Tese Alelo Especifico Expressao

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS
CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA EVOLUTIVA E
BIOLOGIA MOLECULAR
Marcela Maria de Souza
Avaliao dos efeitos de polimorfismos e da origem parental do

alelo na expresso de genes candidatos caracterstica maciez da
carne em bovinos da raa Nelore
So Carlos
2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA EVOLUTIVA E
BIOLOGIA MOLECULAR
Marcela Maria de Souza
Avaliao dos efeitos de polimorfismos e da origem parental do

alelo na expresso de genes candidatos caracterstica maciez da
carne em bovinos da raa Nelore
Dissertao apresentada ao Programa de

Ps-Graduao em Gentica e Evoluo
do Centro de Cincias Biolgicas e da
Sade da Universidade Federal de So
Carlos para obteno do ttulo de mestre
em Gentica e Evoluo.
Orientao: Dra. Luciana Correia de Almeida Regitano

Co-orientao: Dra. Simone Cristina Mo Niciura
So Carlos
2012
Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitria da UFSCar
S729ae
Souza, Marcela Maria de.

Avaliao dos efeitos de polimorfismos e da origem
parental do alelo na expresso de genes candidatos
caracterstica maciez da carne em bovinos da raa Nelore /
Marcela Maria de Souza. -- So Carlos : UFSCar, 2012.
100 f.
Dissertao (Mestrado) -- Universidade Federal de So
Carlos, 2012.
1. Gentica molecular. 2. Expresso allica. 3.
Epigentica. 4. Carne bovina - maciez. 5. Nelore. 6.
Polimorfismo. I. Ttulo.
CDD: 574.87328 (20 a)
Dedico este trabalho minha av Maria

e aos meus pais Goretti e Amrico,
pelo grande apoio e esforo.
AGRADECIMENTOS
Agradeo a Dra. Luciana pela oportunidade de aprender, pela orientao, pela
pacincia e pela amizade.
Dra. Simone Mo Niciura pelas ideias, orientao e amizade.
Aos lderes e componentes da rede Bife de qualidade, na qual este projeto
est inserido, pela participao e contribuio neste trabalho, em especial
Dra. Fabiane Siqueira, ao Dr. Srgio Raposo de Medeiros, Dr. Antnio do
Nascimento Rosa e Dr. Luiz Otvio Campos da Silva.
Ao Dr. Maurcio Mello de Alencar e Dr. Rymer Ramiz Tullio pela essencial
participao neste projeto e pelos ensinamentos.
Ao Dr. Maurcio Mudado por toda ajuda nas anlises de bioinformtica.
Ao Dr. Waldomiro Barioni Junior pela orientao e auxlio nas anlises
estatsticas.
Embrapa pelo auxlio financeiro e aos funcionrios, pela convivncia,
pacincia, dedicao e ateno.
A Capes pela concesso da bolsa de mestrado e ao CNPq pelo auxlio
financeiro.
Aos professores do Programa de Ps Graduao em Gentica Evolutiva e
Biologia Molecular da Universidade Federal de So Carlos pelos
ensinamentos.
Aos meus queridos pais, Amrico e Goretti, que muito me apoiaram,
compartilharam as alegrias e foram pontos-chave nos momentos mais difceis.
minha av Tita pelo apoio e pacincia e ao meu irmo Gabriel pelas palavras
que me confortaram nos momentos difceis e pela colaborao.
Aos colegas do Laboratrio de Biotecnologia Animal da Embrapa Pecuria
Sudeste. Em especial Flvia que colaborou muito nos sequenciamentos. s
amigas Adriana, Sarah, Polyana, Priscila pelo apoio, pela amizade e pelas
caronas. Aos amigos Marina, Gisele, Wilson, Suelen, Vitor, Alexandre,
Gustavo, Renata, Juliana e Gilbertinho por toda colaborao durante todo o
projeto e principalmente pela amizade.
Naiara Saraiva, Clara Slade, Tatiane Tetzner, Aline Lcio e Dr. Joaquim
Garcia por serem os grandes incentivadores dessa minha caminhada no
campo da pesquisa.
A cada um de vocs meu agradecimento, cada um contribuiu de alguma
maneira e foi essencial para a concluso deste trabalho.
RESUMO
A maciez o principal atributo apreciado pelos consumidores da carne bovina, no

entanto, animais da raa Nelore, que compem a maior parte do rebanho brasileiro,
apresentam carne menos macia, quando comparados a animais de origem europeia.
Assim, fundamental compreender a variabilidade de genes associados maciez
alm de seus mecanismos de expresso allica, j que desvios da expresso em
funo da origem parental do alelo tm sido descritos para alguns genes e tais
fenmenos precisam ser compreendidos para serem incorporados nos programas
de melhoramento animal. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a
variabilidade de SNPs contidos em genes candidatos a influenciar a maciez da carne
e compreender o padro de expresso de seus alelos. Para isso, os gentipos para
SNPs contidos nos genes CAST, CAPN1, DGAT1, leptina, KCNJ11 e IGFBP3 foram
determinados em uma populao de 30 touros, nos quais os genes DGAT1, leptina e
IGFBP3 no se mostraram polimrficos. Os SNPs polimrficos na populao de
touros foram ento genotipados na prognie, por ensaio TaqMan em PCR em
tempo real, seguida da avaliao da expresso allica dos mesmos. Na anlise de
expresso utilizou-se um SNP para discriminar cada alelo do gene, ou dois SNPs, no
caso do KCNJ11. O padro de expresso de todos os genes foi biallico no tecido
muscular adulto. Entretanto, com exceo do CAPN1, para o qual a diferena de
expresso allica no foi significativa, as razes de expresso allica foram
significativamente diferentes de 1 para os genes CAST (1,30,03) e os dois SNPs
analisados do KCNJ11 SNP 2126T>C (1,20,04) e SNP 2942C>T (1,460,04). A
expresso allica diferencial (EAD) encontrada no SNP 2126T>C do KCNJ11 e no
CAST no foram influenciadas pela origem parental do alelo, mas a diferena de
expresso allica no SNP 2942C>T do gene KCNJ11 apresentou efeito de origem
parental, alm da influencia do gentipo do outro SNP do KCNJ11. Concluiu-se
ento que os genes CAST, CAPN1 e KCNJ11 so polimrficos na populao, no
so imprinted, mas os genes CAST e KCNJ11 apresentam expresso allica
diferencial.
Palavras-chave: imprint; marcador molecular; Nelore; bovino; expresso allica.
maciez.
ABSTRACT
Tenderness is the main trait appreciated by consumers of bovine meat,

however Nellore animals that comprise the largest part of Brazilian cattle, have lower
tenderness when compared with European animals. In this way, it is essential
understand the variability of genes associated to tenderness as well as their
mechanisms of allelic expression, considering that deviations of expression
depending on the parental origin of the allele have been described for some genes,
and these phenomena must be understood to be incorporated in animal breeding
programs. Therefore, the aim of this study was to evaluate the variability of SNPs in
candidate genes for tenderness and investigate the expression pattern of their
alleles. For this purpose, genotypes of SNPs in CAST, CAPN1, DGAT1, leptin,
KCNJ11 and IGFBP3 genes were determined in 30 sires, in which the genes DGAT1,
leptin and IGFBP3 were not polymorphic. After this, polymorphic SNPs in population
of sires were genotyped in their offspring by TaqMan assay in real time PCR,
followed by allelic expression analysis. In the expression analysis, to discriminate
each allele of the gene it was utilized one SNP, or two in the case of KCNJ11. All
genes presented biallelic expression in adult muscular tissue. However, with
exception of CAPN1 for which the allelic expression difference was not significant,
the allelic expression ratio was significantly different of 1 for SNP of CAST (1.30.03)
and the two SNPs of KCNJ11 SNP 2126T>C (1.20.04) and SNP 2942C>T
(1.460.04). Differential allelic expression (DAE) found in SNP 2126T>C of KCNJ11
and in CAST were not influenced by parental origin of allele, but the differences in
allelic expression for SNP 2942C>T of gene KCNJ11 showed parental origin effect
and influence by genotype of the other SNP of KCNJ11. It was conclude that the
CAST, CAPN1 and KCNJ11 are polymorphic in this population, they are not
imprinted, but CAST and KCNJ11 showed differential allelic expression.
Keywords: imprint; molecular marker; Nellore; Bovine; allelic expression;

Tenderness.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Eletroferogramas gerados pelo sequenciador para posterior anlise nos
programas Phred/Phrap/Consed............................................................................... 50
Figura 2. Imagem da sada do programa Consed que permite a visualizao dos
SNPs......................................................................................................................... 51
Figura 3. Curva padro da intensidade de fluorescncia produzida por diferentes
propores dos produtos de cada alelo. Log2 da intensidade FAM/intensidade VIC
plotado contra log2 da razo aleloFAM/aleloVIC das 7 diluies (8:1, 4:1, 2:1, 1:1,
1:2, 1:4, 1:8 alelo VIC:alelo FAM) dos DNAs deindivduos homozigotos............... 57
Figura 4. Razo da expresso dos alelos G/A do SNP g.2959A>G em amostras de
msculos de novilhos da raa Nelore........................................................................ 58
Figura 5. Razo da expresso allica G/A do SNP g.2959A>G em amostras de
msculos de animais Nelore, de acordo com a origem parental do alelo G............. 59
Figura 6: Curva padro da intensidade de fluorescncia produzida por diferentes
propores dos produtos de cada alelo. Log2 da intensidadeFAM/intensidadeVIC foi
plotado contra o log2 de aleloFAM/aleloVIC das diluies dos DNAs de indivduos
homozigotos em 7 propores (8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 aleloVIC:aleloFAM),
para o SNP do gene CAPN1..................................................................................... 66
Figura 7: Razo allica C/T em amostras de msculos, SNP 2126T>C.................. 67
propores dos produtos de cada alelo. Log2 da intensidadeFAM/intensidadeVIC foi
homozigotos em 7 propores (8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 alelo VIC:aleloFAM).
A) Curva padro SNP 2126T>C. B) Curva padro SNP 2942C>T........................... 70
.
Figura 9: Razo da expresso allica C/T em amostras de msculos, SNP
2126T>C, gene KCNJ11. ......................................................................................... 72
Figura 10: Razo da expresso allica C/T do SNP 2126T>C em amostras de
msculos de novilhos da raa Nelore, de acordo com a origem parental do alelo
C................................................................................................................................ 73
Figura 11: Razo da expresso allica C/T do SNP 2942C>T em amostras de
msculos de animais da raa Nelore........................................................................ 73
Figura 12: Razo allica C/T em amostras de msculos, SNP 2942C>T de acordo
com a origem parental do alelo C.............................................................................. 74
Figura 13: Efeito do gentipo do SNP 2942C>T sobre EAD do SNP 2126T>C...... 76
Figura 14: Efeito do gentipo do SNP 2126T>C sobre a EAD do SNP 2942C>T.... 77
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Localizao e caractersticas de polimorfismos nos genes CAPN1, CAST,
DGAT1, KCNJ11, IGFBP3 e leptina, sequncias no GenBank e possveis
gentipos......................................................................................................................... 45
Tabela 2. Sequncias (5-3) dos primers e das sondas utilizados para a
genotipagem dos polimorfismos nos genes CAPN1, CAST, DGAT1, KCNJ11,
IGFBP3 e leptina....................................................................................................... 46
Tabela 3. Primers utilizados para o sequenciamento de fragmentos do gene CAPN1,
tamanho do produto de amplificao.........................................................................48
Tabela 4. Frequncias allicas e genotpicas encontradas para o SNP A>G
xon30/3'UTR do gene CAST nos touros e prognie de animais da raa Nelore.....56
Tabela 5. Polimorfismos e frequncias allicas do gene CAPN1 de animais da raa
Nelore.........................................................................................................................62
Tabela 6: TagSNP, nas respectivas posies no gene e os SNP que eles
capturam.....................................................................................................................63
Tabela 7: Frequncias allicas e genotpicas encontradas para o SNP 3379G>A do
gene CAPN1 nos touros e prognie de animais da raa Nelore................................65
Tabela 8. Frequncias allicas e genotpicas encontradas para o SNP 2126T>C do
gene KCNJ11 nos touros e prognie de animais da raa Nelore...............................68
Tabela 9: Valores de a e b na equao obtida para a curva padro Y = a + Bx para
os dois SNPs do gene KCNJ11..................................................................................71
Sumrio
1. INTRODUO.......................................................................................................11
2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 13
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 14
3.1. Objetivos gerais .................................................................................................. 14
3.2. Objetivos especficos .......................................................................................... 14
4. REVISO DE LITERATURA ................................................................................. 15
4.1. Bovinocultura de corte no Brasil ......................................................................... 15
4.2. A raa Nelore no Brasil ....................................................................................... 16
4.3. Melhoramento gentico de bovinos .................................................................... 17
4.4. Uso de marcadores moleculares no Melhoramento Animal ................................ 19
4.4.1. Marcadores moleculares................................................................................. 19
4.4.2. Prospeco de polimorfismos no genoma ...................................................... 21
4.4.3. Genotipagem de polimorfismos ...................................................................... 22
4.4.4. Seleo assistida por marcadores (SAM) ....................................................... 24
4.5. Caractersticas de qualidade da carne ................................................................ 26
4.6. Genes candidatos para caractersticas de qualidade da carne........................... 28
4.6.1. CAPN1 Calcium-activated neutral protease 1.............................................. 29
4.6.2. CAST Gene codificador da calpastatina ...................................................... 31
4.6.3. KCNJ11 Potassium inwardly-rectifying channel subfamily J, membro 11 .... 32
4.6.4. Obese Gene codificador da leptina .............................................................. 33
4.6.5. DGAT1- Diacilglicerol O-aciltransferase.......................................................... 34
4.6.6. IGFBP3 - Insulin-like growth factor binding protein 3 ...................................... 34
4.7. Expresso gnica ............................................................................................... 35
4.7.1. Epigentica ..................................................................................................... 36
4.7.2. Expresso allica especfica........................................................................... 37
4.7.2.1. Imprinting genmico ..................................................................................... 38
4.7.2.2. Expresso allica preferencial (EAP) ........................................................... 39
4.7.2.3. Expresso allica diferencial (EAD).............................................................. 39
4.7.3. Prospeco de expresso alelo especfica e sua aplicao no Melhoramento
Animal ....................................................................................................................... 40
5. Material e Mtodos .............................................................................................. 42
5.1. Animais ............................................................................................................... 42
5.1.1. Touros ............................................................................................................. 42
5.1.2. Novilhos .......................................................................................................... 42
5.1. Coleta das amostras de DNA, extrao e quantificao do DNA ....................... 43
5.2. Genotipagem dos polimorfismos ......................................................................... 45
5.4. Sequenciamento ................................................................................................. 46
5.5. Extrao e quantificao do RNA ....................................................................... 51
5.6. Sntese de cDNA (RT-PCR) ................................................................................ 52
5.7. Avaliao da expresso gnica alelo especfica ................................................. 52

6. ANLISE DOS RESULTADOS ............................................................................. 53
6.1. Escolha dos animais extremos para o sequenciamento ..................................... 53
6.2. Anlise de TagSNP para os genes KCNJ11 e CAPN1 ........................................ 54
6.3. Anlise estatstica da expresso allica diferencial ............................................ 54
6.4. Anlise de efeito de origem parental ................................................................... 55
7. RESULTADOS E DISCUSSO............................................................................. 55
7.1. Gene CAST......................................................................................................... 55
7.1.1. Frequncias allicas e genotpicas ................................................................. 55
7.1.2. Anlise da expresso alelo especfica ............................................................ 57
7.2. Gene CAPN1 ...................................................................................................... 61
7.2.1. SNPs identificados no gene CAPN1 ............................................................... 61
7.2.2. Escolha do SNP do CAPN1 para as anlises de expresso .......................... 63
7.3. Gene KCNJ11 ..................................................................................................... 67
7.3.1. Escolha do SNP, Estudo de TagSNP e Haploview ......................................... 68
7.4. Genes da leptina, DGAT1 e IGFBP3................................................................... 78
7. CONCLUSO ....................................................................................................... 79
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 80
11
1. INTRODUO
A bovinocultura de corte tem grande impacto na economia brasileira,
principalmente quando se trata do cenrio de exportao, j que o pas o maior
exportador de carne bovina do mundo e o segundo maior produtor mundial,
perdendo apenas para os Estados Unidos (ANUALPEC, 2010). Para consolidar sua
posio, o Brasil vem tentando se adequar s normas impostas pelo comrcio
mundial (LOPES; SANTOS, 2007) visando modernizao, melhoria na eficincia
de produo e qualidade do produto que chega ao consumidor (MENEZES et al.,
2005).
A maciez da carne a caracterstica mais apreciada pelo consumidor
mundial (VERBEKE et al., 2010), entretanto, animais Bos indicus, que compem a
maior parte do rebanho bovino brasileiro (MAGNABOSCO et al., 1997), so
inferiores nessa caracterstica quando comparados aos animais de origem europeia
(CROUSE et al., 1989; OCONNOR et al., 1997; ROSSATO et al., 2010).
Assim, na tentativa de melhorar a eficincia produtiva do rebanho
brasileiro e a qualidade do produto final, muitos produtores lanam mo do
melhoramento gentico animal por meio de ferramentas como a seleo de
indivduos superiores geneticamente de acordo com as caractersticas de interesse,
e esses animais iro compor o grupo de animais utilizados como pais da prxima
gerao (KINGHORN et al., 2006).
Maciez uma medida geralmente expressa tardiamente. Assim no
sentido de predizer precocemente o potencial do animal para tal caracterstica,
aumentar a eficincia de seleo e diminuir prejuzos, os marcadores moleculares
vm sendo visados como auxiliadores no melhoramento gentico animal
(DEKKERS; HOSPITAL, 2002; VILLANUEVA et al., 2005). Os marcadores so
variaes entre os materiais genticos dos indivduos, que segregam de maneira
Mendeliana e podem ser utilizados como marcos para identificar os melhores
animais a serem reprodutores. A incluso de marcadores moleculares no
melhoramento animal (Seleo Assistida por Marcadores SAM) junto com as
tcnicas tradicionais de melhoramento tambm utilizada com o intuito de aumentar
a preciso da estimativa do valor gentico do animal (CARNEIRO et al., 2006) e
correo de possveis erros nos pedigrees atravs de testes de parentesco (LONG
et al., 1990).
12
Diversos genes j foram associados com maciez, como por exemplo, o

