pot fermenta lactoza (EX .Escherichia coli, Klebsiella spp.)
sau sunt lactoz negativi (EX . Salmonella spp.,Shigella spp.). Pentru
izolare putem folosi medii selective i selectivo-difereniale. Exist
medii cu selectivitate mai redus (EX . Mac Conkey), medii cu
selectivitate medie (EX . ADCL) i medii cu selectivitate nalt (ex.
Wilson-Blair). Caracterele biochimice sunt eseniale pentru
identificare. Studiul caracterelor Ag (prin reacii Ag-Ac) este de
asemenea foarte util (toate enterobacteriile au AgO, cele mobile au
AgH, enterobacteriile capsulate au AgK, Salmonella typhi prezint n
plus AgVi etc.).
Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct (exceptnd
febrele enterale n care exist i diagnostic serologic).
13. 3. 1. Diagnosticul de laborator n infeciile produse
de Escherichia coli
Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu localizare
digestiv
1. Recoltarea i transportul p.p. respect regulile cunoscute; recoltm
materii fecale, lichid de vrstur etc. Dup examinarea macroscopic,
continu examenul de laborator. Spre ex., dac infecia ar fi produs
de E. colienterohemoragic (EHEC), am putea vizualiza cele ce urmeaz.
Materiile fecale pot avea aspect hemoragic, cu lambouri de mucoas
epitelial.
2. Nu facem frotiu. Examinm ntre lam i lamel i am putea vedea
hematiilor i PMN.
3. Cultivm pe MacConkey cu D-sorbitol (EHEC nu fermenteaz
sorbitolul, sau l fermenteaz tardiv). Coloniile suspecte, sunt de tip S,
1-, necolorate (coloniile sorbitol-pozitive au o culoare roz) (Figura nr.
1).
4. Identificarea se face pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: bacili Gram-negativi;
de cultur: colonii de tip S,cu caracterele menionate mai sus;
biochimice (se examineaz numai acolo unde sunt condiii de
biosiguran, conform unei Directive Europene): fermenteaz glucoza
(cu producere de gaz), lactoz-pozitivi, nu fermenteaz (sau

fermenteaz tardiv) sorbitolul, nu produc H2S, pot produce indol, sunt


ureaz-pozitivi, mobili (exist i tulpini imobile) etc.;
antigenice: prin reacii de aglutinare sau latex aglutinare (seruri
monovalente anti O157 i anti H7).
5. Antibiograma este recomandat pentru supravegherea apariiei
fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice; se realizeaz
prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul n infeciile urinare
n principal se recolteaz urin. n funcie de forma clinic se poate
recolta i snge (EX . n pielonefrita acut). Pe lng regulile
cunoscute, trebuie subliniat c iniial se realizeaz toaleta local. Atunci
cnd nu se poate recolta prima urin de diminea, trebuie ateptat
pentru recoltare 3-4 ore dup miciune. Dac p.p. nu este prelucrat
imediat (n maxim 30 de minute dup recoltare), trebuie meninut la
temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +. Se
recolteaz urina din mijlocul jetului. Exist i alte tehnici de recoltare,
neinvazive sau invazive (puncie i aspiraie suprapubian, cateterizare
uretral, cu riscurile respective).
Dup examenul macroscopic (EX . urina poate fi tulbure) pregtim un
sediment urinar. Examinm preparatul ntre lam i lamel; ncercm
s stabilim numrul de bacterii pe cmp i respectiv numrul de PMN
pe cmp (dac exist leucociturie).
Pentru cultivare putem utiliza mai multe medii diferite. Este de reinut
c facem o urocultur cantitativ (trebuie s determinm numrul de
bacterii/ml de urin). De EX ., dac nsmnm 0,1 mililitri de urin
diluat (ex. 1/1.000), incubm i dup apariia coloniilor calculm
numrul de bacterii/ml nmulind nr. de colonii cu 10 i cu 1.000. Asta
nseamn c, n condiiile de mai sus, prezena a 7 colonii nseamn
70.000 bacterii/ml. (Figura nr. 2)
Ce nseamn urocultur cantitativ? Avnd n vedere cele de mai sus,
dac numrul de bacterii/ml este mai mare de 100.000, considerm
urocultura ca fiind pozitiv. Lipsa coloniilor sau un numr de maxim
10.000 bacterii/ml, semnific o urocultur negativ. ntre 10-100.000
bacterii/ml eventual repetm analiza.

Dac urocultura este pozitiv, bacteria izolat se identific pe baza


caracterelor prezentate anterior i se trateaz conform
antibiogramei.
13. 3. 2. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Klebsiella
Sunt enterobacterii imobile, nesporulate. Degradeaz glucoza este
degradat cu producere de gaz i fermenteaz lactoza. Specia tip
este Klebsiella pneumoniae (bacili Gram negativi, capsulai). Este un
microb condiionat patogen. Poate produce TIA de tip infecios,
infecii ale tractului respirator superior, infecii urinare etc, inclusiv
infecii nosocomiale.
Pentru diagnostic, lum drept exemplu situaia n cazul pneumoniei
produse de Klebsiella pneumoniae. Diagnosticul integral include
elemente clinice, paraclinice i de laborator;
diagnosticul bacteriologic permite stabilirea etiologiei i tratamentului
corespunztor.
1. Recoltarea i transportul p.p. respect regulile cunoscute
(recoltm sput). Macroscopic, poate avea un aspect mucoid, de
culoare rou nchis, n jeleu de coacze.
2. Examinm microscopic p.p. i notm prezena celulelor (EX .
macrofage alveolare), celulelor inflamatorii (PMN) i a bacililor Gram
negativi, de dimensiuni relativ mari, cu capsul (halou, vizibil).
3. Cultivm pe medii de cultur obinuite (18-24 ore, 35-37C) i
examinm coloniile izolate, pentru a ncepe identificarea. Utilizm
medii slab selective (EX . MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se
dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe cele
moderat selective. K. pneumoniaeformeaz colonii lactoz-pozitive,
mari, de tip M, cu aspect de curgere pe suprafaa mediului de
cultur (tendin de confluare).
4. Identificarea microorganismului se face urmrind caracterele:
morfotinctoriale: bacili Gram-negativi, dimensiuni mari, capsulai,
dispui n lanuri scurte, perechi sau izolai; (Figura nr. 3)
de cultur: colonii lactoz pozitive, de tip M, mari (2- la 24 de ore,
peste la 48 ore), bombate, vscoase, cremoase, n pictur de miere,
care dau aspectul de curgere pe suprafaa mediului de cultur, cu
tendin la confluare(Figura nr. 4);

biochimice: glucoz pozitiv (cu producere de gaz), lactoz pozitiv,


nu produce H2S, imobil, ureaz pozitiv, indol negativ, se dezvolt
folosind citratul ca unic surs de C. (Figura nr. 5)
antigenice: utilizm seruri cu Ac cunoscui pentru identificarea
tulpinilor deKlebsiella, prin aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare
(n laboratoare de referin);
testarea sensibilitii la bacteriofagi etc.
5. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei prin
metode difuzimetrice (determinarea CMI este indicat).
13. 3. 3. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Proteus
Genul Proteus este format din germeni foarte pleomorfi, foarte mobili,
Gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, nu fermenteaz lactoza,
produc ureaz. Exist 2 specii principale, Proteus
mirabilis i Proteus vulgaris. Sunt germeni condiionat patogeni.
Pot produce TIA de tip infecios, infecii ale tractului urinar (ITU), dar
chiar i alte infecii (tegumentare, genitale, infecii nosocomiale etc).
Discutm diagnosticul de laborator al ITU.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct.
1. Recoltarea i transportul p.p. se realizeaz aa cum am discutat
anterior. Urina poate fi tulbure, purulent. Transportul trebuie realizat
n maxim 30 minute, iar dac nu e posibil, p.p. trebuie transportat la
rece (+4C). (Figura nr. 6)
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea
preparatului proaspt ntre lam i lamel, din sedimentul urinar. Acest
tip de examinare este foarte important (uor de realizat, ieftin, permite
observarea unor elemente utile, care orienteaz
diagnosticul). Mobilitatea poate fi evaluat. Urmrim numrul de
leucocite/cmp. (Film nr. 1)
3. Cultivm pe medii de cultur simple. Trebuie s demonstrm
prezena a peste 100.000 bacterii/ml de urin. Pe mediile simple
uzuale, nu se pot obine colonii izolate; apare fenomenul de
invazie.
4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor
caractere:

morfotinctoriale: bacili Gram-negativi, cu polimorfism (bacili,


cocobacili, forme filamentoase de peste 30 m); (Figura nr. 7)
de cultur:
Fenomenul de invazie (dac nsmnm o tulpin la periferia unei
plci Petri cu mediu simplu, cultura se dezvolt n valuri concentrice,
pe toat suprafaa mediului) (Figura nr. 8),
Pe anumite medii selective (cu sruri biliare), invazia este inhibat i
se obin colonii izolate, de tip S, lactoz negative,
Fenomenul liniei de demarcaie (dac pe o plac cu mediu solid
cultivm 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta
invadnd pn n apropierea liniei de ntlnire, unde se va crea o linie
de demarcaie ntre cele 2 tulpini) (Figura nr. 9);
Fenomenul de crare;
Caractere biochimice: sunt microorganisme lactozo negative (alte
caractere biochimice se pot studia pe mediile multi test, TSI, MIU etc.),
glucoz pozitive, produc H2S, mobile, ureaz pozitive, se pot dezvolta
folosind citratul ca unic surs de carbon; (Figura nr. 10)
Caractere antigenice;
5. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei prin
metode difuzimetrice.
13. 3. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genulSalmonella.
Genul Salmonella include bacili Gram negativi, mobili cu cili peritrichi,
necapsulai, nesporulai, nu fermenteaz lactoza, produc H2S, utilizeaz
citratul ca unic surs de carbon.
Pot produce salmoneloze minore (EX . TIA) i salmoneloze majore (ex.
febra tifoid). n cazul TIA/enterocolitelor, diagnosticul de laborator
estebacteriologic, direct. n cazul afeciunilor sistemice, diagnosticul
poate fibacteriologic i serologic.
13. 3. 4. 1. Diagnosticul de laborator n infeciile cu localizare digestiv
1. Recoltarea i transportul p.p. (EX . materii fecale) respect regulile
cunoscute.
2. Examinm microscopic p.p., ntre lam i lamel (remarcm prezena
granulocitelor). (Figura nr. 11)
3. Cultivm pe urmtoarele medii de cultur: un mediu lichid de
mbogire (bulion selenit) i dou medii selectivo-difereniale

(MacConkey i ADCL). Dup 18-24 ore la 35-37C, pe mediile solide


pot aprea colonii bacteriene suspecte (lactoz-negative) din care
obinem cultura pur. Cultura de 18-24 ore din bulion selenit o
repicm pe medii solide. (Figura nr. 12)
4. Identificm microorganismului pe baza mai multor caractere:
morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi;
de cultur: produc colonii de tip S, lactoz-negative (necolorate pe
MacConkey; necolorate, cu centrul negru pe ADCL) (Figura nr. 13);
biochimice: fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt
lactoz-negativi, produc H2S i utilizeaz citratul ca unic surs de
carbon; (Figura nr. 14)
antigenice: utilizm seruri imune cu Ac anti-O i ulterior Ac anti-H
(reacii de aglutinare pe lam, respectnd protocolul de lucru);
sensibilitatea la bacteriofagi.
5. Antibiograma este recomandat n cazul pacienilor foarte n vrst,
sau n cazul copiilor foarte mici, prematuri, cu alte boli adugate i
pentru supravegherea apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice
i chimioterapice.
13. 3. 4. 2. Diagnosticul de laborator n febrele enterale (EX . febra
tifoid)
Diagnosticul cert este reprezentat de izolarea i identificarea S.
typhi din p.p.
Diagnosticul bacteriologic, direct respect etapele prezentate
anterior.
n prima sptmn de boal, p.p. e reprezentat de snge; ulterior
putem recolta materii fecale, urin, lichid biliar, mduv hematogen
etc. Dac p.p. este reprezentat de materii fecale, respectm ceea ce
am prezentat mai sus (exist i particulariti). Coloniile de S. typhi pot
s nu prezinte centrul de culoare neagr pe ADCL. S. typhi nu produce
gaz din glucoz iar H2S este n cantitate mic. Nu folosete citratul ca
unic surs de carbon. Pentru identificarea AgO este necesar o
inactivare prealabil (termic). Prezena AgVi poate crea probleme n
identificarea AgO. Lizotipia poate fi foarte util. Testarea sensibilitii la
antibiotice i chimioterapice este indicat n toate infeciile produse
de S. typhi.

Diagnosticul serologic: se realizeaz respectnd principiile generale.


Serodiagnosticul Widal (folosind culturi vii) nu se mai practic astzi.
Tehnica actual poart numele de analiz seric
cantitativ (aglutinare n tuburi). Utilizm serii de tuburi (cte o serie
pentru fiecare Ag cunoscut folosit). Utilizm 6 serii de tuburi pentru a
evidenia Ac anti-O (TO - S. typhi, AO - S. paratyphi A, BO - S.
paratyphi B), i anti-H (d - S. typhi, a - S. paratyphi A, b - S.
paratyphi B). Pregtim diluiile, incubm pentru Ac anti-O timp de 1820 ore la 52C i 10 minute la temperatura camerei iar pentru Ac antiH timp de 2 ore la 52 C i 10 minute la temperatura camerei. Apoi
citim reacia. Un titru de 1/250 n cazul Ac anti-O i respectiv 1/2.500 n
cazul Ac anti-H este sugestiv. Creterea de 4 ori a titrului, la 2
determinri succesive confirm diagnosticul.
n cazul convalescenilor i purttorilor este recomandat reacia de
aglutinare n tuburi pentru identificarea prezenei i titrului Ac anti-Vi
(titru mai mare de 1/40).
13. 3. 5. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Shigella
n genul Shigella exist 4 subgrupe: A. Shigella dysenteriae (13
serotipuri), B. S. flexneri (6 serotipuri), C. S. boydii (18 serotipuri) i D. S.
sonnei (1 serotip cu 2 faze, R i S). Sunt bacili gram negativi, imobili,
nesporulai, necapsulai, aerobi facultativ anaerobi, glucoz pozitivi
(fr producere de gaz), oxidaz negativi, lactoz negativi. Subgrupele
se pot diferenia, de EX . pe baza fermentrii manitei (subgrupul A
este manit negativ).
Produc infecii la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate aprea
dup ingestia a numai 10-100 bacterii. Shigella spp. poate produce i
toxiinfecii alimentare de tip infecios.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) i trebuie
pus rapid.
1. Recoltarea i transportul p.p. (materii fecale) respect regulile
cunoscute. Macroscopic, m.f. pot fi n cantitate mic (mucus, puroi,
snge). Transportul trebuie s fie realizat rapid (recomand
nsmnarea la patul bolnavului; altfel, trebuie s folosim mediul de
transport, EX . Cary-Blair). Recoltarea se poate face i cu ajutorul
sondei Nelaton, din colonul sigmoid.

2. Examinarea microscopic a p.p. este foarte important. Poate oferi


un rspuns concret, rapid, util. Examinm preparatul ntre lam i
lamel, iniial cu obiectivul 40. Dac evideniem numeroase PMN,
mecanismul producerii bolii este de tip invaziv, iar dac remarcm un
procent de peste 75% PMN, alturi de hematii, acest aspect este
sugestiv pentru dizenteria bacterian. (Figura nr. 15)
3. Cultivm pe medii slab i moderat selective. Dac apar colonii
lactoz negative, repicm pe medii multitest (TSI, MIU, MILF).
4. Identificarea microorganismului se realizeaz pe baza mai multor
caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi;
Caractere de cultur: produc colonii de tip S, lactoz negative, 1(Figura nr. 16);
Caractere biochimice: sunt glucoz pozitivi, fr producere de gaz,
lactoz negativi, nu produc H2S, imobili, ureaz negativi, indol
negativi; (Figura nr. 17)
Caractere antigenice: utilizm seruri imune polivalente anti-subgrup
sau seruri imune specifice de tip (reacii de aglutinare pe lam,
conform schemelor de lucru);
Testarea sensibilitii la bacteriofagi (lizotipia) poate fi utilizat n
scop epidemiologic.
5. Antibiograma este recomandat. Se realizeaz prin metoda
difuzimetric standardizat att n special n scopul supravegherii
apariiei unor tulpini rezistente ct i pentru stabilirea tratamentului
antimicrobian corespunztor.
13. 3. 6. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de
genul Yersinia
Genul Yersinia include mai multe specii. Infecii umane pot
produce Yersinia pestis (cium), Y. pseudotuberculosis i Y.
enterocolitica. Sunt bacili sau cocobacili Gram negativi, colorai bipolar.
Prezint pleomorfism. Cresc pe medii simple.
Yersiniozele cu poart de intrare digestiv pot avea drept ageni
etiologici Y. enterocolitica sau Y. pseudotuberculosis. Diagnosticul de
laborator n yersiniozele cu poart de intrare digestiv
este bacteriologic, direct. Pentru manifestri extra-digestive se poate
face i diagnostic serologic.

