UNIVERSIDAD DE LAS

FUERZAS ARMADAS ESPE

PERFIL DE PROYECTO INTEGRADOR

Estandarizaci
on del An
alisis
Microbiol
ogico para el proceso de
fabricaci
on de Cerveza Artesanal para la
microcervecera QUINDE BREWERY.

Tutores:
Autor:

Msc. Alma Koch

Carlos Caiza

Ing. Marco Taipe

Proyecto Integrador IIB

Departamento de Ciencias de la Vida

Carrera de Ingeniera en Biotecnologa
Sangolqu-Ecuador
Diciembre, 2013.

Contenido
1 Resumen

2 Introducci
on

3 Justificaci
on

4 Objetivos e Hip
otesis del Proyecto
4.1 Objetivo general . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Objetivos especficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3 Hip
otesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4
4
4
4

5 Marco Te
orico
5.1 Levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1 Levadura cervecera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1.1 Morfologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1.2 Composicion celular . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Reproducci
on de la levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.1 Reproducci
on sexual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2 Reproducci
on asexual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2.1 Division celular . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2.2 Esporas vegetativas . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2.3 Gemacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.3 Factores que intervienen en la reproduccion de la levadura
5.2.3.1 Oxgeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.3.2 Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.3.3 Composicion del mosto (sustrato nutritivo) . . .
5.3 Floculaci
on de la levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3.1 Hidrofobosidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3.2 Potencial Zeta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3.3 Interacci
on protenas az
ucares . . . . . . . . . . . . . .
5.4 Factores que influyen en la floculacion . . . . . . . . . . . . . . .
5.5 Mutaci
on de la levadura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6 Deterioro de la cerveza por microorganismos contaminantes . . .
5.6.1 Levaduras salvajes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6.2 Bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6.3 Bacterias l
acticas como contaminantes . . . . . . . . . . .
5.6.3.1 Lactobacillus spp. . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6.3.2 Pediococcus spp. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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11
11

Contenidos

5.7

ii

5.6.4 Bacterias del

acido acetico . . . . . . . . . . . .
5.6.5 Zymomonas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6.6 Enterobacteriaceae . . . . . . . . . . . . . . . .
5.6.7 Subproductos que pueden afectar la calidad del
Proceso de elaboraci
on de cerveza artesanal . . . . . .
5.7.1 Molienda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7.2 Proceso en Pailas . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7.3 Filtraci
on del Mosto . . . . . . . . . . . . . . .
5.7.4 Ebullici
on del Mosto . . . . . . . . . . . . . . .
5.7.5 Enfriamiento del Mosto . . . . . . . . . . . . .
5.7.6 Fermentaci
on . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7.7 Maduraci
on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7.8 Filtraci
on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7.9 Envasado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.7.10 Diagrama del Proceso de Elaboracion . . . . .

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producto
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6 Materiales y M
etodos
6.1 Tipo de estudio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2 Evaluaci
on de los puntos claves en el proceso de elaboracion
6.3 Toma de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.4 Tinci
on Gram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5 Medios de Cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.1 Medio TSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.2 Medio SDA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.3 Medio MRS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.4 Soluci
on salina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.5.5 Inoculaci
on e incubacion . . . . . . . . . . . . . . . .
6.6 Pruebas Bioqumicas de identificacion bacteriana . . . . . .
R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.6.1 Pruebas API
6.7 Recuento celular para Saccharomyces cerevisiae . . . . . . .
7 Resultados
7.1 Medio TSA . . . . . . . . . . . . . . . .
7.2 Medio SDA . . . . . . . . . . . . . . . .
7.3 Medio MRS . . . . . . . . . . . . . . . .
7.4 Pruebas API (Identificacion Bioqumica)
7.4.1 Interpretaci
on de Pruebas API .
7.5 Recuento en Placa Petrifilm . . . . . . .

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8 Discusi
on

29

9 Conclusiones y recomendaciones

31

Captulo 1

Resumen
Este trabajo se realiz
o con el objetivo de analizar los microorganismos presentes en el
proceso de fabricaci
on de cerveza artesanal y evaluar la calidad microbiologica del producto ya terminado en una microcervecera local.
La parte inicial del trabajo se centro en la descripcion del microorganismo responsable
de la fermentaci
on alcoh
olica para el proceso de fabricacion de cerveza artesanal, tal
organismo conocido normalmente como levadura es Saccharomyces cerevisiae. Aqu se
detallaron los aspectos relacionados de este orgsnismo durante la fermentacion y los
posibles problemas que pueden surgir como un mal manejo de estos microorganismos.
Mas adelante hizo una revisi
on del proceso tpico cervecero llevado a cabo en la microcervecera con el fin de identificar los puntos claves durante la produccion para as llevar
a cabo el cumplimiento de los objetivos que se han planteado, se tomaron muestras en
cada una de las etapas identificadas. El manejo de las muestras se lo realizo utilizando
material esteril y su almacenamiento previo a la siembra se llevo a cabo bajo condiciones
de refrigeraci
on para evitar la multiplicacion de microorganismos presentes en estas o la
proliferaci
on de contaminantes por mal manejo de las mismas.
Como parte complementaria se realizaron los procesos concernientes al analisis microbiologico de los organismos que se puedan encontrar en las muestras.
Los resultados obtenidos durante todo el proceso de investigacion fueron organizados en
tablas para su respectivo an
alisis. Para el aislamiento e identificacion de los diferentes
microorganismos se realizaron las tecnicas de siembra mas conocidas utilizando medios
altamente selectivos que garantizo el exito de la siembra.

Captulo 2

Introducci
on
El objetivo clave de una microcervecera es que la calidad de las cervezas que ofrece
surge como consecuencia de hacer las cosas bien desde el comienzo, en forma ordenada
y met
odica, es as como en el proceso de elaboracion se ha observado que uno de los
aspectos m
as importantes para este tipo de empresa consiste en garantizar una excelente
calidad de su producto, por medio de un riguroso control, la utilizacion de una buena y
adecuada materia prima y la realizacion de un optimo proceso de fabricacion, logrando
as satisfacer las expectativas de sus clientes.
En la medida que se avanza en el proceso de elaboracion de la cerveza, se evidencia
que dentro de cada una de las etapas de elaboracion existen muchos riesgos que pueden
afectar el producto; estos aspectos pueden ser: organolepticos, fsico- qumicos y microbiol
ogicos, y de esta manera influir en la calidad del producto terminado. En el
control de la calidad se encuentran involucrados no solo el control proceso, las especificaciones y el muestreo, sino tambien los procedimientos de organizacion, documentaci
on
y autorizaci
on que aseguran se lleven a cabo las pruebas pertinentes para verificar el
cumplimiento de los est
andares nacionale, y porque no tambien internacionales y de
esta manera asegurar que la calidad es alta.
Es as como en este trabajo de investigacion se planteo analizar los microorganismos
presentes en el proceso de fabricacion de cerveza artesanal y evaluar la calidad microbiologica del producto ya terminado, con el fin de identificar los microorganismos tpicos
o posibles contaminantes, que puedan afectar la calidad del proceso de elaboracion y de
esta manera establecer por medio de los resultados obtenidos, si estos afectan la calidad
del producto terminado.