CAPN1 (KOOHMARAIE, 1994) e o CAST (SCHENKEL et al., 2006), que compem o
sistema calpana-calpastatina, responsvel pela degradao das miofibrilas do
msculo no perodo post-mortem. Genes como o da leptina (GEARY et al., 2003;
KONONOFF et al., 2005) e o DGAT1 (MOORE et al., 2003; THALLER et al., 2003)
tambm esto associados maciez, atuando na deposio de gordura tanto
subcutnea quanto intramuscular, evitando o endurecimento da carne.
Novos genes tornam-se alvos de estudos devido a sua posio no
genoma ou ao seu envolvimento em processos biolgicos que possivelmente
poderiam afetar a maciez da carne. o caso do gene IGFBP3 (VENERONI, 2010),
localizado em uma regio do cromossomo 4 de bovinos associada com gordura
intramuscular, e o gene KCNJ11 que foi associado produo de fentipos magros
em camundongos mesmo em dietas ricas em gorduras (ALEKSEEV et al., 2010).
Contudo, a aplicao da MAS considera que os alelos herdados de
cada parental contribuem igualmente na caracterizao do fentipo, porm so
conhecidos casos em que h expresso alelo especfica, ou seja, o alelo herdado da
me no se expressa de maneira igual ao alelo paterno. Esses eventos so
denominados epigenticos e envolvem a introduo de informaes reversveis nos
cromossomos que alteram a expresso dos genes, podendo resultar em variao no
fentipo, sem modificar a sequncia de nucleotdeos (KENDREW, 1994). Podem
ocorrer atravs da metilao de alelos resultando no silenciamento dos mesmos,
fenmeno conhecido por imprint genmico ou ento ocorrem pela modificao da
estrutura da cromatina, que tambm silencia genes e alelos (GREGORY et al.,
2001).
Assim genes imprinted, nos quais apenas um alelo expresso de
acordo com sua origem parental, podem afetar os modelos estatsticos usados no
melhoramento animal por causarem diferenas entre valores genticos de fmeas e
machos, e produzirem desvios em efeitos genticos aditivos e no aditivos
(PATTEN; HAIG, 2008). A expresso alelo especfica tambm pode ocorrer em
genes no-imprinted, sendo resultado de elementos regulatrios no DNA que atuam
sobre a expresso de cada alelo diferentemente (KURREEMAN et al., 2004;
PASTINEN; HUDSON 2004). J foi demonstrado que esse tipo de expresso
amplamente distribuda no genoma de humanos (YAN et al., 2002; LO et al., 2003).
Em bovinos ainda so escassos os trabalhos envolvendo esses mecanismos, tanto
13
com finalidade de incorporao na MAS quanto para caracterizao dos genes.
2. JUSTIFICATIVA
A raa Nelore compe a maior parte do rebanho bovino brasileiro e, por
essa razo, de extrema importncia para agropecuria nacional. Apesar de ser
bem adaptada ao clima do pas, a qualidade da carne ainda inferior dos animais
europeus. Alm disso, no Melhoramento Gentico tradicional pouco tem sido feito
para a seleo de caractersticas que influenciam a qualidade da carne na raa. A
investigao da presena de polimorfismos em genes candidatos e a investigao
do padro de expresso desses genes podem contribuir para o avano do
conhecimento, que futuramente pode ser empregado para auxiliar os programas de
melhoramento gentico na seleo precoce de animais com base nessas
caractersticas. Estudos sobre o papel de genes candidatos para caractersticas de
produo de carne de bovinos da raa Nelore e o padro de expresso dos seus
alelos ainda so incipientes, razo pela qual propusemos a realizao dessa
pesquisa.
14
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos gerais

O trabalho teve como objetivo verificar se h expresso alelo especfica
e efeito de origem parental para os genes CAST, CAPN1 e KCNJ11, candidatos para
associao com caractersticas de maciez da carne e deposio de gordura, em
tecido muscular e adiposo de animais Nelore. Alm disso, buscou-se analisar a
frequncia de SNPs contidos nos genes CAST, CAPN1, KCNJ11, DGAT1, leptina e
IGFBP3, e encontrar SNPs polimrficos para o gene CAPN1 em uma populao da
raa Nelore.
3.2. Objetivos especficos
Prospectar SNPs informativos contidos no gene CAPN1;
Analisar a frequncia de SNPs contidos nos genes CAPN1, CAST,

KCNJ11, leptina, DGAT1 e IGFBP3;
Avaliar a existncia de expresso alelo especfica e efeito de origem

parental nos genes CAST, CAPN1 e KCNJ11.
15
4. REVISO DE LITERATURA
4.1. Bovinocultura de corte no Brasil

A principal atividade econmica do Brasil o agronegcio, sendo
responsvel por 33% do Produto Interno Bruto (PIB) e 37% dos empregos gerados
no pas (ANUALPEC, 2010). Dentre as atividades do agronegcio destaca-se a
bovinocultura de corte, pois o pas atualmente o maior exportador mundial de
carne, superando inclusive pases como Austrlia e Estados Unidos, em segundo e
terceiro lugares, respectivamente. Essa posio foi alcanada aps crescimento
expressivo no comrcio de exportao da carne brasileira. Em consequncia, em
2009, o pas dedicou 21,2% da sua produo total exportao, o que equivale a
1.611 milhes de toneladas, enquanto a Austrlia exportou 1.390 milhes
(ANUALPEC, 2010).
Uma srie de acontecimentos ao longo de duas dcadas promoveu
essa abertura do mercado internacional para a carne brasileira. Nas dcadas de 80
e 90, houve modernizao do setor de produo de carne no Brasil com o objetivo
de alcanar maior competitividade, aps sua aproximao econmica com a
Argentina e pases do MERCOSUL. A modernizao envolveu o estmulo do setor e
busca por avanos tecnolgicos na engorda e terminao dos animais. A
desvalorizao da moeda brasileira na dcada de 90 tambm favoreceu o
crescimento da exportao de carne gerando investimentos no setor, ponto chave na
abertura do mercado internacional (POLAQUINI et al., 2006).
Alm disso, o abastecimento mundial de carne pelos rebanhos
europeus foi abalado pela incidncia da encefalopatia espongiforme bovina (EEB),
comumente conhecida como doena da vaca louca, e a exportao de carne da
Argentina foi afetada pelo aparecimento de febre aftosa no seu rebanho
(POLAQUINI et al., 2006; ZANINE et al., 2006). As baixas na exportao de carne
permitiram que o Brasil ocupasse reas do mercado antes dominadas pelos
produtores europeus e argentinos.
Diante desses acontecimentos, o pas conquistou espao no mercado
mundial e vem firmando sua posio, demonstrando grande potencial para produo
de carne. Em 2009, o rebanho brasileiro atingiu aproximadamente 174 milhes de
16
cabeas, ficando atrs apenas da ndia, lder isolado com cerca de 281 milhes de
cabeas (ANUALPEC, 2010).
Visando consolidar sua posio de destaque no mundo e atender o
mercado consumidor nacional, o Brasil vem tentando se adequar s normas
impostas pelo cenrio mundial (LOPES; SANTOS, 2007). As exigncias na pecuria
esto se tornando cada vez maiores quanto qualidade (LUCHIARI FILHO, 2006),
otimizao de custos (PANETO et al., 2009), rastreabilidade (LOPES; SANTOS,
2007) e sustentabilidade.
Para atender essas exigncias do mercado e a demanda de
consumidores, novas tecnologias esto sendo aplicadas buscando-se melhorar a
eficincia da produtividade e a qualidade do produto que chega ao consumidor
(MENEZES et al., 2005). A transferncia de embries, a clonagem, a produo in
vitro de embries, o mapeamento genmico e a seleo assistida por marcadores
moleculares (MAS) so exemplos dessas novas tecnologias.
4.2. A raa Nelore no Brasil

Os rebanhos brasileiros so compostos, principalmente, por animais
Bos indicus (BONILHA et al., 2008), sendo sua base gentica composta de animais
importados da ndia por volta de 1962. Os principais touros que contriburam para
formao da base gentica existente hoje na raa Nelore no pas foram: Kavardi, Taj
Mahal, Goghavari, Golias e Rast (MAGNABOSCO et al., 1997).
No incio da colonizao do Brasil, perodo no qual a pecuria no tinha
finalidade econmica, os bovinos utilizados eram de origem europeia (Bos taurus).
Contudo esses animais apresentam baixa adaptabilidade ao clima do Brasil, isso
inclui pouca tolerncia ao calor e baixa resistncia a parasitas, o oposto dos animais
Bos indicus, que apresentam caractersticas satisfatrias de adaptao ao clima
nacional, e foram trazidos principalmente no intuito de serem utilizados para trao e
produo de carne e leite por Dom Pedro I (MAGNABOSCO et al., 1997).
Apesar dos animais zebus (Bos indicus) se adaptarem bem ao clima
tropical e apresentarem maior resistncia a parasitas (MARQUES, 1976; O'KELLY;
SPIERS, 1976; PIPER et al., 2009) so inferiores aos animais europeus em uma
srie de outras caractersticas.
Essa inferioridade percebida em estudos de cruzamentos entre as
17
duas subespcies. Restle et al. (2000) observaram acentuada queda no ganho de

peso medida que se aumenta a proporo de Bos indicus no indivduo. Em relao
s fmeas, Restle et al. (2001) encontraram que vacas da raa Charols (Bos
taurus) apresentaram melhor desempenho reprodutivo do que vacas Nelore, com
porcentagem de fmeas prenhes 80,60% e 45,50%, respectivamente. Alm disso,
animais Bos taurus produzem notavelmente carne de melhor qualidade em relao a
caractersticas como maciez e marmoreio, comparada aos animais Bos indicus
(CROUSE et al., 1989; OCONNOR et al., 1997; VAZ et al., 2002; ROSSATO et al.,
2010).
No Brasil, os animais zebunos representam cerca de 80% do rebanho
bovino (MAGNABOSCO et al., 1997). Em algumas regies do pas, por exemplo, no
Sul, atingindo algumas reas do Centro-Oeste e do Sudeste (VAZ et al., 2001), a
raa Nelore e outros zebunos so utilizados em cruzamentos Bos taurus x Bos
indicus, com o objetivo de melhorar a eficincia produtiva do animal explorando a
heterose (CROUSE et al., 1989).
Alm da utilizao de cruzamentos Bos taurus x Bos indicus, o ganho
gentico do rebanho brasileiro e o aumento de sua produtividade podem ser
alcanados com tcnicas de seleo de animais geneticamente superiores a partir
do uso de Diferena Esperada na Prognie (DEPs), oriundas de avaliaes
genticas (LBO et al., 2008).
4.3. Melhoramento gentico de bovinos

O ganho gentico do rebanho pode ser alcanado lanando mo de
diversas estratgias de melhoramento gentico, cujo objetivo aprimorar as
caractersticas dos animais que formaro a prxima gerao.
As ferramentas clssicas do melhoramento animal so basicamente os
sistemas de acasalamentos e de seleo. Nos sistemas de acasalamento, o
cruzamento entre raas explora diferenas genticas para a caracterstica de
interesse, como o caso dos cruzamentos Bos taurus x Bos indicus. Outra
ferramenta a seleo que, por meio da mensurao de caractersticas fenotpicas
de interesse, identifica os animais geneticamente superiores para comporem o grupo
que ser utilizado como pais da prxima gerao. Recentemente, a aplicao da
gentica molecular, como auxlio a essas ferramentas tradicionais, tem contribudo
18
com o melhoramento animal.

O sistema
de
produo
mercado
vo
direcionar
quais
caractersticas sero utilizadas como critrios de seleo. Com base em

observaes fenotpicas possvel calcular o Valor Gentico Estimado (VGE) do
animal ou a DEP, e assim, inferir quais so geneticamente superiores (KINGHORN
et al., 2006). Para obter maior resposta seleo, a caracterstica utilizada como
critrio deve apresentar variao fenotpica e herdabilidade de alta magnitude. A
herdabilidade a proporo da variao fenotpica que explicada pela variao
gentica aditiva (KINGHORN et al., 2006).
Caractersticas reprodutivas, de crescimento e morfolgicas so
utilizadas como critrios de seleo em programas de melhoramento, e
proporcionam ganho gentico. Contudo,
Medidas de peso corporal, consideradas como caracterstica de
crescimento, so constantemente usadas em programas de melhoramento, pois
alm de serem fceis de mensurar, apresentam herdabilidade de magnitude mdia a
alta, o que significa que quando aplicada como critrio respondem bem seleo. A
velocidade de crescimento do animal pode ser melhorada a partir da seleo de
indivduos com melhores avaliaes para caractersticas como peso ao sobreano,
que apresenta grande variabilidade gentica na raa e alta herdabilidade (KOOTS et
al., 1994; KOURY FILHO et al., 2009; LAUREANO et al., 2011).
Caractersticas de reproduo devem ser includas como critrios de
seleo visando aumentar a eficincia reprodutiva do rebanho. Com esse objetivo, a
caracterstica mais utilizada o permetro escrotal que est relacionado fertilidade,
de fcil mensurao e repetibilidade (SILVA et al., 2000; PEA et al., 2001;
PEREIRA et al., 2002; LAUREANO et al., 2011).
Caractersticas morfolgicas so includas nos programas de avaliao
gentica com o objetivo de melhorar caractersticas de carcaa e de acabamento.
A resposta seleo depender da preciso da estimativa das DEPs
(KINGHORN et al., 2006), podendo produzir taxas anuais de ganho gentico da
ordem de 1% (LBO et al., 2008). A predio do mrito gentico do animal pode ser
baseada no seu prprio desempenho ou de parentes. A metodologia utilizada
quando se aproveita informaes de parentes do indivduo conhecida como BLUP
(Best linear unbiased prediction), ou seja, melhor predio linear no-viesada
(KINGHORN et al., 2006). Entretanto, recentemente a gentica molecular vem
19
possibilitando
conhecimento
de
genes
com
efeito
sobre
determinadas
caractersticas de interesse e, com a utilizao da anlise direta do gentipo,

possvel conferir maiores ganhos genticos (DEKKERS, 2004).
4.4. Uso de marcadores moleculares no Melhoramento Animal
4.4.1. Marcadores moleculares

O
material
gentico
contm
informaes
necessrias
para
coordenao da estrutura e funo de cada clula. Ao comparar o material gentico

de dois indivduos possvel observar grande variao entre eles. Essas diferenas
nos genomas podem ser utilizadas como marcas, as quais so denominadas
marcadores moleculares.
As variaes podem estar situadas em regies codificadoras, e afetar
ou no a funo da protena codificada, ou podem estar em regies no
codificadoras, tais como promotores na regio no traduzida 5 (UTR), ntrons,
regies intergnicas e 3UTR, e afetar ou no caractersticas importantes (IBEAGHAAWEMU et al., 2008).
Quando regies do genoma nas quais esto situados os marcadores
moleculares esto associadas variao de uma caracterstica quantitativa, essas
regies so conhecidas como Quantitative Trait Loci (QTL) (ANDERSSON, 2001).
Sendo assim, a classificao dos tipos de marcadores moleculares associados
variao de caracteres quantitativos, segundo Dekkers (2004), baseada na ligao
dos polimorfismos com o QTL, no qual podem existir um ou muitos genes, que
contm a mutao funcional que influencia o fentipo (ANDERSSON, 2001).
O marcador correspondente mutao funcional que afeta a
caracterstica alvo denominado marcador direto. Apesar de serem mais
convenientes por fornecerem informaes diretas (KINGHORN et al., 2006),
geralmente no so de simples identificao devido dificuldade de provar sua
causalidade (DEKKERS, 2004).
A segunda classe so os marcadores em desequilbrio de ligao,
cujos loci esto prximos o suficiente da mutao funcional para existir desequilbrio
de ligao entre o marcador e o QTL (ANDERSSON, 2001).
O tipo de marcador molecular denominado restriction fragment length
20
polymorphism (RFLP) foi o primeiro descrito, em 1971, por Danna e Nathans

baseado na funo da enzima de restrio caracterizada por Smith e Welcox (1970)
e com a utilizao de gel de poliacrilamida (LOENING, 1967). Nessa metodologia,
uma enzima de restrio corta o DNA dividindo-o em fragmentos cujos pesos
moleculares diferem, e esses so separados por eletroforese em gel de agarose ou
poliacrilamida. Um polimorfismo de uma nica base pode causar ganho ou perda de
um stio de restrio, o que gera variao no peso molecular dos produtos de
restrio, detectada por eletroforese. Marcadores RFLPs foram utilizados em anos
passados na construo de mapas fsicos de restrio (DANNA et al., 1973).
Os primeiros estudos de marcadores moleculares com fins zootcnicos
foram publicados na dcada de 80 envolvendo marcadores RFLPs. Em 1985,
Chardon et al. utilizaram produtos de RFLP para caracterizar uma populao de
sunos quanto ao complexo principal de histocompatibilidade, o qual est associado
s infeces parasitrias. Nos anos seguintes, outros autores utilizaram o RFLP na
avaliao da variao genticas quanto a genes como tiroglobulina (GEORGES et
al., 1987) e hormnio do crescimento (BECKMANN et al., 1986) em populaes de
bovinos. Atualmente so muito utilizados como metodologia de genotipagem de
SNPs e associao de genes com caractersticas produo animal (DARIO;
SELVAGGI, 2011; LV et al., 2011) alm de eventualmente serem usados em estudos
de expresso e epigentica (ZHANG et al., 2007).
Ao longo do genoma esto espalhados blocos constitudos por
repeties em tandem de dois a quatro nucleotdeos, e que podem ser utilizados
como marcadores (WEBER; MAY, 1989). Denominados microssatlites, ou SSLP
(Simple Sequence Length Polymorphism), essa classe utilizada principalmente
para caracterizao gentica de espcies e em estudos de parentesco de indivduos
(AMIGUES et al., 2011; AZAM et al., 2011). A metodologia baseia-se na diferena do
peso molecular dos fragmentos que contm as repeties, assim aqueles cujos
nmeros de repeties diferem, apresentaro peso molecular tambm diferente
(WEBER; MAY, 1989). Com o auxilio de microssatlites foi possvel construir os
primeiros mapas genticos abrangentes de bovinos (BARENDSE et al., 1994;
ROHRER et al., 1994) em virtude de sua ampla distribuio no genoma e alta
variabilidade.
Apesar das utilidades desses marcadores microssatlites, so as
substituies de base nica (SNP - single nucleotide polymorphism) que fornecem
21
maior densidade e muitas vezes so a nica opo de marcadores muito prximos

ou dentro de um gene de interesse (GUT, 2001; KWOK, 2001). Esses marcadores
so descritos como mutaes em bases nicas da cadeia de bases nitrogenadas
(CAETANO, 2009) e so a base de vrios tipos de marcadores moleculares como,
por exemplo, RFLP, RAPD (Ramdom Amplification of Polymorphic DNA) e AFLP
(Amplified Fragment Lenght Polymorphism). Grande parte dos SNPs so neutros,
mas a pequena frao com efeito significativo sobre o fentipo responde como a
principal fonte de variao fenotpica resultante de variao gentica entre os
indivduos de uma espcie (JORDAN et al., 2002).
4.4.2. Prospeco de polimorfismos no genoma

Diversas metodologias para identificao de polimorfismos ao longo do
genoma esto disponveis, no entanto, a maioria desses mtodos no eficiente
para a deteco de sequncias completas de genomas por serem demoradas e
trabalhosas (HUTCHISON, 2007).
Em 1977 foram publicadas duas metodologias de sequenciamento, o
mtodo qumico (MAXAM; GILBERT, 1977) e o mtodo didesoxi (SANGER et al.,
1977), que caracterizaram a era moderna de sequenciamento, possibilitando a
coleta rpida de informaes de genomas inteiros. Nos ltimos anos, didesoxi a
tcnica que vem sendo mais utilizada (KWOK; CHEN, 2003), e foi aprimorada com o
auxlio da bioinformtica na anlise dos dados (EWING et al., 1998; GORDON et al.,
1998). A metodologia baseada na incorporao de didesoxinucletdeos (ddNTP),
que no possuem o grupo hidroxila (OH) 3 necessrio para ligar o prximo
desoxinucleotdeo (dNTP), interrompendo a extenso da fita de DNA (SANGER et
al., 1977). Atualmente, em uma modificao do mtodo proposto por Sanger et al.
(1977), esses ddNTP so marcados e ao final de vrios ciclos possvel identificlos em sequenciador automtico capilar (REGITANO et al., 2007).
Novas tecnologias de sequenciamento esto surgindo, conhecidas
como sequenciamento de nova gerao. As plataformas Roche 454 (MARGULIES,
et al., 2005), Solexa-Illumina (BENNETT, 2004) e ABI Solid (VALOUEV et al., 2008),
que compem o grupo dos sequenciadores de segunda gerao, permitem o
sequenciamento de milhares de bases em uma nica corrida em curto perodo, o
que torna mais eficiente o sequenciamento de genomas inteiros. Recentemente foi
22
desenvolvida
terceira
gerao
de
sequenciadores,
caracterizada
pelo
sequenciamento de uma nica molcula de DNA sem a necessidade de pausa entre

os passos de leitura, permitindo o sequenciamento de um genoma de mamfero
inteiro em algumas horas (SCHADT et al., 2010). As plataformas Pacific Biosciences
e Ion Torrent foram as primeiras a comporem o cenrio dos sequenciadores de
terceira gerao (GLENN, 2011).
Com o grande nmero de SNPs detectados no sequenciamento
completo do genoma bovino (Bovine HapMap Consortium, 2009), mapas genticos
de alta densidade de SNPs tornaram-se disponveis (LODISH et al., 2005; LARKIN,
2011). Esses mapas permitem estudos de associao genmica com caractersticas
de produo, considerando que o alto nmero de marcadores permite proximidade
suficiente a genes de interesse, o que resulta em desequilbrio de ligao com
praticamente qualquer gene do genoma (RISCH, 2000).
4.4.3. Genotipagem de polimorfismos

Aps ser identificado, o SNP pode ser genotipado em grande nmero
de animais com a utilizao de metodologias baseadas na discriminao allica,
seja ela por hibridizao, incorporao de nucleotdeos, ligao de oligonucleotdeos
ou clivagem enzimtica alelo especfica (KWOK, 2001; KWOK; CHEN, 2003).
A evoluo das metodologias de genotipagem teve incio com tcnicas
bsicas de clivagem enzimtica como PCR-RFLP (MAEDA et al., 1989), depois
surgiram tcnicas de incorporao de nucleotdeos que utilizam sequenciadores
automticos para detectar os SNPs nos produtos de PCR marcados com
fluorescncia (KWOK, 2001).
Os equipamentos de PCR em tempo real permitiram a discriminao
de alelos polimrficos de um SNP utilizando uma sonda diferente para cada alelo.
Esse mtodo de hibridizao com sondas de hidrlise tem como produto comercial
amplamente utilizado o ensaio de genotipagem de SNP TaqMan (Applied
Biosystems, CA). So utilizadas duas sondas de oligonucleotdeos alelo especficas
com marcador fluorescente em uma extremidade (reprter) e na outra extremidade
um marcador (quencher) que absorve a fluorescncia do reprter quando a sonda
est intacta. Os primers includos no ensaio flanqueiam a regio do SNP e permitem
o incio da polimerizao de uma fita de DNA pela atividade da DNA polimerase, e
23
essa cliva a sonda que se encontra hibridizada. Essa clivagem da sonda separa o
reprter do quencher, assim a fluorescncia emitida pelo reprter, no mais
absorvida pelo quencher, passa a ser captada pelo equipamento de PCR em tempo
real (LIVAK et al., 1999).
Microarranjos de DNA, tambm conhecidos como chips de SNPs,
caracterizados pela impresso de oligonucleotdeos em lmina de vidro (HACIA et
al., 1999), e espectrometria de massas (MALDI-TOF) (TANG et al., 1999) tambm
so tcnicas que permitem a genotipagem, com a vantagem de analisar grande
nmero de SNPs simultaneamente.
Os SNPs podem ser utilizados na identificao de loci ou regies
cromossmicas que esto associados com a variao em caractersticas
quantitativas, sendo timos auxiliares no desenvolvimento de programas de
melhoramento de caractersticas bovinas de importncia econmica, por serem mais
estveis ao longo das geraes do que os microssatlites (STONE et al., 2005).
Assim quando estabelecida a associao entre SNP e caracterstica de produo,
esse marcador pode ser includo em programas de melhoramento gentico visando
aumentar a acurcia e a resposta seleo (DEKKERS, 2004; IBEAGHA-AWEMU
et al., 2008).
A concluso do sequenciamento completo do genoma bovino (Bovine
HapMap Consortium, 2009) permitiu o desenvolvimento de chips para a
determinao simultnea de 54 mil SNPs (WIGGANS et al., 2009) e, recentemente,
cerca de 770 mil SNPs (Illumina, Inc San Diego). Com base na genotipagem em
larga escala, alguns autores como Solberg et al. (2008) e Wiggans et al. (2009),
relataram estudos de seleo genmica, na qual se utilizam diversos SNPs
distribudos densamente ao longo do genoma, sendo possvel rastrear a
variabilidade gentica aditiva total de uma caracterstica por todo o genoma. Isso
permite calcular o valor genotpico de um indivduo com base nos gentipos de
todos os SNPs que influenciam a caracterstica, ou seja, o valor genmico do
animal. Em 2009 foi publicado o primeiro sumrio com valores genmicos de touros
(USDA) para a raa Holandesa e, desde ento, diversos estudos tm sido
direcionados para produo de sumrios de reprodutores para outras raas bovinas.
24
4.4.4. Seleo assistida por marcadores (SAM)

A aplicao do melhoramento animal na criao de animais de
produo tem como objetivo alcanar maior produtividade com menor custo e em
menor tempo possvel. Essa cincia vem sendo alvo de mudanas de grande
impacto nas ltimas dcadas, em parte devido aplicao da gentica molecular na
identificao de regies cromossmicas ou mesmo de genes que afetam
caractersticas de importncia econmica.
Segundo Dekkers (2004), o programa clssico de melhoramento busca
maximizar a resposta seleo por meio de um balano entre vrias caractersticas
de interesse, e assim melhorar geneticamente a populao. As caractersticas de
importncia econmica, por sua vez, so em sua maioria complexas, apresentam
fentipos com distribuio contnua e so influenciadas por muitos genes ou QTLs
dispersos ao longo do genoma (IBEAGHA-AWEMU et al., 2008). Assim, a gentica
molecular possibilitou a identificao de cada gene e regies cromossmicas que
afetam caractersticas de produo (ANDERSSON, 2001). Dessa maneira, a seleo
direta desses genes ou regies cromossmicas resultou em avanos nos programas
de melhoramento gentico (DEKKERS; HOSPITAL, 2002). Por esse motivo, muitos
estudos esto sendo direcionados para avaliar estratgias de uso da informao
gentica molecular nos programas de seleo.
Com marcadores dispersos ao longo do genoma possvel detectar e
estimar efeitos dos QTLs e genes, e essas informaes vm sendo usadas como
critrio de seleo indireta para o melhoramento gentico de caractersticas
quantitativas. A utilizao de marcadores moleculares como auxlio nos programas
de melhoramento animal denominada Seleo Assistida por Marcadores (SAM), e
sua base a correlao entre a caracterstica e o gentipo do marcador, gerada
devido ao desequilbrio de ligao entre QTL e o locus marcador.
importante salientar que a SAM uma ferramenta que deve ser
utilizada em conjunto com as tcnicas tradicionais, sendo um auxlio seleo dos
melhores animais para serem progenitores da prxima gerao, visando maior
acurcia. A SAM aumenta a preciso da estimativa do valor gentico do animal
(VGA). Para tanto, o efeito aditivo atribudo ao marcador includo no modelo de
estimativa e quanto mais marcadores com efeito aditivo conhecidos so includos no
modelo, maior ser a contribuio para a confiabilidade da DEP. Alm disso, os
25
marcadores podem ser utilizados para confirmar parentesco entre os animais

corrigindo possveis erros de registros genealgicos, j que a seleo baseada no
pedigree, isto , a predio do VGA utilizando informaes de parentes (BLUP) pode
ser afetada por erros de avaliaes e informaes incorretas de pedigree resultando
em prejuzos (CARNEIRO et al., 2006). Os marcadores moleculares so auxiliadores
na obteno dessas informaes corretas de similaridade gentica, favorecendo a
utilizao do pedigree sem erros, portanto a seleo mais eficiente, principalmente
para caractersticas de baixa herdabilidade (LONG et al., 1990). Com o recente
desenvolvimento de painis composto por centenas de milhares de marcadores
possvel implementar a seleo genmica, na qual o efeito aditivo de cada posio
do genoma utilizado na predio de um valor de DEP genmica. Villanueva et al.
(2005), em seus estudos com uso de marcadores moleculares no BLUP,
encontraram ganho extra se comparado ao BLUP tradicional e esse ganho
aumentou ao longo das geraes.
Como j mencionado, os marcadores moleculares podem ser teis na
identificao de indivduos aparentados (DODDS et al., 1996), o que tem diversas
aplicaes possveis, como por exemplo, na anlise de paternidade (HEATON et al.,
2002). Perfis constitudos por muitos marcadores apresentam padro individual e
podem ser teis ao rastreamento de um corte de carne com caractersticas
desejveis at sua fonte de origem (HILL et al., 2008).
Outra utilidade dos marcadores moleculares na caracterizao de
populaes (TAMBASCO et al., 2000, AMIGUES et al., 2011; AZAM et al., 2011) cuja
importncia est na possibilidade de anlise da variabilidade gentica (TELLES et
al., 2001), e esta fundamental para programas de conservao (EDWARDS et al.,
2000; CAN et al., 2001) e no delineamento de programas de cruzamentos.
Caractersticas de qualidade da carne apresentam expresso tardia.
Entretanto, os polimorfismos associados com tais caractersticas podem ser
utilizados como auxiliadores no programa de melhoramento, possibilitando predizer
em idades iniciais, a partir do gentipo do animal, se ele produzir carne com melhor
qualidade para determinada caracterstica.
Diversos estudos esto sendo conduzidos com o intuito de associar
SNPs com caractersticas de interesse econmico em animais de produo, como
qualidade da carne e carcaa. Alguns SNPs em genes candidatos para essas
caractersticas tm sido os principais alvos desses estudos, como por exemplo,
26
aqueles contidos no gene que codifica a calpana, o gene CAPN1 (CASAS et al.,
2006; WHITE et al., 2005; PAGE et al., 2002), no CAST, gene codificador de
calpastatina (SCHENKEL et al., 2006; CASAS et al., 2006; MORRIS et al., 2006), no
gene codificador de leptina (SCHENKEL et al., 2005; NKRUMAH et al., 2005;
KONONOFF et al., 2005; LUSK, 2007), alm do DGAT1, Diacilglicerol Oaciltransferase 1, ligado deposio de gordura na carne (MOORE et al., 2003;
THALLER et al., 2003, FORTES et al., 2009).
4.5. Caractersticas de qualidade da carne

A atual posio do Brasil no setor de exportao de carne bovina tem
como consequncia a necessidade de buscar alternativas para obter carne de
melhor qualidade, satisfazendo o gosto do consumidor nacional e internacional.
Determinadas caractersticas exercem grande influncia sobre a qualidade do
produto final tornando-as de grande interesse econmico e comercial e alvo de
diversos estudos.
Existem fatores que afetam a qualidade da carne no perodo antemortem e esto vinculados ao gentipo, idade ao abate e ao ambiente em que o
animal se desenvolveu. No perodo post-mortem, alm do efeito ambiental, diversas
reaes
enzimticas
acontecem,
podendo
gerar
variaes
marcantes
nas
propriedades da carne.
A maciez da carne o atributo mais valorizado pelos consumidores de
carne bovina (VERBEKE et al., 2010) e sua variao resultante de diversos fatores
ante-mortem e post-mortem. O tamanho dos sarcmeros, a quantidade de colgeno
que compe o tecido conjuntivo (LIGHT et al., 1985) e de gordura intramuscular so
responsveis por uma pequena parte dessa variao, o restante da variao
devido ao processamento post-mortem.
A gordura intramuscular, tambm conhecida como marmoreio, afeta a
qualidade da carne, diminuindo sua densidade (SEIDEMAN et al., 1987), o que
implica em sensao de maior suculncia (THALLER et al., 2003; CASAS et al.,
2007). O marmoreio consiste no deposito de gordura no tecido adiposo que rodeia
os feixes musculares. Essa uma caracterstica quantitativa afetada por diversos
genes, mas que contribui apenas entre 3 a 10% da variao na sensao de maciez
(NISHIMURA et al., 1999).
27
A gordura subcutnea presente na carcaa tambm influencia a maciez

da carne, pois a espessura adequada de gordura protege as fibras musculares
contra a queda brusca de temperatura durante o congelamento, evitando efeitos
indesejveis do resfriamento (KONONOFF et al., 2005) como endurecimento e
escurecimento da carne.
No entanto, o principal mecanismo que atua na maciez da carne o
processamento post-mortem. Aps a morte do animal ocorre o rigor mortis, ou seja,
a contrao muscular irreversvel que torna o tecido muscular rgido, e isso se deve
formao de pontes entre miosinas e actinas (ALVES et al., 2005). A ao das
enzimas proteolticas que degradam as miofibrilas, componentes estruturais do
tecido muscular esqueltico, nesse perodo causa amaciamento na carne,
amenizando o rigor mortis (KOOHMARAIE, 1994) e resultando maior maciez
(KOOHMARAIE, 1994; CASAS et al. 2006).
So trs os complexos enzimticos que atuam no amaciamento, o
sistema das calpanas, o complexo multicataltico de proteases e o sistema das
catepsinas. Entretanto, o sistema das calpanas o principal responsvel pela
protelise miofibrilar (KOOHMARAIE, 1994; GEESINK; KOOHMARAIE, 1999; PAGE
et al., 2002). As enzimas -calpana e m-calpana, que so ativadas por ons clcio,
compem esse complexo enzimtico, que inibido pela atividade da enzima
calpastatina (GEESINK; KOOHMARAIE, 1999). A atividade das proteases tambm
pode ser regulada pelo tamanho dos sarcmeros durante o perodo post-mortem,
pois limita o acesso da protease ao substrato miofibrilar (WEAVER et al., 2008).
Outros reguladores so a taxa de declnio do pH e a temperatura durante o
desenvolvimento do rigor mortis (DRANSFIELD, 1994). O nvel de calpana presente
no msculo uma caracterstica de alta herdabilidade (SHACKELFORD et al.,
1994).
A avaliao da maciez pode ser feita por meio de anlise sensorial, na
qual pessoas treinadas do notas para a carne de acordo com a maciez perceptvel
(CROSS et al., 1978). Outra maneira de verificar a maciez, mas de forma objetiva,
por meio do equipamento que mede a fora necessria para cisalhar uma seo
transversal de carne (WHEELER et al., 1995). O mtodo subjetivo est
correlacionado com o mtodo de anlise objetiva (BOUTON et al., 1971).
As medidas de fora de cisalhamento (FC) e marmoreio apresentam
herdabilidade moderada em torno de 0,2 e 0,5. Segundo Johnston et al. (2003), a
28
herdabilidade para FC em Bos indicus superior de B. taurus (0,3 e 0,09,

respectivamente).
Animais Bos indicus apresentam carne menos macia do que animais B.
taurus (CROUSE et al., 1989; WHEELER et al., 1990; VAZ et al., 2002; ROSSATO et
al., 2010). Isso foi demonstrado nos estudos de Bianchini et al. (2007), os quais
encontraram que animais puros B. indicus ou contendo B. taurus apresentaram
FC de 4,98 e 4,45 kgf, respectivamente, enquanto animais taurinos, das raas
Simental e Simbrasil, apresentaram 3,13 e 3,33 kgf, respectivamente. Alm disso,
outros autores relataram, em cruzamentos B. indicus x B. taurus, que medida que
a proporo de zebuno aumenta, a FC tambm cresce, resultando em diminuio
da maciez (CROUSE et al., 1989; JOHNSON et al., 1990). Essa diminuio da
maciez com aumento da proporo de zebunos pode estar relacionada com a
concentrao superior de calpastatina encontrada nos mesmos (WHEELER et al.,
1990; SHACKELFORD et al., 1991), ou tambm devido ao fato de os animais
zebunos apresentam teor de marmoreio reduzido (SHACKELFORD et al., 1991), o
que lhes confere carne menos suculenta e sensao de menor maciez em relao
aos taurinos.
4.6. Genes candidatos para caractersticas de qualidade da carne

Ao longo do progresso no estudo da biologia molecular aplicada ao
melhoramento animal, diversos QTLs foram demonstrados estar associados com a
variao fenotpica em determinadas caractersticas de qualidade da carne e da
carcaa. Atravs de estudos de mapeamento gentico e da disponibilidade de dados
fenotpicos possvel detectar presena de QTL, demonstrando a variao
fenotpica entre indivduos que herdaram os diferentes alelos (ANDERSSON, 2001).
Stone et al. (1999) demonstraram presena de QTL no cromossomo
bovino 5 (BTA5) influenciando caractersticas de carcaa, como por exemplo
marmoreio, peso da carcaa entre outras, em uma populao oriunda de
cruzamentos B. taurus x B. indicus. Nesse mesmo cromossomo, Alexander et al.
(2007) e Casas et al. (2003) identificaram QTLs para maciez da carne. Keele et al.
(1999) identificaram um QTL no BTA15 afetando fora de cisalhamento no msculo
longissimus, aps 14 dias de maturao, em uma populao descendentes de
touros cruzados Brahman x Hereford e mes, B. taurus. Tambm foram identificados
29
QTLs para maciez nos cromossomos BTA7 (DRINKWATER et al., 2006; DAVIS et
al., 2008), BTA10 (DAVIS et al., 2008) e BTA29 (CASAS et al., 2000; SMITH et al.,
2000). Ainda, QTLs sugestivos para maciez foram relatados no BTA29 (CASAS et
al., 2001) e BTA10 (ALEXANDER et al., 2007).
O marmoreio e a gordura subcutnea, que esto indiretamente
relacionados maciez da carne (THALLER et al., 2003; KONONOFF et al., 2005),
tambm possuem QTLs j descritos em diversos cromossomos bovinos. No BTA3,
Casas et al. (2001) encontraram QTL significativo para grau de marmoreio da carne,
enquanto Casas et al. (2004) encontraram apenas QTL sugestivo. Outros QTLs
sugestivos foram descritos para os cromossomos BTA8 e BTA10 (CASAS et al.,
2001) e BTA16 (CASAS et al., 2004). Para deposio de gordura e metabolismo de
lipdeos existem QTLs descritos no BTA1 (CASAS et al., 2003), BTA2 e BTA7
(ALEXANDER et al., 2007), e sugestivos no BTA3 (CASAS et al., 2004) e BTA8
(CASAS et al., 2001).
A maioria das caractersticas de interesse na produo animal tem
variao contnua no fentipo e so influenciadas por QTLs dispersos no genoma, e
em cada QTL so encontrados uma diversidade de genes que, em conjunto, afetam
as caractersticas de interesse (IBEAGHA-AWEMU et al., 2008). A partir dessas
consideraes fica claro a necessidade de se estudar individualmente cada gene
contido no QTL e que afeta uma pequena proporo da variao da caracterstica,
quando se tem por objetivo compreender os mecanismos envolvidos na variao
fenotpica ou manipular essa variao (RNA de interferncia, transgenia e
farmacogenmica).
4.6.1.
CAPN1 Calcium-activated neutral protease 1

As calpanas so proteases citoslicas que exibem atividade
proteoltica dependente de clcio (Ca2+) em pH neutro. Essa atividade dependente

de Ca2+ foi demonstrada em estudos nos quais a injeo de clcio na carne
aumentou a maciez (WHEELER et al., 1991). Essa protease bovina apresenta alta
similaridade com as protenas de humanos e camundongos (SMITH et al., 2000).
Em bovinos, o gene CAPN1 constitudo por 22 xons, localizado no BTA29
(WHITE et al., 2005).
A molcula -calpana um heterodmero, com uma subunidade
30
regulatria pequena (CAPNS1) e uma grande (gene CAPN1 para a enzima calpana, e CAPN2 para a m-calpana), a primeira e principal enzima a atuar no
amaciamento do msculo esqueltico no perodo post-mortem (KOOHMARAIE,
1996; GEESINK; KOOHMARAIE, 1999; PAGE et al., 2002).
A atividade desempenhada por ela consiste na degradao das
protenas miofibrilares do msculo (KOOHMARAIE, 1994; WHITE et al., 2005),
processo pelo qual a carne sofre amaciamento. Segundo Dransfield (1993), a
variao na atividade da -calpana explica 65% da variao na maciez da carne.
Enquanto Casas et al. (2000) identificaram um QTL para maciez no
cromossomo bovino 29, Smith et al. (2000) mapearam o gene CAPN1 na regio que
compreende esse QTL. Por isso o gene CAPN1 considerado um gene candidato
posicional para maciez, e ainda candidato funcional devido biologia do sistema que
seu produto integra.
Por ser um gene candidato posicional e funcional, o CAPN1 alvo
constante de estudos de associao, e diversos SNPs contidos nele j foram
descritos em diferentes populaes apresentando associao com maciez. Page et
al. (2002) descreveram 2 variaes no gene, uma no xon 9, que resulta em troca
de aminocido na posio 316 da protena (CAPN316), e uma no xon 14, que
corresponde posio 530 na cadeia de aminocidos (CAPN530). As mesmas
variaes foram demonstradas como marcadores potenciais para auxiliar na seleo
de melhoramento para maciez em populaes comerciais de B. taurus nos Estados
Unidos (PAGE et al., 2004). Alguns SNPs do CAPN1 fazem parte de testes de DNA,
fornecido por empresas particulares, que visam melhorar diversas caractersticas,
dentre elas a maciez. O SNP CAPN316 e CAPN4751 fazem parte dos testes
comerciais IGENITY TenderGENE (Merial Ltd., Atlanta, GA) e GeneSTAR
Tenderness 2 test (Genetic Solutions Pty. Ltd., Albion, Austrlia).
Casas et al. (2006) encontraram associao entre o SNP CAPN4751 e
a maciez em populaes taurinas ou em cruzamentos B. taurus x B. indicus. No
entanto, quando analisaram apenas animais B. indicus no obtiveram resultados
significativos. Inversamente, White et al. (2005) encontraram associao desse SNP
com FC no dia 7, 14 e 21 aps o abate, em uma populao composta por animais
da raa B. indicus Brahman.
Casas et al. (2005), estudando quatro SNPs na CAPN1, encontraram
apenas o CAPN316 associado com maciez em uma populao de B. indicus, porm,
31
no foram encontrados animais com o gentipo favorvel e, para o CAPN530,

verificaram
alelo
desfavorvel
praticamente
fixado.
Corroborando
esses
resultados, Pinto et al. (2010) verificaram que esses SNPs no eram polimrficos em
uma populao de Nelore, encontrando o alelo favorvel de ambos SNPs com
frequncia menor que 1%.
Pintos e Corva (2011) atriburam a baixa frequncia dos alelos
favorveis a maciez associao entre os mesmos e menor DEPs para taxa de
crescimento e tamanho corporal. Isso plausvel, j que durante anos o
melhoramento animal deu nfase seleo para essas caractersticas e no para
maciez, acarretando diminuio dos alelos favorveis para maciez nas populaes
selecionadas.
Considerando a baixa frequncia de alelos e as poucas associaes
dos SNPs do gene CAPN1 em B. indicus, pode-se pensar que no so marcadores
adequados para populaes com essa composio, assim, so necessrios novos
estudos de prospeco de SNPs polimrficos em B. indicus e associao com
maciez.
4.6.2. CAST Gene codificador da calpastatina

O gene CAST mapeado em um QTL para maciez no cromossomo 7 de
bovinos (DAVIS et al., 2008) considerado candidato para maciez de carne
(SCHENKEL et al., 2006), por codificar a calpastatina, o nico inibidor endgeno da
calpana. Sua atividade reduz a taxa e a extenso da protelise no msculo
esqueltico pela calpana (GEESINK; KOOHMARAIE, 1999). Portanto o aumento da
atividade de CAST no perodo post-mortem tem sido relacionado com a reduo da
maciez da carne (PRINGLE et al., 1997).
A unidade inibitria da molcula da calpastatina repetida quatro
vezes, e cada uma delas inibe uma molcula de calpana (MAKI et al., 1984). Sua
atividade especfica para calpanas, atuando em -calpana e m-calpana de forma
e intensidade similares.
Em estudos prvios foram detectadas associaes entre SNP no gene
CAST e a maciez da carne (MORRIS et al., 2006; CASAS et al., 2006; SCHENKEL
et al., 2006; PINTO et al., 2010). Morris et al. (2006) estudaram a substituio de A
por G na posio 2959 do 3UTR no gene CAST, constatando que os alelos AA
32
(5,11,6%), quando comparado com AG (8,62,0%) apresentaram reduo na fora

mdia de cisalhamento. Casas et al. (2006) encontraram resultados semelhantes
para esse SNP em populaes taurinas puras ou com influncia de B. indicus, no
entanto, para populao exclusivamente B. indicus, o CAST no apresentou
associao com maciez.
Segundo Schenckel et al. (2006), o SNP UOGCAST, contido no ntron
5, est associado maciez da carne em grandes populaes de bovinos mestios
taurinos. Foi verificado que a substituio de G por C, no SNP estudado, produziu
bifes mais macios. Pinto et al. (2010) tambm estudaram o UOGCAST e
encontraram efeito aditivo para FC nos dias 7, 14 e 21e de desvios de dominncia
nos dias 7 e 21, sendo o alelo C favorvel e o G dominante.
H relatos na literatura da interao entre SNPs nos genes CAST e
CAPN1 (MORRIS et al., 2006; CASAS et al., 2006), sendo que j foi observado
epistasia entre eles (BARENDSE et al., 2007; PINTO et al., 2010).
4.6.3. KCNJ11 Potassium inwardly-rectifying channel subfamily J, membro 11

No cromossomo 15 de bovinos est localizado o gene KCNJ11, o qual
composto por apenas um xon e codifica uma protena com 388 aminocidos.
Essa protena atua no transporte de ons de potssio atravs da membrana da
clula (Gene Onthology, www.geneontology.org).
A inativao do gene em ratos por Alekseev et al. (2010) ocasionou em
fentipo magro mesmo quando os animais foram submetidos dieta rica em
gordura. Atribuiu-se esse fato perda de funo do canal de KATP, fazendo com que
reduzisse o depsito de glicognio pelo msculo.
Em humanos o gene vem sendo amplamente estudado porque ele est
intimamente ligado a diabete melitus tipo II, e sua inativao pode estar envolvida
com outros tipos de diabetes tambm. Esse gene conservado entre bovinos,
humanos
camundongos
(Homologene,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/
homologene/441).
Em estudos com bovinos da raa Charols, Bernard et al. (2009)
encontraram que o perfil de expresso desse gene, junto com outros 8, explicou
grande parte da variabilidade na massa muscular e do contedo de lipdeos
intramuscular (60% e 52%, respectivamente).
33
Em estudos no laboratrio de Biotecnologia Animal na Embrapa

Pecuria Sudeste, em So Carlos, o gene KCNJ11 foi sequenciado em animais da
raa Nelore (dados no publicados), e encontrou-se grande nmero de SNPs os
quais podem ser includos em estudos de associaes com caractersticas de
carcaa, tendo em vista o processo biolgico em que ele est inserido.
4.6.4. Obese Gene codificador da leptina

A leptina uma protena hormnio que contm 167 aminocidos,
produto sintetizado pelo gene obese, o qual foi mapeado no cromossomo 4 em
bovinos (STONE et al., 1999). Predominantemente secretada pelos adipcitos
brancos (NKRUMAH et al., 2005), a leptina alcana os receptores do hipotlamo,
promovendo a reduo do consumo de alimento e aumentando o gasto de energia e
assim, influencia a deposio de gordura e o ganho de peso dirio (KONONOFF et
al., 2005).
Em alguns estudos a concentrao de leptina no soro foi associada
com deposio de tecido adiposo na carcaa e marmoreio em animais mestios Red
Angus e Charols (GEARY et al., 2003). Outros cientistas associaram polimorfismos
contidos no xon 2 com caractersticas de qualidade de carne e de carcaa
(NKRUMAH et al., 2004; SCHENCKEL et al., 2005).
O polimorfismo R25C, caracterizado por uma transio de citosina para
timina, resulta na substituio de aminocido arginina por cistena. Essa substituio
foi associada com a deposio de gordura subcutnea em bovinos (KONONOFF et
al., 2005; NKRUMAH et al., 2005; SCHENKEL et al., 2005; WU et al., 2005;
FORTES et al., 2009)
Ao estudar cinco polimorfismos contidos no gene codificador da leptina
em animais cruzados (Angus, Charols, Limosin e Simental), Schenckel et al. (2005)
encontraram associaes de dois desses SNPs com produo de gordura e de
carne magra, alm de encontrarem interao entre os dois na maciez da carne
(P<0,01). Anton et al. (2011) encontraram o gentipo TT apresentando maior
porcentagem de gordura no msculo do que os demais gentipos. Todas essas
associaes podem ser explicadas em parte pelos estudos de Orr et al. (2011), no
qual polimorfismos presentes na regio codificadora do gene obese afetam a
desnaturao de cidos graxos monoinsaturados.
34
Pelo exposto, importante compreender completamente as atividades

biolgicas da leptina e suas influncias nas caractersticas de importncia
econmica para a agropecuria, como a deposio de gordura subcutnea e o grau
de marmoreio.
4.6.5. DGAT1- Diacilglicerol O-aciltransferase

O gene DGAT1 foi considerado forte candidato a explicar um QTL
mapeado na regio centromrica do cromossomo 14 em bovinos, com efeito no
marmoreio da carne (THALLER et al., 2003; MOORE et al., 2003). Esse gene
codifica a enzima aciltransferase CoA:diacilglicerol, que fundamental na sntese de
triglicerdeos.
Polimorfismos
nesse
gene
foram
associados
marmorizao
(THALLER et al., 2003). Grisart et al. (2002) identificaram o SNP K232A no incio do
xon 8 que resulta na substituio de lisina por alanina. Essa substituio no
conservativa foi apontada por influenciar a produo e porcentagem de gordura no
leite de vacas. O gentipo AA, contendo uma lisina, apresenta maior produo de
gordura.
Em relao ao contedo de gordura intramuscular, Anton et al. (2011)
encontraram que o gentipo AA/AA resultou em maiores valores. O teor de
marmoreio da carne varia entre indivduos, sendo que os zebunos apresentam teor
reduzido (SHACKELFORD et al., 1991), o que lhes confere uma carne menos
suculenta e menos macia.
4.6.6. IGFBP3 - Insulin-like growth factor binding protein 3

O gene IGFBP3 composto por 7 xons, est localizado no
cromossomo bovino 4 e seu produto uma protena que se associa com alta
afinidade s IGFs (fator de crescimento semelhante insulina). Essa associao
afeta a atividade do IGF aumentando ou diminuindo sua habilidade de ligar a seus
receptores (DAYTON et al., 2008).
O IGF um fator que regula o crescimento, a diferenciao e a
manuteno da funo diferenciada de inmeros tecidos (LI et al., 2004). So
componentes do sistema IGF as protenas ligantes, as IGFBPs, que variam em 6
35
formas conhecidas e proteases que podem alterar a afinidade de IGF IGFBPs

(GIBSON et al., 1999).
Por estar localizado em uma regio do cromossomo 4 dos bovinos que
contm um QTL para marmoreio, esse gene um forte candidato para ser testado
em relao a essa caracterstica. Esse gene foi pouco estudado em bovinos.
Veneroni (2010) no encontrou associao significativa entre o gene e a
caracterstica em animais da raa Canchim. Mais estudos em diferentes raas e
populaes so necessrios para comprovar esses achados.
4.7. Expresso gnica

O gentipo e o fentipo so interligados pela expresso dos genes, ou
seja, a converso do gentipo em fentipo mediada pela traduo do gene em
protena, e esta, por sua vez, ir atuar na caracterizao e funo das clulas,
resultando no fentipo. Portanto, variaes na expresso gnica resultam em
diversidade fenotpica, que a base gentica da evoluo (WRAY et al., 2003). J
em 1975, King e Wilson afirmaram em seus estudos que as mudanas evolutivas
so principalmente resultados das alteraes nos mecanismos de controle da
expresso gnica do que nas protenas.
Como exemplo de que a variao da expressa gnica a base
gentica da evoluo, Oleksiak et al. (2002) estudaram a expresso de indivduos
pertencentes a uma mesma populao de peixes do gnero Fundulus, ou seja,
desenvolvidos no mesmo ambiente e sob as mesmas condies, e encontraram
diferena de aproximadamente 18% na expresso dos genes entre os indivduos.
Alm disso, Townsend et al. (2003) verificaram a existncia de variao na
expresso gnica em escala genmica em populaes naturais de Saccharomyces
cerevisiae. Em bovinos, animais com alto potencial de crescimento muscular
apresentaram genes com diferentes perfis de expresso em relao a animais com
baixo potencial (BERNARD et al., 2009)
Em geral, o estado natural dos genes em eucariotos desativado, e
so expressos quando necessrios em determinados tecidos, condies ambientais
ou em alguns estgios do desenvolvimento (LANDE-DINER et al., 2007). A
regulao da expresso pode ser por meio de mecanismos como condensao da
cromatina, metilao do DNA, regulao da iniciao da transcrio, splicing
36
alternativo, estabilidade do mRNA, controle da traduo, alm de modificaes pstranscricionais e degradao das protenas, e assim, entre outros benefcios, a
clula evita gastos desnecessrios. Contudo, o mecanismo de regulao gnica
mais utilizada o controle do incio da transcrio (LEMON; TJIAN, 2000). Os genes
so transcritos pelo complexo da holoenzima RNA polimerase, e essa maquinaria
estruturada no promotor basal (ORPHANIDES et al., 1996), o qual contm um
elemento chamado TATA box, localizado aproximadamente 25 a 30 pares de base
na direo 5 do stio de incio da transcrio. O TATA box o sitio onde se liga a
primeira protena, a TBP (TATA box Binding Protein), que se associa ao fator TAF (do
ingls Transcritional Associated Factors) o qual guia a enzima RNA polimerase e seu
complexo para se ligarem ao DNA, dando incio ao processo de transcrio (LEE et
al., 1997). Os fatores de transcrio (FT) e cofatores compem o complexo da
holoenzima RNA polimerase, interagindo com o promotor.
O perfil total da expresso gnica resultado de uma somatria de
eventos que ocorrem para iniciar a transcrio do gene alvo. A posio relativa ao
promotor, a orientao e a sequncia de nucleotdeos dos stios de ligao dos TBP,
TAF, FT e cofatores, assim como o perfil de expresso desses fatores so exemplos
desses mecanismos.
4.7.1. Epigentica
Eventos epigenticos so informaes reversveis introduzidas nos
cromossomos que alteram a expresso dos genes, e consequentemente o fentipo,
sem modificar a sequncia de nucleotdeos (KENDREW, 1994). Os eventos
epigenticos mais conhecidos so modificaes das histonas e metilaes do DNA
(GREGORY et al., 2001).
A cromatina dos organismos eucariotos composta pela eucromatina e
a heterocromatina. Na eucromatina, as histonas so responsveis por moldar a
estrutura da cromatina e precisam sofrer modificaes para permitir o acesso da
maquinaria
transcricional.
Domnios
de
heterocromatina
possuem
estrutura
condensada de tal forma a impedir o acesso do complexo da RNA polimerase II (LI

et al., 2011). As modificaes na estrutura da cromatina ocorrem por meio de
alteraes nas histonas (GUILLEMETTE et al., 2011), o que resulta na transio
entre os estados ativo e inativo da transcrio da cromatina, influenciando a
37
expresso dos genes. Portanto, as modificaes nas histonas podem interferir em

processos biolgicos fundamentais, sendo herdados de maneira no mendeliana
(JENUWEIN; ALLIS, 2001; KOUZARIDES, 2007; GUILLEMETTE et al., 2011).
A metilao do DNA pode resultar em imprint genmico, no qual a
atividade transcricional do gene dependente da origem parental do alelo
(MORISON et al., 2001; SLEUTELS et al., 2000), mediado por metilao do DNA,
ocasionando expresso monoallica, de acordo com a origem parental (MORISON
et al., 2001; SLEUTELS et al., 2000; ZAINTOUN; KHATIB, 2008).
4.7.2. Expresso allica especfica

Segundo as leis da gentica mendeliana, alelos paternos e maternos
apresentam expresso e funes iguais em clulas somticas. So conhecidos, no
entanto, padres de expresso que contradizem essa afirmao, caracterizados pela
expresso de apenas um alelo, ou quando ambos so expressos, mas em nveis
diferentes.
A diferena de expresso entre os alelos de um gene pode ser devido a
polimorfismos distintos presente em cada alelo, mas que seguem as leis da herana
mendeliana, ou ento, essa variao pode estar relacionada a eventos epigenticos
que fogem s regras Mendelianas (YAN; ZHOU, 2004).
A
expresso
alelo
especfica
parece
estar
amplamente
proporcionalmente distribuda no genoma humano (LO et al., 2003; CHEUNG et al.,

2003; PALACIOS et al., 2009), e esse padro pode variar dependendo do estgio de
desenvolvimento ou do tecido (KHATIB, 2005).
Em bovinos, pouco havia se estudado sobre esse mecanismo devido
ao escasso conhecimento sobre as sequncias dos genes, no entanto, na ltima
dcada, grandes avanos na rea do genoma bovino (Bovine Hapmap Consortium,
2009) permitiram ampliar o leque de genes conhecidos como imprinted nessa
espcie.
38
4.7.2.1. Imprinting genmico

O imprinting genmico resultado da metilao do DNA em domnios
com alta concentrao de citosina-fosfato-guanina (CpG), o que pode silenciar
parcial ou completamente a expresso do gene. Esse mecanismo tem incio durante
a gametognese, estgio no qual a marca do imprint removida nos gametas e
posteriormente restabelecida de acordo com a origem parental do alelo, e ento so
transmitidos aos descendentes (REIK; WALTER, 2001).
Existe uma teoria para o surgimento do imprinting genmico descrita
com base em estudos genticos de sequncias de origem externa ao organismo,
como por exemplo, elementos repetitivos parasitrios ou transgenes. Esses
elementos so desligados por modificaes epigenticas como uma defesa do
organismo (SUZUKI et al., 2007). A partir desse conhecimento, o imprinting
genmico seria a evoluo de uma adaptao do sistema de defesa do hospedeiro
que apresentou vantagem seletiva e ento essa metilao se estendeu aos genes
vizinhos (ONO et al., 2001). Essa teoria sustentada por estudos com o gene
PEG10, derivado de retrotransposons, que expresso paternalmente em
camundongos (ONO et al., 2001; SUZUKI et al., 2007).
O primeiro catlogo de genes imprinted e de efeito de origem parental
foi publicado em 1998 por Morison e Reeve. Desde ento, efeito de origem parental
sobre a expresso allica vem sendo amplamente estudado em humanos e
camundongos (MORISON et al., 2001; LO et al., 2003; KHATIB, 2007; PALACIOS et
al., 2009), porm pouco se sabe sobre esses efeitos em bovinos. Isso fica claro
quando se acessa o banco de dados de genes imprinted e de efeitos de origem
parental (http://www.otago.ac.nz/IGC; MORISON et al., 2001). Cerca de 309 genes
de humanos e 194 de camundongos j foram catalogados nessa base de dados,
apresentando ou no efeito de origem parental, enquanto esse nmero diminui
drasticamente para 32 em bovinos e 20 em ovinos.
Em
mamferos,
alguns
genes
imprinted
desempenham
papel
importante no crescimento e desenvolvimento (VAN LAERE et al., 2003; CHENG et

al., 2008). O gene IGF-2 (Insulin-like growth-factor 2) foi um dos primeiros genes
descrito como imprinted em diversos mamferos, sendo a cpia materna inativa
(JEON et al., 1999). Esse gene j foi associado com caractersticas quantitativas de
desempenho em animais de produo, como crescimento muscular em sunos (VAN
39
LAERE et al., 2003) e rea de olho de lombo em bovinos (GOODALL; SCHMUTZ,

2007).
Os genes PI (KHATIB, 2005), TSSC4, PEG10 (ZAITOUN; KHATIB,
2008) e NESP55 (KHATIB, 2004) so conhecidos como imprinted em bovinos,
enquanto CD81, OBPH1, ASB4, HTR2A (ZAITOUN; KHATIB, 2008), COPG2, DCN e
SDHD (KHATIB, 2005) foram estudados e classificados como genes de expresso
biallica.
4.7.2.2. Expresso allica preferencial (EAP)

Existem casos em que genes imprinted apresentam expresso de
ambos alelos, paterno e materno, mas em nveis diferentes de mRNA e de acordo
com a origem parental do alelo (KHATIB, 2007). Esse padro de expresso de
genes imprinted denominado expresso allica preferencial (EAP).
Muitos genes descritos como imprinted foram reavaliados, devido
descoberta de que muitos deles apresentam EAP, de acordo com a origem parental
do alelo, ao invs de expresso monoallica (KHATIB et al., 2007). Khatib et al.
(2007) estudaram o perfil de expresso de 50 genes de camundongos e humanos
intitulados imprinted em estudos anteriores, e observaram que, desse total, apenas
24 apresentaram expresso monoallica exclusiva, sendo que 26, portanto, foram
reclassificados como genes com expresso allica preferencial.
4.7.2.3.
Expresso allica diferencial (EAD)

