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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS


GENETICA MICROBIANA
LABORATORIO

NOMBRES:
Alvarado Hernndez Gladis Susana
Ruiz Madrigal Alejandro Jair
MATERIA:
Gentica microbiana
SECCION: 1
EQUIPO: 1
PROFESOR:
Calvo Villarreal Ilse
Alicia Espinoza Lara

FECHA DE ENTREGA : 03/02/15


PRACTICA
TRANSFERENCIADEMATERIALGENETICOPORCONJUGACIONEN
Escherichiacoli

INTRODUCCION
La conjugacin se basa en el intercambio unidireccional de informacin gentica desde una
bacteria donante a otra receptora mediante un contacto real. Los plsmidos son los elementos
genticos que con mayor frecuencia se transmiten de esta forma. La capacidad de conjugacin
depende de la presencia en la bacteria de plsmidos conjugativos que contienen los genes
necesarios para tal proceso. Un ejemplo muy conocido de plsmido conjugativos es el plsmido F
de E. coli que codifica las protenas necesarias para la conjugacin, incluyendo el pili sexual. ste,
es una estructura especializada esencial para el contacto entre la bacteria donadora y la
receptora. Las clulas que lo poseen se llaman F+, masculinas o donantes y las que carecen de l
se denominan F-, femeninas o receptoras. El resultado de la conjugacin es una bacteria con las
caractersticas de las dos cepas progenitoras.

Generalmente, los plsmidos conjugativos solamente causan la transferencia de su propio material


gentico pero en ocasiones el plsmido puede integrarse al cromosoma bacteriano y en el
momento de conjugar se transferir no solo a s mismo, sino tambin a los genes cromosmicos
que se encuentran tras l. Tericamente todo el cromosoma podra ser transferido lo que
requerira ms de dos horas, pero la unin entre las bacterias por medio del pili persiste menos
tiempo. Las cepas bacterianas con el plsmido F tienen gran capacidad de recombinacin por lo
que se denominan cepas hfr por su sigla en ingls (high frecuency of recombination). Este es un
mecanismo muy efectivo para la transferencia de genes de resistencia antibitica.

OBJETIVOS

Cuantificar la transferencia de material gentico por medio de conjugacin en bacterias


Gram(-)
Establecer las diferencias entre las transconjugantes que se obtienen a partir de las
clulas donadoras Hfr y F+ y con receptoras Rec + y Rec -

Resultados
Calculo de ttulo bacteriano (Dia 1)

Se muestran resultados de clculos de ttulo bacteriano a partir de una muestra inicial de 40


unidades klett(UK) donde 1 UK=4X10^6 clulas/ml.(Kistler and Lin) Estas se calcularon a partir de
las diluciones 10^-3, 10^-4, 10^-5 en caldo L Y vaciado en placa.
Titulo bacteriano de Escherichia coli. (cepas: CSH62,JC4046, RC712 y KL323.)
CEPA

Dil 10^-3

Dil 10^-4

Dil 10^-5

CSH621

incontable

incontable

incontable

CSH622

incontable

incontable

incontable

incontable

CSH623

s/d

s/d

s/d

s/d

CSH624

incontable

incontable

incontable

JC40463

s/d

s/d

s/d

s/d

s/d

JC40464

incontable

incontable

incontable

incontable

incontable

JC40465

incontable

incontable

JC40466

incontable

incontable

incontable

RC7121

incontable

incontable

incontable

incontable

336 incontable

3.3x10^8

RC7122

incontable

incontable

incontable

incontable

300

3x10^8

RC7125

incontable

incontable

RC7126

incontable

incontable

incontable

KL3233

incontable

incontable

incontable

349

272

33 3.11x10^7

KL3234

incontable

incontable

incontable

94

163

2 1.23x10^7

230 <25

UFC/mlequipo
<25

300 s/d
s/d

260

3x10^8

s/d

239 s/d

296

2.3x10^7

s/d
33 2.47x10^7

s/d

s/d
365 3.6x10^8

311 s/d

s/d

3.03x10^7

535 s/d

s/d

5.3x10^7

268 s/d
incontable

s/d

incontable

2.6x10^7
201 2.01x10^8

n= nmero de equipo que realizo la cuenta viable para cada cepa.