Captulo 3

Justificaci
on
La calidad de la cerveza en el sentido mas amplio, es la suma de todas aquellas caractersticas que le permiten a un producto llenar los requisitos del mercado y atraer a
los consumidores para quienes esta dirigido; la calidad tambien es usada para denotar
la ausencia de defectos y, mientras que el termino se aplica tanto al empaque como
al proceso de elaboraci
on del producto, solo este u
ltimo aspecto sera evaluado en este
proyecto.
Las cerveceras generan y recolectan grandes cantidades de informacion con respecto a
caractersticas especficas de la produccion de la cerveza tanto en producto en proceso
como en el producto terminado, la cual requiere ser analizada de una manera confiable
para que se constituya en una herramienta basica para el control de su proceso.
Considerando esto, se hace importante la necesidad de conocer el comportamiento microbiol
ogico de la cerveza, en cada una de sus etapas de produccion, para que al obtener
los datos, dicha informaci
on contribuya a mejorar la calidad, consistencia del producto y
confiabilidad del proceso que se lleva a cabo, para establecer finalmente que los analisis
realizados son precisos y repetibles, que estan utilizando los controles de proceso adecuados, para que los cerveceros puedan centrar su atencion en la administracion y mejora
continua del proceso.

Captulo 4

Objetivos e Hip
otesis del
Proyecto
4.1

Objetivo general

Estandarizar el an
alisis microbiologico para el proceso de elaboracion de cerveza artesanal para la microcervecera QUINDE BREWERY.

4.2

Objetivos especficos

Identificar levaduras Saccharomyces y no Saccharomyces en las muestras recolectadas.

Identificar los posibles microorganismos contaminantes.
Deternimar el n
umero de levaduras por recuento en placas de Petrifilm.

4.3

Hip
otesis

Para el proceso de fabricaci

on de cerveza artesanal se puede plantear un protocolo de
analisis microbiol
ogico, el cual permita mantener un control periodico en el lugar de
producci
on.

Captulo 5

Marco Te
orico
5.1

Levadura

Las levaduras son hongos unicelulares que se reproducen principalmente por gemacion,
son organismos eucari
oticos, es decir que tienen una membrana nuclear bien definida
que envuelve el n
ucleo [Adams et al, 1998].
Las levaduras son las causantes principales de la fermentacion de los alimentos, lo cual
puede ser perjudicial (deterioro) o favorable (produccion de cervezas, vinos, pan, quesos,
enzimas, etc) [Adams et al, 1998].

5.1.1

Levadura cervecera

Saccharomyces cerevisiae tiene como caracterstica que al final de la fermentacion se

va al fondo del tanque, se la conoce como levadura de profundidad y su temperatura
optima de fermentaci
on es de 1014C [Aguilar, 2003].

5.1.1.1

Morfologa

S. cerevisiae tiene forma esferica, elipsoide u ovoide. Su tama

no vara con la edad de
la celula pero generalmente oscila entre 4 y 14 micras. Puede vivir aislada o formando
colonias [Aguilar, 2003].

Marco Te
orico

Fig. 5.1: Morfologa de Saccharomyces cerevisiae[Caiza, 2013].

5.1.1.2

Composici
on celular

Con el objeto de producir una nueva celula, todos los compuestos presentes en la celula se
deben incrementar. La celula de levadura tiene alrededor del 75 80% de agua [Adams
et al, 1998].
El contenido de otros materiales es usualmente expresado como % de la materia seca
remanente.
La celula est
a constituida aproximadamente por:
P-glucanos (polisac
arido) 40%
Mananos (polisac
arido) 40%
Protenas 8%
Lpidos (grasas) 7%
Sustancias inorg
anicas 3%
Hexosamina y quitina 2%

5.2

Reproducci
on de la levadura

La levadura se puede reproducir de dos formas diferentes: sexual y asexual.

5.2.1

Reproducci
on sexual

En este proceso se realiza la fecundacion uniendose dos celulas sexuales.

Los dos

n
ucleos de las celulas se unen formando uno, mezclandose el material genetico de los
dos padres.De este tipo de reproduccion resultan cuatro celulas hijas, cada una con la
mitad de los cromosomas iniciales [Klimovitz, 2002].

Marco Te
orico

5.2.2

Reproducci
on asexual

Se caracteriza porque se genera sin fecundacion, un solo individuo puede producir una
celula completamente nueva [Klimovitz, 2002]. Este tipo de reproduccion puede ocurrir
de tres maneras:

5.2.2.1

Divisi
on celular

Es una simple divisi

on de la celula formando un nuevo individuo a partir del que se est
a
dividiendo (bacterias y algunos tipos de levaduras) [Klimovitz, 2002].

5.2.2.2

Esporas vegetativas

La celula forma un cuerpo reproductor, que una vez afuera y en condiciones del medio
adecuadas produce un nuevo organismo (bacterias y hongos)[Klimovitz, 2002].

5.2.2.3

Gemaci
on

Es la m
as importante en este caso porque es la principal forma en que se reproduce la
levadura cervecera[Klimovitz, 2002].
La celula madre produce un peque
no brote en la pared celular, que aumenta gradualmente y se estructura poco a poco como una nueva celula de levadura [Klimovitz, 2002].
Cuando la celula hija ha alcanzado el desarrollo adecuado, se separa de la celula
madre por estrangulaci
on dejando una cicatriz en la pared celular [Klimovitz, 2002].
Es posible llegar a tener cadenas celulares cuando una madre tiene varias formaciones de nuevas celulas al mismo tiempo y a su vez las celulas en crecimiento empiezan
a ser madres de otras nuevas, sin haber terminado de separarse [Klimovitz, 2002].

5.2.3
5.2.3.1

Factores que intervienen en la reproducci

on de la levadura
Oxgeno

A mayor oxigeno, entonces mayor es la velocidad de reproduccion.

5.2.3.2

Temperatura

A mayor temperatura, mayor velocidad, teniendo en cuenta que la temperatura optima

de desarrollo se encuentra entre 25o C y 30o C.

Marco Te
orico
5.2.3.3

Composici
on del mosto (sustrato nutritivo)

Debe contener los nutrientes requeridos para la formacion de la nueva celula.

5.3

Floculaci
on de la levadura

La floculaci
on es una propiedad fsica, donde las celulas de la levadura se adhieren unas
con otras, formando grupos que rapidamente sedimentan (levaduras de fondo) o alcanzan la superficie del liquido (levaduras de superficie) [Klimovitz, 2002].
Una levadura que flocule bien facilita la separacion y recoleccion de la levadura, disminuye tiempos de proceso y evita que pase excesiva cantidad de levadura a maduraci
on
(riesgos de autolisis) [Klimovitz, 2002].
Los mecanismos fsicos por medio de los cuales la levadura flocula son:

5.3.1

Hidrofobosidad

La pared celular presenta caractersticas hidrofobas (repele el agua) lo que hace que se
aglomeren. Esta propiedad esta asociada a la edad de la celula [Klimovitz, 2002].

5.3.2

Potencial Zeta

Es una medida de la carga electrica de la superficie celular. La reduccion en esta carga

favorece el acercamiento celular (y por ende la floculacion). La carga superficial se afecta
por el pH del medio y la presencia de sustancias buffer como los fosfatos [Klimovitz,
2002].

5.3.3

Interacci
on protenas az
ucares

Existe una protena llamada lectina que tiene la propiedad de reconocer (atraer)
sacaridos como la manosa. Como la pared celular de la levadura es rica tanto en lectina
como en manosa se considera factible que estos compuestos se atraigan entre si uniendo
las celulas[Klimovitz, 2002].

5.4

Factores que influyen en la floculaci

on

Una levadura que carezca de los factores geneticos de la floculacion no podra flocular.
A menor temperatura la levadura entra en un estado de latencia que activa el sistema

Marco Te
orico

de floculaci
on.
A menor pH se activa la floculacion por la neutralizacion de cargas en la pared celular.
Durante la fermentaci
on hay una cada de pH por lo que la levadura tiende a flocular al
final.
El calcio favorece la formaci
on de lectina en la pared celular y facilita la union lectinamanosa entre las celulas de la levadura.
La presencia de az
ucares (como la manosa) o de protenas tipo lectina en el mosto puede
bloquear los sitios de atracci
on de la pared de la celula e interrumpir la floculaci
on
[Klimovitz, 2002].

5.5

Mutaci
on de la levadura

Se conoce como mutaci

on los cambios que ocurren en la informacion genetica de la
celula (DNA) inducido por factores externos y que pueden generar variaciones en el
metabolismo o comportamiento celular, asociados a la fraccion de DNA alterado [Heggart, 1999]..
En el proceso cervecero se pueden favorecer las mutaciones por malas practicas de manejo
almacenamiento, de tratamiento la levadura acido, (condiciones contaminacion externas
con de levaduras diferentes, etc). Sin embargo nos es muy com
un que se presenten mutaciones a gran escala en el proceso tpico cervecero [Heggart, 1999].

5.6

Deterioro de la cerveza por microorganismos contaminantes

Los microorganismos causantes de deterioro durante la preparacion y el procesamiento

de la cerveza se limitan a algunos generos de bacterias , levaduras salvajes, y los hongos.
Esto es porque la cerveza es un medio de crecimiento desfavorable para la mayora de
microorganismos. El alcohol contenido, bajo pH y la presencia de componentes de l
upulo
son agentes que inhiben el crecimiento de organismo extra
nos, mientras que la falta de
nutrientes restringe el crecimiento de estas celulas. Sin embargo , estas pueden interferir
con la fermentaci
on o tener efectos negativos sobre sabor de la cerveza y la vida u
til
[Hornsey, 2003].

Marco Te
orico

5.6.1

10

Levaduras salvajes

Se considera como levadura salvaje o silvestre cualquier especimen que no corresponda al utilizado en el proceso y que aparece como contaminante del medio o equipos
de trabajo [Heggart, 1999].
No todas las levaduras salvajes originan defectos en el producto, pero son indeseables
ya que pueden llegar a competir con la levadura del proceso. Algunos tipos de levadura
salvaje, pueden producir velos (turbidez), malos olores, sabores anormales, floculaci
on
deficiente y fermentaci
on diferente. Las levaduras salvajes se pueden identificar por
diferentes formas:
Forma de las celulas (redondas, ovales, alargadas, etc).
Tama
no de la celula.
Forma de agrupamiento de las celulas (aisladas, cadenas, etc).
Forma de reproducci
on.
Metabolismo fermentativo.
Algunas de las levaduras salvajes mas comunes en cervecera son: Saccharomyces elipsoideus, S. turbidans, S. pastorianus, S. chevaliere. C
andida utilis, C. tropicales y C.
mycodema [Heggart, 1999].

5.6.2

Bacterias

Para todos los efectos pr

acticos solo hay siete generos comunes de contaminantes bacterianos en la f
abrica de cerveza . Estos se dividen en dos categoras en funcion de su
reacci
on a una procedimiento de tincion diferencial , la tincion de Gram . La tincion de
Gram divide bacterias cerveceras en dos grupos [Heggart, 1999].
Bacterias Gram Positivas.
Bacterias Gram Negativas
Dentro del primer grupo encontramos a las bacterias
acido l
acticas

Marco Te
orico

5.6.3

11

Bacterias l
acticas como contaminantes

El grupo de bacterias l
acticas esta constituido por cocos y bacilos que comparten propiedades
fisiol
ogicas y bioqumicas y cuyo metabolismo generador de energa es fermentativo, los
sustratos fermentables son az
ucares que incluyen variedad de monosacaridos, disacaridos
y polialcoholes y cuyo producto final principal es el acido lactico y en algunos casos el
u
nico dependiendo de la ruta metabolica que utilicen para convertir los carbohidratos,
de ah que las bacterias l
acticas pueden dividirse en dos grupos seg
un los productos
resultantes de la fermentaci
on de glucosa [Jacques et al, 1999].
Bacterias del
acido l
actico son capaces de crecimiento a lo largo de fermentacion, ya que
son resistentes a etanol, no requieren oxgeno y pueden sobrevivir en niveles bajos de
pH. El nivel
optimo para el crecimiento es de aproximadamente 5,5 , pero algunas cepas
puede sobrevivir a niveles de pH tan bajos como 3,5 [Hornsey, 2003].
Las bacterias l
acticas a menudo son contaminantes presentes el los granos secos (cebada, trigo, avena, etc.) y pueden actuar al momento de activar la levadura para la
fermentaci
on. Ellos pueden ser los organismos infecciosos mas significativos durante fermentaci
on y maduraci
on, adem
as causan turbidez , acidez y sabores desagradablesdebido
a la presencia de diacetilo [Hornsey, 2003].

5.6.3.1

Lactobacillus spp.

En terminos generales , las bacterias del acido lactico son las mas problematicas de las
bacterias de la putrefacci
on de cerveza, se cree que Lactobacillus spp. son mas peligrosos
durante la maduraci
on y despues del envasado [Hornsey, 2003].

5.6.3.2

Pediococcus spp.

Pediococcus es un contaminante mas com

un que el Lactobacillus y es prevalente al final
de la fermentaci
on y durante la maduracion. Es particularmente frecuente como un
organismo que deteriora la cerveza fermentada a bajas temperaturas [Hornsey, 2003].
Este organismo es uno de los mas temidos debido a la dificultad de sacarlo de la fabrica
de cerveza. La contaminaci
on es mas a menudo de los depositos calcificados turbios
[Klimovitz, 2002].

5.6.4

Bacterias del
acido ac
etico

Son bacterias Gram Negativas. Estas

son particularmente conocidas en fabricas de
cerveza por su capacidad para producir acido acetico y, por lo tanto, sabores a vinagre

Marco Te
orico

12

y turbidez. La superficie de contaminacion que causan a menudo es evidente como una

pelcula aceitosa o con moho [Klimovitz, 2002].
Las bacterias del
acido acetico pueden desarrollarse en ambientes aerobicos o microaeroflicos.
Se desarrollan mejor en el mosto y la cerveza cuando se expone a aire durante la fermentaci
on inicial [Klimovitz, 2002].
Estas bacterias son por lo tanto incapaces de crecer despues de que el cultivo de levadura
ha utilizado el oxgeno disuelto en el mosto [Hornsey, 2003].
No hay ninguna restricci
on del crecimiento de bacterias de acido acetico por un pH bajo,
o por resinas de l
upulo o sus is
omeros [Klimovitz, 2002].
Bacterias del
acido acetico se subdividen en los generos Acetobacter y Acetomonas.

5.6.5

Zymomonas

Es la principal bacteria anaerobia que puede deteriorar la cerveza. Las Zymomonas

en cervezas son capaces decrecer rapidamente; solo unas pocas celulas por litro puede
producir el deterioro en cuesti
on de das [Hornsey, 2003].
Es particularmente un problema en la industria cervecera del Reino Unido debido a las
practicas continuas de maduracion barril, y quizas tambien debido a las temperaturas
mas altas en la fermentaci
on [Klimovitz, 2002].
La contaminaci
on por Zymomonas en una fabrica de cerveza se da a menudo ren la fase
de envasado, aunque en algunos casos se remonta a la etapa de fermentacion [Hornsey,
2003].

5.6.6

Enterobacteriaceae

Especies de esta familia incluyen Klebsiella, Citrobacte y Enterobacter, que son bacterias m
oviles y anaer
obicas. Estas especies se denominan coliformes , ya que estan
estrechamente relacionadas con Escherichia coli, un ejemplo bien conocido de la familia.
Normalmente atacan durante el enfriamiento y el periodo de retraso de la fermentacion.
El mosto enfriado es un medio ideal para su crecimiento [Hornsey, 2003].

5.6.7

Subproductos que pueden afectar la calidad del producto

La producci
on de algunos compuestos por bacterias contaminantes contribuye a la disminuci
on de la calidad del producto final de la fermentacion as como el desarrollo mismo
del proceso pues el microorganismo fermentador puede ver afectada su fisiologa por la
presencia de sustancias extra
nas y/o en altas cantidades [Jacques et al, 1999].
Los
acidos l
actico y acetico son productos que afectan notablemente las caractersticas

Marco Te
orico

13

organolepticas del producto (etanol), pues se producen a partir de el, as como la acrolena y el diacetil, una cetona que puede producirse durante la fermentacion cuando el
piruvato es convertido a
acido lactico y algunas especies de Pediococcus y Lactobacillus
son los responsables de dicha produccion, no obstante, las levaduras producen diacetil
durante los primeros estados de la fermentacion pero este es removido por la accion de
varias enzimas y por la presencia de algunos aminoacidos en el medio [Jacques et al,
1999].

5.7

Proceso de elaboraci
on de cerveza artesanal

La cerveza, al igual que otras bebidas similares producidas con cereales, es sometida a
fermentaci
on pero no a destilacion. Las materias primas que intervienen en el proceso
son agua, l
upulo y cebada, suplida a veces por el maz, el arroz o el az
ucar [Hough, 1990].

5.7.1

Molienda

Tanto la malta como los cereales sin maltear (trigo, avena, centeno, maz, arroz), tienen
que pasar por el molino que rompe el grano, dando lugar a la harina y otras partes fijas
[Hornsey, 2003].
La molienda consiste en destruir el grano, respetando la cascara o envoltura y provocando la pulverizaci
on de la harina. La malta es comprimida entre dos cilindros pero
evitando destruir la c
ascara lo menos posible, pues esta servira de lecho filtrante en la
operaci
on de filtraci
on del mosto; a su vez el interior del grano en una harina lo mas fina
posible. Estas dos condiciones, cascara entera y harina fina no podran respetarse si el
grano no est
a seco (excepci
on molienda h
umeda) y muy bien desagregado, una tercera
exigencia es un buen calibrado de la malta. La molienda debe ser tambien regulada
seg
un el cocimiento posterior [Hornsey, 2003].

5.7.2

Proceso en Pailas

En esta parte del proceso se extraen de la malta y eventualmente de los granos crudos la
mayor cantidad de extracto y de la mejor calidad posible en funcion al tipo de cerveza
que se busca fabricar. La extraccion se logra principalmente por hidrolisis enzimatica,
solamente un 10% de la extraccion es debida a una simple disolucion qumica. Las

Marco Te
orico

14

amilasas desdoblan el almid

on en dextrinas y maltosa, principalmente las enzimas proteolticas desdoblan las protenas complejas en materias nitrogenadas solubles, la fitasa
desdobla la fitina en inositol y fosfato, etc. Estas transformaciones enzimaticas han sido
ya empezadas durante el malteado a un ritmo menos intenso del que sucedera en el
cocimiento; donde debido a la accion de las diferentes temperaturas y la gran cantidad
de agua las reacciones suceden muchas veces en forma explosiva [Hough, 1990].
Cuantitativamente el desdoblamiento del almidon en az
ucares y dextrinas es el mas importante. Las principales reacciones que ocurren durante el cocimiento por accion de
las amilasas son formaci
on de dextrinas, formacion de maltosa y en menor proporci
on
formaci
on de glucosa [Hough, 1990].

5.7.3

Filtraci
on del Mosto

Una vez disueltas las materias solubles por el cocimiento es necesario separar el mosto de
la parte insoluble llamada orujo o afrecho. La operacion se realiza en dos fases: primero
el flujo del mosto y luego la operacion de lavado del extracto que contiene el afrecho
[Verstrepen, 2003].
El mosto y el agua de lavado deben ser claros pues si se aporta durante la operaci
on
demasiadas sustancias mal disueltas, la clarificacion de la cerveza sera demasiado difcil.
La calidad de la cerveza puede ser tambien alterada por un lavado de afrecho con agua
alcalina pues los polifenoles y sustancias amargas de la cascara de la malta se disuelven
muy f
acilmente en agua alcalina a
un mas si se tiene en cuenta que el lavado se hace en
agua a una temperatura m
axima de 75 C; esta no puede exceder ese lmite, pues se corre
el riesgo de disolver almid
on presente a
un en el afrecho, lo que conllevara a problemas
de turbiedad y fermentaci
on posteriores [Verstrepen, 2003].

5.7.4

Ebullici
on del Mosto

La finalidad de la ebullici
on es estabilizar enzimatica y microbiologicamente el mosto,
buscar la coagulaci
on de las protenas. La destruccion de las enzimas es realizada para
evitar que sigan desdoblando a lo largo de la fermentacion, las amilasas podran seguir
desdoblando las dextrinas y estas se transformaran enteramente en alcohol [Hornsey,
2003].
La esterilizaci
on del mosto es obtenida por simple ebullicion, pues su reaccion es ligeramente
acida. La coagulaci
on de las materias protenicas debe hacerse lo mejor posible,
pues si subsisten en el mosto ocasionaran problemas en la fermentacion, provocando
facilmente turbiedad en la cerveza embotellada. La esterilizacion y la destruccion de las
enzimas es f
acil de realizar, un cuarto de hora de ebullicion es generalmente suficiente

Marco Te
orico

15

[Hornsey, 2003].
La coagulaci
on de protenas es mucho mas difcil, se realiza por etapas, la primera es la
desnaturalizaci
on que consiste en la ruptura de puentes de hidrogeno en la molecula de
protena, pasando del estado hidratado al deshidratado, manteniendose en suspensi
on
u
nicamente por su carga electrica; luego de la desnaturalizacion se produce la coagulacion propiamente dicha por agrupacion de micelios deshidratados; es aqu donde el
pH juega un papel muy importante, pues la coagulacion sera eficiente si se realiza en el
punto isoelectrico; como existen muchas protenas en el mosto se ha optado por el pH
5.3 como el m
as conveniente [Hornsey, 2003].
Durante la ebullici
on, la coloracion tambien aumenta sobre todo por la formacion de
melanoidinas, tambien por oxidacion de taninos, estas dos reacciones son favorecidas
por el pH elevado. Por u
ltimo a lo largo de la ebullicion se forman productos reductores
que contribuyen a la calidad y estabilidad de cerveza [Hornsey, 2003].
El lupulado del mosto se realiza tradicionalmente durante esta operacion, es decir, en la
paila de ebullici
on. El amargor es obtenido por isomerizacion de los acidos y del l
upulo;
esta isomerizaci
on es incompleta debido principalmente al pH del mosto, el pH optimo
de isomerizaci
on es de 9. Existen muchas lupulonas y humulonas en el l
upulo; cada
uno de estos compuestos donara su isomero respectivo; el conjunto es conocido como
isohumulonas pues son esencialmente quienes donan el amargor deseado [Verstrepen,
2003].

5.7.5

Enfriamiento del Mosto

El mosto obtenido por sacarificacion de la malta o de los adjuntos y por proteolisis de

las protenas de la malta, es llevado a ebullicion durante hora y media con el l
upulo para
otorgarle el amargo, a lo largo de esta ebullicion la esterilizacion completa es obtenida
gracias al pH que oscila alrededor de 5.3 [Hough, 1990].
Los precipitados proteicos son eliminados por sedimentacion, filtracion o centrifugacion;
el mosto es enseguida enfriado a la temperatura de inoculacion de la levadura, esta temperatura depende del tipo de levadura empleada y del tipo de cerveza a fabricar entre 6
a 20 C [Hough, 1990].
Durante el enfriamiento un nuevo precipitado de polifenoles-protenas se forma, por un
lado por enlaces de hidr
ogeno y tambien por la falta de solubilidad de las prolaminas.
La presencia de este nuevo precipitado juega un rol esencial sobre la formacion de H2 S
por la levadura [Verstrepen, 2003].
El mosto enfriado, en principio esteril, debe ser aireado antes del inicio de la fermentaci
on, de no ser aireado la tasa de mortalidad de la levadura aumentara a tal punto

Marco Te
orico

16

que esta no podra ser reutilizada; la oxigenacion del mosto antes del inicio de la fermentaci
on permite a la levadura sintetizar acidos grasos insaturados (olecos, linolecos, y
linolenicos), en ausencia de estos acidos grasos la pared celular esta sujeta a alteraciones
lo cual lo hace m
as permeable a los esteres correspondientes a los alcoholes superiores
que ella misma forma [Klimovitz, 2002].
La composici
on del mosto es muy variable en funcion al tipo de cerveza fabricada, su
densidad puede variar entre 2 a 20 grados Plato, es decir que puede contener de 2 a 20g
de soluto por 100g de lquido; a su vez puede ser rico o no en aminoacidos y peptidos
en funci
on de la importancia de la proteolisis y de la proporcion de adjuntos utilizados
[Klimovitz, 2002].
La relaci
on maltosa/dextrinas es igualmente variable de acuerdo al metodo de cocimiento
escogido. De manera general se puede decir que el mosto es un medio incompleto, normalmente carente de amino
acidos y acidos grasos insaturados pues es imposible obtener
un crecimiento r
apido y completo de levadura; cosa que no sucede si se tratara de un
medio sintetico a base de extractos de levadura [Klimovitz, 2002].

5.7.6

Fermentaci
on

Hasta esta etapa se ha preparado un lquido complejo y se ha purificado cuidadosamente hasta el momento de agregar la levadura cervecera para producir su fermentaci
on
[Hornsey, 2003].
Inicialmente, se agrega al mosto fro, levadura en una cantidad calculada, para que quede
en el mosto de 8 a 10 millones de celulas por cc. Para la fermentacion de mosto concentrado, se usa un mill
on de celulas por cc por cada grado plato del mosto [Hornsey,
2003].
La cantidad de levadura previamente determinada se diluye en el mosto y luego se inyecta a la lnea de mosto fro durante el enfriamiento. La cantidad total de levadura que
se inyecta se calcula teniendo el cuenta el volumen de mosto que va contener la tina de
fermentaci
on [Hornsey, 2003].
La temperatura inicial de fermentacion puede variar entre 6 a 10 C. Una vez que se
inicia la fermentaci
on se aprecian como cambios notorios, el descenso del extracto, la
producci
on de gas carb
onico y el desprendimiento de calor; durante la fermentacion se
controla el descenso de la densidad regulando la temperatura con atemperadores (serpentines o chaquetas), por los cuales circula agua fra o salmuera o agua glicolada a
temperaturas que oscilan entre 1 a 2 C para el caso del agua y de -5 a -10 C para el caso
de la salmuera o el agua glicolada [Xiao, 2004].
Para recolectar el gas carb
onico que se desprende de la fermentacion, com
unmente el

Marco Te
orico

17

tanque est
a conectado por la parte superior con dos tuberas; una que va a la intemperie y la otra que va a la planta de purificacion de gas carbonico. En la planta de
gas carb
onico, este es purificado y licuado con el fin de inyectarlo posteriormente a la
cerveza [Hornsey, 2003].
Cuando se alcanza el extracto lmite o sea hasta donde se le va a dejar fermentar se abre
el fro para conseguir enfriar la cerveza y para que la levadura se alimente [Xiao, 2004].
Se consigue enfriar la cerveza hasta 5 C y se suspende el envio de gas carbonico a la
planta, luego se bombea la cerveza a los tanques de maduracion y se recupera la levadura
[Hornsey, 2003].
A la cantidad de levadura obtenida en cada fermentacion se le denomina cosecha de
levadura, lo normal es obtener 4 veces la cantidad de levadura agregada [Hornsey, 2003].
Al final de esta cuando los azucares han sido transformados hasta alcohol y gas carbonico
se tendr
a la cerveza. Despues de la fermentacion la cerveza es separada de la levadura,
la cual puede ser utilizada para fermentar mas mosto, posteriormente. La fermentaci
on
juega un rol esencial en la calidad de la cerveza, en particular gracias a los productos
secundarios como los alcoholes superiores y esteres; es tambien la etapa de la fabricaci
on
mas difcil de controlar [Xiao, 2004].
La levadura que es reutilizada de una fermentacion a otra no tiene un metabolismo
estable; esta se va degenerando.

5.7.7

Maduraci
on

Es la etapa siguiente a la fermentacion y comprende todo el tiempo que dure la cerveza

en los tanques a baja temperatura antes de ser filtrada. Com
unmente se divide en dos
etapas que son reposo y acabado, entre el reposo y el acabado puede haber una prefiltraci
on, pre-enfriamiento y pre-carbonatacion [Klimovitz, 2002].

5.7.8

Filtraci
on

Despues de la maduraci
on y antes del embotellamiento, la cerveza pasa de nuevo por
una filtraci
on con tierra diatomacea que elimina los u
ltimos restos que puedan quedar
de la fermentaci
on y tambien los restos de nitrogeno que durante la maduracion han
formado una especie de mucosa, lo que podra provocar mas adelante que la cerveza
saliera turbia [Hornsey, 2003].

Marco Te
orico

5.7.9

18

Envasado

Antes de llevar la cerveza a la maquina de llenado se inyecta CO2 en los tanques hasta
conseguir la saturaci
on deseada, para que la cerveza salga de su recipiente con una buena
capa de espuma [Hornsey, 2003].
Para alargar el tiempo de conservacion de una cerveza, sin que cambie de aspecto, se
esteriliza por medio de la pasteurizacion despues del envasado (las botellas pasan por un
t
unel con agua a 70 o C), o con una pasteurizacion rapida antes de envasar (durante el
recorrido del tanque a la cadena de envasado la cerveza se calienta hasta 65 o C) [Hornsey,
2003].

5.7.10

Diagrama del Proceso de Elaboraci

on

El porceso descrito anteriormente se puede representar por el siguiente diagrama:

Fig. 5.2: Esquema de elaboracion de cerveza. (www.cerveceriaaustralis.com.ar).

Captulo 6

Materiales y M
etodos
6.1

Tipo de estudio

Este trabajo se realiz

o de manera experimental, se analizaron los microorganismos presentes durante la elaboraci
on de cerveza artesanal. Para esto se tomo muestras en cada
una de las etapas de producci
on de la cerveza.

6.2

Evaluaci
on de los puntos claves en el proceso de elaboraci
on

Mediante el desarrollo de este trabajo se pretende mejorar los porcesos de elaboraci

on
de cerveza artesanal en una microcervecera local. Una microcervecera libre de agentes
contaminantes tendr
a mayor posibilidad de ampliar su mercado y ofrecer un mejor producto, por ello, se debe detectar los puntos de contaminacion en el proceso y eliminarlos
de una manera pr
actica e inmediata.
Para eliminar las bacterias que contaminan la cerveza, lo que se necesita saber es en que
etapa del proceso de elaboraci
on de la cerveza son introducidas estas bacterias. Tambien
sera u
til saber que tipo de bacteria es, para tener una mejor idea de como tratar con
esta. Ciertos tipos de bacterias son mas susceptibles a tipos especficos de saneamiento.
Incluso la f
abrica de cerveza m
as limpia alberga ciertos tipos de bacterias, y la cerveza,
en alg
un momento, puede entrar en contacto con algunas de ellas. Esto puede suceder
en cualquier etapa del proceso de elaboracion de la cerveza.
Parte del trabajo en las f
abricas de cerveza es reducir al mnimo el n
umero de bacterias
que pueden ponerse en contacto con la cerveza. Pruebas y analisis periodicos de diversas
areas de la f
abrica de cerveza daran una idea del trabajo que se esta haciendo respecto
19

Materiales y Metodos

20

a la proliferaci
on o no de las bacterias contaminantes.
Debido a que las bacterias se pueden introducir en cualquier etapa de la produccion, es
importante poner a prueba la cerveza en cada etapa de su elaboracion; por motivos de
tiempo, se ha decidi
o tomar las muestras en tres etapas de todo el proceso, estas son
en la activaci
on de la levadura, una vez terminada la fermentacion y en el producto ya
almacenado.

6.3

Toma de muestras

Se tom
o tres muestras en cada etapa se
nalada, las muestras fueron manejadas utilizando
material esteril y su almacenamiento previo a la siembra se llevo a cabo bajo condiciones
de refrigeraci
on para evitar cualquier foco de contaminacion.

6.4

Tinci
on Gram

Para la identificaci
on de microorganismos presentes en alimentos y, en el caso particular
en muestras de cerveza artesanal, primero se debe identificar la morfologa general de los
microorganismos de interes y clasificarlos seg
un su respuesta a la tincion Gram[Hornsey,
2003].
Esta tecnica es la tinci
on diferencial mas utilizada en Bacteriologa pues permite separar
las bacterias en dos grandes grupos, las Gram positivas y las Gram negativas[Jacques,
1999].
Una vez que se tuvo las muestras refrigeradas se realizo, como primer paso de identificaci
on, una tinci
on Gram y de esta manera se tuvo idea con que microorganismos
posiblemente se estuvo trabajando.

6.5

Medios de Cultivo

Una vez diferenciados por tinci

on Gram, que organismos estan presentes en las muestras
se prepar
o tres medios de cultivo en funcion de lo observado en la tincion.

6.5.1

Medio TSA

El primer medio, un medio est

andar llamado TSA (por sus siglas Trypticasa Soya Agar).
Es un medio id
oneo para el desarrollo de muchos microorganismos, entre ellos levaduras
y los posibles agentes contaminantes de cerveza. Para cada ensayo se preparo 400 mL

Materiales y Metodos

21

de agar, el cual se distribuy

o en 20 cajas de Petri ( 20 mL en cada una) previamente
lavadas y esterilizadas en el auto clave.

6.5.2

Medio SDA

Es un medio exclusivo para levaduras. Conocido como Sabouraud Dextrosa Agar, permite el crecimiento selectivo de levaduras y hongos. Para cada ensayo se preparo 100
mL de este medio selectivo y se lo distribuyo en 5 cajas de Petri (20 mL en cada una)
tambien lavadas y esterilizadas.

6.5.3

Medio MRS

Tambien un medio selectivo para varios microorganismos del genero Bacillus. Se prepar
o
400 mL para cada ensayo. Se distrbuyo el medio en 20 cajas esterilizadas.

6.5.4

Soluci
on salina

Precio a la inoculaci
on de las muestras en los medios de cultivo se realizo una serie de
diluciones de cada una de las muestras con el propsito de evitar una sobrepoblaci
on
de microorganismos. Estas diluciones se las hizo con una solucion salina. Para cada
muestra se prepar
o 8 tubos de ensayo de 25 mL en los cuales se hicieron las diluciones
correspondientes.

6.5.5

Inoculaci
on e incubaci
on

Una vez que se tuvo las diluciones de cada muestra se inoculo los medio de cultivo
con 1 mL de muestra por siembra en superficie y estriado simple y luego las cajas de
Petri fueron selladas con parafilm y almacenadas en la incubadora por 48 horas a una
temperatura de 32 o C.

6.6

Pruebas Bioqumicas de identificaci

on bacteriana

Luego de aislar las colonias bacterianas presentes en cada medio de cultivo se realizo la identificaci
on de las bacterias. Para ello se preparon pruebas de identificaci
on
bioqumicas. Para este proyecto se utilizo las pruebas conocidas como API.

Materiales y Metodos

6.6.1

22

R
Pruebas API

R son m
Las pruebas de identificaci
on API
etodos simplificados que permiten identi-

ficar los microorganismos presentes en muestras a traves de un conjunto de pruebas

bioqumicas.
R que sirven para la identificaci
Existen varias pruebas API
on de una serie microorganR api 20E y api 50CH.
ismos, en este trabajo, en particular se utilizo las pruebas API :

Estas son especficas para Bacilos Gram negativos y Gram positivos respectivamente.

6.7

Recuento celular para Saccharomyces cerevisiae

El recuento de microorganismo es indispensable cuando se trabajo com productos de

consumo humano. En especial para la cerveza artesanal, la cual no es pasteurizada, se
dedbe controlar bien el n
umero de celulas de levadura que estuvieran presentes en el
producto que se dispensa al p
ublico[Klimovitz, 2002].
En base a las normas INEN para bebidas alcoholicas una cerveza artesanal debe contener un n
umero m
aximo de levaduras. De esta manera se asegura que el producto es
apto para el consumo humano.
En el desarrolo de esta proyecto se utilizo, para el recuento de levaduras, las placas
de cultivo selectivo para recuento denominadas Petrifilms, en funcion de la casa comercial 3M T M P etrif ilmT M . Estas placas contienen medios selectivos dependiendo del
microorganismo que se predende analizar, para el proyecto se utilizo las placas 3M T M
P etrif ilmT M especficas para Mohos y Levaduras.
En funci
on del manual de la casa comercial, primero de deben realizar una serie de
dilusiones de la muestra e inocular 1 mL de cada dilusion en una placa de Petrifilm y
luego incubar por un perodo de tiempo de 5 das. Finalmente observas las placas y contar el n
umero de colonias de color azul-verdoso. En total se preparo 30 diferentes placas.

Captulo 7

Resultados
Luego del proceso de incubaci
on se observo todas las cajas macroscopicamente y se not
o
que existan varios tipos de colonias en cada medio. Los primeros resultados se muestran
en las siguientes figuras:

Fig. 7.1: Medio MRS (Caiza, 2013).

Fig. 7.2: Medio SDA (Caiza, 2013).

Ya identificadas las colonias se realizo una tincion Gram de cada una de ellas y se observaron los siguientes resultados bajo el microscopio optico:

23

Resultados obtenidos

24

Fig. 7.3: Medio TSA (Caiza, 2013).

Fig. 7.4: Medio MRS (Caiza, 2013).

Fig. 7.5: Saccharomyces cerevisiae. 100x. (Caiza, 2013).

Como se muestra en las figuras 7.1, 7.2, 7.3 y 7.4 existen varias colonias en los medios
de cultivo. Pero luego de realizar la tincion se obtuvo los microorganismos mostrados
en las figuras 7.5, 7.6 y 7.7.
Todas las imagenes anteriores muestran a los organismos que se encontraron en las
muestras tomadas en los tres puntos de control.
Para cada medio preparado se inoculo un total de 36 cajas de Petri, para los tres ensayos
en los que tom
o las muestras en la microcervecera. Se inoculo estas con las dilusiones
104 y 105 .

Resultados obtenidos

25

Fig. 7.6: Posible organismo contaminante. 100x.(Caiza, 2013).

Fig. 7.7: Posible organismo contaminante. 100x.(Caiza, 2013).

7.1

Medio TSA

Los resultados obtenidos para este medio se muestran en la tabla 7.1 a continuacion.
Muestra
Activaci
on
Fermentaci
on
Maduraci
on
Activaci
on
Fermentaci
on
Maduraci
on

Diluci
on
104
104
104
105
105
105

No Cajas Inoc.
6
6
6
6
6
6

Tiempo de Inc. (h)

72
72
72
72
72
72

Crecimiento
Crecimiento Moderado
Poco Crecimiento
Poco Crecimiento
Poco Crecimiento
Poco Crecimiento
Ninguno

Observaciones
Una sola colonia
Se observ
o diferentes colonias
Se observ
o diferentes colonias
Una sola colonia
Se observ
o diferentes colonias
No hubo colonias

Tabla 7.1: Resultados para la inoculacion de medio TSA.

7.2

Medio SDA

Los resultados obtenidos para este medio se muestran en la tabla 7.2 a continuacion.

7.3

Medio MRS

Los resultados obtenidos para este medio se muestran en la tabla 7.3.

Resultados obtenidos
Muestra
Activaci
on
Fermentaci
on
Maduraci
on
Activaci
on
Fermentaci
on
Maduraci
on

Diluci
on
104
104
104
105
105
105

26
No Cajas Inoc.
6
6
6
6
6
6

Tiempo de Inc. (h)

72
72
72
72
72
72

Crecimiento
Crecimiento Moderado
Crecimiento Moderado
Crecimiento Moderadoo
Poco Crecimiento
Poco Crecimiento
Poco Crecimiento

Se
Se
Se
Se
Se
Se

Observaciones
observ
o una sola colonia
observ
o una sola colonia
observ
o una sola colonia
observ
o una sola colonia
observ
o una sola colonia
observ
o una sola colonia

Tabla 7.2: Resultados para la inoculacion de medio SDA.

Muestra
Activaci
on
Fermentaci
on
Maduraci
on
Activaci
on
Fermentaci
on
Maduraci
on

Diluci
on
104
104
104
105
105
105

No Cajas Inoc.
6
6
6
6
6
6

Tiempo de Inc. (h)

72
72
72
72
72
72

Crecimiento
Poco Crecimiento
Poco Crecimiento
Poco Crecimiento
Ninguno
Poco Crecimiento
Poco Crecimiento

Observaciones
Se observ
o una sola colonia
Se observ
o una sola colonia
Se observ
o una sola colonia
No hubo presencia de colonias
Se observ
o una sola colonia
Se observ
o una sola colonia

Tabla 7.3: Resultados para la inoculacion de medio MRS.

7.4

Pruebas API (Identificaci

on Bioqumica)

Luego que se aisl

o los microrganismos presentes en las cajas de Petri se realizo pruebas
de identificaci
on bioqumicas conocidas como Pruebas API.
Para los resultados de este trabajo utilizo dos tipos de API: API 20E para bacterias
Gram Negativas (especialmente Bacilos) y API 50CH para bacilos Gram Positivos. Los
resultados se indican en las figuras 7.8 y 7.9.
Se realiz
o cuatro pruebas API en total: dos API 20E y dos API50CH.

Fig. 7.8: API 20E para bacterias Gram Negativas. (Caiza, 2013).

Resultados obtenidos

27

Fig. 7.9: API 50CH para bacterias Gram Positivas. (Caiza, 2013).

7.4.1

Interpretaci
on de Pruebas API

Los resultados de las pruebas API fueron ingresados en el programa en lnea de la casa
comercial que provee las pruebas. La direccion es:
http : //www.mediclim.ro : 81/jsp/ident/index.jsp

7.5

Recuento en Placa Petrifilm

Para concluir el proceso de estandarizacion del analisis microbiologico, se realizo un

recuento del n
umero de levaduras presentes en la cerveza ya envasada. Para esto se
utiliz
o las placas de Petrifilm que se inocularon e incubaron de acuerdo con el protocolo
de la casa comercial. Los resultados que se observaron en este ensayo se muestran en la
figura 7.10. Los resultados que se obtuvo para todas las muestras analizadas se resumen
en la tabla 7.4. Donde se indican los tres ensayos elaborados y de cada uno de ellos se
replic
o la prueba tres veces con tres dilusiones distintas, tambien se preparo un blanco
para cada dilusi
on.

Resultados obtenidos

28

Fig. 7.10: Placas Petrifilm para Mohos y Levaduras. (Caiza, 2013).

Muestra
Ensayo 1
Ensayo 2
Ensayo 3
Ensayo 1
Ensayo 2
Ensayo 3
Ensayo 1
Ensayo 2
Ensayo 3
Blanco

Diluci
on
103
104
105
103
104
105
103
104
105
0

No Placas
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3

No Colonias
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

Tabla 7.4: Resultados para el recuento de levaduras en placas Petrifilm.

Captulo 8

Discusi
on
Para dise
nar un protocolo de control se requiere la toma de muestras periodicamente a
lo largo de todo el proceso para su analisis directo al microscopio y a traves de medios de
cultivo adecuados para obtener crecimiento de colonias y realizar una verificacion m
as
especializada de las mismas [Hornsey, 2003].
Un adecuado control microbi
olico en distinto puentos del proceso de fabricacion permite
corregir los errores de manipulacion y/o manejo de la materia prima involucrada y as
obtener en producto de buena calidad [Hornsey, 2003].
Al concluir con las pruebas para los tres ensayos planteados y en base a los resultados obtenidos se puede afirmar que existen contaminacion en algunas de las muestras
analizadas. Para la muestra que se tomo al momento de la activacion de la Levadura
no se observ
o en las cajas de Petri alg
un tipo de contaminacion; pero respecto a las
muestras en las etapas de fermentacion y maduracion, los resultados indicados en las
tablas muestran que ya existe agentes contaminantes.
Al aislar estas colonias son los posibles organismos contaminantes se encontro que hay
dos tipos de bacterias claramnete diferenciables bajo la Tincion Gram: el primero es un
basilo Gram negativo no esporulado mientras que el segundo es un basilo Gram positivo
tambien sin esporas. En base a los resultados arrojados por las pruebas bioqumicas
API los posibles agentes contaminantes seran Citrobacter en el caso Gram Negativo y
un tipo de Lactobacillus Gram Positivo.
Seg
un [Hough, 1990; Klimovitz, 2002; Hornsey, 2003] los posibles contaminates de una
cervecera pueden ser los generos Citrobacter y Lactobacillus spp. ya que estos generos
estan presentes en el ambiente y en los granos secos utilizados en la elaboracion.
Adem
as se sabe que ambos generos son resistentes a pH bajos y tambien a cierttas concentraciones de etanol [Klimovitz, 2002].
29

Discusi
on

30

Pediococcos y Lactobacillus, pueden proliferar en la etapa de fermentacion, ya que al

ser los Lactobacillus generalmente insensibles a los amargos del l
upulo, sobreviven en
un 5% de etanol, y son capaces de crecer en un rango de temperatura de 5 - 50 o C
[Hornsey, 2003]. Los Lactobacillus son heterofermentativos, y producen acido lactico,
acido acetico, di
oxido de carbono, etanol y glicerol como productos finales [Hornsey,
2003].
El otro contanimante es Citrobacter, estos organismos no son muy tolerantes al etanol.
Soportan alrededor del 2% de etanol por lo que no representaran una ameza muy directa
al producto finalpero sin duda en las etapas tempranas pueden ocasionar inconvenientes
[Klimovitz, 2002]. Todos los analisis y muestreos se llevaron a cabo bajo normas de
seguridad adecuadas pese a esto siempre existe riesgo de contaminacion externa; microrganismos presentes en el ambiente del laboratorio pudieron contaminar las muestras. Esto hace que cualquier control de calidad para un analisis serio se haga bajo
circunstancias de extremo cuidado.
Respecto al recuento en placas de Petrifilm, en todos los casos analizados se obtuvo un
conteo nulo de colonias. Estos resultados pueden explicarse seg
un [Hornsey, 2003] por
una mala preparaci
on de las dilusiones inoculadas en cada placa, tambien podra ser el
caso que las placas ya estuvieran deterioradas. Por estas razones es necesario realizar
otras pruebas en las placas de Petrifilm cambiando los factores que estan involucrados.

Finalmente es importante recordar que un control de calidad microbiologico rutinario

no resolver
a necesariamente los problemas de contaminacion. Sin embargo, ayudara a
identificar el problema, cuando este aparezca, para que puedan tomarse las medidas
apropiadas para eliminar tal problema [Klimovitz, 2002]. Un control de calidad microbiol
ogico tambien revelar
a los problemas que ocasionalmente surgen en un producto
terminado que no sea resultado de una contaminacion microbiana, permitiendo as implementar correcciones y mejoras al proceso de elaboracion.

Captulo 9

Conclusiones y recomendaciones
Al conocer detalladamente el proceso de elaboracion de cerveza artesanal se logr
o
establecer punto definidos de control de dicho proceso. Estos puntos son: activaci
on de levadura, fermentacion y proceso de maduracion.
Con la inoculaci
on en los medios preparados se observo que en la etapa de activaci
on no existe contaminacion, salvo por dos cajas que presentaron un tipo de
contaminaci
on que luego de realizar las repeticiones se evidencio que no exista.
Para los procesos de fermentacion y maduracion se encontro dos agentes contaminantes: una bacteria Gram Negativa y otra Gram Positiva, ambos con estructura
de bacilos y sin la presencia de esporas.
Las pruebas API revelaron que estos contaminantes son de los generos Citrobacter
y Lactobacillus. Ambos son los contaminantes mas comunes en la cerveceras seg
un
lo reportado por la bibliografa consultada.
El recuento en Petrifilm tuvo resultados ilogicos, en todos los caos el conteo de
colonias fue nulo.
Para un control microbiologico de un producto para el consumo humano se debe
tener un cuidado muy minucioso y seguir el protocolo establecidos de la mejor
manera para evitar errores de interpreatcion.
Estandarizar un metodo de control microbiologico para un producto de consumo
humano resulta ser un proceso laborioso y en cierto grado complicado por todos los
facores que se deben tener presentes al momento de montar las pruebas a aplicarse.
En nuestro trabajo se cumplieron los objetivos planteados pero, sin embargo, no
se logr
o establecer el protocolo de control microbiologico.

31

Discusi
on

32

Por esta raz

on se recomienda que el trabajo de continuar en funcion de las pruebas
que presentaron resultados dudosos o fuera de contexto.
Para ello se recomienda tambien que en futuros trabajos se debe tener mas preacuci
on
al aplicar los protocolos, mejor manejo de materiales y adecuar un espacio especfico para realizar todos los ensayos.

Bibliografa
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33

Bibliografa

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