METODOLOGA

Preparacin de un frotis bacteriano

Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una
muestra o cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya
que si aparecen agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen
clara y ntida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del
portaobjetos para poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten
la observacin al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea
arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una extensin bacteriana
hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo
menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de
clulas que pudiera haber.
REALIZACIN DEL FROTIS

Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio.

Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa
de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una
mnima gota de agua, que resulta suficiente.

Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea

cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de
agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una
suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su
secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario
realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una
gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra,
directamente sobre el portaobjetos.

Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin

acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener
mucha precaucin de no calentar demasiado el porta pues las clulas
pueden deformarse o romperse.

FIJACIN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS

Por calor: Pasar cinco veces el portaobjetos por la llama durante unos
segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases.

Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser
observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es
continuar con el proceso de tincin.
TINCIN DEL FROTIS BACTERIANO

Cubrir el frotis con crista violeta y dejarlos actuar durante el tiempo que
indique el protocolo de cada tincin concreta. En el caso de nuestra
practica 1 minuto.

Lavar la preparacin con agua para eliminar el colorante. Esta operacin se

realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte
superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido
directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo.
Eliminar la mxima cantidad de agua de los portaobjetos golpendolos por
su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo.

Secar el porta: en ningn caso se debe frotar el porta.

Observar la preparacin al microscopio llegando hasta el mximo aumento.

Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de
inmersin.

Caractersticas microscpicas. El estudio microscpico en fresco y tras

tincin revela la forma, la manera de agruparse, la estructura de las clulas y
su tamao. Las tinciones son el primer paso, y ocasionalmente el nicho, para
la identificacin bacteriana. Las tinciones son el primer paso, y ocasionalmente
el nicho, para la identificacin bacteriana. Las tinciones ms utilizadas e
imprescindibles son la del azul de metileno y la de Gram. La tincin de Gram
es, a menudo, la primera y nica herramienta de la que nos servimos para
hacer un diagnstico provisional en el proceso de identificacin de la mayora
de las bacterias teniendo en cuenta tambin el tipo de muestra y el diagnstico
presuntivo del proceso infeccioso.
Caractersticas macroscpicas

La morfologa de las colonias es fundamental en la identificacin preliminar y

para la diferenciacin de los microorganismos. Para la observacin morfolgica
es preferible examinar colonias de cultivos frescos crecidas en medios no
selectivos. En este paso de la identificacin es muy importante el aislamiento
de las bacterias en cultivo puro ya que esta debera estar compuesta por un
solo tipo de microorganismos y procedera de una nica clula. Las colonias de
una nica especie, cuando crecen en medios especficos y bajo condiciones
idneas se describen por sus 5caractersticas de tamao, forma, consistencia,
y a veces por su color. El tamao de las colonias bacterianas es generalmente
uniforme entre una misma especie. Por ejemplo, las colonias de estreptococos
tienen un tamao ms pequeo que las de los estafilococos y las entero
bacterias. La forma esta determinada por los bordes y el grosor de la colonia.
El borde puede ser liso o rugoso e irregular; la colonia, abultada o plana. La
textura de la colonia es tambin importante. Puede variar desde seca a
viscosa, con superficie lisa o granular. Algunos microorganismos producen una
colonia pigmentada, lo que puede ser de ayuda en el proceso de identificacin
(ejemplo: Pseudnimas a eruginosa (pigmento verde), Serratia marcescens
(pigmento rojo) aunque en una misma especie puede haber cepas no
pigmentadas