Genes no-imprinted tambm podem apresentar expresso allica
especfica, nesse caso conhecida como expresso allica diferencial (EAD), a qual
se refere a uma variao allica na expresso gnica, envolvendo variao
fenotpica, mas sem relao com a origem parental (KHATIB, 2007).
A expresso gnica alelo especfica relativamente comum em genes
no-imprinted humanos e est distribuda amplamente no genoma e em processos
biolgicos. um fator importante para a variabilidade fenotpica humana,
apresentando influncia sobre o desenvolvimento de doenas, razo pela qual vem
sendo amplamente estudada nessa espcie (YAN et al., 2002; LO et al., 2003;
PALACIOS et al., 2009).
40
A EAD uma caracterstica herdada de maneira mendeliana (YAN et

al., 2002; PASTINEN; HUDSON, 2004; KURREEMAN et al., 2004) que pode ser
resultado de variaes em elementos regulatrios de DNA que atuam de forma CIS
(MORLEY et al., 2004; PASTINEN; HUDSON., 2004).
Por exemplo, Wang et al. (1995) identificaram em algumas pessoas
tolerantes lactose que um dos alelos apresentava nveis de expresso muito
baixos no intestino do que o outro, e essa diferena era coordenada por elementos
regulatrios CIS e implicava em atividade intermediria da protena lactose.
Um indivduo heterozigoto para um polimorfismo que afeta de maneira
CIS a transcrio do gene poder apresentar nveis de expresso diferentes de
mRNA (BRAY et al., 2003). Esses SNPs podem estar presentes em elementos
regulatrios localizados no 5UTR, ou em xons, ntrons e regies regulatrias
3UTR (PARKER-KARTIRAEE et al., 2008).
Polimorfismos presentes em stios alvo de micro RNAs (miRNA) podem
influenciar a atuao do miRNA na regulao da traduo do mRNA (SUN et al.,
2011). Esses elementos apresentam, em sua maioria, funo de ligar regio 3
UTR e assim regular a expresso do gene (MCDANEL, 2009). Sun et al. (2011)
atriburam a responsabilidade da EAD do gene UGT2B15 a um SNP na regio
3UTR, como sendo um provvel stio alvo de miRNA, visto que eles verificaram que
a EAD no era resultante de outros mecanismos como gnero e estgio de
desenvolvimento.
4.7.3. Prospeco de expresso alelo especfica e sua aplicao no

Melhoramento Animal
A existncia de expresso alelo especfica pode ser verificada com a
utilizao de mtodos de discriminao allica, adotando um SNP como marcador
para distinguir os transcritos derivados de cada alelo. A anlise feita em um indivduo
heterozigoto compara a expresso entre os alelos de cada indivduo, assim cada
alelo atua como controle interno para o outro, eliminando a influncia ambiental
(YAN et al., 2002; BRAY et al., 2003, LO et al., 2003, PALACIOS et al., 2009).
Essa metodologia pode ser colocada em prtica com a utilizao de
ensaios de discriminao allica TaqMan (LO et al., 2003; PALACIOS et al., 2009;
NICIURA et al., 2012) e SnapShot (PARKER-KATIRAEE et al., 2008) ambos da
41
Applied Biosystem. Alm de poder ser aplicado em larga escala para compreender a
distribuio genmica da variao na expresso allica (LO et al., 2003; PALACIOS
et al., 2009), lanando mo de arranjos de oligonucleotdeos.
Estudos recentes tm discutido as consequncias da origem parental
em programas de melhoramento e seus efeitos nas caractersticas quantitativas
(PATTEN; HAIG, 2008; SPENCER, 2009) tentando entender como esses efeitos
podem ser incorporados nos modelos (KONING et al., 2000; SPENCER, 2009).
A epigentica pode contribuir ao melhoramento animal por meio da
elucidao da falta de explicao para resultados de casualidade e herdabilidade de
caracteres complexos e doenas. Isso remover o rudo existente na equao de
decomposio do fentipo (modelo infinitesimal) de maneira a aumentar a acurcia
na estimativa dos parmetros (GONZLEZ-RECIO, 2012).
esperado que genes imprinted afetem os modelos estatsticos
usados no melhoramento animal por causarem diferenas entre valores genticos
de fmeas e machos, e produzirem desvios em efeitos genticos aditivos e no
aditivos (PATTEN;HAIG, 2008).
Assim, em caso de genes imprinted, a gerao F1 se assemelhar ao
progenitor do qual herdou o alelo funcional (SPENCER, 2009), ou o alelo mais
expresso, no caso de genes no-imprinted com expresso alelo especfica. Em
caractersticas de carcaa, o imprint j foi demonstrado contribuir significativamente
para a varincia gentica com propores de 8 a 25% da varincia gentica aditiva
total (NEUGEBAUER et al., 2010).
A escassez de estudos envolvendo efeitos de origem parental na
expresso gnica e a denominao errnea de alguns genes como imprinted
(KHATIB et al., 2007) tm justificado estudos que objetivam compreender melhor
esses mecanismos epigenticos.
Alguns
genes
associados
com
caractersticas
de
importncia
econmica apresentam expresso alelo especfica. O gene que codifica a leptina

apresenta controle da expresso tecido especfica por meio da metilao do DNA
(KREMENSKOY et al., 2006) e apresentou efeito de origem parental em tecidos
bovinos fetais (NICIURA et al., 2012). Para o gene DGAT1 foi relatado efeito de
origem parental sobre a produo de leite (KUEHN et al., 2007) porm, em tecidos
fetais de bovinos de corte, Niciura et al. (2012) no encontram efeito de origem
parental nesse gene, por isso seria importante analisar em tecidos adultos. Tambm
42
existem estudos de efeitos de origem parental em QTLs relacionados a

caractersticas de interesse econmico em animais de produo (NEZER et al.,
1999; VAN LAERE et al., 2003; MORISON et al., 2001). Em relao ao gene CAST,
fetos GG apresentaram o dobro da expresso observada em msculo de animais
AG, demonstrando a existncia de expresso alelo especfica independente da
origem parental (NICIURA et al., 2012).
As informaes obtidas nos estudos de associao de polimorfismos
com caractersticas de qualidade da carne e na verificao do padro da expresso
podem ser posteriormente combinadas em programas de seleo para aumentar a
preciso na escolha dos animais com potencial gentico para formar o grupo de
progenitores (RUVINSKY, 1999; SPENCER, 2009; MAGEE et al., 2010).
5. Material e Mtodos
5.1. Animais
5.1.1. Touros
A seleo dos touros para comporem a populao dos progenitores foi
realizada a partir de consultas aos catlogos das principais centrais de inseminao
artificial do pas. A partir de um nmero total de 616 touros Nelore, foram eleitos para
a composio desta amostra 32 touros ativos na populao, ou seja, para os quais
havia smen disponvel no mercado, cujo valor no excedesse R$ 50,00 a dose, a
fim de representar touros acessveis ao produtor tpico da raa.
Outro importante critrio de seleo dos touros foi que os mesmos
pertencessem s genealogias representativas das principais linhagens que
compem a raa Nelore, de uso comercial mais frequente dentro da raa. A escolha
foi feita de maneira a minimizar o grau de parentesco entre eles. Caractersticas
fenotpicas no foram utilizadas como critrio para escolha dos touros.
5.1.2. Novilhos
A criao dos animais utilizados, assim como sua produo e avaliao
43
fenotpica, foram realizadas no mbito do projeto em rede Bife de Qualidade

(BifeQuali) Projeto Componente: Gentica quantitativa e molecular de
caractersticas de qualidade da carne e de eficincia alimentar na raa Nelore, da
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria (Embrapa).
Para a realizao deste experimento foram produzidos 635 novilhos
machos, em duas estaes de monta (2007 e 2008), descendentes dos touros
registrados da raa Nelore, compondo famlias de meios-irmos produzidas atravs
de inseminao artificial em tempo fixo (IATF). Os animais foram criados na
Embrapa Pecuria Sudeste e na Embrapa Gado de Corte, localizadas,
respectivamente, na Fazenda Canchim em So Carlos e no municpio de Campo
Grande-MS, alm de propriedades particulares do Estado de Mato Grosso do Sul. O
projeto BifeQuali foi composto por trs safras de confinamento, porm os animais
utilizados neste trabalho foram confinados e abatidos nas duas primeiras safras. Em
cada safra os confinamentos ocorreram simultaneamente nas duas unidades da
Embrapa, nas quais os animais foram avaliados para caractersticas de eficincia
alimentar, crescimento e deposio de gordura. Aps cerca de 100 dias de
confinamento, e posteriormente abatidos em frigorfico.
5.1. Coleta das amostras de DNA, extrao e quantificao do DNA

Foram coletadas amostras de 5 ml de sangue dos novilhos, por puno
da veia jugular, em tubos de coleta a vcuo contendo EDTA potssico (K3). As
amostras foram mantidas refrigeradas at o incio do processo de extrao.
Os protocolos utilizados nos processos de extrao de DNA a partir de
leuccitos do sangue e de smen so adaptaes daqueles descritos em Regitano
(2001).
Extrao de DNA de amostras de sangue dos novilhos
Para obteno de leuccitos, as clulas vermelhas do sangue foram
gradualmente desintegradas em tampo apropriado (10 mM de Tris-HCl pH 7,6, 5
mM de MgCl2 e 10 mM de NaCl) com posterior centrifugao (700 g, 10 mim) e
descarte do sobrenadante. Esse procedimento foi repetido por trs vezes ou at a
obteno de um precipitado branco.
As clulas brancas do sangue foram ressuspendidas em 500 L de
44
uma soluo composta por 10 mM de Tris-HClpH 8, 10 mM de EDTA pH 8,0, 100

mM de NaCl, 0,5% de SDS, 2 g de proteinase K, e ento incubadas a 55C at a
dissoluo do pellet (por 4 a 6 horas ou durante a noite). Aps a incubao
adicionaram-se 240 l NaCl 5M e 210l de TE (10 mM de Tris HCl pH 7,6 e 1 mM de
EDTA pH 8,0). Por inverso dos tubos, o material foi agitado at formar pequenos
cogulos de protena e centrifugado por 15 minutos a 16.000 g, promovendo a
precipitao das protenas.
O sobrenadante contendo o DNA foi recuperado e precipitado pela
adio de dois volumes de etanol absoluto gelado. Logo em seguida, foi lavado com
etanol 70% gelado e, ento secado em capela de fluxo laminar. Posteriormente, o
precipitado foi dissolvido em 250 l de soluo TE + RNase (10 g por ml de
amostra) e incubado por uma hora a 37C. Ao final do procedimento, as amostras
foram armazenadas em freezer.
Extrao de DNA de amostras de smen dos touros
Para a extrao de DNA das amostras de smen, as palhetas foram
descongeladas em microtubos de 1,5 ml, centrifugadas por 8 minutos a 5.000 g e os
sobrenadantes descartados. O pellet, de cada amostra, foi lavado 4 vezes em 1 ml
de soluo PBS 1X pH 7,0 (2,7 mM de KCl, 1,5 mM de KH2PO4, 137 mM de NaCl, 8
mM de Na2HPO4). A seguir ressuspendeu-se o pellett em 100 l de PBS 1X e foram
adicionadas 400 l de soluo de lise (2% de 2-mercaptoetanol,10 mM de Tris.HCl
pH 8, 100 mM de NaCl, 10 mM de EDTA pH 8.0 e 0,5% de SDS). Posteriormente foi
incubado por 30 minutos a 50oC, a proteinase-K (200 g/mL) foi adicionada, e as
amostras foram vortexadas e incubadas por 16 horas a 50C.
Para a precipitao das protenas com sal, adicionou-se 90 l de TE e
160 l de NaCl 5M. Os tubos foram agitados por inverso, incubados em gelo por 15
minutos e centrifugados a 16.000g por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido
para tubos limpos, acrescentando-se 1 ml de etanol absoluto a cada tubo, os quais
foram agitados por inverso e centrifugados a 16.000 g por 5 minutos. O
sobrenadante foi descartado, o pellet lavado com etanol 70% e centrifugado a
16.000 g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado, o pellet seco, ressuspendido
em 100 l de TE + RNAse e incubado por 1 hora. As amostras foram armazenadas
em freezer a -20C.
45
Quantificao do DNA
Para a anlise da concentrao e da pureza (razo absorbncia
A260/A280) do DNA extrado, utilizou-se o NanoDrop. Esse espectrofotmetro
sensvel, conseguindo mensurar a concentrao de uma amostra pequena (1L a
2L) e apresenta uma cobertura de 220 a 750 nm.
Sabendo-se que as protenas absorvem luz no comprimento de onda
de 280 nm, a relao A260/A280 fornece um parmetro de avaliao da qualidade
das preparaes de cidos nucleicos e, valores inferiores a 1,8 resultam de
contaminao com protena.
Aps a quantificao, as amostras foram diludas em gua para se
obter uma concentrao final de 40 ng/l e conservadas em freezer 20 C.
5.2. Genotipagem dos polimorfismos

Os genes e os respectivos polimorfismos estudados esto descritos na
Tabela 1.
Tabela 1. Localizao e caractersticas de polimorfismos nos genes CAPN1, CAST, DGAT1, KCNJ11,
IGFBP3 e leptina, sequncias no GenBank.
BTA
regio
aminocido
Gene
Gene ID
Localizao
SNP
a
29
xon
5
281661
3379pb
G>A
CAPN1
b
7
30/3UTR
281039
2655 pb
A>G
CAST
c
14
xon
8
Lisina>Alanina
282609
707 e 708 pb
GC>AA
DGAT1
xon
1
2126
pb
T>C
532060
15
KCNJ11d
3UTR
2942 pb*
C>T
4
xon 4
Triptofano>Arginina
282261
4394 pb
T>C
IGFBP3e
120 pb
4
xon 2
C>T
Arginina>Cistena
Leptinac
280836
a
b
c
d
PAGE et al., 2002; MORRIS et al., 2006; WU et al., 2005 ; ALEKSEEV et al., 2010 ; eVENERONI et
al., 2010.*SNP foi utilizado apenas na expresso.
a) Touros: as genotipagens dos SNPs contidos nos genes CAST, DGAT1 e

leptina foram realizadas em estudos simultneos no laboratrio da Embrapa Gado
de Corte (sob responsabilidade da pesquisadora Fabiane Siqueira) atravs da
tcnica de PCR-RFLP.
Os genes IGFBP3, CAPN1 e KCNJ11 foram genotipados nos touros
por discriminao allica em PCR em tempo real, no equipamento Tempo Real 7500
(Applied Biosystems), a partir do DNA extrado de sangue e smen.
b) Novilhos: para todos os genes foi utilizado o sistema de discriminao
46
allica em PCR em tempo real.

O sistema TaqMan (Applied Biosystems) foi a ferramenta utilizada
para a discriminao allica em PCR em tempo real. Os primers que amplificam a
regio genmica de interesse e as sondas que permitem a identificao das
variantes allicas foram construdos pelo servio Assay-by-Design (Applied
Biosystems) e suas sequncias encontram-se descritas na Tabela 2.
As reaes de PCR foram realizadas com 2,5l de TaqMan PCR
Genotyping Master Mix (Applied Biosystems) 1X, 0,125 l de ensaio TaqMan 1X
contendo 0,9 M de cada primer e 0,25 M de cada sonda TaqMan e 15 ng de DNA
genmico, exceto para os genes CAPN1 e KCNJ11 para os quais foram usados 7 ng
de DNA, em reao final de 5 l. O incio da reao ocorreu com incubao a 50C
por 2 minutos e desnaturao a 95C por 10 min, seguidas por 40 ciclos de 95C por
30 s e 60C por 45s.
Tabela 2. Sequncias (5-3) dos primers e das sondas utilizados para a genotipagem dos
polimorfismos nos genes CAPN1, CAST, DGAT1, KCNJ11, IGFBP3 e leptina.
Gene
Primers (F e R)
Sondas*
AGCTACGAGGCCCTCTCA
VIC-AGGCAGCACGTCTGA (G)
CAPN1
TTGCGCAGCTCGTACCA
FAM-AGGCAGCACATCTGA (A)
TTTGCACATTCTCCCCACAGT
VIC-AATAAGTGCAAATTGAAAAT (T)
CAST
CGTGAGGCATCGTTTTCCAAATG
FAM-AGTGCAAATCGAAAAT (C)
GGCCAAGGCCAAGGCT
VIC-TTGGCCGCCTTACCT (GC)
DGAT1
CGCGGTAGGTCAGGTTGTC
FAM-CGTTGGCCTTCTTACCT (TT)
CCCAGCCTGCTGGATGT
VIC-CCTGACCCTTGTCCGC (T)
KCNJ11*
CCACGGTGCGCTTGC
FAM-CTGACCCTCGTCCGC (C)
GAAGCCTGATGTGATGTCCTATGG
VIC-TCCCATGTTGGACCC (T)
IGFBP3
CAGGAAGGCACGGGTGTATAA
FAM-CCATGTCGGACCC (C)
CTTTGGCCCTATCTGTCTTACGT
VIC-CATCTGCAAGGTC(T)
Leptina
TCTTGATGAGGGTTTTGGTGTCA
FAM-CATCCGCAAGGTC (C)
*Identificao dos fluorforos (VIC ou FAM), do alelo especfico para a sonda e do stio de
anelamento ao SNP; KCNJ11 SNP2126 pb.
Os gentipos foram obtidos a partir dos arquivos de sada e imagens

do software SDS do equipamento Tempo Real 7500. O software genotipa os animais
de acordo com a captao da fluorescncia emitida na amplificao em tempo real
de cada alelo.
5.4. Sequenciamento
Foi realizado sequenciamento de amostras representativas dos trs
47
gentipos do gene CAST que haviam sido genotipadas por ensaio TaqMan, para
confirmar os gentipos e a eficincia do ensaio. Para tanto, os primers (Tabela 3)
foram desenhados com auxlio do software primer3plus, disponvel na web
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Verificou-se a qualidade dos primers pelo software
OligoAnalyzer (http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/). Foram
escolhidos os melhores pares de primers desenhados, ou seja, os pares que
apresentaram G maior que 0 (ideal para que no ocorram reaes espontneas),
que no formaram hairpin (primers que no foram auto complementares) e que o
produto de amplificao tivesse aproximadamente 600pb.
Tambm realizou-se o sequenciamento dos xons do gene CAPN1
com o intuito de encontrar um polimorfismo que apresentasse distribuio
satisfatria de ambos os alelos e por fim pudesse ser utilizado na anlise de
expresso allica. Ao todo, foram desenhados 14 pares de primers (Tabela 3) para
sequenciamento a partir da sequncia depositada no banco de dados Ensembl
(http://www.ensembl.org/index.html).
48
Tabela 3. Primers utilizados para o sequenciamento de fragmentos do gene CAPN1 e CAST,

tamanho do produto de amplificao.
gene
CAST
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
CAPN1
Primer
Sequncia (5-3)
CAST3UF_Seq TTG CCT TCA GTT GGG AGA GA

CAST3UR_Seq ACAAGGTGCGGAAGTCCTAA
1F
GGG GAC TAC TCT GCC TTT GA
1R
AGC TTG GGG GCT GAT AAG T
2F
AGT GAA GAG GTG GGG AAA CC
2R
TCC TGC AAG AGA CCC AGA GT
3F
CCT GAG TGA GGA GTG GGA AT
3R
ACT CCT TGT CCA AGG TGC AT
4F
GGG ATC TCA AAG CAG GGA TT
4R
GAT GGT GTG AGG CAA AGG AC
5F
CCC CTC ACC AGC AGT ATC AT
5R
TCC CTG GGA GAT AGG AAG GT
6F
AGG CTT CTC AGC TGT GCT TC
6R
CCA GTC CCA GGG GTT ATC TT
7F
CCA GGG AAG GAC AGG CCC CA
7R
ACC CCA CTC CCC AGG TCA CC
8F
CGG TGG ACC CAG TGA TAC TT
8R
TCA CTC ACT ATC CGC CTC CT
9F
CAG CCT TTG GGT GAC TGA AC
9R
TTG CTG GCT AGA GAC CAA GA
10F
AGG AAG CGA GCA ATG TGA CT
10R
TTG CTG GCTA GAG ACC AAG A
11F
CCC TCA TCA TTG GGC TGT AT
11R
GGA CTC TGA AAG GCA GTG GA
12F
CTG CAC TTC CTT CCC TTC TG
12R
GAA CTG GCC TGT CCA CAT CT
13F
TAC TCA CTC ACC CAG CGT CT
13R
ACT TCA CCA CCA CTG CCA TC
14F
TTC TGG GTC CTC AAG CTT TC
14R
CGG GTG AGA AAA ACC CAC T
Tamanho do
produto em pb
422
528
518
554
509
361
417
522
496
527
560
543
430
553
549
Temperatura de
anelamento
57C
57C
56C
56C
56C
56C
56C
64C
56C
56C
56C
56C
56C
64C
64C
As concentraes dos reagentes para PCR especficas dos primers

estabelecidas aps testes foram: tampo de reao 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM
de dNTP, 0,165 M de cada primer, 0,65 U da enzima Taq DNA polimerase e 80 ng
de DNA. A temperatura de amplificao estabelecida para cada par de primer est
na Tabela 3. gua miliQ autoclavada foi adicionada para completar o volume final de
49
15 L.
A amplificao iniciou-se com 5 minutos a 95C para a desnaturao
inicial das fitas do DNA, seguidos de 35 ciclos de 45 segundos a 94C, 45 segundos
temperatura de anelamento dos primers, 45 segundos a 72C. Aps os 35 ciclos, o
produto da amplificao foi submetido etapa de extenso final por 10 minutos a
72C. A qualidade dos amplicons dos segmentos dos gene estudados foi verificada
por eletroforese em gel de agarose a 2,0%.
As reaes de PCR foram purificadas atravs do kit ExoSap. Para
purificao foram adicionados 2 L de ExoSAP a 5 L de produto da PCR, a mistura
foi colocada no termociclador durante 15 minutos a 37C e 15 minutos a 80C .
Para as reaes de sequenciamento seguiu-se o protocolo adaptado
por Regitano (2001) utilizando o Kit ABI PRISM BigDye terminator v. 3.1 cycle
sequencing da Applied Biosystem. Foram adicionados 5L de gua, 1 L de BigDye
(que contm DNA polimerase, ddNTPs marcados e dNTPs), 1 L de tampo (Mg+2 e
Tris-HCl), 2 pmol de cada primer e 1 L de produto de PCR, sob as seguintes
condies: pr-incubao a 94C por 2 min e 25 ciclos a 96C por 20 seg,
temperatura de anelamento do primer por 10 seg e 60C por 4 seg.
Os produtos de sequenciamento foram purificados para evitar que os
reagentes no incorporados interferissem na leitura do sequenciamento. Para isso
foram adicionados 26 L de isopropanol 65% temperatura ambiente (TA),
homogeneizados e incubados no escuro TA por 15 min. Passado esse tempo,
centrifugou-se por 25 min a 16.000 g em TA, e o sobrenadante foi descartado por
inverso. Foram adicionados 150 L de etanol 70%, TA, centrifugou-se por 10 min
a 2250 g e o sobrenadante foi descartado (a lavagem com etanol 70% foi repetida
duas vezes). As reaes ficaram no escuro para secar durante 1 h e depois foram
armazenadas em freezer (20C). Aps a reao de sequenciamento, o produto da
reao foi ressuspendido em formamida. Foi ento desnaturado, a 95 oC por 5 min,
e resfriado a 4 C por 5 min. Posteriormente a placa foi submetida eletroforese
capilar no equipamento ABI 3100 Avant da Applied Biosystems. Utilizou-se o
polmero POP6, capilar de 50 cm e tampo de corrida (Applied Biosystem) e aplicouse uma voltagem de 15 kV.
Os eletroferogramas (Figura 1), gerados pelo software GenScan
(Applied Biosystems), foram submetidos anlise de qualidade atravs do programa
50
Phred (EWING et al., 1998), que atribui um valor de qualidade a cada nucleotdeo
identificado. Em seguida, as sequncias foram submetidas ao programa de
montagem Phrap (Phragment Assembly Program; EWING; GREEN, 1998;
PROSDOCIMI et al., 2002), que agrupa as sequncias organizando-as em contigs. A
visualizao das sequncias geradas e, consequentemente, dos SNPs (Figura 2) foi
realizada atravs do programa Consed (GORDON, et al., 1998; PROSDOCIMI et al,.
2002). A presena de 2 picos no eletroferograma foi interpretada como um SNP.
Figura 1. Eletroferogramas gerados pelo sequenciador para posterior anlise nos

programas Phred/Phrap/Consed
51
Figura 2. Imagem da sada do programa Consed que permite a visualizao dos SNPs
5.5. Extrao e quantificao do RNA

O RNA foi extrado de amostras de gordura subcutnea ou de tecido
muscular, coletados na posio correspondente ao contrafil na linha de abate. As
amostras foram transportadas em nitrognio lquido e mantidas em freezer -80C at
o processamento.
Os tecidos pulverizados em nitrognio lquido foram destinados
extrao de RNA com Trizol (Invitrogen). O tecido foi macerado em nitrognio
lquido. Para cada 50 a 100mg de tecido adicionou-se 1mL de Trizol e, seguida pela
homogeneizao em vrtex. Posteriormente, foram incubados por 5 min em TA,
acrescentado de 200 L de clorofrmio e agitados por 15 seg. Realizou-se
novamente incubao por 5 min em TA, e ento centrifugou-se a 16.000 xg a 4C
durante 15 min. A parte aquosa foi removida para um microtubo limpo, ao qual foram
adicionados 500 L de isopropanol e homogeneizado. Foi incubado por 10 min em
TA e depois centrifugado a 13.000 xg a 4C por 10 min. O sobrenadante foi
descartado e o pellet lavado em 1 mL de etanol 75% (feito com gua DEPC).
Centrifugou-se a 10.500 xg a 4C por 5 min e, ento, o pellet foi seco por 15 min
52
TA. O pellet foi ressuspendido em gua DEPC e mantido 55C por 10 min e, por
fim, a integridade de RNA foi avaliada por eletroforese e a quantidade, em
espectrofotmetro.
Aps a extrao, 1g do RNA total foi destinado transcrio reversa
(RT) para obteno de cDNA.
5.6. Sntese de cDNA (RT-PCR)

A produo do cDNA foi realizada a partir do RNA extrado dos tecidos,
utilizando o kit SuperScript III First-Strand Syntheis SuperMix (Invitrogen). Para
tanto, os componentes do mix RNA/primer (1 g de RNA total, 1 L de dNTP mix
10nM, 1 L de OligodT 0,5 g/L, em volume 10 L) foram descongelados e
homogeneizados. Incubou-se o mixRNA/primer a 65C por 5 min que depois foi
resfriado em gelo por 1 min. Posteriormente preparou-se 10 L do mix da reao (2
L de Buffer RT 10X, 4 L de MgCl2 a 25mM, 2 L de DTT 0,1 M, 1 L de RNAse Out
40 U/L e 1 L de SuperScript III RT 200U/l) o qual foi incubado a 50C por 50
min. Ento foi incubado novamente a 85C durante 5 min e centrifugado. E, por fim,
adicionou-se 1L de RNAse H, e incubou-se por 20 minutos a 37C e estocou-se em
freezer a -20C.
5.7. Avaliao da expresso gnica alelo especfica

A expresso de cada alelo foi determinada por PCR em tempo real a
partir de amostras de cDNA de animais heterozigotos, filhos de touros homozigotos
para cada SNP. Nessas anlises foram utilizados os mesmos ensaios TaqMan
usados na genotipagem, no equipamento PCR em tempo real 7500 (Applied
Biosystems), segundo metodologia descrita por Lo et al. (2003). Considerando que
os primers e sondas utilizadas nas genotipagens foram os mesmos que os utilizados
para a avaliao de expresso gnica, foi preciso desenh-los em xons e foram
evitadas as junes xon-xon.
As condies de reao utilizadas foram as mesmas descritas nos
procedimentos de genotipagem por discriminao allica, com exceo da utilizao
do TaqMan Universal PCR Master Mix e foi feita em duplicata para o gene CAST e
em triplicata para os demais.
53
Para cada gene alvo (CAPN1, CAST e KCNJ11), foi utilizado DNA
genmico de dois animais homozigotos (AA e BB) cujos gentipos haviam sido
confirmados por sequenciamento. O DNA genmico desses animais foi misturado
nas seguintes propores: 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 (alelo FAM :alelo VIC) com
o intuito de construir uma curva padro (Figura 6), de acordo com o mtodo descrito
por Lo et al. (2003).
Os ensaios TaqMan foram conduzidos e os dados de intensidade de
fluorescncia foram exportados do software SDS.
esperado que as fluorescncias dos alelos em uma amostra de DNA
genmico de um heterozigoto sejam as mesmas se no houvesse diferena no
comportamento das sondas VIC e FAM. Portanto, a construo de uma curva
padro com DNA genmico em diferentes diluies ir dizer qual seria a razo
esperada entre os alelos em cada proporo.
Para cada proporo de um dado gene, foi calculado o log2
(intensidade de FAM/ intensidade de VIC) no ltimo ciclo de PCR (ciclo 40). Foi
gerada uma curva padro (reta de regresso linear, Figura 7), y = a + bx, onde y o
log2 intensidade FAM/ intensidade VIC de uma dada proporo, x o log2 da
proporo, a o intercepto e b o slope.
Aps definida a curva padro, foi medida a expresso alelo especfica
dos animais para cada gene utilizando o mesmo procedimento, porm com cDNA.
Ento a razo do alelo na expresso gnica foi extrapolada interceptando o log2
(intensidade FAM/ intensidade VIC) na curva padro.
6. ANLISE DOS RESULTADOS
6.1. Escolha dos animais extremos para o sequenciamento

Para a determinao dos animais com fentipos extremos de maciez
foram utilizados os resduos do modelo obtido na anlise de varincia realizada para
determinar as fontes de variao da caracterstica, que foram realizadas pelo
procedimento GLM do software SAS (SAS INSTITUTE INC., 2000). Aps a
ordenao dos valores residuais, animais classificados entre os 5% maiores e
menores
valores
foram
selecionados,
considerando-se
ainda
que
fossem
representadas famlias de meio-irmos diferentes, amostrando assim variabilidade.
54
Foram escolhidos 14 animais de cada extremo para maciez.
6.2. Anlise de TagSNP para os genes KCNJ11 e CAPN1

No intuito de escolher os SNPs dos genes KCNJ11 e CAPN1 a serem
investigados nas anlises de associao e expresso allica, buscou-se um
TagSNP, ou seja, um SNP que apresentasse um padro de desequilbrio de ligao
com outros SNPs contidos no gene de tal forma que sua genotipagem revelaria
gentipos desses outros SNPs. O TagSNP foi determinado com base nos resultados
de anlise pelo programa Haploview (BARRETT et al., 2005), o qual mostra o
padro de desequilbrio de ligao entre os SNPs, o que torna possvel a escolha do
principal TagSNP e possibilita o estudo de diversos SNPs simultaneamente.
6.3. Anlise estatstica da expresso allica diferencial

Para verificar se as diferenas de expresso entre os alelos foram
significativas, certificou-se que as razes allicas de intensidade de fluorescncia da
sonda apresentaram distribuio normal pelo teste DAgostino executado no
BioEstat 5.0 (AYRES et al., 2007) e ento foi aplicado o teste-t de Student de uma
amostra com intervalo de confiana (IC) de 5%. Para tal, adotaram-se as seguintes
hipteses:
H0= mdia das razes igual a zero (Hiptese Nula);
H1 = mdia das razes diferente de zero (Hiptese Alternativa).
Foi calculada a mdia das razes de expresso allica e o IC para
cada gene, se o nmero 1 estivesse contido dentro do IC ento a hiptese nula seria
aceita e, portanto, a razo seria considerada estatisticamente igual a zero e o gene
no apresentaria expresso allica diferencial. Caso o IC calculado no abrangesse
o nmero 1, a hiptese nula seria rejeitada, ou seja, a razo seria estatisticamente
diferente de 1 e o gene apresentaria expresso allica diferencial. O teste-t foi
executado no software BioEstat 5.0 (AYRES et al., 2007).
Nos casos em que 2 SNPs do mesmo gene foram estudados, a
interao de ambos na expresso allica tambm foi avalida. Para isso separou-se
os animais heterozigotos para um SNP em dois grupos, de acordo com o gentipo
no segundo SNP (homozigotos e heterozigotos) e ento o teste-t independente foi
55
aplicado a esses dois grupos.
6.4. Anlise de efeito de origem parental

Aps anlise da expresso allica, para os genes nos quais se
encontrou diferena de expresso allica, foi avaliado se a EAD era influenciada
pela origem parental do alelo. Para tanto, os animais foram separados de acordo
com a origem parental do alelo escolhido e aplicou-se uma anlise de varincia
(ANOVA) para um critrio utilizando o software BioEstat 5.0 (AYRES et al., 2007).
7. RESULTADOS E DISCUSSO
7.1. Gene CAST

O SNP g.2959A>G do gene CAST, que uma transio de uma
adenina para uma guanina na regio no traduzida 3 (3UTR) descrita por
Barendse (2002), foi escolhido para ser genotipado na populao por ter sido
previamente associado com maciez e caractersticas sensoriais da carne em
populaes B. taurus (BARENDSE, 2002; CASAS et al., 2006; MORRIS et al.,
2006), alm de compor testes de DNA comerciais para maciez (VAN EENENNAM et
al., 2007). O principal papel biolgico do CAST na regulao da protena calpana,
que atua no amaciamento da carne no perodo post-mortem (GEESINK;
KOOHMARIE, 1999).
7.1.1. Frequncias allicas e genotpicas

Em prvia anlise das frequncias do SNP no gene CAST na
populao dos touros (Dra. Fabiane Siqueira comunicao pessoal), observou-se
que o SNP era polimrfico, portanto compatvel para o estudo de expresso. Na
Tabela 4 esto dispostas as frequncias allicas e genotpicas para o SNP do gene
CAST nas populaes de Nelore. Na populao da raa Nelore avaliada neste
trabalho, o SNP se demonstrou bastante polimrfico, com MAF (alelo de menor
56
frequncia) de 44,57% para o alelo A. As frequncias encontradas neste estudo so

diferentes daquelas obtidas por Morris et al. (2006), Casas et al. (2006) e Pintos e
Corva (2011), principalmente quando esses autores avaliaram populaes B. taurus.
Tabela 4. Frequncias allicas e genotpicas encontradas para o SNP A>G xon30/3'UTR
do gene CAST nos touros e prognie de animais da raa Nelore.
Populao
Nmero
animais
Touros
24
AA
30,76
Prognie
184
17,39
Frequncias (%)
Genotpica
AG
GG
57,69
11,55
54,35
28,26
Allica
A
G
59,61
40,38
44,57
55,43
Os resultados de frequncias allicas foram prximos daqueles obtidos

por Curi et al. (2009), no qual o alelo A apresentou frequncia de 55,7% em uma
populao de Nelore. Contudo, Casas et al. (2006) encontraram frequncia mais
baixa para o alelo G, sendo 28,1% em populao B. indicus e 19,8% em populaes
B. taurus. Morris et al. (2006) e Pintos e Corva, (2011) encontraram frequncias
baixas para o alelo G em animais B. taurus (1 a 16% e 21,2%, respectivamente).
Em relao s frequncias genotpicas, Morris et al. (2006), analisando
populao de animais B. taurus, encontraram o gentipo GG em somente 1% na
populao, outros autores encontraram resultados parecidos 2,2%, (CASAS et al.,
2006), enquanto no presente trabalho, o gentipo GG foi encontrado a uma
frequncia de 28,26%. Considerando-se que animais B. taurus produzem
notavelmente carne de melhor qualidade, mais macia se comparadas a do B. indicus
(CROUSE et al., 1989), admissvel que em uma populao B. indicus o alelo
desfavorvel G estivesse com maior frequncia do que em uma populao B. taurus.
Em animais taurinos, Morris et al. (2006) e Casas et al. (2006) encontraram
frequncia do gentipo desfavorvel abaixo de 5% enquanto, que na populao
Nelore aqui em estudo, foi encontrado 28,26% (Tabela 4).
Os programas de melhoramento no Brasil utilizaram por muitas
dcadas caractersticas de crescimento como critrio de seleo. Contudo, em
estudo recente, o alelo desfavorvel G foi associado a altas DEPs para
caractersticas de crescimento (PINTOS; CORVA, 2010), assim o direcionamento
dos programas de melhoramento para caractersticas de crescimento pode ter
contribudo para a maior frequncia do alelo desfavorvel.
57
7.1.2. Anlise da expresso alelo especfica

Os genes associados s caractersticas de maciez e carcaa em
bovinos foram analisados quanto expresso de seus alelos. Foi utilizado um SNP
como marcador para distinguir entre os transcritos derivados de cada alelo de
indivduos heterozigotos (YAN et al., 2002; LO et al., 2003, PALACIOS et al., 2009).
Cada alelo serviu como controle interno para o outro, eliminando diferenas de
background gentico e fatores ambientais.
A curva padro para o gene CAST (Figura 3) foi construda a partir de
diluies do DNA genmico de dois animais homozigotos AA e GG, o que permitiu
Log2 (intensidade FAM/intensidade VIC)
avaliar quantas vezes um alelo foi mais expresso que o outro nas amostras.
log2 da proporo do alelo FAM pelo VIC

Figura 3. Curva padro da intensidade de fluorescncia produzida por diferentes propores
dos produtos de cada alelo do gene CAST. Log2 da intensidadeFAM/intensidadeVIC plotado
contra log2 da razo aleloFAM/aleloVIC das 7 diluies (8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 alelo
VIC:alelo FAM) dos DNAs de indivduos homozigotos.
Aps anlise de expresso, os valores das fluorescncias das sondas

coletadas no ciclo 40 foram interpolados na curva por meio da equao Y = a + bX,
na qual a assumiu o valor -0,1811 e b o valor 0,8578. O valor de X, correspondente
razo de expresso entre os alelos foi obtido a partir da equao, considerando o
58
valor de fluorescncia observado para a amostra (Y) no ciclo 40.

Como mostra a Figura 4, todos os animais analisados apresentaram
excesso do alelo G, e consequentemente um desvio da razo 1:1. A razo mnima
foi 1,12 e a mxima 1,5, resultando em mdia e erro padro de 1,30,03 enquanto
que em tecido muscular fetal, Niciura et al. (2012) encontrou razo mdia 1,570,09
quando analisou o mesmo SNP para o gene CAST.
2
razo allica G/A
Expresso allica CAST SNPg.2959A>G
0
Animais
Figura 4. Razo da expresso dos alelos G/A do SNP g.2959A>G do gene CAST em
amostras de msculos de novilhos da raa Nelore.
Na inteno de verificar se esse desvio da razo 1:1 era significativo foi

aplicado o teste-t de Student de uma amostra. O intervalo de confiana 95% (limite
inferior = 1,24; superior 1,37) no englobou o nmero 1, por isso a hiptese nula foi
refutada concluindo que a razo 1,3 diferente de 1.
O gene CAST apresentou expresso allica diferencial (EAD) entre os
alelos G e A, e com base nos gentipos paternos, foi possvel determinar que no
houve efeito da origem parental do alelo na expresso do gene. Na Figura 5 as
barras cinza claro representam animais que herdaram o alelo G da me e as barras
cinza escuro os que herdaram o alelo G do pai. Os dois grupos de animais
apresentaram a mesma tendncia de expresso allica, demonstrando que o
excesso de alelo G no influenciado pela origem parental do alelo. Os 14 animais
foram divididos em dois grupos de acordo com a origem parental do alelo G e
submetidos ANOVA para confirmar se no havia realmente efeito de origem
parental. O valor de P no foi significativo (P>0,05), portanto no h influencia da
59
origem parental na diferena de expresso allica para o gene CAST.
Efeito origem parental CAST

1,6
1,4
razo G/A
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
alelo G herdado da me
alelo G herdado do pai
Figura 5. Razo da expresso allica G/A do SNP g.2959A>G do gene CAST em

amostras de msculos de animais Nelore, de acordo com a origem parental do alelo
G.
Assim podem ser descartados imprinting genmico e expresso

preferencial para o gene CAST em tecido muscular adulto de animais da raa
Nelore.
Em trabalho analisando a diferena de expresso entre os trs
gentipos possveis, Niciura et al. (2012) verificaram que o gene CAST expresso o
dobro em msculo de fetos GG do que AG. Esses resultados esto de acordo com o
excesso de expresso do alelo G encontrados tanto em tecido muscular fetal
(NICIURA et al, 2012) quanto em tecido adulto, razo G/A 1,59 e 1,3
respectivamente. Vale ressaltar que o alelo que teve maior expresso nesse trabalho
foi o associado com menor maciez por outros autores.
O gnero do animal, idade, local e perodo de confinamento
provavelmente no so a causa da EAD. Todos os animais analisados so machos,
originados em uma nica estao de monta por IATF (safra 1), portanto possuem
aproximadamente a mesma idade, e confinados no mesmo local (Embrapa Pecuria
Sudeste) e perodo semelhante.
Dentre os fatores epigenticos e genticos que poderiam estar atuando
na expresso allica do CAST esto a condensao da cromatina, a metilao do
DNA, a regulao da transcrio por elementos CIS e TRANS, o RNA splicing, a
estabilidade do mRNA e microRNAs. Contudo, elementos que atuam de maneira
CIS na regulao da expresso gnica tm sido apontados por muitos autores como
60
a explicao plausvel para a EAD (WITTKOPP et al., 2004; CHEUNG et al., 2010;
SUN et al., 2011). Elementos CIS podem afetar de maneira alelo especfica o incio e
a taxa da transcrio, alm da estabilidade do transcrito, resultando em diferentes
nveis de mRNA. Sun et al. (2010), ao estudar EAD em um SNP no gene UGT2B15,
encontrou polimorfismos em elementos CIS na regio promotora. Diversos autores
utilizam a EAD como ferramenta para encontrar elementos CIS (PASTINEN;
HUDSON, 2004; YAN; ZHOU, 2004; WITTKOPP et al., 2004).
Portanto, o SNP do gene CAST pode no ser a mutao causal, ou
seja, pode estar em desequilbrio de ligao (DL) com algum SNP situado em algum
elemento CIS na regio promotora ou distante do gene. Hoogendoorn et al., (2003)
estudaram promotores humanos e verificaram que 10% daqueles analisados
apresentaram variaes funcionalmente relevantes na sua sequncia, confirmando
que polimorfismos dentro de promotores podem ser forte fonte de variao
fenotpica. conhecido que o promotor do CAST em bovinos alvo da atividade da
PKA (cAMP-dependent protein kinase) que parece aumentar a transcrio do gene
da calpastatina e reduzir a protelise da calpana (CONG et al., 1998), sendo assim,
polimorfismos nessas regies podem estar associados regulao da calpana e
por consequncia, com a maciez da carne.
Contudo, o SNP estudado no gene CAST est localizado na regio
3UTR do gene e pode estar em uma regio alvo de miRNA. Os miRNAs se ligam
regio 3 UTR influenciando a regulao da expresso do gene (MCDANEL, 2009).
Considerando a posio do SNP na regio 3UTR, foi utilizado o
TargetScan (http://www.targetscan.org/) (LEWIS et al., 2005) com o intuito de
verificar se o SNP faz parte de uma regio alvo de miRNA, alterando a afinidade
entre mRNA e miRNA. Nenhum miRNA conhecido cujo stio alvo envolvesse a
posio do SNP no mRNA foi encontrado, no entanto o stio alvo de dois miRNAs
bovinos (bta-miR-19a e bta-miR-19b) inicia no segundo nucleotdeo aps o SNP.
Ainda, esse SNP pode estar em desequilbrio de ligao com algum outro SNP alvo
de miRNA. Estudos com miRNA ainda esto caminhando e o banco de dados de
miRNA bovinos conhecidos ainda pequeno, portanto esse SNP poderia ser alvo de
algum miRNA ainda desconhecido.
Tendo em vista essas observaes, no se pode afirmar que o SNP
influencia ou no interaes com miRNA. Mais estudos envolvendo miRNA e anlise
de elementos CIS e TRANS so necessrios para elucidar o verdadeiro motivo de o
61
CAST apresentar EAD.
7.2. Gene CAPN1

A atividade biolgica da calpana sugere que ela seja um gene
candidato para maciez. Ela atua na degradao das miofibrilas do msculo
esqueltico no perodo post-mortem e isso est relacionado com o amaciamento da
carne (KOOHMARAIE, 1996; GEESINK; KOOHMARAIE, 1999; PAGE et al., 2002;
WHITE et al., 2005).
SNPs identificados nesse gene compem os principais testes genticos
para maciez disponveis no mercado IGENITY TenderGENE (Merial Ltd., Atlanta,
GA) e GeneSTAR Tenderness 2 test (Genetic Solutions Pty. Ltd., Albion, Austrlia).
Por esses motivos o gene CAPN1 foi selecionado para estudo de
expresso alelo especfica e associaes de SNPs com maciez da carne bovina.
7.2.1. SNPs identificados no gene CAPN1

Foram identificados 37 SNPs nos segmentos do gene CAPN1
estudados. Do total, 9 SNPs estavam localizados em xons, 2 na regio 5UTR e os
26 restantes em ntrons (Tabela 5). Todos os SNPs apresentaram frequncia
superior a 3,5%.
62
Tabela 5: Polimorfismos e frequncias allicas do gene CAPN1 de animais da raa Nelore.

Nmero
Localiza
o no gene
pb
Regio
do gene
Sequncia
Nucleotde
o
consenso
Frequncia
do n.
consenso
Nucleotdeo
Mutante
Frequncia do
n. mutante
Nmero
NCBI
SNP1
16
5UTR
GAGCCCG
92,90%
7,10%
SNP2
589
5UTR
CCTCTGT
50,00%
50,00%
SNP3
925
ntron 1
TGGGAAT
95,00%
5,00%
SNP4
1084
xon 2
GGGCGCA
92,90%
7,10%
SNP5
1330
ntron 2
GACGGGG
53,60%
46,40%
SNP6
3379
xon 5
CACGTCT
67,90%
32,10%
rs17872099
SNP7
3406
xon 5
CGGTGGA
28,60%
71,40%
rs17872093
SNP8
4310
ntron 5
ACAGCGG
92,90%
7,10%
SNP9
4419
xon 6
CAAACAG
53,80%
46,20%
rs17870630
SNP10
4474
ntron 6
TGCCTCT
80,80%
19,20%
rs17870629
SNP11
4744
ntron 6
AGGCGCT
73,10%
26,90%
SNP12
4751
ntron 6
GACGTGA
7,70%
92,30%
SNP13
4866
ntron 7
TCCATGG
92,30%
7,70%
SNP14
4976
ntron 7
CTGCGTG
96,20%
3,80%
SNP15
5096
ntron 7
GACTGGG
7,70%
92,30%
SNP16
5487
xon 9
CGCGCTC
95,80%
4,20%
SNP17
5529
xon 9
GTACGAG
12,50%
87,50%
rs134439483
SNP18
17976
ntron 10
CCCACCA
85,70%
14,30%
SNP19
21432
ntron 11
GCAACTC
80,00%
20,00%
SNP20
21705
ntron 12
GTAGAAA
91,70%
8,30%
SNP21
21810
xon 13
TGACCAG
89,30%
10,70%
rs17871050
SNP22
21814
xon 13
CAGGTCC
89,30%
10,70%
rs17871051
SNP23
22614
ntron 15
GAGCGTC
89,30%
10,70%
SNP24
23528
ntron 15
GACACTG
50,00%
50,00%
rs17872033
SNP25
23552
ntron 15
AGACTGG
85,70%
14,30%
SNP26
23560
ntron 15
CTTTCTT
88,50%
11,50%
SNP27
23587
xon 16
CACGGGC
96,20%
3,80%
SNP28
24177
ntron 17
GCGGCGG
87,50%
12,50%
rs17872152
SNP29
24199
ntron 17
ACCAGCT
17,90%
82,10%
rs17872153
SNP30
24208
ntron 17
GTGTTTC
42,90%
57,10%
rs110896665
SNP31
24250
ntron 17
CACGTGT
89,30%
10,70%
SNP32
24259
ntron 17
CAGTGGC
82,10%
17,90%
SNP33
24298
ntron 17
CCACGCT
96,40%
3,60%
SNP34
24330
ntron 17
TGCCGAG
89,30%
10,70%
SNP35
24504
ntron 18
TGACAGC
88,50%
11,50%
SNP36
25413
ntron19
GGAATGG
87,50%
12,50%
SNP37
25435
ntron 20
CAGGCTG
87,50%
12,50%
63
Ao todo 13 SNPs j estavam descritos no banco de dados do

ENSEMBL e NCBI, entre os quais 6 em xons e 7 em ntrons.
Os SNPs do gene CAPN1 mais estudados em bovinos so CAPN316 e
o CAPN530, ambos identificados por Page et al. (2002), no entanto, nesta
populao de extremos pra maciez o SNP316 no foi identificado e o CAPN530
(SNP 22) apresentou MAF 10,7%.
Esses resultados esto de acordo com os achados por Casas et al.
(2005) e Pinto et al. (2010). Casas et al. (2005) no encontraram o gentipo
favorvel na populao B. indicus para o SNP CAPN316 e, para o SNP CAPN530, o
alelo desfavorvel (A) estava praticamente fixado. Pinto et al. (2010) no
encontraram polimorfismos para esses SNPs em uma populao Nelore.
7.2.2. Escolha do SNP do CAPN1 para as anlises de expresso

Para a genotipagem da populao e anlise de expresso foi preciso
selecionar um dentre os 37 SNPs. Adotou-se como critrios de escolha que o SNP
apresentasse distribuio satisfatria dos dois alelos na populao, que estivesse
localizado na regio mediana de xon e que carregasse a maior quantidade de
informaes de outros SNPs, ou seja, o melhor TagSNP.
Para encontrar o TagSNP, foi utilizado o programa Haploview
(BARRETT et al., 2005) que possibilitou verificar o padro de desequilbrio de
ligao entre os SNPs. Na Tabela 6 seguem descritos os TagSNP e os SNP que eles
capturam.
Tabela 6. TagSNP, nas respectivas posies no gene e os SNP que eles capturam.
TagSNP
Regio do gene
SNPs capturados
SNP26
SNP37
SNP13
SNP21
SNP12
SNP8
SNP9
SNP27
SNP30
ntron 15
ntron 20
ntron7
xon 13
ntron 6
ntron 5
xon 6
xon 16
ntron 17
SNP34,SNP25,SNP31
SNP28,SNP22,SNP36
SNP15,SNP12
SNP35,SNP23
SNP6
SNP4
SNP5
SNP33
SNP24
Os polimorfismos que no esto na Tabela 6 no capturam nenhum

outro SNP. O SNP9, que TagSNP para o SNP5, est localizado na parte final do
64
xon 6, portanto no era apropriado para ser utilizado na anlise de expresso. Isso
porque no sobraria espao no xon para ser desenhado o primer reverse do ensaio
TaqMan e teria que ser desenhado na regio intrnica impossibilitando o uso da
sonda em mRNA que no contm os ntrons. O inverso acontece com o SNP27, que
est na parte inicial do xon 16, no havendo espao para o desenho do primer
forward o que, portanto, foi tambm descartado.
O SNP21 est posicionado quatro bases antes do SNP22 (CAPN530),
o qual foi bastante estudado em bovinos e associado com maciez em diversas
populaes (PAGE et al., 2004; CASAS et al., 2005). Entretanto, essa proximidade
impossibilitou os estudos de genotipagem e expresso por atrapalhar o anelamento
da sonda e gerar gentipos errneos. Testes prvios realizados com sondas
TaqMan para o SNP22 mostraram a ineficincia do ensaio para esse locus (MELLO
et al., 2010), alm de no terem sido encontrados animais homozigotos para ambos
os alelos, necessrio para construo da curva padro. Esse SNP foi encontrado em
baixo polimorfismo em outras populaes tambm. Pinto et al. (2010) encontraram
frequncia de 8% para o alelo A em populao de Nelore, e Casas et al. (2005)
encontraram o alelo G fixado em uma populao de B. indicus, mas quando autores
analisaram esse polimorfismo em populaes B. taurus, ele se mostrou mais
polimrfico. Page et al. (2004), analisando diferentes grupos genticos, encontraram
frequncias variveis para o alelo A, em Simental foi observada 58%, em Charols
45%, enquanto em Angus foi encontrado apenas 7%, ressaltando que esses grupos
so B. taurus. Nessas populaes, o SNP foi associado com variao na fora de
cisalhamento.
Page et al. (2002) identificaram o polimorfismo CAPN316 no xon 9,
que uma substituio de uma citosina por uma guanina na posio 5709
(AF252504) associada com maciez. Gill et al. (2009) encontraram o gentipo CC
resultando em carne mais macia em B. taurus, enquanto que em Nelore, Pinto et al.
(2010) no encontraram animais cujo gentipo fosse CC, e Curi et al. (2010) no
encontraram segregao adequada do SNP. No presente trabalho, o SNP CAPN316
no foi identificado a partir do sequenciamento dos 14 animais extremos para
maciez. O alelo G, relatado como sendo desfavorvel maciez, foi associado com
altas DEPs para caractersticas de crescimento em outros trabalhos (PINTOS e
CORVAS, 2011), ento a forte nfase da seleo em caractersticas de crescimento
poderia explicar em parte as altas frequncias allicas do SNP CAPN316
65
desfavorvel para maciez. Essa associao do sistema calpana-calpastatina com

caractersticas de crescimento explicada pelo seu papel na migrao de clulas
musculares e diferenciao nos estgios iniciais do desenvolvimento (BARNOY et
al., 2005).
O SNP 4751 tambm apresentou seu alelo desfavorvel associado
com altas DEPs de crescimento (PINTOS e CORVAS, 2011), o que explica a alta
frequncia desse alelo (76,5%) em Angus argentino (PINTOS e CORVAS, 2011) e
em cruzados Nelore (89,5%, CURI et al., 2009) mas, nos animais Nelore extremos
para maciez desse estudo, esse SNP no foi identificado, portanto est fixado.
Diante desses resultados, o polimorfismo escolhido foi o SNP6, cuja
posio no xon 5 era apropriada ao desenho das sondas e primers, alm dos alelos
estarem bem distribudos na populao (MAF 32,10%) e terem sido encontrados os
trs gentipos possveis nos 14 animais sequenciados.
Esse
SNP
foi
nomeado
nesse
experimento
como
3379G>A,
caracterizando a troca de uma guanina por uma adenina na posio 3379 pb do

gene, sem troca de aminocido.

Na prognie e nos touros, as frequncias dos alelos do SNP foram
bastante equilibradas, como descrito na Tabela 7, mas as frequncias genotpicas
mostraram muitos animais homozigotos AA, e o gentipo GG com 4,2% e 0%,
respectivamente. Foram utilizados 476 animais para genotipagem na prognie e 29
touros.
Tabela 7: Frequncias allicas e genotpicas encontradas para o SNP 3379G>A do gene
CAPN1 nos touros e prognie de animais da raa Nelore.
Populao
Frequncias (%)
Nmero
animais
AA
Genotpica
GA
Allica
GG
Touros
29
58,62
41,37
79,31
20,68
Prognie
476
64,29
31,51
4,20
80,04
19,96
66

A anlise da expresso allica especfica do gene CAPN1 foi realizada
de acordo com o protocolo adotado para o CAST, iniciando com a construo da
curva padro (Figura 6) para normalizar as sondas, seguido da expresso allica
dos 12 animais heterozigotos, filhos de pais homozigotos, e a interpolao dos
resultados na curva padro por meio da equao Y = a + bX, na qual a foi 0,9927 e b
foi -0,6573. Ento, o valor de X foi obtido o que possibilitou verificar a razo de
Log2
(intensidadeFAM/intensidadeVIC)
expresso entre os alelos.
Log2 da proporo do alelo FAM pelo VIC

propores dos produtos de cada alelo. Log2 da intensidadeFAM/intensidadeVIC foi plotado
contra o log2 de aleloFAM/aleloVIC das diluies dos DNAs de indivduos homozigotos em 7
propores (8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 - aleloVIC:aleloFAM), para o SNP do gene
CAPN1.
Como mostra a Figura 7, a maioria dos animais apresentaram excesso

do alelo G e apenas 3 mostraram o inverso. Aparentemente houve um desvio da
razo 1:1 (mdia e erro padro 0,970,05), mas aplicando as anlises estatsticas
verificou-se que 0,9716 estatisticamente igual a 1, concluindo que no h EAD
67
para o gene CAPN1 em tecido muscular adulto, pois o nmero 1 estava contido
dentro do IC (0,8534 a1,0898).
Log2 razo
(intensidadeFAM/intensidadeVIC)
Expresso allica CAPN1 3379G>A
Razo FAM/VIC (A/G)
Figura 7: Razo allica C/T em amostras de msculos, SNP 3379G>A, do gene CAPN1.
7.3. Gene KCNJ11

O KCNJ11 at o presente momento foi pouco estudado em bovinos
(BERNARD et al., 2009), por isso h a necessidade de pesquisas visando sua
aplicao no melhoramento animal, mas principalmente pesquisas fundamentais que
desvendem sua estrutura e biologia. Sendo assim, ele foi selecionado para integrar
o conjunto de genes estudados neste trabalho, tanto no estudo de estrutura e
biologia quanto na sua aplicao no melhoramento animal, visto que ele foi
relacionado deposio de glicognio pelo msculo em camundongos (ALEKSEEV
et al., 2010) e, em bovinos, explicou parte da variabilidade na massa muscular e
contedo de lipdeos (BERNARD et al., 2009).
68
7.3.1. Escolha do SNP, Estudo de TagSNP e Haploview

As regies 5UTR e 3UTR, e o nico xon que compe o gene foram
sequenciados em 14 novilhos com fentipos extremos para maciez (como parte do
projeto de doutorado de Polyana C. Tizioto; dados no publicados). Entre os 22
SNPs detectados, pretendia-se escolher para o presente trabalho um TagSNP que
apresentasse boa distribuio dos dois alelos na populao e que carregasse
informaes do maior nmero de SNPs possvel.
Para encontrar o TagSNP, foi utilizado o programa Haploview
(BARRETT et al., 2005) que possibilitou ver o padro de desequilbrio de ligao
entre os SNPs. O SNP que carrega informaes de um maior nmero de SNPs foi o
T>C, localizado na regio codificadora, posio 2126 pb, que contm informaes
de outros 5 SNPs distribudos ao longo do gene, sendo um deles na regio 5UTR,
um na regio codificadora e trs na regio 3UTR.

As frequncias allicas e genotpicas encontradas nos touros e na
prognie foram semelhantes, e esto dispostas na Tabela 8.
Tabela 8. Frequncias allicas e genotpicas encontradas para o SNP 2126T>C do gene
KCNJ11 nos touros e prognie de animais da raa Nelore.
Populao
Frequncias (%)
Nmero
animais
TT
Genotpica
TC
Allica
CC
Touros
28
32,14
67.86
16,07
83,93
Prognie
614
2,45
26,38
71,17
15,64
84,36
Na prognie, os trs gentipos possveis para o SNP 2126T>C foram

encontrados, mas o TT representou apenas 2,44% da populao cujo tamanho era
614 animais, produzidos nas duas estaes de monta. A MAF foi 15,75% para o
alelo T.
Em bovinos, Bernard et al., (2009) encontraram que o perfil de
expresso desse gene, junto com outros 8, explicaram parte da variabilidade na
massa muscular e do contedo de lipdeos intramuscular (60% e 52%,
69
respectivamente), entretanto, no existem relatos de associao desse gene com

maciez da carne.
A possvel associao do gene KCNJ11 com maciez explicada em
parte pelas vias metablicas nas quais ele est envolvido. Alekseev et al. (2010)
demonstraram que a inativao do gene em ratos ocasionou em fentipo magro
mesmo quando os animais foram submetidos dieta rica em gordura. Atribuiu-se
esse fato perda de funo do canal de KATP, fazendo com que reduzisse o
depsito de glicognio pelo msculo. Portanto, os canais sarcolemais KATP
governam economia de energia muscular, e sua baixa regulao em um tecido
especfico pode apresentar uma antiobesidade estratgica, ao tornar o msculo
cada vez mais termognico no repouso e diminuindo a eficincia de combustvel
durante o exerccio. Alm disso, conhecido que o teor de gordura do msculo pode
estar intimamente relacionado com maciez, j que muitos autores associaram
gordura intramuscular com maciez (SEIDEMAN et al., 1987; SMITH et al., 2001).

No h relatos na literatura de estudos de expresso allica com ou
sem efeito de origem parental para o gene KCNJ11 em bovinos, ento os dados
obtidos nesse trabalho so inditos para a raa.
Para verificar se o gene KCNJ11 apresenta diferena de expresso
entre alelos resultante ou no de efeito de origem parental, foi utilizado o mesmo
SNP da genotipagem, alm de um adicional, localizado na posio 2942 pb na
regio 3UTR, resultante de uma troca de citosina por timina (C>T). Uma anlise
prvia de teste de Fisher utilizando as frequncias encontradas nos 14 extremos
para maciez, sugeriu associao entre esse segundo SNP (2942C>T) e maciez da
carne (P<0,05). Ento ele foi genotipado na populao (parte do projeto de
doutorado da aluna Polyana C. Tizioto) e sua expresso allica foi avaliada junto
com o SNP 2126T>C.
Para normalizar as sondas de cada ensaio TaqMan foi construda a
curva padro separadamente para cada SNP (Figura 8). Para ambas realizaram-se
as diluies com animais CC e TT. Na curva padro do SNP 2126T>C, a sonda FAM
equivalia ao alelo C e a sonda VIC ao alelo T, e o inverso para o SNP 2942C>T.
70
Curva Padro KCNJ11 SNP 2126T>C 2126T>C
Log2 (intensidade
FAM/ intensidadeVIC)
Curva Padro KCNJ11 SNP 2942C>T
Log2 (intensidade
FAM/ intensidadeVIC)

Figura 8: Curva padro da intensidade de fluorescncia produzida por diferentes propores
dos produtos de cada alelo do gene KCNJ11. Log2 da intensidadeFAM/intensidadeVIC foi
homozigotos em 7 propores (8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 - alelo VIC:aleloFAM). A)
Curva padro SNP 2126T>C. B) Curva padro SNP 2942C>T.
71
Na anlise da expresso do RNA extrado de tecido muscular e tecido

adiposo verificou-se que no houve expresso do gene no tecido adiposo, portanto
foi utilizado apenas o tecido muscular para anlise da expresso allica.
Os valores das fluorescncias das sondas coletadas no ciclo 40 foram
interpolados na curva atravs da equao Y = a + bX. Os valores de a e b esto
descritos na Tabela 9. Assim o valor de X foi obtido, para cada valor de Y
(fluorescncia no ciclo 40) o que possibilitou verificar a razo de expresso entre os
alelos. Ao todo, foram analisados 17 animais para o SNP 2126T>C e 18 animais
para o 2942C>T.
Tabela 9: Valores de a e b na equao obtida para a curva padro Y = a + Bx para os dois

SNPs do gene KCNJ11.
SNP
a (intercepto)
b (coef. de
regresso)
2126T>C
-0,9315
0,6537
2942C>T
-0,032
0,622
Quatro animais apresentaram excesso do alelo C para o SNP

2126T>C, com a menor razo sendo 0,801. As razes dos demais animais variaram
entre 1,01 e 1,55, demonstrando excesso do alelo T (Figura 12). No teste-t de
Student, a mdia e erro padro foram 1,200,04, com limite inferior 1,04 e superior
1,35 compondo o IC (95%). Como o nmero 1 no est contido no IC, a hiptese
nula foi rejeitada e conclui-se que a mdia 1,2 estatisticamente diferente de 1,
ento h diferena de expresso para esse SNP.
72
RazoallicaC/TSNP2126T>C
Expresso allica SNP 2126T>C gene KCNJ11
Figura 9: Razo da expresso allica C/T em amostras de msculos, SNP 2126T>C, gene
KCNJ11.
Foi verificado tambm se a EAD do SNP 2126T>C era influenciada

pela origem parental do alelo (Figura 13). Para isso os 17 animais foram divididos
em dois grupos considerando a origem parental do alelo C e ento realizou-se a
anlise de varincia (ANOVA) e o resultado no foi significativo (P>0,05), sugerindo
portanto, que a EAD no SNP 2126T>C no sofre efeito da origem parental do alelo.
Entretanto, a amostra de 17 animais possua um maior nmero de indivduos nos
quais o alelo C tinha origem paterna (10), observando-se na Figura 11 uma
tendncia de comportamento semelhante nas amostras em que o alelo C foi
herdado da me.
73
Razo allica C/T
Efeito origem parental KCNJ11 2126T>C
0
alelo C herdado do pai
alelo C herdado da me
Figura 10: Razo da expresso allica C/T do SNP 2126T>C do gene KCNJ11 em amostras
de msculos de novilhos da raa Nelore, de acordo com a origem parental do alelo C.
Para o 2942C>T, tambm foi encontrada EAD. Todos os animais

apresentaram razo maior que 1, o que significa que o alelo C foi expresso em maior
quantidade se comparado ao T (Figura 11). A razo mnima foi 1,03 e a mxima
1,73, resultando em uma mdia e erro padro de 1,460,04. O IC 95% (limite inferior
= 1,37; superior 1,56) passou longe de englobar o nmero 1, por isso a hiptese nula
(a qual diz que a razo 1,46 igual a 1) foi refutada.
2
RazoallicaC/T
Expresso allica 2942C>T do KCNJ11
Figura 11: Razo da expresso allica C/T do SNP 2942C>T do gene KCNJ11 em amostras
de msculos de animais da raa Nelore.
74
Para testar se a EAD do SNP 2942C>T era influenciada pela origem

parental do alelo, realizou-se anlise de varincia (ANOVA) com os animais e foi
encontrado efeito significativo (P<0,05). Portanto o SNP 2942C>T apresenta
expresso allica diferencial e essa variao entre os alelos influenciada pela
origem parental do alelo (Figura 12).
Razo allica C/T
Efeito de origem parental KCNJ11 2942C>T
alelo C herdado do pai
alelo C herdado da me
Figura 12: Razo allica C/T em amostras de msculos, SNP 2942C>T do gene KCNJ11 de
acordo com a origem parental do alelo C.
A anlise dos dois SNPs do gene KCNJ11 revelou a existncia de

diferena de expresso entre os dois alelos de ambos os SNPs. O SNP 2126T>C
apresentou EAD mais fraca se comparado ao SNP 2942C>T, isso porque os limites
do primeiro (1,37 a 1,56) distanciam-se mais de 1 do que os do SNP 2942C>T (1,04
a 1,35).
A EAD encontrada para esse gene pode ser resultante de diversos
fatores genticos. Estudos com indivduos no relacionados, irmos e gmeos
monozigticos sugeriram que essa variabilidade dos nveis de expresso
determinado geneticamente (CHEUNG et al., 2003). Dentre esses fatores esto a
influencia da origem parental (KHATIB 2005), elementos reguladores CIS (BRAY et
al., 2003; CHEUNG et al., 2010) ou miRNA (SUN et al., 2011).
Apenas o SNP 2942C>T apresentou efeito significativo de origem
75
parental sobre a EAD, caracterizando assim expresso allica preferencial (EAP).

Em virtude do desbalano no nmero de indivduos que apresentam alelo C de
origem materna e paterna, a ausncia de efeito de origem parental para o SNP
2126T>C deve ser melhor investigada. Estudos indicam que a variao na
expresso allica pode ser herdada de maneira Mendeliana tambm (PASTINEN;
HUDSON, 2004; YAN et al., 2002), o que provavelmente o caso da EAD do SNP
2126T>C.
Parker-Katiraee et al. (2008) encontraram EAD analisando clulas
embrionrias murinas e perceberam que essa variao na expresso pode mudar de
forma dinmica ao longo do desenvolvimento. Assim fica evidente a necessidade de
estudar o gene KCNJ11 em diversas fases de desenvolvimento.
O efeito de origem parental precisa ser estudado por interferir nos
valores genticos de fmeas e machos nas anlises quantitativas do melhoramento
animal (MAGEE et al., 2010). No caso do SNP 2942C>T, foi descrito que a diferena
de expresso allica diminui quando o alelo C herdado da me e o alelo T herdado
do pai. Portanto em populaes que esse SNP esteja associado com caractersticas
de interesse, importante considerar esse efeito de origem parental nas anlises
quantitativas.
Considerando que ambos os alelos afetaram a expresso do gene, foi
feita uma anlise para verificar se o SNP 2942C>T estava influenciando a EAD no
SNP 2126T>C, e vice versa, como sugerido por Sun et al. (2011). Em seu trabalho,
eles encontraram razo mdia de 0,75 para um SNP no gene UTG2B15,
caracterizando EAD, e em estudos recentes eles haviam encontrado outro SNP,
situado no promotor que tambm afetava a expresso do gene. Em uma anlise de
teste-t independente eles verificaram se o SNP no promotor poderia influenciar a
expresso do outro. Para isso classificaram os indivduos em homozigotos e
heterozigotos para ambos os alelos, e compararam as mdias dos dois alelos do
primeiro SNP, mas no encontraram diferena significativa entre esses dois grupos,
portanto o SNP do promotor no afetava o SNP alvo do estudo. No presente estudo,
essa metodologia foi adotada para o gene KCNJ11. Para isso os animais foram
classificados como homozigotos (CC e TT) em um grupo e heterozigotos (TC) em
outro grupo, separadamente para cada SNP.
Primeiro foi analisado se o SNP 2942C>T influenciava a EAD
apresentada pelo SNP 2126T>C. Com os animais heterozigotos para o 2126T>C
76
formou-se dois grupos de acordo com o gentipo no SNP 2942C>T, os heterozigotos

(CT, n=11 com mdia 1,18) e homozigotos (CC, n=10 com mdia 1,26). Ento o
teste-t independente foi aplicado a esses dois grupos, considerando as seguintes
hipteses:
H0= no h diferena entre as mdias de EAD no SNP 2126T>C dos
animais com gentipo CC ou CT no SNP 2942C>T.
H1= h diferena entre as mdias de EAD no SNP 2126T>C dos
animais com gentipo CC ou CT no SNP 2942C>T.
Foi obtido o valor de t sendo -0,1144 e o IC (95%) compreendendo 0,2104 a 0,1886. Como o t est contido no IC, a H0 aceita, portanto no h
influncia do SNP2942C>T sobre a EAD do SNP2126T>C (Figura 13).
CT
Razo allica
SNP 2126T>C
CC
Gentipo SNP 2942C>T

Figura 13: Efeito do gentipo do SNP 2942C>T sobre EAD do SNP 2126T>C do gene
KCNJ11.
Tambm foi analisado se o SNP 2126T>C influe5555555nciava a EAD

apresentada pelo SNP 2942C>T. A mesma metodologia foi utilizada, separando os
animais heterozigotos para o 2942C>T em dois grupos de acordo com o gentipo no
SNP 2126T>C, os heterozigotos (TC, n=4 com mdia 1,14) e homozigotos (CC,
n=14 com mdia 1,56).
Foi encontrado que o SNP2126T>C influencia a EAD do SNP2942C>T.
O valor de t (8,3) no est contido no IC (95%, 0,3067 a 0,5169), portanto a H0
77
rejeitada (Figura 14). Quando o gentipo no SNP 2126T>C CC ento a diferena

de expresso entre os alelos do SNP2942C>T maior do que quando o gentipo
CT (1,56 e 1,14, respectivamente). No foram encontrados animais heterozigotos
para o SNP2942C>T cujo gentipo no SNP 2126T>C foi TT.
Razo allica
SNP 2942 C>T
CC
CT
Gentipo SNP 2126T>C

Figura 14: Efeito do gentipo do SNP 2126T>C sobre a EAD do SNP 2942C>T do gene
KCNJ11.
Em ovinos Texel, uma mutao na regio 3UTR no gene da miostatina

criou um stio alvo para os miRNAs mir1 e mir206, que so altamente expressos no
msculo, inibindo translacionalmente o gene miostatina o que contribui pra
hipertrofia muscular (CLOP et al., 2006).
Como o SNP 2942C>T est contido na regio 3UTR, assim como 3
dos SNPs cujas informaes so carregadas pelo TagSNP 2126T>C, e estes podem
ser alvos de miRNA, foi realizada busca por stios-alvo de miRNA na regio dos
SNPs semelhante aquela com o gene CAST.
Diferentemente, no presente trabalho nenhum stio alvo de miRNA
envolveu os dois SNPs estudados, nem os SNPs cujas informaes so reveladas
pelo TagSNP2126T>C. Assim no foi possvel relacionar variaes da expresso
efeitos de miRNAs.
78
7.4. Genes da leptina, DGAT1 e IGFBP3

Na anlise das frequncias dos genes DGAT1 nos touros (genotipado
pela Dra. Fabiane Siqueira), nenhum animal apresentou polimorfismo e o gene
IGFBP3 (Dra. Gisele Veneroni) apresentou baixa frequncia do polimorfismo
proposto. Considerando que a frequncia allica e genotpica nesses uma
estimativa para as principais linhagens da raa Nelore que, portanto, representa uma
estimativa da distribuio allica na raa, optou-se por no realizar a genotipagem
destes polimorfismos em toda a populao.
Nos touros, a leptina (Dra. Fabiane Siqueira) mostrou baixo
polimorfismo para o SNP proposto com 92,6% de CC, 7,4% de CT e nenhum animal
TT. Apesar da baixa distribuio, uma pequena amostra da prognie foi genotipada
para anlise da distribuio desse polimorfismo pelo interesse de se estudar esse
gene, principalmente o padro de expresso, porque, alm de se tratar de um gene
associado deposio de gordura (KONONOFF et al., 2005; NKRUMAH et al.,
2005; SCHENKEL et al., 2005; WU et al., 2005; FORTES et al., 2009), existem
relatos que ele apresenta controle da expresso tecido especfica por possuir um
stio de metilao do DNA (KREMENSKOY et al., 2006). Assim 30 novilhos foram
genotipado por sonda TaqMan sendo todos homozigotos CC, portanto o gene foi
descartado para estudo de expresso.
79
7. CONCLUSO
A partir da anlise de distribuio das frequncias allicas dos SNPs

contidos nos genes CAPN1, DGAT1 e gene da leptina, na populao de touros
representativa da raa Nelore no pas, concluiu-se que preciso investigar
polimorfismos especficos de Bos indicus nesses genes, pois os descritos em Bos
taurus, estavam praticamente fixados na amostra. A variabilidade dos SNPs contidos
no gene CAST, descritos em Bos taurus, e dos genes CAPN1 e KCNJ11,
encontrados a partir de sequenciamento de animais Bos indicus, indicaram a
viabilidade de estudos de associao entre esses marcadores e caractersticas de
maciez da carne, para posterior utilizao como ferramentas de auxlio aos
programas de melhoramento animal.
A anlise da expresso allica no presente trabalho permitiu
demonstrar a existncia de variaes do modelo mendeliano clssico. A expresso
allica diferencial encontrada nos genes CAST e KCNJ11 pode resultar de diversos
eventos tanto genticos quanto epigenticos, cujo entendimento pode auxiliar nos
modelos estatsticos de programas de melhoramento animal, elucidando rudos nas
equaes de decomposio fenotpica, adicionando preciso na estimativa do mrito
gentico. O gene CAPN1 no apresentou diferena de expresso entre seus alelos,
no entanto esse padro de expresso, assim como dos demais genes estudados no
presente trabalho, precisa ser confirmado em diferentes populaes, tecidos e
estgios de desenvolvimento para que ento tais efeitos sejam includos nos
modelos estatsticos.
80
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE

Marcela Maria de Souza

Avaliao dos efeitos de polimorfismos e da origem parental do

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

Marcela Maria de Souza

Avaliao dos efeitos de polimorfismos e da origem parental do

Dissertao apresentada ao Programa de

Orientao: Dra. Luciana Correia de Almeida Regitano

Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

Souza, Marcela Maria de.

Dedico este trabalho minha av Maria

A maciez o principal atributo apreciado pelos consumidores da carne bovina, no

Tenderness is the main trait appreciated by consumers of bovine meat,

Keywords: imprint; molecular marker; Nellore; Bovine; allelic expression;

5.7. Avaliao da expresso gnica alelo especfica ................................................. 52

Diversos genes j foram associados com maciez, como por exemplo, o

com finalidade de incorporao na MAS quanto para caracterizao dos genes.

3.1. Objetivos gerais

3.2. Objetivos especficos

Prospectar SNPs informativos contidos no gene CAPN1;

Analisar a frequncia de SNPs contidos nos genes CAPN1, CAST,

Avaliar a existncia de expresso alelo especfica e efeito de origem

4.1. Bovinocultura de corte no Brasil

4.2. A raa Nelore no Brasil

duas subespcies. Restle et al. (2000) observaram acentuada queda no ganho de

4.3. Melhoramento gentico de bovinos

com o melhoramento animal.

caractersticas sero utilizadas como critrios de seleo. Com base em

caractersticas de interesse e, com a utilizao da anlise direta do gentipo,

4.4. Uso de marcadores moleculares no Melhoramento Animal

4.4.1. Marcadores moleculares

coordenao da estrutura e funo de cada clula. Ao comparar o material gentico

polymorphism (RFLP) foi o primeiro descrito, em 1971, por Danna e Nathans

maior densidade e muitas vezes so a nica opo de marcadores muito prximos

4.4.2. Prospeco de polimorfismos no genoma

sequenciamento de uma nica molcula de DNA sem a necessidade de pausa entre

4.4.3. Genotipagem de polimorfismos

4.4.4. Seleo assistida por marcadores (SAM)

marcadores podem ser utilizados para confirmar parentesco entre os animais

4.5. Caractersticas de qualidade da carne

A gordura subcutnea presente na carcaa tambm influencia a maciez

herdabilidade para FC em Bos indicus superior de B. taurus (0,3 e 0,09,

4.6. Genes candidatos para caractersticas de qualidade da carne

CAPN1 Calcium-activated neutral protease 1

proteoltica dependente de clcio (Ca2+) em pH neutro. Essa atividade dependente

no foram encontrados animais com o gentipo favorvel e, para o CAPN530,

4.6.2. CAST Gene codificador da calpastatina

(5,11,6%), quando comparado com AG (8,62,0%) apresentaram reduo na fora

4.6.3. KCNJ11 Potassium inwardly-rectifying channel subfamily J, membro 11

Em estudos no laboratrio de Biotecnologia Animal na Embrapa

4.6.4. Obese Gene codificador da leptina

Pelo exposto, importante compreender completamente as atividades

4.6.5. DGAT1- Diacilglicerol O-aciltransferase

4.6.6. IGFBP3 - Insulin-like growth factor binding protein 3

formas conhecidas e proteases que podem alterar a afinidade de IGF IGFBPs

4.7. Expresso gnica

condensada de tal forma a impedir o acesso do complexo da RNA polimerase II (LI

expresso dos genes. Portanto, as modificaes nas histonas podem interferir em

4.7.2. Expresso allica especfica

proporcionalmente distribuda no genoma humano (LO et al., 2003; CHEUNG et al.,

4.7.2.1. Imprinting genmico

importante no crescimento e desenvolvimento (VAN LAERE et al., 2003; CHENG et

LAERE et al., 2003) e rea de olho de lombo em bovinos (GOODALL; SCHMUTZ,