Diagnosticul bacteriologic
1. Recoltarea i transportul p.p. (materii fecale), se face conform
regulilor prezentate anterior. Se poate folosi mediul de transport CaryBlair.
2. Examinarea microscopic a p.p. include realizarea unui preparat
ntre lam i lamel. Vom evidenia prezena celulelor inflamatorii.
3. Cultivm pe medii selective clasice (MacConkey, ADCL) sau mediul
CIN (cefsulodin, irgasan, novobiocin). Incubm i la temperatura
camerei (20-30C).
4. Identificm pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: cocobacili sau bacili Gram-negativi,
pleomorfi (Figura nr. 18);
de cultur: produc colonii de tip S, 1-1,5 mm (2-3 mm dup 48 ore);
biochimice: fermenteaz glucoza fr producere de gaz, nu
fermenteaz lactoza, nu produc H2S, sunt imobile la 37C i mobile la
22 C, nu produc indol, produc ureaz;
antigenice: utilizm seruri specifice anti-Yersinia (reacii de
aglutinare pe lam).
5. Se recomand realizarea antibiogramei, prin metoda
difuzimetric standardizat.
Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic poate fi util n determinarea etiologiei artritelor
reactive, eritemului nodos sau n cazul altor manifestri extraintestinale. Anticorpii apar la circa 4-7 zile de la debutul bolii, ating
valoarea maxim dup circa 14 zile i persist cteva luni. Se pot
practica diferite tehnici, de EX . reacia de aglutinare n tuburi.
Un titru mai mare de 1/160 poate avea semnificaie. Se recomand
testarea n dinamic.
Trebuie s fie luat n considerare posibilitatea apariia unor reacii
ncruciate, datorit existenei unor Ag asemntoare la
microorganisme din genurileBrucella sau Salmonella.
13. 4. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate
trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se


resursele World Wide Web.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24072767
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24661557
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24400226
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24429069
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24595804
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24630581
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24588391
13. 5. Povestire adevrat
Copil n vrst de 4 ani, de sex masculin, din mediul urban se
interneaz ntr-o secie de pediatrie cu febr, tuse seac, fatigabilitate,
inapeten, disfagie, dureri abdominale. n urm cu 10 zile, prezint
semnele unei angine acute eritematoase, cu febr , care nu se remite n
urmtoarele zile sub tratament antipiretic. Pe parcursul internrii
primete tratament antibiotic i simptomatic, durerea abdomnial
devine mai accentuat, apar scaune apoase, fetide. Se efectueaz
coprocultur.
Se decide transferul pacientului ntr-o secie de boli infecioase. Starea
general rmne deteriorat, facies palid, ncercnat, tegumente
palide, limb sabural cu descuamare la vrf, adenopatie
laterocervical, subangulo-mandibular; sistemul muscular hipoton,
hipokinetic; abdomen sensibil la palpare periombilical i n hipogastru;
tranzit intestinal accelerat. Din analize se evideniaz uoar anemie,
iar ecografia abdominal arat hepatomegalie. Se comunic i
rezultatul coproculturii recoltate: Salmonella gr. B, rezistent la
ampicilin, sensibil la cotrimoxazol, acid nalidixic, ciprofloxacin.
Diagnostic pozitiv: gastroenterit acut cu Salmonella gr. B, form
clinic medie; angina acut eritematoas, tulburri hidrice i
hidroelectrolitice. S-a instituit tratament cu ciprofloxacin; starea
pacientului s-a ameliorat.
Discuii
n cazul unei enterocolite la copiii sub 10 ani, simptomele sunt mai
severe. Astfel, chiar dac enterocolitele salmonelozice sunt de obicei
autolimitante i nu se trateaz cu antibiotice (existnd riscul de a
prelungi portajul i perioada n care pacientul va continua s excrete

salmonele), n aceast situaie (avndu-se n vedere i starea clinic) sau administrat pentru a evita apariia unor complicaii.
13. 6. De reinut
Familia Enterobacteriaceae reprezint cea mai larg reprezentat
grupare taxonomonic, cuprinznd specii patogene pentru om,
ct i specii saprofite sau condiionat patogene
Sunt bacili Gram-negativi ce nu se pot diferenia prin microscopie
optic
n anumite situaii reechilibrarea hidroelectrolitic este suficient
ca i tratament, antibioterapia poate prelungi portajul bacteriei
responsabile de infecie
Msurile profilactice se refer n primul rnd la respectarea
msurilor igienice att n unitile sanitare, ct i n unitile
administraiei publice.
13. 7. Verificai-v cunotinele
1. Pacient de sex masculin, n vrst de 35 de ani, se prezint la spital
pentru disurie, polakiurie, durere lombar, febr. Hemoleucograma
evideniaz leucocitoz cu neutrofilie, VSH, PCR, fibrinogen crescute.
Sumar de urin: hematii, leucocite, flor microbian, cilindrii leucocitari
prezeni. S-a efectuat urocultura. Care este cel mai probabil agent
patogen implicat n aceast patologie urinar?
A. E.coli
B. Yersinia pestis
C. Yersinia enterocolitica
D. Klebsiella pneumoniae
E. Shigella shiga
2. Despre enterobacterii sunt adevrate urmtoarele afirmaii:
A. Sunt bacili Gram-negativi, cu capete rotunjite, nesporulai
B. Sunt germeni pretenioi oxidaz-pozitivi, catalaz-negativi
C. Prezint ca i structur antigenic lipopolizaharidul (LPZ)
D. Unele enterobacterii elaboreaz exotoxine
E. Pot coloniza n mod normal intestinul omului
3. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Salmonella cu
localizare digestiv cuprinde:
A. Diagnosticul serologic

B. Examinarea microscopic a produsului patologic cu


realizarea preparatului nativ, ntre lam i lamel
C. Analiza seric cantitativ, realizat prin tehnica aglutinrii n
tuburi
D. Identificarea microorganismului patogen, izolat n cultur
pur
E. Utilizarea mediilor convenionale (TSI, MIU, MILF) sau a
galeriilor multi test
4. Despre Y. enterocolitica i Y. pseudotuberculosis sunt adevrate
urmtoarele afirmaii:
A. Microorganismele sunt lactoz-negative, catalaz pozitive i
oxidaz negative
B. n timpul incubaiei se multiplic la nivelul mucoasei
intestinale
C. Manifestrile clinice pot conduce la punerea eronat a
diagnosticului de apendicit acut
D. Prin inhalarea de nuclei de pictur pot determina apariia
pestei pneumonice primare
E. Se recomand vaccinarea anti-pest pentru cltorii care se
deplaseaz n zonele endemice
5. ntre caracterele de cultur i cele biochimice ntlnite la Proteus spp.
se numr:
A. fenomenul liniei de demarcaie
B. se poate dezvolta folosind citratul ca unic surs de carbon
C. pe medii multitest este glucoz pozitiv, lactoz negativ
D. nu produce H2S
E. pe medii de cultur formeaz colonii de tip S
13. 8. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Respectarea regulilor generale de igien reprezint principala
modalitate profilactic.
2. Se recomand n scop profilactic administrarea de antibiotice.
3. Au fost dezvoltate o serie de vaccinuri pentru combaterea acestor
infecii, dar acestea confer o protecie ce variaz ntre 50-80%.
4. Ciuma este eradicat, deci nu trebuie instituite msuri preventive
specifice.
5. Dup infecie, exist imunitate postinfecioas pe via.

14. Diagnosticul de laborator n


infecii produse de microorganisme
din genurile Vibrio i Pseudomonas.
(Gabriela-Loredana Popa, Alexandra
Limbu)

14. 1. Cuvinte cheie


Bacilul piocianic
Vibrion holeric
Ecthyma gangrenosum
Scaune riziforme
Oxidaz pozitivi
Pigmentogenez
14. 2. Introducere
14. 2. 1. Clasificare

Bacilii Gram negativi studiai n acest capitol sunt inclui n


genurilePseudomonas i Vibrio. Cea mai important specie a
genului Pseudomonas estePseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic,
bacilul puroiului albastru) una dinprincipalele bacterii oportuniste.
Genul Vibrio face parte din familia Vibrionaceae i cuprinde mai multe
specii cu patogenitate variabil pentru om.
14. 2. 2. Cale de transmitere

14. 2. 2. 1. Genul Vibrio


Vibrio cholerae se gsete n intestinul i n materiile fecale ale omului
bolnav de holer. Supravieuiete timp ndelungat n apele poluate i
pe obiectele contaminate. n mediul extern, prezena vibrionului
holeric este explicat prin contaminarea fecal, existnd i posibilitatea
unui ciclul de via extraintestinal. Vibrionii sunt introdusi n organism
pe cale digestiv fie prin alimente, fie pe calea minilor murdare.
14. 2. 2. 2. Genul Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa este un bacil comensal al tubului digestiv,
foarte rspndit n natur (agent de putrefacie a materiei organice

animale i vegetale). Este o bacterie creia i place apa. A fost izolat din
apa de ru, de piscin, termal etc. Este o bacterie rezistent n mediul
extern, supravieuind mai multe luni de zile i chiar multiplicndu-se n
ap la temperatura mediului ambiant. Contamineaz obiectele din
grupurile sanitare, produsele alimentare, chiuvetele. Este din ce n ce
mai frecvent izolat din mediul de spital, de pe diferite suprafee i
dispozitive medicale. Elaboreaz o piocin (bacteriocina) cu efect
inhibitor asupra unor tulpini din aceiasi specie.
14. 2. 3. Tablou clinic

14. 2. 3. 1. Tabloul clinic n infeciile produse de Vibrio cholerae


Holera este o toxiinfecie alimentar (TIA) acut, caracteristic omului.
Nu este o infecie invaziv, vibrionii nu difuzeaz n snge, ci rmn
cantonai la nivelul intestinului. Ader la epiteliul celular (adezine/pili),
se ataez de microvilii de la nivelul epiteliului ciliat, apoi colonizeaz
i invadeaz mucoasa. La acest nivel se multiplic i elibereaz variate
substane active biologic, incluznd enzime extracelulare, enterotoxine,
citotoxine, hemolizine (este vorba n special de enterotoxina holeric).
Dup o perioad de incubaie de 1-4 zile, boala debuteaz brutal cu
greuri, vrsturi, diaree abundent (10-30 litri/zi) nsoite de crampe
abdominale. Scaunele sunt apoase, riziforme (ap de orez), conin
mucus, celule epiteliale i numeroi vibrioni. Pierderile masive de ap i
electrolii prin scaune diareice i prin vrsturi conduc la deshidratarea
organismului, acidoz, hemoconcentratie marcat, colaps circulator i
decesul bolnavului. Rata mortalitii n lipsa tratamentului adecvat este
de aproximativ 25-50%.
14. 2. 3. 2. Tabloul clinic n infeciile produse de Pseudomonas
aeruginosa
Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa sunt patogene prin virulen i
toxinogenez. Este putin virulent pentru organismul sntos, dar
devine agresiv pentru cei imunodeprimai. Dintre factorii de virulen
ai bacilului piocianic se pot aminti prezena pililor (asigur adeziunea
de substratul specific), producerea unor proteaze (cu efecte
histotoxice), a unor lipaze, sinteza de hemolizine, exotoxine (exotoxina
A, de natur proteic, sintetizat n cantiti variabile n funcie de
tulpin mult mai toxic dect endotoxina) i a lipopolizaharidului din

peretele bacterian cu rol de endotoxin. Pseudomonas


aeruginosa poate produce infecii foarte variate, de la infecii
tegumentare superficiale pn la septicemii fulminante. n urma
contaminrii cu diferite soluii apoase sau dup not n piscin, la
persoanele cu reactivitate normal, infeciile sunt de obicei localizate
(foliculite, otite, infecii oculare etc.). Ar putea semnala prezena
piocianicului, culoarea albastr verzuie a pansamentelor, ca urmare a
proprietii de pigmentogenez prin producerea de piocianin
(albastru) i pioverdin (galben verzui fluorescent). Poate cauza o
varietate de infecii ale pielii, att localizate ct i difuze, poate avea o
evoluie grav, cu apariia de vezicule, care se sparg, aprnd o baz
necrotic i poate progresa n profunzime (ecthyma
gangrenosum) (Figura nr. 1). Pseudomonas a fost de asemenea implicat
n foliculit i forme greu de gestionat de acnee vulgar. Poate
determina apariia bacteriemiei n principal la pacienii
imunodeprimai. Condiii predispozante includ afeciuni maligne
hematologice, imunodeficiena n SIDA, neutropenie, diabet zaharat i
arsuri severe. Infeciile respiratorii cauzate apar aproape exclusiv la
persoanele cu un tract respirator inferior i un mecanism de aprare
sistemic compromise. Colonizarea tractului respirator inferior la
pacienii cu fibroz chistic (mucoviscidoz) este dificil de eradicat fiind
produs de un fenotip particular al speciei de Pseudomonas
aeruginosa. n lipsa tratamentului adecvat (dificil datorit rezistenei la
antibiotice), evoluia procesului infecios poate fi grav (80% din
septicemiile cu piocianic au evoluie letal).
14. 3. Diagnosticul de laborator n infecii produse de
microorganisme din genurile Vibrio i Pseudomonas
14. 3. 1. Diagnosticul de laborator n holer (Vibrio cholerae)
Genul Vibrio include mai multe specii. Cea mai bine cunoscut specie
esteVibrio cholerae (vibrionul holeric), mobil, aerob facultativ anaerob,
oxidaz pozitiv, rezistent la pH alcalin i sruri biliare. Produce toxina
holeric i respectiv holera.
Diagnosticul este bacteriologic, direct. Trebuie realizat ct mai urgent.
14. 3. 1. 1. Recoltarea i transportul p.p. respect regulile prezentate
anterior (vezi capitolul 4). Recoltm materii fecale sau/i lichid de
vrstur. Materiile fecale sunt apoase, riziforme (ca apa de orez), au

culoare verzuie, miros fetid, conin mucus. Cel mai bine nsmnm
rapid. Dac nu putem ajunge la laborator 1-3 ore folosim mediul de
transport Cary-Blair. Apa peptonat alcalin (pH 9-9,5) poate fi
utilizat ca mediu de transport dar i ca mediu de mbogire.
14. 3. 1. 2. Examinm microscopic p.p., n preparatul ntre lam i
lamel (nu frotiuri) (Figura nr. 2). Utilizm obiectivul 40. Nu se
evideniaz PMN. Exist vibrioni care prezint micri active.
14. 3. 1. 3. Cultivm (direct sau dup transport) n ap peptonat
alcalin (APA). Dup 6-8 ore la 35-37, trecem pe un mediu selectiv, cu
sruri biliare (TCBS i/sau BSA), prelevnd de la suprafaa mediului
lichid (unde ar putea s apar un vl). Dac examinm microscopic
(ntre lam i lamel) coninutul vlului am putea grbi diagnosticul.
14. 3. 1. 4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza
caracterelor
morfotinctoriale: bacili Gram-negativi; (Figura nr. 3)
de cultur: produc colonii de tip S(galbene, mari, 2-4 mm, pe TCBS)
sau colonii de tip S (rotunde, strlucitoare, transparente ca picturile
de rou, pe BSA);
biochimice: V. cholerae este oxidaz pozitiv; alte teste biochimice se
pot efectua n laboratorul de referin;
antigenice: utilizm ser anti-holeric O:1 (reacii de aglutinare pe
lam); n centrul de referin se confirm reacia pozitiv i se identific
serotipul (Ogawa, Inaba sau Hikojima); dac rezultatele sunt negative
se folosete i serul anti-holeric O:139;
testarea sensibilitii la bacteriofagi se poate utiliza n studii
epidemiologice sau n scop de cercetare (n laboratorul de referin).
14. 3. 1. 5. Antibiograma se realizeaz prin metoda difuzimetric
standardizat, pentru supravegherea apariiei unor tulpini rezistente la
medicamentele antimicrobiene (vezi capitolul 8).
14. 3. 2. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de genul
Pseudomonas
Genul Pseudomonas include mai multe specii, specia tip fiind
reprezentat dePseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic/bacilul
puroiului albastru). Sunt bacili Gram-negativi, aerobi,oxidaz pozitivi,
nesporulai, mobili (unul sau mai muli cili polari).