Seleccin de revertantes (Dia1)
Este experimento mostro la frecuencia de revertantes para prototrofia de los aminocidos pro+,
his+ y trp+. Se encontraron revertantes nicamente en el equipo 2, el equipo 6 reporta
contaminacin y el equipo 4 no reporta crecimiento de revertantes en los distintos medios.
Seleccin de revertantes . (cepas: CSH62 y RC712)
Equipo

Cepa

Marcador
gentico

Numero de
colonias

Ttulo
bacteriano

Frecuencia de
reversin

CSH62

His+

4/0

2x10^1

6.66x10-8

Trp+

1/0

5 x10^0

1.66x10-8

Pro+

1/0

5 x10^0

1.66x10-8

His+

2/0

1 x10^1

3.33x10-8

Trp+

1/0

1.66x10-8

Pro+

1/0

1.66x10-8

RC712

Conjugacin (Dia 2)
Se realizaron las cruzas de las cepas donadoras CSH62 y JC4046 con las cepas receptoras
RC712 y KL323 en una dilucin 1:10 respectivamente de la cual se obtuvieron transconjugantes
resultantes de las cruzas de KL323 con las dos cepas donadoras, se evaluaron los marcadores
genticos de las transconjugantes en medios mnimos adicionados de Trp, Pro (G8) His, Pro (G9)
y His,Trp (G10). Los equipos 3 y 4 no encontraron transconjugantes en su ensayo, abajo se
muestran las transconjugantes y su frecuencia de recombinacin por cruza y marcador.

Conjugacin de cepas donadoras y receptoras de E. coli


Equipo

Cruza

Marcador Diluci No. de


(medio)
n
colonias

CSH62XRC712

CSH62XRC712

JC4046XRC71
2

JC4046XRC71
2

Ttulo de
Frecuencia de
recombinant recombinaci
e
n

His+(G8)

10^0/10^-1

1-1/0-0

1x10^1

4.3X10^6

Trp+(G9)

10^0/10^-1

285-280/4-1

2.59x10^3

1.1X10^-3

Pro+(G10)

10^-1/10^-2

332-455/41-46

3.97x10^4

1.7X10^-2

His+(G8)

10^0/10^-1

6-14/1-0

7.5x10^1

2.5X10^-6

Trp+(G9)

10^0/10^-1

30-49/6-1

4.15x10^2

1.3X10^-5

Pro+(G10)

10^-1/10^-2

124-132/s/d

1.28x10^4

4.2X10^-4

His+(G8)

10^-3

228-230

2.29X10^6

7.5X10^-1

Trp+(G9)

10^0/10^-1

115-120/5-5

1.11X10^3

3.6X10^-4

Pro+(G10)

10^0/10^-1

23-26/2-2

2.4X10^2

7.9X10^-5

-3

171-164

1.67X10^

3.1X10^-1

His+(G8)

10^

Trp+(G9)

10^0/10^-1

25-29/4-1

2.6X10^2

4.9X10^-5

Pro+(G10)

10^0

12-11

1.15X10^2

2.1X10^-5

Prueba de la gota (Dia 3)


Se realiz la prueba de gota con el bacterifago M13 en las cepas receptoras, donadoras as
como en las transconjugantes obtenidas en el ensayo de conjugacin.
Prueba de la gota
1