Discutm diagnosticul de laborator n infeciile tegumentelor. Este un


diagnostic bacteriologic, direct, etapele fiind similare celor discutate
anterior.
14. 3. 2. 1. Recoltarea i transportul p.p. (puroi) respect recomandrile
cunoscute. Macroscopic, p.p. poate avea un aspect sugestiv (culoare
albastr/galben-verzui fluorescent).
14. 3. 2. 2. Examinm microscopic dup realizarea a cel puin 2 frotiuri
(colorate cu A.M. i Gram). Notm prezena celulelor,
prezena celulelor inflamatorii (EX . PMN) i a bacililor gramnegativi, 1-5/0,5-1m, dispui n lanuri scurte, perechi sau
izolai. (Figura nr. 4)
14. 3. 2. 3. Cultivm pe medii de cultur obinuite, timp de 18-24 ore.
Bacilul piocianic se poate multiplica la temperaturi care variaz ntre 542C, ns dezvoltarea optim este la 30-37C. Recomandm utilizarea
unor medii de cultur selective (p.p. contaminat). Formeaz coloniide
tip S care se pigmenteaz, nsoindu-se de pigmentarea
mediului (EX . albastru sau galben-verde fluorescent) (Figura nr. 5).
Cultura poate avea un miros ca al florilor de tei.
14. 3. 2. 4. Identificm microorganismului pe baza caracterelor
morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, dispui n lanuri scurte,
perechi, izolai, relativ polimorfi. n culturi mai vechi pot aprea diferite
forme (filamentoase, cocoide). Mobilitatea se poate examina pe
preparatul proaspt, ntre lam i lamel. (Figura nr. 6) (Film nr. 1)
de cultur: produc colonii de tip S pigmentate (se remarc
ipigmentarea mediului, albastru sau galben-verde fluorescent).
Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei. Pe mediile cu
snge produc hemoliz. (Figura nr. 7)
biochimice: produce diferii pigmeni (de EX . piocianina/albastr i
pioverdina sau fluoresceina/galben-verzui fluorescent); degradeaz
oxidativ glucoza, nu fermenteaz lactoza; este oxidaz pozitiv. (Figura
nr. 8)
14. 3. 2. 5. Antibiograma este obligatorie i se realizeaz de obicei
prin metode difuzimetrice. Este bine ca testarea difuzimetric s se
nsoeasc de determinarea CMI.
14. 4. Direcii de cercetare

Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate


trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva
link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se
resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3863721/
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3622680/
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3534063/
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3360073/
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3461346/
6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3592444/
14. 5. Povestire adevrat
O pacient n vrst de 26 de ani se interneaz ntr-o secie de ORL,
avnd n antecedente un traumatism cranian (hematom epidural
temporal stang). n secia de terapie intensiv a necesitat intubaie
oro-traheal, ventilaie mecanic prelungit, apoi traheostomie ca
urmare a unei stenoze traheale aprute. La 24 de ore post intervenie
chirurgical pentru stenoz, s-a instalat ocul septic cu punct de
plecare pulmonar. S-a institutit terapie antibiotic cu spectru larg
(carbapenem + aminoglicozid + levofloxacin + vancomicina). Timp de
10 zile s-au susinut funciile vitale prin ventilaie mecanic i suport
vasopresor. Pe parcurs au aprut tulburari de ritm ventricular.
Disfuncia respiratorie s-a corectat la cateva zile, ocul septic s-a remis
treptat. Parametrii clinici i paraclinici s-au normalizat dup ncheierea
tratamentului antibiotic (aproximativ 14 zile).
Discuii
Tinnd cont de rapiditatea cunoscut a dobndirii rezistenei la
monoterapie antibiotic a bacilului piocianic, se utilizeaz n general
n tratament, asocierea mai multor antibiotice. ocul septic produs
de Pseudomonas aeruginosa se manifest cu o gravitate deosebit i
este dificil de controlat, chiar cu resursele terapeutice moderne ale
terapiei intensive.
14. 6. De reinut
Prezena anticorpilor n sngele pacienilor nu confer o eficacitate
protectiv.

n orice infecie, atunci cnd s-a dovedit agentul etiologic implicat,


antibiograma este obligatorie.
Educaia sanitar, mbuntirea gradului de sanitaie, al apei i al hranei
reprezint metode profilactice.
14. 7. Verificai-v cunotinele
1. Un brbat de 35 de ani cu infecie HIV dezvolt sepsis cu apariia
unei leziuni necrotice cu margini eritematoase la nivelul coapsei. Care
este cel mai probabil agent patogen responsabil de aceast leziune?
A. Clostridium perfringens
B. Bacillus anthracis
C. Enterococcus faecalis
D. Pseudomonas aeruginosa
E. Staphylococcus aureus
2. Apariia infeciei cu Vibrio cholerae poate fi prevenit prin:
A. mbuntirea gradului de sanitaie
B. Educaie sanitar
C. Chimioprofilaxie cu ageni antimicrobieni
D. Vaccinare cu DTP
E. Utilizarea Ig antitoxice
3. Diagnosticul de laborator n holer cuprinde:
A. Diagnosticul bacteriologic, direct
B. Recoltarea produsului patologic (materii fecale n general)
C. Identificarea microorganismului pe baza caracterelor
morfotinctoriale
D. Antifungigrama
E. Testul de hemaglutinare
4. Factorii de virulen ai bacilului piocianic sunt urmtorii, cu excepia:
A. Pilii
B. Producerea unor proteaze
C. Exotoxina A
D. Endotoxina
E. Listeriolizina O
5. Principalele afeciuni produse de bacilul piocianic sunt urmtoarele:
A. Foliculite
B. Apariia de vezicule la nivel dermic
C. Ecthyma gangrenosum

D. Diaree sangvinolent
E. Ascita produs brusc
14. 8. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Vaccinul reprezint doar o msur adiional pe lng educaia
sanitar.
2. Nu este nevoie de vaccinare deoarece holera este o infecie
eradicat, deci nu reprezint o ameninare.
3. Holera este o simpl toxiinfecie alimentar care se remite
spontan.
4. Colonizarea cu piocianic apare doar la pacienii spitalizai.
5. Rspndirea de Pseudomonas aeruginosa poate fi cel mai bine
controlat prin respectarea procedurilor adecvate de izolare i a
diverselor tehnici de asepsie.

15. Diagnosticul de laborator n


infecii produse de bacili Gram
pozitivi. (Gabriela-Loredana Popa,
Alexandra Limbu)

15. 1. Cuvinte cheie


Germen anaerob
Exototin
Fals membran
Pustul malign
Risus sardonicus
Toxiinfecie alimentar de tip toxic
15. 2. Introducere
15. 2. 1. Clasificare

Bacilii Gram pozitivi studiai se pot clasifica n bacili nesporulai


(ex.Corynebacterium diphteriae, Listeria spp.) i respectiv bacili Gram
pozitivi sporulai (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.). Exist i ali
bacili Gram-pozitivi.
15. 2. 2. Cale de transmitere

15. 2. 2. 1 Bacili Gram-pozitivi nesporulai


Specia tip a genului Corynebacterium este C. diphteriae, agentul
etiologic al diferiei. Genul cuprinde i alte specii, care n anumite
condiii, pot genera infecii umane. Corynebacterium diphteriae poate
fi identificat n leziuni dermice (la nivel tegumentar), precum i n
tractul respirator superior. Transmiterea bacteriei se realizeaz pe cale
respiratorie sau prin contact direct, cu zonele contaminate.
Listeria monocytogenes este un microorganism patogen, capabil s se
multiplice n macrofage, celule epiteliale, fibroblaste. Sunt bacterii
rspndite n natur (la nivelul solului, plantelor). Pot fi izolate din
alimente (ex. brnzeturi) i identificate n lapte i produse lactate, carne
crud sau insuficient prelucrat. Se transmite omului prin consumul de
alimente contaminate. Listerioza este o zoo-antroponoz. Infecia la

om evolueaz de multe ori inaparent i deseori apare n mod


accidental.
15. 2. 2. 2 Bacili Gram-pozitivi sporulai
Bacillus anthracis este un germen ubicuitar, sporii i confer rezisten.
Este agentul etiologic al unei zoo-antroponoze care afecteaz
ierbivorele. Se gsete n esuturile i umorile animalelor bolnave. Este
eliminat prin dejecii i contamineaz mediul extern. Germenul
sporuleaz pe sol i supravieuiete zeci de ani.
Clostridium tetani, germen anaerob, specie patogen prin toxinele
neurotrope elaborate, produce tetanosul. Sporii ptrund n organism
prin intermediul unor plgi tetanigene (asigur condiii de
anaerobioz necesare multiplicrii germenului).
Clostridium botulinium nu se multiplic n organism ci n alimente
unde produce o exotoxin. Infecia (botulismul) apare prin ingestia de
alimente care conin toxina botulinic preformat. Exist i unele
excepii.
Clostridiile gangrenei gazoase cresc pe medii simple, n condiii de
strict anaerobioz. Sunt ubicuitare, prezente n mod normal n tractul
digestiv al omului sau al animalelor ca forme vegetative. Eliminate pe
sol prin dejecte, sporuleaz. Sursa principal pentru contaminare este
reprezentat de sol.
15. 2. 3. Tablou clinic

15. 2. 3. 1 Tabloul clinic n difterie


Frecvent infecia este localizat la poarta de intrare (n general la
nivelul amigdalelor) determinnd o angin. La nivelul tractului
respirator (laringe, faringe, nas) se produce o laringit cu obstrucia
cilor respiratorii. Nu are capacitate invaziv, se multiplic la poarta de
intrare; determin un proces inflamator cu necroz i exsudat. Toxina
elaborat local induce i apariia unei structuri compus din fibrin,
leucocite, eritrocite, celule epiteliale respiratorii distruse i bacterii,
denumit falsa membran (Figura nr. 1), foarte aderent de esutul
subiacent; smulgerea ei determin sngerare. Din cauza prezenei
acestor membrane la nivelul cilor respiratorii, exist pericol de asfixie.
La distan, toxina circul prin snge i se fixeaz pe miocard,

suprarenale, sistem nervos sau la nivel renal. Cu ct diagnosticul este


mai tardiv, cu att rata mortalitaii prin difterie crete.
15. 2. 3. 2 Tabloul clinic n infeciile produse de Listeria spp.
Listerioza este o zoo-antroponoz. Infecia uman apare accidental i
evolueaz inaparent, n foarte multe cazuri. n mod normal, sistemul
imunitar elimin infecia. Dac sistemul imun este deficitar sau
compromis, manifestrile sistemice ale infeciei se pot dezvolta. La
nou-nscut contaminarea se produce transplacentar. Dup natere, n
primele ore, poate exista septicemie cu multiple localizri secundare i
afectare neuro-meningean. La gravid, infecia este frecvent
inaparent cu manifestri nespecifice, de tip gripal, febr,
simptomatologie n sfera urinar, digestiv. La adult, listerioza se poate
manifesta ca meningoencefalit. Calea gastrointestinal este
considerat cea mai important cale de ptrundere asociat
consumului de alimente contaminate (EX . brnz din lapte
nepasteurizat).
15. 2. 3. 3 Tabloul clinic n infeciile produse de Bacillul anthracis
Simptomatologia depinde de localizarea infeciei i poate exista o
perioad de 1 zi sau mai mult de 2 luni pn la apariia manifestrilor.
La om n funcie de localizarea manifestrilor clinice putem vorbi
despre:
a. Antraxul cutanat,cunoscut sub numele de pustul malign, apare
dup contactul direct cu solul contaminat cu spori (cel mai frecvent).
La locul ptrunderii sporilor (EX . leziune/traumatism), dupa o
perioada de 4-5 zile, apare o papul, care ulterior se transform n
vezicul. Dupa ce vezicula se sparge, la baza ei se observ o crust de
culoare neagr, inconjurat de o zon de edem (Figura nr. 2).
Netratat, infecia poate disemina, ducnd la generalizarea procesului
infecios (septicemie).
b. Antraxul pulmonar, apare ca urmare a inhalrii sporilor; acetia se
cantoneaz la nivelul alveolelor pulmonare, se transform n bacili care
elibereaz exotoxina. Iniial simptomele sunt uoare i nespecifice,
similare unei afeciuni respiratorii virale. Ulterior, dup 1-3 zile, apar
semne de insuficien respiratorie acut (febr, dispnee, hipoxie,
hipotensiune). Pneumopatia acut are adesea o evoluie grav.

c. Antraxul gastrointestinal apare prin ingerarea crnii provenit de la


un animal infectat. Manifestrile clinice includ febr, grea, vrsaturi,
dureri abdominale, diaree sanguinolent, deshidratare. Este rar la om,
dar insoit de o mortalitate mare.
15. 2. 3. 4 Tabloul clinic n infeciile produse de genul Clostridium
Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin
multiplicare la poarta de intrare i toxinogenez. Elaboreaz o
exotoxin neurotrop ce ajunge n sistemul nervos pe calea nervilor
periferici i secundar pe cale sanguin sau limfatic. Acioneaz la
nivelul centrilor motori blocnd eliberarea mediatorilor de glicin i
acid gamma amino butiric (care au rol inhibitor). Apare paralizia
spastic (spasme severe, dureroase, ale musculaturii striate, iniial n
zona contaminat). Contractura musculaturii feei are un aspect
caracteristic risus sardonicus (fruntea ncreit, pleoapele nchise pe
jumtate, colurile gurii trase n jos) i a muchilor masticatori
manifestat prin trismus(gura nu se mai deschide) (Figura nr. 3). Pe
fondul contracturii tonice, orice stimul extern determin apariia de
crize de contracturi musculare paroxistice foarte dureroase. Starea de
contien este pstrat. Moartea se produce prin asfixie ca urmare a
spasmului muchilor respiratori.
Botulismul apare prin ingestia de alimente care conin toxina
(toxiinfecie alimentar de tip toxic / toxin preformat n aliment).
Toxina botulinic este substana biologic cea mai toxic cunoscut.
Doza letal pentru om este de circa 1-2 g. Dup ingestie, se resoarbe
la nivel intestinal i ajunge n circulaie. Acioneaz la nivelul jonciunii
neuromusculare blocnd eliberarea de acetilcolin. Apare paralizia
flasc, cu o evoluie descendent. ncepe la extremitatea cefalic,
afectnd muchii globilor oculari, cu diplopie, hipersecreie lacrimal i
ajunge pan la paralizia musculaturii respiratorii. Decesul survine prin
asfixie. n primele 6 luni de via poate aprea botulismul infantil, ca o
consecin a formrii toxinei botulinice prin germinarea la nivel
intestinal a sporilor ingerai (EX prin consum de miere). La persoanele
care folosesc droguri injectate intravenos sau prezint leziuni
contaminate cu pmnt, poate aprea botulismul plgilor.
Gangrena gazoas este produs de dou sau mai multe dintre
urmtoarele specii: C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum,

C. sporogenes etc. Poarta de intrare pentru spor este tegumentul


contaminat (leziuni/traume). Anaerobioza determin germinarea
sporilor, formele vegetative se multiplic, fermenteaz zaharuri i se
formeaz gaz. Leziunea este nsoit de un edem dur, crepitant
(datorit prezenei de gaz) i necroza esuturilor. Diseminarea infeciei
este favorizat de distensia tisular cu obstrucia mecanic a
structurilor vasculare n conjuncie cu sinteza de toxine. Evoluia n 2080 % din cazuri este fatal.
15. 3. Diagnosticul de laborator n infecii produse de bacili Gram
pozitivi
15.3.1. Diagnosticul de laborator n difterie
Genul Corynebacterium include mai multe specii.
Grupul Corynebacterium diphtheriae cuprinde speciile C. diphtheriae, C.
pseudotuberculosis i C. ulcerans. Tulpinile lizogene (infectate cu
bacteriofagi tox+) sintetizeaz toxina difteric; aceasta are efecte
importante la nivel cardiac (miocardit), nervos (demielinizare), renal
(necroz tubular), suprarenalian, muscular i hepatic.
Diagnosticul de laborator n difterie este bacteriologic (direct) i
trebuie realizaturgent; fixarea toxinei pe celule int este ireversibil,
astfel nct decizia trebuie luat foarte rapid (acesta este i motivul
pentru care cel mai bine este ca vaccinarea s se realizeze
corespunztor i s existe prevenirea infeciei).
Se pornete de la un diagnostic de suspiciune (clinic) i se realizeaz
diagnosticul de laborator. Examinarea frotiurilor din p.p. n contextul
clinic poate conduce la recomandarea de instituire a tratamentului
(administrare de Ac antitoxin), imediat, fr a atepta finalizarea
diagnosticului bacteriologic.
1. Recoltarea i transportul p.p. respect recomandrile
obinuite (vezi cap. 4), dar exist i anumite lucruri de atenie. Trebuie
s recoltm secreii de la nivelul faringelui i secreii nazale. Dac
exist o fals membran se recomand detaarea cu grij a acesteia
i recoltarea secreiei. Se vor utiliza cel puin 4 tampoane, 3 pentru
recoltarea secreiilor faringiene i al 4-lea pentru recoltarea secreiilor
nazale. Un tampon va fi utilizat pentru realizarea frotiurilor, al doilea se
va utiliza pentru cultivare pe diferite medii de cultur solide, selective
i neselective (EX . geloz snge, Loeffler i medii cu telurit de

potasiu). Al treilea i al patrulea tampon sunt introduse ntr-un mediu


de mbogire (OST, ou-ser-telurit). (Figura nr. 4)
2. Examenul microscopic este foarte important. Atunci cnd contextul
clinic este sugestiv, n baza acestui examen se poate ncepe
tratamentul (leucocite, bacili Gram-pozitivi, cu capetele mai umflate,
aezai n V, L) (Figura nr. 5).
3. Cultivarea a avut loc i continum diagnosticul, chiar dac
tratamentul a fost nceput. Trebuie s obinem colonii izolate,
respectiv o cultur pur, s le identificm i s punem n eviden
capacitatea toxigen. Coloniile caracteristice apar la 24-28 h pe mediul
cu telurit de potasiu (colonii de tip R pentru biotipul gravis).
4. Identificarea microorganismului se realizeaz pe baza mai multor
caractere:
Caractere morfotinctoriale:bacili Gram-pozitivi, polimorfi, cu capete
umflate, aezai n V, L sau sub form de litere chinezeti;
Caractere de cultur: produc colonii de tip Ssau R, n funcie de
biotip (R pentru gravis); pe mediul Loeffler (electiv) coloniile apar n 18
ore (albe, lucioase, bombate, semicremoase);
Caractere biochimice: diferenierea biotipurilor se realizeaz prin testul
catalazei (pozitiv), ureazei (negativ), reducerea nitrailor i fermentarea
unor zaharuri;
Caractere antigenice: utilizm ser cu Ac anti-toxin difteric pentru
identificarea producerii toxinei (testul ELEK); (Figura nr. 6)
Caractere de patogenitate: testarea producerii de toxin pe celule
Vero sau prin alte metode (EX . PCR pentru subuniti ale
genei tox+etc.).
5. Antibiograma se poate realiza prin metoda difuzimetric
standardizat (vezi cap. 8), n special n scopul supravegherii apariiei
unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene sau n scop de
cercetare. De regul, tulpinile deC. diphtheriae sunt sensibile la
penicilin sau eritromicin.
15. 3. 2. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Listeria
spp.
Genul cuprinde mai multe specii dintre care cea mai important specie
esteListeria monocytogenes (poate produce infecii variate animale i
umane). Sunt bacili fini, Gram pozitivi (Figura nr. 7), aerobi facultativ

anaerobi, mobili la 25C; se dezvolt mai bine la 20-30C sau chiar la


temperatura frigiderului (mbogire la rece).
Diagnosticul de laborator n infeciile cu L.
monocytogenes este bacteriologic, direct.
1. Recoltarea i transportul p.p. (snge, lichid amniotic, placent, esut
fetal etc.) se face conform regulilor discutate anterior (vezi capitolul 4).
2. Examinarea microscopic a p.p. permite evidenierea unor bacili sau
cocobacili Gram pozitivi, dispui izolat, n perechi sau n lanuri scurte,
intra sau extracelular.
3. Cultivarea se face pe medii complexe. L. monocytogenes se poate
multiplic la temperaturi ce variaz ntre 2-45C (cel mai bine la 2030C). Sunt necesare medii selective atunci cnd p.p. este potenial
contaminat.
4. Identificm microorganismul pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: bacili fini Gram-pozitivi, dispui separat sau
grupai n palisade, n perechi sau n form de litere (asemntor
corynebacteriilor);
de cultur: formeaz colonii de tip S, cu aspect de picturi de rou;
pe agar-snge, coloniile sunt nconjurate de b-hemoliz; (Figura nr. 8)
biochimice: produce b-hemoliz; fermenteaz diferii carbohidrai;
antigenice: folosim seruri cu Ac cunoscui pentru identificarea
tulpinilor de Listeria monocytogenes; serotiparea este util n scop
epidemiologic.
5. Antibiograma poate fi necesar i se realizeaz de obicei prin
metode difuzimetrice. n cazul infeciilor grave se vor determina CMI i
CMB (vezi cap. 8).
15. 3. 3. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Bacillus
anthracis
Din genul Bacillus mai frecvent implicate n patologia uman sunt B.
anthracis,B. cereus i B. subtilis. B. anthracis se prezint sub form de
bacili Gram pozitivi, de dimensiuni mari, imobili, sporulai, cu sau fr
capsul, aerobi facultativ anaerobi.
15. 3. 3. 1. Diagnosticul de antrax pornete de la datele clinice i
epidemiologice. Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct i
trebuie realizat ct mai rapid.

1. Produsul patologic recoltat i transportat este reprezentat cel mai


frecvent de secreii de la nivelul leziunilor cutanate (n funcie de forma
clinic - cutanat/visceral). Dac transportul va dura peste o or,
asigurm temperatura de transport (2-8C). Trebuie luate msuri de
biosecuritate !
2. Examinm microscopic frotiurile din p.p. (colorm 2 frotiuri i unul l
reinem, ca rezerv) i putem remarca structuri de esut, PMN (relativ
rare) i bacili Gram pozitivi, cu capetele tiate drept, de dimensiuni
mari (1,5mm/10mm), capsulai, dispui izolat, n perechi sau lanuri
scurte, inclui ntr-o capsul comun. (Figura nr. 9)
3. Cultivm pe geloz nutritiv sau geloz snge, n condiii de
aerobioz, la de 37C (se poate multiplica i la 15-42C). Pot fi
necesare medii selective.
4. Identificm microorganismului pe baza mai multor caractere:
Caractere morfotinctoriale: bacili Gram-pozitivicu dimensiuni mari,
dispui n lanuri; poate ncepe procesul de sporogenez (spor oval,
situat central, mai mic dect bacilul);
Caractere de cultur: produc colonii de tip R, mari, de 2-5 mm
(marginile neregulate, cu prelungiri laterale au dus la asemnarea cu
capul de meduz sau coama de leu); (Figura nr. 10)
Caractere biochimice: Bacillus anthracis este catalaz pozitiv,
produce lecitinaz i este sensibil la penicilin;
Caractere de patogenitate: testarea patogenitii la oarecele alb.
5. Antibiograma nu este necesar. Bacillus anthracis este sensibil la
penicilin, eritromicin, tetraciclin, cloramfenicol, ciprofloxacin etc
(atenie n atac bioterorist).
15. 3. 3. 2. Diagnosticul imunobiologic (IDR cu antraxin)
Este important punerea diagnosticului de antrax la animale (n special
ierbivore).
15. 3. 4. Diagnosticul de laborator n infecii produse de
genul Clostridium
Genul Clostridium include mai multe specii care se gsesc n intestinul
animalelor; se elimin n mediul extern i sporuleaz. Sunt bacili Gram
pozitivi, de dimensiuni mari, aezai n perechi sau lanuri, mobili cu cili
peritrichi (C. perfringens este capsulat). (Figurile nr. 11 i 12)

Diagnosticul de laborator al infeciilor cu germeni anaerobi este destul


de dificil, este costisitor i sunt necesare att dotri speciale ct i un
personal medical experimentat. Ca o particularizare a acestui
diagnostic, n legtur cu infeciile clostridiente, prezentm
succesiunea etapelor.
1. Prima etap este esenial. Dac nu sunt meninute condiiile
deanaerobioz, nu avem cum s realizm diagnosticul de laborator.
2. Produsul patologic poate s aib un miros putrid. Constatm
prezena unor fragmente de esut necrotic, a unor secreii de culoare
nchis, existena de snge i puroi n plag etc.
Examenul microscopic are rol orientativ (cu toate acestea, este un
examen care poate fi realizat n orice laborator; multe dintre
laboratoare nu pot face dect acest examen). C. tetani are 0,5-2mm/218mm (dac sporuleaz, sporul este rotund, localizat terminal),
C. botulinum are 0,5-1,5mm/3-20mm (dac sporuleaz, sporul este
oval, localizat central sau subterminal) n timp ce C. perfringens are 0,51,5mm/1,5-19mm (dac sporuleaz, sporul este oval, localizat
subterminal). Examenul microscopic poate servi la alegerea terapiei
antimicrobiene.
3. Pentru cultivarea p.p. pregtim minim 3 medii de cultur (bulion VF,
geloz-snge plus neomicin incubat n anaerobioz i geloz-snge
incubat n aerobioz). Incubarea n condiii de anaerobioz dureaz
24-48 de ore la 35-37C. Pentru c am incubat n aerobioz i
anaerobioz, putem evalua n funcie de apariia coloniilor dac sunt
germeni aerobi sau anaerobi.
4. Identificarea se realizeaz pe baza caracterelor:
morfotinctoriale:baciliGram-pozitivi;am putea observa fenomenul
de sporogenez;
de cultur: speciile mobile (majoritatea) formeaz colonii de tip S,
cu margini ondulate i tendin de invadare a mediului; dac a avut loc
inocularea i n profunzimea mediului, coloniile au aspect
pufos;Clostridium perfringens (imobil) formeaz colonii de dimensiuni
mari, de tip S, rotunde, cu margini regulate, convexe (pot avea i
aspect R);
biochimice: testm producerea de lecitinaz; (Figura nr. 13) pentru
tulpinile lecitinaz-pozitive se pot verifica mobilitatea, fermentarea

lactozei, producerea de lipaz, ureaz, hidroliza gelatinei, digestia


crnii etc.; clostridiile sunt sensibilie la vancomicin i rezistente la
colistin;
antigenice:
demonstrarea prezenei tetanospasminei prin seroneutralizare la
oareci,
testarea prezenei anti-toxinei tetanice (titrul protectiv0,01UAI/ml),
demonstrarea prezenei toxinei botulinice n alimente, materii
fecale, ser sau n medii de cultur [prelevm cultur din bulion VF,
centrifugm i supernatantul l mprim n 2 tuburi; un tub l nclzim
la 100C; rcim; inoculm intraperitoneal la dou loturi de oareci;
dac oarecii injectai cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de
toxina botulinic (pentru c toxina botulinic este termosensibil);
prezena toxinei botulinice poate fi confirmat prin seroneutralizare
(protejm un oarece cu anti-toxin de tip A i un alt oarece cu antitoxin de tip B, apoi i injectm cu p.p.; dac animalul seroprotejat cu
anti-toxina de tip A supravieuiete iar cellalt animal moare cu semne
caracteristice pentru botulism, n mediul de cultur a existat C.
botulinum de tip A).
5. Antibiograma nu se recomand, n infeciile cu bacili Gram-pozitivi
sporulai (lucrurile difer n cazul germenilor anaerobi Gram-negativi).
Clostridiile sunt sensibile la penicilin, cefalosporine, vancomicin,
tetracicline, metronidazol etc, ns tratamentul este mai complex.
15. 4. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate
trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva
link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se
resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24477182
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24406014
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24471528
4. http://www.cdc.gov/tetanus/about/causes-transmission.html
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22120198
6. http://www.cdc.gov/nczved/divisions/dfbmd/diseases/botulism/

7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24340950
15. 5. Povestire adevrat
Copil n vrst de 1 an i jumtate, nevaccinat, este adus de mam la
spital cu edem generalizat (de aproximativ 6 zile). Mama relateaz c
n urm cu 15 zile a avut un episod febril, dureri n gt i convulsii
tonico clonice generalizate. A fost suspectat ca avnd difterie i i s-a
administrat ser antidifteric. A primit tratament intravenos cu antibiotice
i steroizi, cu ameliorarea simptomatologiei.
La acel moment s-au efectuat investigaii imagistice. Radiografia a
artat prezena unei cardiomegalii cu infiltrate bilaterale, iar ecografia
abdominal a identificat o uoar hepatomegalie cu lichid de ascit.
Paraclinic, hepatic, n limite normale.
n sfera urinar, analizele au artat proteinurie cu hematurie
microscopic i o uoar cretere a creatininei. Examinarea sistemului
nervos a fost normal.
Diagnostic: miocardit i glomerulonefrit post difteric. A urmat
tratament cu furosemid, enalapril, imunoglobuline intravenos, suport
inotrop i restricie de lichide. Simptomatologia s-a remis sub
tratament.
La 4 sptmni copilul prezint slabiciune n membrele superioare i
inferioare, cu acumularea de secreii bucal. Examinarea EMG
evideniaz o neuropatie demielinizant. Primete suport ventilator.
Diagnostic: polineuropatie difteric.
Treptat, slabiciunea diminueaz, glomerulonefrita i miocardita
rspund bine la tratament. Primete BCG, DTP, HVB, iar mama este
sftuit n privina respectrii schemei complete de vaccinare.
Discuii
Prevenirea poate fi mai eficient dect tratarea. Vaccinarea ar fi
impiedicat apariia acestor complicaii i ar fi protejat copilul de o
suferin ndelungat.
15. 6 De reinut
Imunizarea activ a copiilor (vaccinarea i revaccinarea) permite
obtinerea unor nivele protective de anticorpi
Semnele i simptomele sunt foarte variate i depind de localizarea
infeciei

Cu ct diagnosticul de certitudine este mai tardiv, cu att rata


mortalitaii crete.
15. 7 Verificai- v cunotinele
1. Despre Corynebacterium diphteriae urmtoarele afirmaii sunt
adevrate:
A. Este un bacil Gram- pozitiv nesporulat
B. Se gsete n esuturile i umorile animalelor bolnave
C. Poarta de intrare poate fi reprezentat de tractul respirator (faringe,
nas)
D. Diagnosticul n difterie este un diagnostic serologic
E. Tulpinile sunt sensibile la antibiotice folosite uzual n tratament (EX .
penicilin)
2. Listerioza:
A. Este o zoo-antroponoz
B. Infecia uman apare accidental i foarte frecvent evolueaz
inaparent
C. Este frecvent asociat cu consumul de alimente contaminate
D. Calea respiratorie reprezint cea mai important cale de ptrundere
E. La aduli poate aprea meningoencefalita
3. Manifestrile clinice ale infeciei determinate de bacilul antraxului
sunt reprezentate de:
A. Pustula malign ce apare la nivelul unui traumatism cutanat
B. Prezena unei cruste de culoare neagr nconjurat de o zona de
edem
C. Falsa membran de culoare gri-maronie
D. Paralizie respiratorie
E. Insuficiena respiratorie acut ( febr, dispnee, hipoxie, hipotensiune)
4. Botulismul:
A. Este o toxiinfecie alimentar de tip toxic
B. Se caracterizeaz prin paralizie spastic
C. Se realizeaz diagnostic bacteriologic pentru identificarea agentului
patogen
D. Poate afecta persoanele care folosesc droguri injectate intravenos
E. Decesul poate surveni prin asfixie
5. Toxina tetanic elaborat n infecia cu Clostridium tetani are
urmtoarele caracteristici:

A. Blocheaz eliberarea mediatorilor (glicin i acid gama aminobutiric)


B. Nu depete bariera hematoencefalic, nu ptrunde n SNC
C. Genereaz spasme ale musculaturii din zona contaminat
D. Este cea mai puternica otrav cunoscut
E. Titrul protectiv este 0,01UAl/ml
15. 8 Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Vaccinurile nu au efect i este numai o coincidena faptul c
incidena anumitor boli a sczut dupa nceperea campanilor de
vaccinare.
2. Ratele sczute de vaccinare duc la rate mrite ale bolii.
3. Sunt prini care gndesc: copilul meu nu are nevoie de vaccinare
deoarece bolile pe care le previn vaccinurile au fost eradicate.
4. Este mai bine s faci boala dect s te vaccinezi.
5. Sistemul imun poate fi copleit de vaccinuri.

16. Diagnosticul de laborator n


infecii produse de Mycobacterium
tuberculosis. (Gabriela-Loredana
Popa, Cristina-Iulia Mitran, MdlinaIrina Mitran, MI Popa)
16. 1. Cuvinte cheie
BAAR
Ziehl Neelsen
Lwenstein Jensen
Ritm lent de multiplicare
TB activ/ TB latent
IDR cu PPD
16. 2. Introducere
16. 2. 1. Clasificare
Genul MYCOBACTERIUM include peste 140 de specii i subspecii
diferite. Cei mai cunoscui reprezentani sunt M. tuberculosis i M.
leprae. n afara acestor specii definite nainte de 1900 exist
numeroase specii de mycobacterii netuberculoase (considerate iniial
drept saprofite). De fapt sunt microorganisme condiionat patogene; n
condiia n care apar deficiene ale sistemului imun pot fi implicate n
patologia uman.
16. 2. 2. Calea de transmitere
Principala surs de infecie este reprezentat de pacienii cu
tuberculoz (TB)pulmonar. Nucleii de pictur expectorai sunt
particule de 1-3 m, care poart bacili acid-alcool rezisteni (BAAR).
Fiind de dimensiuni foarte mici pot traversa barierele de aprare ale
organismului i pot ajunge la nivel alveolar. Intraalveolar bacilii sunt
fagocitai de macrofage i celule dendritice, dar unii dintre ei
supravieuiesc i se multiplic la acest nivel. naintea dezvoltrii
imunitii specifice, mycobacteriile pot disemina la nivelul ganglionilor
limfatici i pot ajunge n majoritatea organelor. De obicei nu are loc o

multiplicare necontrolat la niveul ficatului, splinei sau mduvei


hematogene. Cei mai muli dintre indivizi dezvolt un rspuns
imun celular eficient care mpiedic multiplicarea suplimentar a
bacililor i leziunile se vindec. Dei o treime din populaie este
infectat cu M. tuberculosis (TB latent) doar 10% dezvolt boala. n 5%
din cazuri TB activ apare n primul an de la infecie i n 5% la un
moment dat n cursul vieii. Un rol important l deine imunitatea
gazdei. Pacienii cu TB latent nu reprezint o surs de infecie.
16. 2. 3. Tablou clinic
Cea mai frecvent form de TB este cea pulmonar, dar majoritatea
organelor pot fi afectate. Manifestrile clinice sunt nespecifice, depind
de gazd, de microorganism i interaciunea dintre acestea. Debutul
bolii adeseori este insidios. Se caracterizeaz prin tuse, dispnee,
subfebr, scdere ponderal i transpiraii nocturne. Cel mai frevent
tusea este productiv, uneori poate fi nsoit de hemoptizie. Pacienii
cu TB latent sunt asimptomatici.
16. 3. Diagnosticul de laborator
16. 3. 1. Principii generale
Discutm aspectele legate de diagnosticul de laborator (microbiologic)
n infeciile produse de M. tuberculosis, varianta hominis. Tuberculoza
(TB) poate avea diferite localizri. Cea mai frecvent form este TB
pulmonar. Epidemiologic, pacienii cu TB pulmonar (elimin prin
sput BAAR) reprezint principala surs de
infecie. Diagnosticul, tratamentul corect i complet al acestor
pacieni este esenial.
Diagnosticul poate fi sugerat clinic, paraclinic (EX . radiologic), de alte
elemente de laborator, dar trebuie confirmat prin izolarea i
identificarea M. tuberculosis. O prim etap n diagnostic este
examinarea frotiului din p.p. (cel mai adesea sput) folosind coloraia
Ziehl Neelsen. Trebuie avut n vedere cM. tuberculosis este un
microorganism, care se dezvolt lent pe medii complexe. Actual prin
utilizarea metodelor de cultur rapide i a tehnicilor moleculare
diagnosticul este realizat ntr-un timp mult mai scurt.
16. 3. 2. Diagnosticul bacteriologic

Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. Datele obinute n


cadrul diagnosticului imunobiologic i serologic pot completa
informaiile i pot fi utile.
16. 3. 2. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic
Recoltarea i transportul p.p. se realizeaz respectnd o serie de reguli,
discutate anterior cu mare atenie i respectnd toate normele
privindprotecia personalului medical (vezi capitolul 4). Principalul
p.p. este sputa; se pot recolta i lichid de spltur bronic, LCR,
urin, lichide recoltate prin puncie articular, probe obinute prin
biopsie, puroi etc. Sputa trebuie decontaminat (de EX . prin tratare
cu NaOH 4%) i neutralizat (cu acid) n vederea realizrii etapelor 2 i
3. Este important ca pacientul s fie instruit de personalul medical
pentru ca p.p. s fie recoltat ntr-un mod corespunztor.
16. 3. 2. 2. Examinarea microscopic
Examinarea microscopic a p.p. include minim 3 frotiuri (colorate A.M.,
Gram i Ziehl Neelsen). Examinm i notm prezena celulelor de la
nivelul tractului respirator inferior (EX . macrofage alveolare),
prezena celulelor inflamatorii(PMN) i prezena BAAR. n coloraia
Ziehl Neelsen mycobacteriile tuberculoase apar ca bacili subiri, drepi,
de 0,4/3m, roii pe fond albastru (celelalte structuri au culoare
albastr) (Figura nr. 1). O alt modalitate de examinare a frotiului este
utiliznd coloraia fluorescent (IF). n acest caz se observ bacilii de
culoare galben fluorescent pe un fond galben pal (dac se folosete
permanganat de potasiu) (Figura nr. 2).
Rezultatele examenului microscopic (IF/Z-N) trebuie s fie cuantificate
prin numrul de BAAR n raport cu numrul de cmpuri examinate (1030 cmpuri n cazul IF, 100-300 n cazul Z-N). De EX . nregistrarea a 19 BAAR/10 cmpuri (n IF) sau 1-9 BAAR/100 de cmpuri (Z-N) ne
permite s notm n buletinul de analiz 1+ (maxim sunt 4+, la peste 9
BAAR/1 cmp/Z-N). Acest mod de notare permite s comparm
rezultatele ntre laboratoare diferite sau rezultatele unui bolnav n
cursul tratamentului. Examenul microscopic negativnu
exclude diagnosticul de TB.
16. 3. 2. 3. Cultivarea
Cultivarea se poate face pe diferite medii de cultur (lichide,
semisolide i solide, pe baz de ou, de EX . mediul Lwenstein-

Jensen sau agar, tip Middlebrook ). La compoziia mediului L-J se


adaug verde malachit (inhib multiplicarea unor microorganisme).
Pentru izolare este necesar o atmosfer de 8-10% CO2. Incubarea se
face la 35-. Este foarte important s examinm mediile n fiecare zi (n
prima sptmn dup inoculare), ulterior sptmnal pn la
mplinirea a 6-12 sptmni (M. tuberculosis are o rat de diviziune de
12-27 ore). Exist i metode de cultur rapide. Cu ajutorul unor astfel
de sisteme se poate detecta creterea M. tuberculosis mult mai rapid
dect pe mediile tradiionale (n 4-25 zile).
16. 3. 2. 4. Identificarea
Identificarea microorganismului se realizeaz pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: BAAR (Figura nr. 3);
de cultur: M. tuberculosis i M. bovis-BCG formeaz colonii de tip R,
rugoase, grunjoase, nepigmentate (Figura nr. 4);
biochimice: testul producerii de niacin, testul reducerii nitrailor i
testul catalazei la i dup nclzire la ;
antigenice (se pot examina n centre de referin);
de patogenitate: M. tuberculosis este patogen pentru cobai;
alte teste:
o teste care au la baz analiza caracterelor fenotipice moleculare,
de EX . studiul cromatografic al acizilor grai din peretele celular, sau
genotipice (PCR, sonde nucleotidice);
o tehnicile de amplificare a acizilor nucleici au ca principiu amplificarea
unor regiuni specifice; se poate folosi att cultura ct i produsul
patologic;
o detectarea antigenelor mycobacteriene n urin. Se poate detecta n
urin lipoarabinomananul (LAM) prin tehnica ELISA. Metoda s-a
dovedit a fi util mai ales la pacienii coinfectai HIV-TB;
o teste ce utilizeaz anumii mycobacteriofagi.
16. 3. 2. 5. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice
Testarea sensibilitii la medicamentele anti-TB este necesar; se
realizeaz conform recomandrilor Programului Naional de Prevenire,
Supraveghere i Control a TB. Se pot utiliza metoda proporiilor,
metoda rapoartelor de rezisten etc. S-au dezvoltat tehnici
moleculare prin care sunt identificate mutaiile specifice responsabile
de apariia rezistenei (EX . Genotype MTBDRplus, Xpert MTB/RIF,

etc). Alte tehnici au ca principiu metode colorimetrice, folosirea


mycobacteriofagilor.
16. 3. 3. Diagnosticul imunobiologic
Diagnosticul imunobiologic presupune evaluarea rspunsului imun
de tip celular. Se utilizeaz IDR cu PPD. n anumite situaii se poate
utiliza IGRA (IFN Release Assay) (vezi capitolul 11). Nici IDR cu PPD,
nici IGRA nu deosebesc TB latent de TB activ.
16. 3. 4. Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic are la baz detectarea rspunsul imun de tip
umoral exprimat prin prezena de Ac anti-mycobacterieni ce pot fi
evideniai prin tehnica ELISA. Testele nu sunt standardizate i nu au
intrat n practica de rutin.De reinut: n diagnosticul TB nici un
element nu este lipsit de importan ntr-un context clinic, paraclinic i
epidemiologic.
16. 4. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate
trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva
link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se
resursele World Wide Web.
1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24484441
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24466020
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24434262
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24363885
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24363879
6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24093965
7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24404155
16. 5. Povestire adevrat
O pacient n vrst de 28 de ani se prezint la medic pentru tuse
productiv care a debutat n urm cu 3 sptmni. Pacienta era
nsrcinat n 26 de sptmni. La examenul fizic pulmonar nu s-a
detectat nimic patologic. A primit tratament antibiotic. Tusea nu s-a
ameliorat i dup 2 sptmni pacienta s-a prezentat din nou la medic.
Cu toate c pacienta era nsrcinat s-a luat decizia realizrii unei
radiografii pulmonare, care a pus n eviden infiltrat pulmonar

paracardiac. Medicul a suspicionat diagnosticul de TB i pacienta a fost


ndreptat ctre centrul regional de TB. Avnd n vedere c era gravid
i centrul se afla la o distan mare a fost internat n spitalul local. La
momentul internrii examenul clinic era normal. Imaginea radiologic
decelat anterior persista. S-a recoltat sput, frotiul a fost negativ
pentru BAAR. Pacienta a primit din nou tratament antibiotic.
Dup o sptmn a fost externat. Evoluia a fost nefavorabil, 2
sptmni mai trziu prezentnd acas hemoptizie. S-a prezentat din
nou la spitalul local, de unde a fost transportat la centrul regional de
TB. Fiind coroborate simptomatologia, istoricul i aspectul radiografiei
toracice s-a pus diagnosticul de TB i s-a recoltat sput. S-a iniiat
tratament cu medicamente anti-TB. Culturile au fost pozitive
pentru Mycobacterium tuberculosis.
Evoluia a fost favorabil. A fost externat. Pacienta a nscut acas.
Nou nscutul a primit tratament profilactic cu izoniazid pentru
posibil TB latent timp de 6 luni. Avnd n vedere c a nscut acas
placenta nu a putut fi examinat.
Discuii
n managementul TB este foarte important investigarea contacilor.
Pacienta era cstorit i avea 2 copii. n urma anchetei
epidemiologice s-a descoperit c toi trei aveau IDR la PPD intens
pozitiv. Radiografia toracic a fiicei n vrst de 7 ani prezenta
revrsat pleural i adenopatii mediastinale, dar culturile din sput au
fost negative. n cazul fiicei de 4 ani s-a observat pe radiografie infiltrat
pulmonar. Culturile din sput au fost pozitive. Ambii copii au primit
tratament cu medicamente anti-TB. Soul nu prezenta nimic patologic
i s-a administrat doar tratament profilactic cu izoniazid (HIN). Dup
un timp tratamentul a fost oprit n urma apariiei unei afectr hepatice
ca reacii advers la administrarea HIN. Pacientul nu a mai reluat
tratamentul. Doi ani mai trziu a prezentat dureri abdominale, ascit i
febr. A fost diagnosticat cu TB abdominal.
Analizele moleculare au dovedit c n cele trei cazuri (pacienta
nsrcinat, fiica de 4 ani i soul, n cazul fiicei de 7 ani culturile fiind
negative) a fost implicat aceeai tulpin de M. tuberculosis.
Este important de reinut c un frotiu negativ pentru BAAR din sput
nu elimin diagnosticul de TB. n plus se recomand recoltarea a trei

probe de sput. Trebuie avut n vedere c i persoanele cu frotiu


negativ pot transmite infecia. n cazul copiilor diagnosticul este mai
dificil. Unele din motive sunt c TB este paucibacilar i produsul
patologic este mai greu de obinut.
Chimioprofilaxia reprezint o parte important n managmentul TB.
16. 6. De reinut
Principala surs de infecie este reprezentat de pacienii cu TB
pulmonar.
Tabloul clinic este nespecific. Un frotiu din sput pe care se
vizualizeaz BAAR orienteaz diagnosticul, dar un frotiu negativ nu-l
exclude. Diagnosticul de certitudine presupune izolarea M. tuberculosis.
n diagnosticul TB orice element este important, inclusiv elemente de
diagnostic imunobiologic i serologic.
16. 7. Verificai-v cunotinele
1. Alegei afirmaiile adevrate despre infecia cu M. tuberculosis:
A. TB se transmite cel mai frecvent pe cale aerian
B. Cea mai frecvent form de TB este cea pleural
C. Imunitatea specific nu reuete de cele mai multe ori s controleze
infecia
D. Bacilii disemineaz pe cale limfatic
E. Pacienii cu TB latent sunt asimptomatici
2. Alegei afirmaiile false despre cultivarea M. tuberculosis:
A. Mediul de cultur trebuie suplimentat cu NaCl
B. Se dezvolt pe medii solide i lichide
C. Este un microorganism anaerob
D. Tulpinile rezistente la HIN formeaz colonii de tip S
E. Creterea este inhibat de verde malachit
3. Alegei afirmaiile adevrate despre diagnosticul n TB:
A. Sputa trebuie decontaminat i neutralizat
B. Examenul microscopic presupune realizarea unui singur frotiu n
coloraia Z-N
C. Pentru izolare este necesar o atmosfer de 8-10% CO2
D. Incubarea se realizeaz la 35-37C
E. Culturile se obin n 24-48 h pe mediul L-J
4. Alegei afirmaiile adevrate_despre M. tuberculosis:
A. Formeaz colonii de tip R

B. Coloniile sunt pigmentate n galben


C. Testul producerii de niacin este negativ
D. Testul reducerii nitrailor i testul catalazei la 22C sunt pozitive
E. Rata de diviziune este de 12-27 minute
5. Alegei afirmaiile false:
A. Examenul microscopic negativ pentru BAAR exclude diagnosticul de
TB
B. Antibiograma este rareori necesar
C. Se poate detecta LAM, n urin, n special la pacienii coinfectai
HIV-TB
D. M. tuberculosis este patogen pentru cobai
E. Pentru diagnostic se recomand recoltarea a trei probe din sput
16. 8. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Oricine se infecteaz cu M. tuberculosis va dezvolta boala.
2. TB se transmite prin srut.
3. Malnutriia i stresul reprezint factori de risc pentru TB.
4. Dac o persoan a avut TB, nu se va mai mbolnvi de TB.
5. Orice persoan vaccinat cu BCG la natere nu va face TB.

17. Diagnosticul de laborator n


infeciile produse de microorganisme
din genul Treponema. (GabrielaLoredana Popa, Mara-Mdlina Mihai)

17. 1. Cuvinte cheie


Spirochet
Infecie transmis pe cale sexual
ancru dur
Microscopie pe fond ntunecat
Teste treponemice i nontreponemice
Bordet-Wasserman
VDRL
TPHA
17. 2. Introducere
17. 2. 1. Clasificare
Bacteriile spiralate studiate fac parte din ordinul Spirochaetales,
submprit n familia Spirochaetaceae (genurile Treponema i Borrelia)
i familiaLeptospiraceae (genul Leptospira). Specia Treponema
pallidum, cu alte patru subspecii care pot produce infecii la om, este
clasificat n cadrul genuluiTreponema.
17. 2. 2. Cale de transmitere
Infecia cu Treponema pallidum subspecia pallidum determin
afeciunea denumit sifilis (lues); este transmis n aproximativ 90% din
cazuri pe cale sexual. Din acest motiv, atunci cnd consultm un
pacient suferind de sifilis, este esenial s efectum o anamnez
detaliat cu privire la contactele sexuale neprotejate, n vederea
depistrii partenerilor potenial infectai. Nu arareori, la aceste
persoane sunt decelate simultan multiple infecii transmise pe cale
sexual (ITS), un caz aparte fiind acela al asocierii infeciei HIV, care prin
imunosupresie poate determina o evoluie nefavorabil a luesului.

Sifilisul dobndit poate evolua n mai multe stadii clinico-biologice:


primar, secundar, latent i teriar, cu afectarea mucoaselor, a esutului
cutanat, iar n formele mai severe cu afectarea organelor interne, a
sistemului osteoarticular, nervos, cardiac.
Atunci cnd o femeie nsrcinat sufer de lues, bacteria poate s
depeasc bariera placentar determinnd avort spontan sau sifilis
congenital, cu posibilitatea unor malformaii fetale invalidante.
17. 2. 3. Tablou clinic
Dup aproximativ 3 sptmni de la contactul sexual infectant (uneori
fiind posibil totui o perioad de laten prelungit, de pn la 10
sptmni), la locul inoculrii se formeaz ancrul dur, o ulceraie cu
centrul i marginile de consisten ferm, ce exsudeaz un lichid clar,
foarte bogat n treponeme (Figura nr. 1). Aceast leziune este nsoit
de adenopatie regional. N.B.: orice ulceraie a mucoaselor bucal,
faringian, genital sau anorectal oblig la testarea serologic pentru
sifilis.
Dup alte 6 sptmni apar leziunile secundare sub forma unei
erupii maculopapulare roiatice, localizate la orice nivel (Figura nr. 2),
dar i condiloame mai frecvent n regiunea anogenital (Figura nr. 3).
n stadiile primar i secundar leziunile sunt foarte contagioase, fiind
bogate n spirochete.
n sifilisul teriar (nu foarte des ntlnit n practica actual datorit
tratamentului curativ larg rspndit cu penicilin - terapie de elecie),
pacientul poate s dezvolte complicaii neurologice, cardio-vasculare,
osteo-articulare etc.
N.B.: sifilisul este considerat marele imitator, tabloul clinic putnd fi
adeseori atipic, similar diferitor afeciuni dermatologice.
17. 3. Diagnosticul de laborator
17. 3. 1. Principii generale
Diagnosticul infeciei cu T. pallidum pornete de la elemente clinice i
epidemiologice. Confirmarea prin metode de laborator este
obligatorie (cu att mai mult cu ct manifestrile cutanate sau
mucoase pot fi neltoare).
Diagnosticul de certitudine se stabilete prin vizualizarea spirochetelor
n secreiile prelevate, prin microscopia n cmp ntunecat sau prin

imunofluorescen direct. Totui, aceste tehnici sunt laborioase i


necesit un examinator experimentat, motive pentru care nu sunt
utilizate de rutin n practica medical. De ce nu folosim microscopia
clasic? Datorit dimensiunii reduse a bacteriilor, care nu permite
vizualizarea acestora. Treponema pallidumnu poate fi cultivat pe
medii artificiale, diagnosticul bacteriologic cuprinznd doar 2 etape:
recoltarea i transportul produsului patologic i examinarea
microscopic.
Diagnosticul serologic al probelor sanguine este cel mai frecvent
utilizat pentru a confirma suspiciunea clinic, existnd dou tipuri de
teste disponibile: nontreponemice (VDRL, RPR etc.) i treponemice
(TPHA, FTA-abs etc.).
17. 3. 2. Diagnosticul bacteriologic
Acesta poate fi realizat att n sifilisul primar, ct i n sifilisul secundar.
17. 3. 2. 1. Recoltarea si transportul produsului patologic
Recoltarea i transportul probelor prelevate trebuie s respecte
regulile cunoscute (vezi capitolul 3), dar exist i aspecte particulare
infeciei sifilitice. Cel mai adesea produsul patologic este reprezentat
de exsudatul clar de la nivelul leziunilor primare, dar poate fi prelevat
i de la nivelul leziunilor secundare ori din ganglionii limfatici regionali.
Dup ndeprtarea crustelor superficiale, care nu conin
microorganisme viabile, se recolteaz cu grij, fr s provocm
sngerare local. Preparatele nu trebuie s conin hematii, leucocite,
fragmente de esut sau bule de aer. Ulterior, preparatele microscopice
ntre lam i lamel sunt examinate rapid, n maxim 20 de minute de la
recoltare.
17. 3. 2. 2. Examinarea microscopic
17. 3. 2. 2. 1. Examenul microscopic pe fond ntunecat
Pentru fiecare leziune se pregtesc cel puin dou preparate
lam/lamel. Preparatele nu trebuie s se usuce. n acest scop, pentru
meninerea ntr-o atmosfer umed, le vom pune ntr-o cutie Petri n
care punem i puin vat mbibat cu ap distilat. Preparatele nu pot
fi examinate n vederea detectrii treponemelor cu ajutorul
microscopului optic, cu imersie. Vom utiliza microscopul pe fond
ntunecat, vom examina insistent, cel puin 10 minute n cazul unui
rezultat aparent negativ (Figura nr. 4).

Experiena examinatorului i spune cuvntul, fiindu-i dificil unui medic


neantrenat s diferenieze pe baza caracterelor microscopice
treponemele patogene de acelea nonpatogene. Pledeaz n favoarea
diagnosticului de infecie cu Treponema pallidum subspecia
pallidum vizualizarea unor microorganisme foarte subiri i lungi,
spiralate, luminoase pe fondul negru al cmpului, mobile, dar cu o
deplasare lent, ce seamn cu o micare de nurubare (Film nr. 1).
Rezultatul pozitiv poate pune diagnosticul de sifilis primar (Figura nr.
5) i poate decide tratamentul.
17. 3. 2. 2. 2. Imunofluorescena direct
Am discutat deja despre dificultatea diferenierii treponemelor
patogene de acelea saprofite, iar imunofluorescena direct vine n
ajutorul diagnosticianului permind marcarea cu anticorpi fluoresceni
monoclonali (o singur subspecieTreponema intit) sau policlonali a
microrganismelor de cercetat (reactie antigen-anticorp) (Figura nr. 6).
Reactivul este obinut de la pacieni cu sifilis sau de la animale de
laborator infectate, serul acestora fiind tratat cu o tulpin Reiter,
nepatogen, n scopul creterii specificitii, urmat de marcarea
anticorpilor cu izotiocianat de fluorescein.
17. 3. 2. 3. Alte elemente utile n diagnosticul bacteriologic
n laboratoarele de referin sunt utilizate i alte metode diagnostice,
spre exemplu testul infectivitii la iepure (RIT). Produsul prelevat
este inoculat animalului de experien intratesticular sau cutanat, etap
urmat de observarea modificrilor clinico-biologice. Aceasta este cea
mai sensibil metod existent pentru detectarea Treponema pallidum.
La pacientele nsrcinate este posibil prelevarea lichidului amniotic, n
vederea diagnosticrii prin tehnici de biologie molecular,
precum Polymerase Chain Reaction (infecia sifilitic depind bariera
materno-fetal).
17. 3. 3. Diagnosticul serologic
Testarea serologic este considerat metoda standard de detectare a
infeciei sifilitice, n toate stadiile evolutive. Cel mai adesea serul
pacientului este produsul testat, dar n situaii aparte i alte probe pot
fi utilizate; spre exemplu ntr-o suspiciune de neurosifilis lichidul
cefalo-rahidian (LCR) poate fi supus examinrii. Exist dou tipuri de
teste disponibile, clasificate n funcie de specificitatea antigenului

utilizat: nespecifice sau nontreponemice i specifice sau treponemice.


Diagnosticul pozitiv se stabilete prin mbinarea acestora, putnd
utiliza, spre exemplu VDRL sau RPR din prima categorie, urmat de
confirmarea prin TPHA sau FTA-abs din a doua categorie. Pentru
monitorizarea evoluiei sub tratament sunt repetate periodic testele
nontreponemice (Figura nr. 7; algoritm de diagnostic).
17. 3. 3. 1. Reacii serologice care utilizeaz antigene
nontreponemice
Infecia cu Treponema pallidum conduce la apariia n serul pacientului,
dup aproximativ 2 sptmni de la debut, a unor anticorpi protectori,
denumii istoric reagine. Acetia reacioneaz cu antigenul
(cardiolipina), un difosfatidil-glicerol prezent n structura celulelor
cardiace umane i animale, dar i n aceea a membranei mitocondriale
bacteriene. Aceast reacie antigen-anticorp st la baza testelor
nontreponemice sau nespecifice: reacia de fixare a complementului
Bordet-Wasserman (RBW, cu cea mai mare vechime, din 1906) i
reaciile de floculare Veneral Disease Research Laboratories (VDRL, cel
mai frecvent utilizat) i Rapid Plasma Reagin (RPR).
17. 3. 3. 1. 1. Reacia de fixare a complementului Bordet
Wasserman
Aceast metod este discutat n detaliu n Diagnosticul de laborator
n microbiologie.
17. 3. 3. 1. 2. Reacia de precipitare VDRL
Principiu. VDRL este o reacie antigen-anticorp nespecific,
observndu-se flocularea la punerea n contact a serului pacientului cu
antigenul cardiolipin.
Procedura. n scopul efecturii microreaciei VDRL sunt necesare
urmtoarele materiale: plcile cu godeuri, antigenul de tip VDRL
(preparat COMERCIAL ), serul de cercetat (clarificat prin centrifugare i
inactivat timp de 30 minute la 56C) i probele martor (seruri cu
reactivitate cunoscut, martor pentru antigen).
n continuare, vom introduce n fiecare godeu 0,05 ml ser (n godeul
pentru martor antigenic punem soluie salin fiziologic) i cte o
pictur de suspensie antigenic (1/60 ml). Dup acoperirea plcii, o
vom plasa pe un agitator timp de 4 minute, la 180 turaii pe minut
(Film nr. 2).

Interpretarea o vom face imediat, aeznd placa pe un fond


ntunecat i observnd, cu ajutorul unei lupe, fiecare godeu, ncepnd
cu martorii i continund cu serurile de testat.
Interpretare. Este posibil s obinem un rezultat negativ atunci
cnd lichidul nu prezint flocoane, un rezultat slab pozitiv dac
observm flocoane fine ntr-un lichid uor tulbure sau un rezultat
intens pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane de dimensiuni mari
ntr-un lichid clar (Figura nr. 8).
Testul VDRL se pozitiveaz la aproximativ sptmni de la apariia
ancrului i la 4-8 sptmni de la contactul sexual infectant.
Aa cum am nvat, diagnosticul serologic este realizat n etape,
fiind necesar repetarea testrii. Din acest motiv, un rezultat negativ nu
elimin diagnosticul de sifilis, fiind recomandat, n special cazul unui
pacient suspect, repetarea testrii dup 1 sptmn, 1 lun i la 3 luni.
Prin cumularea informaiilor epidemiologice, clinice i paraclinice,
completate de un rezultat VDRL pozitiv se stabilete suspiciunea de
sifilis, a crui confirmare se face obligatoriu prin efectuarea unui test
treponemic/specific. Nu trebuie s omitem posibilitatea apariiei unui
rezultat fals pozitiv n urmtoarele situaii: a.pacieni cu diferite
patologii infecioase asociate (pneumonii de etiologie viral, rujeol,
hepatite virale acute, mononucleoz infecioas sau alte infecii virale,
malarie), b.pacieni cu afeciuni imunitare asociate (boli ale esutului de
colagen), c.administrarea unor produse biologice de uz uman ce pot
declana reacii imunitare (EX . vaccinare recent). Fiziologic, la
persoanele n vrst sau pe parcursul sarcinii pot sa apar rezultate fals
pozitive.
17. 3. 3. 2. Reacii serologice care utilizeaz antigene treponemice
Antigenele treponemice sunt extrase din tulpinile Reiter sau Nichols
deTreponema pallidum, cu o mare specificitate. Teste treponemice
sunt urmtoarele: reacia de hemaglutinare TPHA, testul imobilizrii
treponemelor i testul de imunofluorescen indirect FTA-Abs.
17. 3. 3. 2. 1. Reacia de hemaglutinare TPHA (T.
pallidumHemagglutination Test)
n aceast reactive antigenele specifice, extrase din tulpina Nichols,
sunt adsorbite pe membrana unor hematii fixate. n cazul n care n
serul de cercetat sunt prezeni anticorpi anti-Treponema pallidum,

hematiile sensibilizate aglutineaz n reele caracteristice formate din


complexe imune.
17. 3. 3. 2. 2. Testul imobilizrii treponemelor (TPI) nu mai este
utilizat n prezent, dar pentru o lung perioad de timp a fost
considerat tehnica standard de diagnostic. Serul de cercetat era diluat
i amestecat cu treponeme vii, mobile (obinute din testicul de iepure)
i complement. La microscopul pe fond ntunecat era observat
mobilitatea bacteriilor. Dac pacientul suferea de sifilis, anticorpii din
serul acestuia reacionau cu treponemele din prob, imobilizndu-le.
17. 3. 3. 2. 3. Testul de imunofluorescen indirect FTA
Abs(Fluorescent Treponemal Antibody)
Principiu.Serul pacientului este pus n contact cu antigene
treponemice, formndu-se complexe antigen-anticorp. La adugarea
n proba de cercetat a anticorpilor anti-imunoglobuline umane marcai
fluorescent, complexele pot fi vizualizate prin microscopia cu
fluorescen.
Procedura. Serul care va fi utilizat n reacie este obinut prin
prelucrarea serului pacientului (ntr-o diluie de 1/5 este pus n contact
cu un extract antigenic nespecific- comun treponemelor patogene i
comensale- din tulpin Reiter, n scopul ndeprtarii anticorpilor care
nu sunt specifici pentru T. pallidum). Ulterior, serul obinut este pus n
contact cu antigenele specifice ale tulpinii Nichols de T. pallidum. n
acest moment, n cazul n care pacienii sufer de sifilis, se formeaz
complexe antigen-anticorp. La adugarea n proba de cercetat a Ac
anti-imunoglobuline umane marcai fluorescent, complexele pot fi
vizualizate prin microscopia cu fluorescen. n cazul n care serul de
cercetat este pozitiv, treponemele apar galben-verzui (Figura nr. 9).
17. 3. 3. 2. 4. Tehnica ELISA (EX . detectarea anticorpilor de tip Ig
M anti-T. pallidum) este util pentru diagnosticul sifilisului congenital.
Interpretarea rezultatelor se face n context clinic, epidemiologic i de
laborator. Dac, spre exemplu, att VDRL, ct i TPHA dau un rezultat
negativ, infecia este de obicei exclus. ns, n cazul n care pacientul
se afl la debutul bolii, iar anticorpii nu sunt nedectabili (suspiciunea
clinic sau epidemiologic persist), repetm testele dup 3 sptmni.
Nu intrm n amnunte privind strategia diagnostic i terapeutic, dar
este foarte important de tiut c algoritmul este elaborat de ctre

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

comisiile de specialitate ale ministerului sntii i trebuie respectate


ca atare.
17. 4. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate
trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva
link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se
resursele World Wide Web.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24461955
http://www2a.cdc.gov/stdtraining/self-study/syphilis/default.htm
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24335464
http://www.cdc.gov/std/syphilis/stdfact-syphilis.htm
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24244772
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24386329
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24134407
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24066175
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24047081
17. 5. Povestire adevrat
O pacient n vrst de 50 de ani, fr antecedente personale
patologice semnificative se prezint n cabinetul medicului su
stomatolog acuznd apariia n urm cu aproximativ 3 sptmni a
unei PAPULE roiatice lucioase, dure, nedureroase, la nivelul
mucoasei linguale. Aceasta a crescut progresiv n dimensiuni, avnd la
momentul prezentrii la medic un diametru aproximativ de 8 mm.
Examinnd cu atenie leziunea, medicul observ n centrul su o
eroziune de 1-2 mm. ntrebat dac a suferit un traumatism local,
pacienta mrturisete c a but multe ceaiuri fierbini pentru c avea o
senzaie de usturime n gt, n special la nghiit (odinofagie) i a crezut
c a rcit.
Medicul a presupus c leziunea a fost cel mai probabil determinat de
ingestia lichidelor la o temperatur prea nalt i a recomandat

pacientei soluii bucale antiseptice i medicaie sistemic


antiinflamatorie.
Dup circa 2 sptmni pacienta revine n cabinetul medicului.
Leziunea lingual sczuse n dimensiune, nu mai acuza odinofagie, n
schimb la nivelul feei i palmo-plantar se puteau observa multiple
macule i PAPULE roiatice, acoperite de scuame fine, care nu o
deranjau deocamdat pe pacient, fiind nepruriginoase i nedureroase.
Medicul stomatolog consultase n cei 30 de ani de practic i ali
pacieni cu modificri asemntoare. Cu tact, acesta i recomand
examinarea de ctre un medic infecionist i efectuarea analizelor
uzuale, printre care include i testarea VDRL.
Pacienta i face analizele i se prezint ngrijorat la un medic
specialist n boli infecioase pentru a afla care este cauza erupiei sale
cutanate. Medicul ascult ntreaga istorisire i observ valori n limite
normale ale probelor hematologice i biochimice uzuale, dar un
rezultat VDRL intens pozitiv. i explic pacientei posibilitatea unei
infecii cuTreponema pallidum i i recomand efectuarea testului de
confirmare TPHA, alturi de alte analize precum: serologia HIV,
testarea serologic pentru infeciile hepatitice B i C.
ntrebat de medic, pacienta relateaz faptul c n urm cu aproximativ
6 sptmni a avut un contact sexual neprotejat cu un partener
ocazional.
Testarea TPHA are un rezultat pozitiv; nu sunt depistate alte ITS.
Partenerul respectiv a fost invitat la rndul su pentru consult i i s-a
recomandat acelai tratament: Penicilin G, 2 mil. UI injectate
intramuscular ntr-o singur administrare.
Sub tratament cu penicilin pacienta a prezentat remisiunea tuturor
leziunilor.
Discuii
Dei infecia cu Treponema pallidum apare cel mai frecvent la vrste
cuprinse ntre 20-40 de ani, o ulceraie mucoas ar trebui s ridice
ntotdeauna aceast suspiciune, indiferent de vrsta pacientului.
Screening-ul partenerilor este ntotdeauna recomandat.
Toi pacienii diagnosticai cu sifilis trebuie s fie testai suplimentar
pentru alte afeciuni transmisibile pe cale sexual. Co-infecia HIV nu
modific doar evoluia strii generale a pacientului i a infeciei

sifilitice, dar i tratamentul acesteia, schema terapeutic n acest caz


fiind diferit.
Nediagnosticat, sifilisul poate persista n stadiul latent zeci de ani,
prezentnd att un important risc epidemiologic, ct i un impact
semnificativ asupra pacientului prin morbiditatea cardio-vascular i
neurologic.
17. 6. De reinut
La un pacient diagnosticat cu sifilis este obligatorie testarea
prezenei altor infecii transmise pe cale sexual (HIV, virusuri
hepatitice B, C, alte virusuri, fungi, parazii, alte bacterii);
Urmrirea rspunsului sub tratament se face prin repetarea VDRL
cantitativ, test ale crui valori ar trebui s se reduc progresiv n
timp, pn la dispariie.
17. 7. Verificai-v cunotinele
1. Bifai testele diagnostice nontreponemice:
A.
Testul infectivitii la iepure
B.
Reacia de fixare a complementului Bordet Wasserman
C.
VDRL (Venereal Disease Research Laboratory)
D.
TPHA (Treponema pallidum Hemaglutination Assay)
E.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
2. Alegei ordinea corect cronologic a urmtoarelor manifestri
clinice:
A.
ancru dur genital, rozeol sifilitic, anevrism aortic
B.
Erupie generalizat maculo-papulara roiatic, ancru dur
genital, neurosifilis
C.
Ulceraie genital, ulceraie conjunctival, necroza septic de
cap femural
D.
Pneumonie luetic, neurosifilis, ancru dur labial
E.
Ulceraie faringian, erupie generalizat maculo-papular
roiatic, neurosifilis
3. Un pacient n vrst de 23 de ani, fumtor, se prezint la medicul
stomatolog cu o ulceraie la nivel lingual, cu dimensiunea aproximativ
de 8 mm, dur la palpare, neted, nedureroas. Relateaz apariia
leziunii n urm cu 1 sptmna, urmat de creterea lent n

dimensiuni. ntrebat de medic mrturisete faptul c n urm cu 1 lun


a avut un contact sexual neprotejat cu o partener nou. Rezultatele
analizelor de laborator evideniaz: probe hematologice n limite
normale, VDRL intens pozitiv, TPHA pozitiv. Diagnosticul medicului
este:
A.
Traumatism lingual
B.
Sifilis primar
C.
Sifilis secundar
D.
Neoplazie lingual
E.
Sifilis latent
4. Pacient n vrst de 25 de ani, se prezint la camera de gard,
ngrijorat fiind de faptul c n urm cu aproximativ 3 zile a avut un
contact sexual neprotejat cu un partener nou, la care a observat dup
ncheierea actului o ulceraie la nivelul glandului. Medicul a
recomandat efectuarea screening-ului infeciilor cu transmitere
sexual, rechemnd pacienta la control peste 1 sptmn cu
rezultatul analizelor. Acestea au fost: serologie HIV pozitiv, VDRL
negativ, TPHA negativ, markeri virali hepatitici negativi. Alegei
rspunsurile corecte:
A.
Pacienta s-a infectat cu HIV n urma contactului sexual
neprotejat
B. Este necesar retestarea VDRL, TPHA peste 2 sptmni; n doar 3
zile de la contactul infectant nu apare un rspuns umoral susinut,
evideniat prin metodele standard de laborator
C.
Este posibil c pacienta s fi transmis infecia HIV partenerului
D.
Recomandm att pacientei, ct i partenerului, consultarea
unui medic specialist infecionist
E.
Nu este cazul s lum msuri suplimentare. Este doar o infecie
HIV
5. Alegei afirmaia adevrat:
A. Examinarea microscopic n cmp ntunecat este o metod
antic. Nu ne mai intereseaza acest subiect
B. Rezultatul VDRL este intens pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane
de dimensiuni mari, iar lichidul este clar

C. Rezultatul TPHA este intens pozitiv atunci cnd vizualizm flocoane


de dimensiuni mari, iar lichidul este clar
D. Pot aprea rezultate VDRL fals + la persoane cu boli ale esutului de
colagen
E. Pot aprea rezultate VDRL fals pozitive la persoane cu amigdalit.
17. 8. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Dac ai suferit de sifilis la un moment dat n viaa ta, nu te vei mai
mbolnvi niciodat.
2. A fi observat dac a suferi de sifilis. Sunt perfect sntos!
3. Nu toate infeciile transmisibile sexual sunt curabile.
4. Sifilisul i gonoreea in de trecut. Medicina modern le-a eliminat.
5. Anual merg la medic pentru a efectua testul Papanicolau. Medicul
ginecolog nu mi-a spus niciodat c a suferi de o infecie transmis
sexual. Nu am vreun motiv s m ngrijorez.

18. Diagnosticul de laborator n


infecii produse de microorganisme
din genurile Chlamydia i
Mycoplasma. (Gabriela-Loredana
Popa, Alexandru-Andrei Muntean)
18. 1. Cuvinte cheie
Corpusculi elementari i corpusculi reticulai
Trahom
Conjunctivit
Pneumonie interstiial
Limfogranulomatoz
Traheobronit
18. 2. Introducere
18. 2. 1. Clasificare

Bacilii Gram negativi studiai n acest capitol sunt inclui n


genurile Chlamydiai Mycoplasma. Speciile cu cea mai mare
importan a genului Chlamydia suntChlamydia trachomatic, C.
psittaci i C. pneumoniae; acestea cauzeaz infecii variate fiind
implicate n infecii cu transmitere sexual i pneumonii atipice, dar i
alte forme de patologie. Unii autori clasific C. psittaci i C.
pneumoniaen genul Chlamydophila.
n genul Mycoplasma ntlnim speciile M. pneumoniae, M.
genitalium i M. hominis. Aceste microorganisme cauzeaz, la rndul
lor, infecii variate fiind implicate n infecii cu transmitere sexual
(uretrite non-gonococice), pneumonii atipice, dar i pielonefrit, febr
post-partum sau infecii sistemice (n special la pacienii
imunodeprimai).
18. 2. 2. Fiziologie i cale de transmitere

18. 2. 2. 1. Genul Chlamydia


Microorganismele din genul Chlamydophila prezint un ciclu de
dezvoltare particular. Aceste microorganisme sunt parazite, folosind

ATP din celulelei eucariote infectate. Astfel, replicarea lor are lor doar
intracelular. n mediul extracelular, aceste bacterii exist sub forme
numite corpusculi elementari (CE), asemntoare cu sporii bacterieni,
inactive metabolic, dar cu infeciozitate pstrat. CE sunt endocitai de
celulele eucariote i se reorganizeaz sub formele metabolic-active,
non-infecioase, capabile de replicare, numite corpusculi reticulai
(CR).
C. pneumoniae i C. psittaci se transmit aerogen, fiind o cauz de
pneumonie bacterian interstiil (numit i atipic). C.
trachomatis este responsabil de boli oftalmologice i boli cu
transmitere sexual. Acestea sunt transmise princontact direct, prin
fluide biologice sau prin vectori.
Pe baza proteinelor din structura sa, microorganismul se poate mpri
n multiple serogrupuri.
18. 2. 2. 2. Genul Mycoplasma
Microorganismele din genul Mycoplasma sunt cele mai mici
organisme carepot s supravieuiasc de sine stttoare n natur, fr
nevoia de a parazita o celul gazd. Spre deosebire de celelalte
microorganisme, acestea nu au perete celular i prezint steroli n
membran. Sunt microorganisme pleomorfe ce prezint forme
cocoidale sau bacilare (dimensiuni de la 0.1 0.2 m la 1 2 m).
Timpul de generaie a acestor microorganisme este de 6 ore, aa nct
culturile se dezvolt greu, necesitnd tehnici speciale de examinare i o
compoziie special a mediilor de cultur.
Calea de transmitere a M. pneumoniae este aerogen, n cursul
episoadelor de tuse. M. genitalium i M. hominis, sunt transmise prin
contact direct.
18. 2. 3. Tablou clinic

18. 2. 3. 1. Tabloul clinic n infeciile produse de Chlamydia spp.


Trahomul este o infecie difuz, cronic, a conjunctivei. Apare o
important fibroz a conjunctivei, nsoit de eversiunea pleoapei, care
contribuie la leziunile oculare. Rezultatul este diminuarea acuitii
vizuale, uneori pn la orbire (Figura nr. 1).
Conjunctivita neonatal apare atunci cnd nou-nscutul este
contaminat n cursul naterii naturale. Dup o perioad de incubare de

5-12 zile, apare inflamarea pleoapelor i secreia purulent (Figura nr.


2). Tratamentul trebuie s fie sistemic, ntruct poate s apar i autoinocularea cu evoluie spre pneumonie interstiial.
Lymphogranuloma Venereum este o boal cu transmitere sexual (ITS)
ce prezint la debut o leziune primar la locul de inoculare aceasta
este o papul sau o leziune ulceroas, nedureroas i care se vindec
repede. Inflamaia progreseaz, n a doua faz, implicnd lanul
ganglionar inghinal, cu apariia adenopatiilor dureroase, fluctuante, ce
pot fistuliza.
Infeciile urogenitale sunt de multe ori greu de diagnosticat datorit
faptului c infeciile sunt asimptomatice la aproximativ 80% din
persoanele de sex feminin. Acestea reprezint un rezervor natural
pentru infecie. Aceste infecii pot duce la sterilitate dac nu sunt
detectate i diagnosticate corespunztor. Infeciile la brbai sunt cel
mai adesea simptomatice, dar 25% din infecii rmn asimptomatice.
18. 2. 3. 2. Tabloul clinic n infeciile produse de Mycoplasma
pneumoniae
Traheobronita este forma clinic cea mai frecvent ntlnit.
Aceasta se caracterizeaz prin tuse neproductiv, febr, cefalee i
subfebr. De multe ori, simptomatologia asociaz i faringit.
Pneumonia atipic reprezint o alt form de prezentare. Spre
deosebire de pneumoniile cu S. pneumoniae, simptomatologia este
mai subtil. Examenul radiologic contrasteaz cu simptomatologia,
artnd infiltrate bronhopneumonice diseminate (Figura nr. 3).
18. 3. Diagnosticul de laborator n infecii produse de
microorganisme din genurile Chlamydia i Mycoplasma
Ne vom referi n continuare la diagnosticul infeciilor produse de C.
trachomatis i M. pneumoniae.
18. 3. 1. Diagnosticul bacteriologic n trahom (Chlamydia
trachomatis)
18. 3. 1. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se
realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul 4), n special
recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea
antibioterapiei i respectnd msurile de precauie. Produsul patologic
poate fi reprezentat de raclat conjunctival sau de la nivelul altor
mucoase (EX . cervival), urin, sperm, secreie purulent uretral,

secreii nazale, secreii faringiene, sput, aspirat ganglionar, puroi din


fistul etc. n cazul n care secreia uretral nu este evident, putem
utiliza un tampon subire pe care l introducem cu blndee 3-5 cm n
uretr, rotindu-l uor. Indiferent de p.p. recoltat, tampoanele trebuie s
fie din Dacron. Produsul trebuie s fie prelucrat imediat. Dac acest
lucru nu este posibil, transportul se va face n medii speciale de
transport sau la cel puin -20 C (preferabil -70C).
18. 3. 1. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include
realizarea unor frotiuri pe care le colorm prin imunoflorescen.
Aceasta pune n eviden incluziile intracitoplasmatice sau corpusculii
elementari (Figura nr. 4). Frotiul este uscat, fixat chimic (cu aceton, la 20C) i colorat imunofluorescent (metoda direct sau indirect).
Urmrim prezena celulelor inflamatorii (PMN) i a celulelor
caracteristice esutului de la nivelul cruia am realizat recoltarea.
Incluziile apar ca o mas bine definit, cu fluorescen de EX . galbenverzui, n interiorul celulelor epiteliale. Frotiul va fi examinat cel puin 3
minute n cazul n care pare s fie negativ. Celelalte frotiuri vor putea fi
colorate prin metoda Gimenez (corpusculii elementari apar aglomerai
i de culoare roie pe fondul verde al frotiului) sau cu lugol (incluziile
de C. trachomatis conin glicogen i apar ca o mas de culoare brun).
Unii autori menioneaz c examenul citologic, cu punerea n eviden
a unor limfocite transparente i a unui numr crescut de histiocite
este sugestiv pentru infecia cu C. trachomatis. Prin tehnici de tip ELISA
se pot pune n eviden antigene n p.p. Exist i tehnici ale biologiei
moleculare care pot fi aplicate direct pe p.p. (sonde nucleotidice, PCR
etc).
18. 3. 1. 3. Pentru cultivarea produsului patologic am putea utiliza oul
de gin embrionat (inoculare la nivelul sacului vitelin) dar de regul
se folosesc culturile de celule. Pentru Chlamydia trachomatis se pot
utiliza liniile celulare BGMK, HeLa 229. nainte de inocularea pe
culturile de celule, p.p. este centrifugat (3000g, timp de 60 minute). Se
pot utiliza culturile de celule n sistemul clasic sau micrometoda de
cultivare pe culturi de celule n godeuri. Incubarea dureaz 48-72 de
ore. Tehnica incubrii este destul de complex (incubri repetate, n
condiii diferite) i trebuie s respecte strict protocolul de lucru.

18. 3. 1. 4. Identificarea se va realiza difereniat. n cazul n care s-a


utilizat micrometoda, godeurile se examineaz microscopic dup
colorare cu lugol sau prin imunofluorescen. n cazul cultivrii prin
metoda clasic, realizm frotiuri pe care le fixm chimic (de EX . cu
metanol). Un frotiu va fi colorat cu lugol (incluziile de C.
trachomatis conin glicogen) iar altul cu Ac monoclonali marcai
fluorescent. Se pot aplica i tehnici de biologie molecular.
18. 3. 1. 5. Nu exist tehnici standardizate de stabilire a sensibilitii la
antibiotice i chimioterapice a tulpinilor de Chlamydia spp.
n tratament se pot folosi eritromicina (sau alte macrolide),
tetraciclinele sau fluorochinolonele.
18. 3. 2. Diagnosticul serologic n trahom (Chlamydia trachomatis)
Diagnosticul serologic implic utilizarea reaciei de fixare a
complementului, reaciei de microimunofluorescen i a tehnicilor de
tip ELISA. Se consider c un titru 1/64 este sugestiv n timp ce o
cretere de 4 ori a titrului n dinamic permite diagnosticul pozitiv.
Identificarea prezenei Ac de tip IgM la nou nscui permite
diagnosticul de pneumonie cu C. trachomatis. Tehnicile imunologice
sunt frecvent utilizate n scop epidemiologic (studii de seroprevalen).
18. 3. 3. Diagnosticul imunobiologic n infeciile cu C. trachomatis
Utilizarea intradermoreaciei (IDR Frei) a intrat n istoria medicinii.
18. 3. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse
de Mycoplasma pneumoniae
18. 3. 4. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se
realizeze respectnd regulile cunoscute (vezi capitolul nr. 6), n special
recoltarea ct mai rapid dup debutul bolii i nainte de iniierea
antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de exsudat
faringian, secreii nazale, sput, secreii genitale, urin etc. n
continuare vom discuta numai diagnosticul de laborator n infeciile
respiratorii. Transportul trebuie realizat la rece (la +4C) ct mai rapid
posibil, fr a depi un maxim de 3-4 ore de la recoltare. O alternativ
este reprezentat de utilizare mediilor speciale de transport care pot
asigura conservarea p.p. pentru cel mult 24 de ore. Utilizarea azotului
lichid (-70C) permite conservarea probelor timp de mai multe zile dar
nu este nc accesibil (cu foarte puine excepii) sistemului sanitar
romnesc.

18. 3. 4. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic nu permite


obinerea unor rezultate utile, M. pneumoniae ca i celelalte specii ale
ordinului are dimensiuni foarte reduse. Unii autori recomand
realizarea de frotiuri colorate imunofluorescent. Pornind de la p.p. s-ar
putea realiza amplificarea genetic (PCR) cu o sensibilitate foarte bun.
Prin tehnici de tip ELISA pot fi puse n eviden Ag de M.
pneumoniae n sput.
18. 3. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se
poate realiza utiliznd tehnici i medii speciale. Unul dintre mediile de
cultur cunoscut este mediul mbogit, pe baz de infuzie de cord
bovin numit generic PPLO. Acest mediu include att substane
nutritive, surse de energie, indicator de pH ct i substane care i
asigur selectivitatea. Cei mai muli autori recomand nsmnarea
p.p. att pe un mediu de cultur solid ct i pe un mediu de cultur
lichid (EX . bulion PPLO). Vom realiza o incubare la 37C n atmosfer
de 5% CO2 i urmrim culturile pe mediul lichid pentru a sesiza ct mai
rapid (dar nu mai devreme de 48-72 ore de incubare) modificrile de
culoare care trdeaz virajul pH-ului. Mediul devine acid prin
fermentarea glucozei n cel mult 3-4 sptmni. Este recomandat s
realizm repicri pe medii solide i lichide ct mai curnd dup ce am
observat virajul pH-ului (Figura nr. 5).
18. 3. 4. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va
realiza pe baza mai multor caractere:
morfotinctoriale nu sunt utile n identificarea M. pneumoniae
de cultur:
Se pot examina la stereomicroscop (cu mrire de minim 25x). n scopul
identificrii trebuie s citim placa cu mediu agarizat de cel puin 2 ori
pe sptmn. Pot aprea colonii de dimensiuni foarte mici (cu
diametru de la 10 pn la 200 m), cu aspect muriform. (Figura nr.
6)Sunt descrise i colonii cu aspect de ou-ochi, cu centrul dens, opac,
nconjurat de o zon periferic mai clar pe care unii autori le
consider drept tipice pentru Mycoplasma (astfel de colonii ar mai
putea fi produse de bacterii n form L i necesit realizarea
diagnosticului diferenial).
Se poate realiza i cultivarea pe oul de gin embrionat (inoculare
intravitelin) sau n culturi de celule.

biochimice: Fermenteaz glucoza, nu metabolizeaz arginina, nu


hidrolizeaz ureea dar reduce (n aerobioz) tetrazoliul. Acesta este un
compus incolor, iar n cazul n care este redus la formazan, culoarea
devine roie. Testul se poate realiza direct pe placa pe care
presupunem prezena coloniilor de M. pneumoniae.
Alte caractere care ar putea fi utilizate n identificare sunt:
Fenomenul adsorbiei hematiilor de cobai
Colorarea imunofluorescent a coloniilor cu seruri specifice marcate cu
fluorocromi
Inhibarea dezvoltrii coloniilor n jurul unor discuri impregnate cu
anticorpi specifici
Tehnici de biologie molecular (sonde nucleotidice, PCR) etc.
18. 3. 4. 5. Nu exist o standardizare a tehnicilor pentru determinarea
sensibilitii la antibiotice i chimioterapice. Tratamentul pneumoniei
cu M. pneumoniae se poate face cu eritromicin sau alte macrolide sau
cu tetracicline. Durata tratamentului este de circa 3 sptmni.
18. 3. 5. Diagnosticul serologic al infeciilor cu M. pneumoniae
n cursul infeciei se produc Ac din diferite clase, unii fiind utili pentru
neutralizarea M. pneumoniae n timp ce alii acioneaz ca auto-Ac
(determinabili prin reacia Coombs). Dintre acetia, aglutininele la
rece (crioglobuline) sunt Ac de tip IgM oligoclonali care reacioneaz
cu un Ag de la suprafaa hematiilor pacienilor infectai cu M.
pneumoniae. Cu toate c exist i alte maladii n care apar aglutinine la
rece, iar pe de alt parte acetia nu se pot identifica la toi pacienii
infectai cu M. pneumoniae, demonstrarea aglutininelor la rece
continu s fie util n diagnosticul serologic. Utilizm serul pacientului
pe care l amestecm cu eritrocite provenite de la pacieni de grup O,
incubm la 0C cteva minute i urmrim apariia aglutinrii. Dac
apare aglutinarea repetm testul realiznd diluii de ser pentru a
determina titrul. Un titru 1/32 este sugestiv pentru infecia cu M.
pneumoniae.
Se poate utiliza i RFC, dar pentru c Ac fixatori de complement apar
tardiv (3-4 sptmni) este util n studii epidemiologice. Tehnica de
tip ELISA poate determina Ac de tip IgM (anti adezina P1) i este util
n infecia acut.
18. 4. Direcii de cercetare

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate


trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva
link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se
resursele World Wide Web.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3148448
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3754237
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3730386
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2716518
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2633477
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2689234
18. 5. Povestire adevrat
n 2007 s-a descris un caz de M. Pneumoniae, fatal, la o tnr de 18
ani fr patologie subiacent. nainte de a fi internat n spital, ea s-a
adresat medicului de familie care a efectuat o radiografie ce a pus
diagnosticul de pneumonie. S-a nceput tratamentul cu un
medicament din clasa fluorochinolonelor, fr remisiunea
simptomatologiei. La examenul clinic obiectiv efectuat la internare s-a
constat febr de 40C i tuse productiv. Tratamentul antibiotic a fost
schimbat cu o asociere dintre o beta-lactamin (cefalosporin) i
macrolid; chiar i aa, evoluia a fost nefavorabil, cu progresie a
infiltratelor pulmonare, apariia revrsatelor pleurale bilaterale i
insuficien hepatic. Dei s-a instituit un regim antibiotic agresiv i
suport respirator, a dezvoltat pneumonie hemoragic, disfuncie
multipl de organ i a decedat n ziua 35. Diagnosticul de M.
pneumoniae s-a efectuat prin serologie. Dei diagnosticul bazat pe
cultivarea celulelor i PCR ar fi fost mai convingtor, cazul
demonstreaz susceptibilitatea adulilor fa de infeciile cu M.
pneumoniae i complicaiile grave care pot urma.
18. 6. Verificai-v cunotinele
1. Microorganismele din genul Mycoplasma:
A. Au structur asemntoare cu cea a microorganismelor Gram
pozitive
B. Pot cauza infecii pulmonare i uro-genitale
C. Nu se dezvolt pe medii acelulare

D.Cauzeaz pneumonie franc lobar


E. Mediul de cultur se poate examina la stereomicroscop
2. Privind patologia cauzat de microorganismele din
genul Chlamydia:
A. Trahomul este o infecie a aparatului uro-genital
B. Conjunctivita nou-nscutului apare la aproximativ o lun
dup natere
C. Infeciile uro-genitale cu Chlamydia spp. sunt mai des
asimptomatice la pacienii de sex masculin
D. Pentru infeciile uro-genitale exist un vaccin eficient
E. Diagnosticul se face doar prin examen bacteriologic direct
3. Diagnosticul de laborator al Chlamydia trachomatis cuprinde:
A. Diagnosticul bacteriologic, direct
B. Recoltarea produsului patologic (secreii uro-genitale)
C. Identificarea microorganismului pe baza caracterelor
morfotinctoriale
D. Antifungigrama
E. Testul de hemaglutinare
4. Diagnosticul infeciilor cu Mycoplasma pneumoniae se poate face
prin:
A. Microscopie optic direct a p.p.
B. Microscopie cu fluorescen a p.p.
C. Izolarea pe mediile de cultur lichide, apoi solide
D. Identificarea de crioglobuline
E. Inocularea n sacul vitelin al oului embrionat
5. Urmtoarele afirmaii despre genul Mycoplasma sunt false:
A. Sunt microorganisme obligatoriu parazite intracellular
B. Au perete celular caracteristic microorgasnimelor Gram
negative
C. Conin steroli n membrana citoplasmatic
D. Au dezvoltare nceat, avnd timpul de generaie de
aproximativ 12 ore
E. Se pot dezvolta pe medii de cultur selective, ce conin
indicatori pentru dezvoltarea microbian
18. 7. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)

1. Recoltarea p.p. n infeciile genitale cu microorganisme din


genul Chlamydiase face cu un tampon de vat.
2. Sputa se poate recolta att n infecii cu Chlamydia spp.
i Mycoplasma spp.
3. Tratamentul pentru conjunctivita nou-nscutului cu Chlamydia
trachomatistrebuie s fie sistemic.
4. Crioglobulinele sunt Auto-Ac de tip IgM ndreptai mpotriva
eritrocitelor ce apar n urma infeciilor cu Chlamydia spp.
5. Colorarea imunofluorescent duce la identificarea corpusculilor
elementari, corpusculilor reticulai (caracteristice pentru Chlamydia
spp.) i a Mycoplasma pneumoniae.

19. Diagnosticul de laborator n


infecii cu Candida albicans. (GabrielaLoredana Popa, Violeta-Corina
Cristea)

19. 1. Cuvinte cheie


Levuri
Pseudomicelii
Candidoz
Mediu Sabouraud
Antifungigram
19. 2. Introducere
Fungii sunt microorganisme eucariote, larg rspndite n natur. Au
fost descrise peste 250.000 de specii dar dintre acestea doar circa 200
pot fi implicate n patologia uman. n micologia medical fungii sunt
clasificai n: levuri, fungi dimorfi i fungi filamentoi. Levurile sunt
reprezentate de elemente unicelulare rotund ovalare care se nmulesc
prin nmugurire, fungii filamentoi cresc sub form de hife iar fungii
dimorfi pot prezenta ambele aspecte, putnd trece din forma de
levur n cea filamentoas n funcie de condiiile de mediu (levuri in
vivo, hife in vitro).
Genul Candida cuprinde peste 150 de specii, cele mai frecvent ntlnite
n patologia uman fiind reprezentate n ordinea frecvenei
de: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis, C. krusei. C.
albicans face parte din flora saprofit a cavitii bucale, tubului digestiv
i tractului genital feminin. Sunt microorganisme condiionat patogene
i determin infecii doar la pacienii ce prezint factori de risc att
intrinseci (EX . vrste extreme, endocrinopatii, hemopatii maligne,
SIDA) ct i extrinseci (EX . leziuni la nivel
tegumentar,tratament abuziv cu antibiotice i chimioterapice, terapie
imunosupresiv, diferite manevre medico-chirurgicale). n funcie de
localizare, infeciile fungice pot fi superficiale atunci cnd afecteaz
pielea, fanerele i mucoasele (bucale i peribucale, genitale) i infecii

invazive sau sistemice caracterizate prin invazia esuturilor profunde, a


organelor sau diseminare sangvin (fungemie sau candidemie). Infecia
sistemic frecvent are ca punct de plecare colonizarea cuCandida,
aceasta reprezentnd un factor de risc important n dezvoltarea
sepsisului.
19. 3. Diagnosticul de laborator poate fi micologic (direct)
sau imunologic(indirect).
19. 3. 1. Diagnosticul micologic
Fiecare laborator clinic trebuie s aib personal instruit i posibiliti
materiale pentru realizarea examenului micologic, sau mcar o parte
din acesta (recoltare, examinare microscopic, evidenierea levurilor structurilor miceliene - structurilor pseudo-miceliene, testul
filamentrii, zimograma, auxanograma i antifungigrama).
19. 3. 1. 1. Recoltarea i transportul p.p. se fac respectnd aceleai
reguli, discutate n cazul infeciilor bacteriene.
Spre ex. ntr-o candidoz superficial tegumentar, antiseptizm, dup
care recoltm p.p. prin tergerea zonei afectate cu un tampon steril
care este imersat ulterior ntr-un recipient cu mediu de transport. n
acelai mod mai recoltm un tampon din care vom efectua examinarea
microscopic. n cazul infeciilor de la nivelul unghiilor (onicomicoze),
raclm i colectm fragmentele de unghie ntr-un recipient sterilcu
capac etan. Timpul de transport nu trebuie s depeasc 48 de ore
(iar p.p. nu trebuie s se usuce). Pentru prevenirea multiplicrii
bacteriene n cazul acestor produse patologice se adaug antibiotice n
mediul folosit pentru nsmnare (frecvent se folosete mediul
Sabouraud cu cloramfenicol i gentamicin).
n cazul suspiciunii de fungemie se recolteaz hemoculturi de preferat
n recipiente special destinate acestui scop (BACTEC Mycosis-IC/F
Culture Vials) i transportate ctre laborator imediat sau la 37C
(Figura nr. 1). Este suficient o singur hemocultur pozitiv pentru a
pune diagnosticul de fungemie iar tratamentul antifungic se ncepe
imediat.
19. 3. 1. 2. Examinarea microscopic a p.p. are cteva particulariti
Dac examinm un p.p. sub form de scuame sau fragmente
unghiale, facem nti un preparat ntre lam i lamel, folosind o
soluie 10-30% KOH-glicerol care are rol de dilacerare a stratului

cornos. Dac utilizm i calcofluor alb (fluorocrom), levurile se


vdovoide, cu dimensiuni relativ mari,
iarpseudomiceliile i miceliile se vd galben-verzui sau alb-albstrui.
(Figura nr. 2) Aceste aspecte ne fac s suspicionm prezena Candida
spp. (cultivarea este ns strict necesar).
Dac examinm un p. p. recoltat de la nivelul mucoaselor, pregtim
i preparate ntre lam-lamel i frotiuri (colorate A.M. i Gram). n
cazul preparatelor proaspete folosim i calcofluor alb. Dac vedem
levuri i pseudomicelii, suspicionm prezena Candida spp. (Figura nr.
3)
19. 3. 1. 3. Cultivarea p. p. o facem pe mediul Sabouraud (putem
aduga, pentru selectivitate, cloramfenicol, gentamicin,
cicloheximid). Un p. p. necontaminat l cultivm pe Sabouraud
neselectiv. Un p. p. contaminat l cultivm i pe Sabouraud neselectiv
dar i selectiv. Potrivim termostatul la 28-30C, pentru incubare i
ateptm 24-96 ore.
19. 3. 1. 4. Identificarea o facem prin examinarea caracterelor
morfotinctoriale: Examinm preparate proaspete colorate cu
lactofenol i frotiuri fixate i colorate, remarcnd prezena levurilor
(rotunde, ovoide sau puin mai alungite, Gram pozitive); dovedim i
puritatea coloniei. (Figura nr. 4) n particular, dac repicm din colonie
pe un mediu cu agar i fin de porumb (slab nutritiv) i apoi facem un
preparat ntre lam i lamel, vom vedea apariia de chlamidospori (la
extremitatea pseudomiceliilor). (Figura nr. 5)
de cultur: Produc n 24-96 ore colonii de tip S (rotunde, bombate,
netede, albe, care seamn cu coloniile bacteriene dar sunt mai mari).
(Figura nr. 6)
biochimice: Facem spre EX . auxanograma (levurile au un
echipament enzimatic i pot s utilizeze un anumit carbohidrat ca
unic surs de carbon; C. albicans asimileaz glucoz, maltoz,
trehaloz, galactoz etc.). (Figura nr. 7)Testarea fermentrii unor
carbohidrai poart numele de zimogram. (Figura nr. 8)
antigenice: Putem folosi diferite tehnici (aglutinare pe lam, latexaglutinare, ELISA).
alte teste care ar putea fi utile n identificare

Testul filamentrii - verificm capacitatea blastoconidiilor de a


produce, n anumite condiii, tubi germinativi [repicm tulpina pe
medii care conin ser de iepure; din 60 n 60 de minute pregtim
preparate ntre lam i lamel i examinm microscopic pentru a
detecta prezena tubilor germinativi; C. albicans produce n maxim 4
ore pseudofilamente/tubi germinativi relativ (scurte, fr stricturi, cu
un calibru similar)]; (Figura nr. 9)
Detectarea unor metabolii prin tehnici cromatografice;
Identificarea se mai poate obine prin utilizarea unor kit-uri
comerciale precum Candifast, Auxacolor, API 20C, API 32C etc.
19. 3. 1. 5. Antifungigrama a fost pus la punct (standardizat) relativ
recent.
Exist sisteme comerciale care efectueaz antifungigrama pe o diluie
a unor antifungice (Candifast) sau pe dou diluii (Fungitest).
Standardele EUCAST i CLSI recomand metoda diluiilor n bulion sau
E-test. (Figura nr. 10)
19. 3. 2. Diagnosticul imunologic
Diagnosticul imunologic poate fi serologic i imunobiologic.
19. 3. 2. 1. Diagnosticul serologic
Exist studii care arat c identificarea i titrarea Ac anti-C.
albicans poate fi util n diagnosticul candidozelor profunde. Iniial au
fost utilizate tehnici de aglutinare pentru detectarea prezenei Ac antimanan. Ulterior au fost puse la punct tehnici pentru detectarea
prezenei Ac fa de Ag localizate n citoplasma C. albicans. Detectarea
de antigen C. albicans n ser este nalt sugestiv pentru o candidoz
sistemic sau generalizat.
19. 3. 2. 2. Diagnosticul imunobiologic
Intradermoreacia cu candidin este pozitiv la majoritatea
persoanelor adulte, fiind astfel util n aprecierea existenei RIC. Se mai
poate utiliza testul transformrii blastice a limfocitelor n prezena unor
Ag de C. albicans.
19. 4. Direcii de cercetare
Chiar dac nu toate noiunile prezentate n manualele de specialitate
trebuie nvate ca atare, n dezvoltarea pe parcursul activitilor
universitare considerm c este necesar ca cititorii s citeasc mai
mult, pentru o ct mai bun informare. Ca atare, recomandm cteva

link-uri corespunztoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se


resursele World Wide Web.
1. http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1472-6831-14-14.pdf
2. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3884923/
3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3892259/
4. http://www.e-jmii.com/article/S1684-1182(13)00206-5/fulltext
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3818827/
6. http://www.revistanefrologia.com/modules.php?name=articulos&i
darticulo=11790&idlangart=ES
7. https://www.landesbioscience.com/journals/virulence/2013VIRULE
NCE0008R.pdf
8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3767025/
9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21666985
19. 5. Povestire adevrat
O pacient n vrst de 79 de ani, cu antecedente de urolitiaz, se
prezint la camera de gard a unui spital pentru durere acut n flancul
drept i febr. Imagistica relev prezena unei mase hiperecogene,
neomogen, situat n pelvisul renal drept, cu hidronefroz
concomitent. Urografia cu substan de contrast a relevat un defect
extins de umplere cu pelvis renal mrit ca urmare a prezenei unei
mase amorfe cu bule de gaz pe alocuri. Constatrile radiologice au fost
extrem de sugestive pentru urolitiaz. S-a intervenit chirurgical i s-a
prelevat ntr-o cantitate considerabil un amestec de cheaguri de
snge i mici calculi. Aspectul intraoperator ns, a fost sugestiv pentru
o infecie fungic. Cultura pe Sabouraud din p.p. extirpat a confirmat
prezena de C. albicans. S-a administrat tratament antifungic cu
fluconazol 400 mg pe zi i datorit evoluiei favorabile pacienta a fost
externat a 6-a zi postoperator. Tratamentul s-a continuat 30 de zile la
domiciliu iar la uroculturile de control efectuate la 3 luni i 1 an de la
intervenie nu s-a observat recdere.
Discuii
Mai mult de jumtate din cazurile de infecii fungice ale tractului urinar
sunt cauzate de specii de Candida ns foarte rar acestea determin
uropatii obstructive. Diabetul zaharat, imunosupresia, bolile cronice i
bolile maligne sunt cunoscute ca situaii predispozante pentru infecii

fungice. Dar, n cazul de fa, pacienta nu prezenta nici una n


antecedentele personale. Acest aspect a condus diagnosticul ctre o
pist greit, motiv pentru care nu s-au efectuat culturi bacteriene i
fungice anteoperator.
19. 6. De reinut
n cazul unei obstrucii de tract urinar superior cu caracteristici
preoperatorii imagistice de zone calcifiate intercalate cu bule de gaz ar
trebui s fie luat n considerare etiologia fungic, chiar i la pacienii
imunocompeteni. Astfel, recoltarea de urin pentru culturi dirijeaz i
confirm diagnosticul, respectiv strategia terapeutic ce trebuie
efectuat: terapie antifungic urmat eventual de acces minim invaziv
la nivelul sistemului pielocaliceal pentru evacuare.
19. 7. Verificai-v cunotinele
1. Levurile au caracteristic:
A. Creterea la 37C
B. Creterea la 25C
C. Determin onicomicoze
D. Formeaz colonii cu aspect pufos
E. Colonizeaz mucoasele
2. Care din urmtoarele caracterizeaza fungii dimorfi?
A. Sunt levuri in vitro
B. Sunt fungi filamentoi in vivo
C. Pot prezenta ambele aspecte
D. Au ambele aspecte in vitro
E. Sunt doar levuri in vivo
3. C. albicans face parte din flora saprofit de la nivelul
A. Mucoasei oral
B. Vezicii urinare
C. Tubului digestiv
D. Corneei
E. Tractului genital feminin
4. Care din urmtorii reprezint factori de risc pentru o infecie
fungic?
A. Hemopatiile maligne
B. Adolescena
C. SIDA

D. Oboseala
E. Implanturile
5. Soluia 10-30% KOH-glicerol este folosit pentru
A. Dilacerare strat cornos
B. Prinderea p.p. de lam
C. Colorarea fungilor
D. Mordant
E. Nu are un rol deosebit.
19. 8. Myth busters (ALEGEI ntre adevrat i fals)
1. Din genul Candida doar specia C. albicans este patogen pentru om.
2. Diagnosticul de fungemie poate fi pus prin pozitivarea unei singure
hemoculturi care relev fungi.
3. Transportul flacoanelor de hemocultur pentru fungi trebuie fcut la
temperatura de 37C.
4. Antigenul de C. albicans n ser nu are valoare diagnostic.
5. Intradermoreacia cu candidin este negativ la majoritatea
persoanelor adulte.