CSH62

sp

sp

s/d

s/d

s/d

s/d

JC4046

s/d

s/d

s/d

s/d

sp

RC712

s/d

s/d

s/d

s/d

s/d

sp

KL323

s/d

s/d

s/d

s/d

s/d

s/d

CSH62xRC712

sp

sp

s/d

s/d

s/d

s/d

CSH62xKL323

s/d

s/d

s/d

s/d

s/d

s/d

JC4046xRC71

s/d

s/d

s/d

s/d

sp

Equipo

Prueba de la gota
2
JC4046xKL32
3

s/d

s/d

s/d

s/d

s/d

sp=sin formacin de placa, s/d =sin datos y H= formacin de halo

Discusin de resultados

Calculo del ttulo bacteriano


De las distintas cepas se obtuvo un ttulo cercano al esperado (1.6 x10^8 clulas/ml) en la
mayora de los equipos, solamente se obtuvo un excedente a este titulo en las cepas CSH62,
JC4046 y RC712 de los equipos 1, 2 y 4 de aproximadamente el doble del titulo estimado segn
las unidades klett.
Seleccin de revertantes
En la seleccin de revertantes se esperaba observar el fenmeno de mutacin espontanea el cual
solo fue visible en las cepas trabajadas por el equipo 2 con una frecuencia del orden de 10^ -8, lo
cual se encuentra dentro de los parmetros para este tipo de mutacin, este fenmeno pudo
apreciarse por la resistencia a la estreptomicina de en la cepa donadora CSH62 y prototrofia
adquirida de la cepa receptora RC712 en los medios de seleccin G8-G10.
Esto nos marca un parmetro despreciable para la prueba de conjugacin ya que solo
observaramos 1 revertante por cada 10^8 clulas en nuestros ensayos.
Conjugacin
En el ensayo de conjugacin solo fue posible observar el comportamiento de las cruzas con la
cepa receptora RC712 la cual contena en su genoma el marcador rec +, que nos indica que la
cepa donadora es capaz de integrar material cromosmico en su genforo, las cepas donadoras
CSH62 y JC4046 usadas en estas cruzas se identifican por ser Hfr y F respectivamente lo cual
nos sugiere un resultado de transconjugantes F- y F respectivamente.
En los resultados es claramente observable en HfrxF-debido a la frecuencia en la que se observan
las transconjugantes en los distintos marcadores que siguen el orden pro+>trp+>his+ de la misma
manera en que se encuentran localizados estos genes en la cepa de Escherichia coli CSH62 en
su mapa gentico a partir del origen de replicacin.
Los resultados de la cruza F se distinguen por la frecuencia en la que se obtuvieron las
transconjugantes his+ y la relativa baja pero similar frecuencia de los otros marcadores, esto
describe el comportamiento tpico de una cepa F.
Prueba de la gota
Los resultados obtenidos en esta prueba nos indicaron la presencia del pili F en las
transconjugantes lo cual es indicativo de la cruza Fx F- y fue asi como se pudo observar en la
mayora de los equipos, se esperaba observar halos de inhibicin de lisis con turbidez homognea
en la cepa donadora JC4046 y en las transconjugantes con esta cepa lo cual queda demostrado
por los resultados del equipo 3 y 5.

Conclusiones
Se logr determinar una frecuencia de transferencia de material gentico entre cepas del genero
Escherichia con cepas donadoras tipo Hfr y F.

Se estableci una diferencia en los patrones de transferencia de Hfr y F, obteniendo una


transferencia de marcadores en gradiente en alta frecuencia y una transferencia especifica del
plsmido/marcadores cromosmicos de baja frecuencia y aleatorio respectivamente entre las
donadoras.
En las cepas receptoras no se pudo determinar una diferencia debido a que no creci ninguna
transconjugante en los ensayos de los equipos 3 y 4, sin embargo se esparaba que la cruza Hfr x
F- disminuyera su frecuencia de transferencia de marcadoras pero aun conservara la transferencia
de marcadores en gradiente y en la cruza F x F - no se esperaba ver una diferencia significativa
debido a que la expresin del marcador de la donadora est dado por el plsmido.

Bibliografa

1. http://cvb.ehu.es/open_course_ware/castellano/salud/tecnicasmol/tema2pdf.pdf
2. http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/plasmids/conjugation.html
3. Anaerobic L-a-Glycerophosphate Dehydrogenase of Escherichia coli: Its Genetic Locus and
Its Physiological Role', W. S. KISTLER' AND E. C. C. LIN, Department of Microbiology and
Molecular Genetics, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts