DOSSIER BIOPHOTONIQUE

TECHNIQUE INSTRUMENTALE
Olivier Haeberl, Bruno Colicchio*

Techniques damlioration de
la rsolution en microscopie de
uorescence : de la production des
photons au traitement des images
RSUM

Fluorescence

Le microscope de uorescence est devenu un instrument de rfrence pour la biologie. Ses

capacits dimagerie en trois dimensions sur des spcimens vivants sont en eet uniques.
Cependant, compare dautres techniques, la rsolution des microscopes confocaux est
encore limite : de lordre de 150 nm latralement, mais surtout pas mieux quenviron 350 nm
longitudinalement. Ceci limite grandement ltude des structures nes intracellulaires. Nous
prsentons certaines techniques pour amliorer la rsolution en microscopie optique en champ
lointain.

MOTS CLS

Microscopie de uorescence confocale 3D, Rsolution

Techniques to improve the resolution in uorescence microscopy : from

photon production to image processing
SUMMARY

The uorescence microscope is the instrument of choice for biology, because of its unique possibilities of acquiring
data in 3-D within a living specimen. However, compared to other techniques, its resolution is still limited to about
150 nm laterally, and no better than about 350 nm longitudinally. This limits the study of small intracellulat
stuctures. We present some techniques to improve the resolution in far eld uorescence microscopy.

KEYWORDS

3-D confocal uorescence microscopy, Resolution

I - Introduction :
Lacquisition dune image multidimensionnelle en
microscopie optique requiert la matrise de nombreuses techniques, photonique (lasers), optique
(microscope), lectronique (dtection) et informatique (traitement des donnes). Une approche systme permet cependant didentier trois
tapes (gure 1). On peut en eet sparer dans la
chane dacquisition dune image, tout dabord les

phnomnes physiques de production du signal

lumineux, le systme de mesure et les post-traitements numriques permettant de reconstruire les
images.

II - Processus dmission photonique

La matrise du processus dmission photonique
consiste essayer de provoquer lmission du

*Groupe LabEl - Laboratoire MIPS - Universit de Haute-Alsace IUT Mulhouse - 61 rue A. Camus - F-68093 Mulhouse Cedex
Tl : 03 89 33 76 60 - Fax : 03 89 33 76 05 E-Mail : olivier.haeberle@uha.fr

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SPECTRA ANALYSE n 244 Mai - Juin 2005

Technique Instrumentale

Techniques damlioration de la rsolution en microscopie de uorescence :

de la production des photons au traitement des images

signal de uorescence de manire contrle dans

une zone la plus petite possible. On montre en effet que dans un microscope balayage, la limite
de rsolution est impose par le plus petit volume
dans lequel on cre le signal et non par le systme
de dtection.
La premire amlioration de la rsolution par cette
approche a donn naissance au microscope confocal, qui consiste utiliser le mme objectif pour
la fois exciter et observer le spcimen (1). La gure 2 dcrit le principe des microscopes classique et
confocal. Lutilisation dun laser permet de nexciter
le spcimen que dans un petit volume autour du
point focal, contrairement un microscope classique, o le spcimen est clair uniformment. Les
phnomnes dexcitation non-linaire permettent
un rsultat similaire (2,3). Un pinhole devant
le dtecteur permet de rejeter la lumire venant
dautres points que le point focal. On peut aussi
mettre prot le phnomne dinterfrence pour
rduire la zone dobservation eective. Dans cette
technique, appele microscopie 4Pi (4), lchantillon est illumin de manire cohrente travers 2
objectifs et le signal de uorescence est dtect par
un systme confocal (Microscopie 4Pi de type A).
Le signal de uorescence peut aussi tre dtect
par ces deux objectifs et recombin (Microscopie
4Pi de type B). Lorsque excitation et dtection
sont eectues de manire cohrente, on obtient
un microscope 4Pi de type C (gure 3).
Pour un objectif douverture numrique 1.4 et
une longueur donde de dtection de 450 nm, on
obtient en thorie une rsolution latrale de 200
nm et longitudinale de 450 nm pour un microscope
classique. Pour un microscope confocal, en considrant une excitation 400 nm, on obtient une rsolution latrale de 130 nm et longitudinale de 320
nm. Avec les mmes paramtres et pour un microscope 4Pi type C, la rsolution longitudinale est 70
nm, la rsolution latrale restant celle dun confocal
(gure 4, page suivante). La rme Leica propose
maintenant un tel microscope (5).
Une autre approche possible utilise les proprits
des uorophores. Lorsquun colorant est excit, la
transition de uorescence peut avoir lieu spontanment si on laisse la molcule relaxer librement,
ou tre induite par mission stimule laide dun
rayonnement externe (gure 5, page suivante). En
microscopie STED (Stimulated Emission Depletion) (6), on utilise cet eet pour dpeupler le niveau excit, qui ne peut alors plus contribuer au
rayonnement de uorescence spontane.

Figure 1
A)

Dcomposition en
blocs du processus
damlioration des
images en microscopie
optique.

B)

Figure 2

Principes du microscope classique

4A) et du microscope confocal (en
piuorescence) 4B).
Figure 3

Principe de la microscopie de uorescence 4Pi de type C.

SPECTRA ANALYSE n 244 Mai - Juin 2005

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TECHNIQUE INSTRUMENTALE

Figure 4

Rponse impulsionnelle optique dun microscope de uorescence 4Pi de type C pour un objectif
douverture numrique 1,4.
Figure 6

Rponses impulsionelles optiques entrant en uvre dans un microscope

confocal STED. (a) : excitation, (b) : uorescence normale, (c) : faisceau
STED, (d) : PSF nale.

Figure 5

Diagramme de Jablonsky et principe du microscope STED.

NOTE
Ce travail a
t ralis en
concertation avec
le programme
Interreg III aid par
la Communaut
Europenne et
la rgion Alsace,
Programme
Rhin Suprieur
Centre Sud,
Rhnaphotonics.

24

On excite donc dabord une petite zone, laide

dun faisceau focalis (gure 6a). Dans un microscope confocal classique, cette zone excite donne
naissance un signal de uorescence spontane,
dont la forme est trs similaire au spot dexcitation
(gure 6b). Dans un microscope STED, le spot
dexcitation est suivi trs rapidement par un spot
STED (gure 6c), qui provoque le phnomne de
uorescence induite sur les bords du spot dexcitation. Il faut donc mettre en forme laide dun
montage optique le faisceau STED de telle manire
quil prsente laspect dune sphre creuse . La
uorescence spontane ne peut alors tre mise
que de la partie centrale du spot dexcitation, qui a
t excite, mais non dpeuple. Il en rsulte donc
une rponse impulsionelle optique nale bien plus
petite (gure 6d).
Une rsolution de 100 nm en trois dimensions sur
des cellules vivantes a t atteinte (7). Lobservation
de molcules uniques xes sur substrat avec une
rsolution infrieure 30 nm a aussi t possible
(8, 9). En principe, la rsolution de cet instrument
nest limite que par le rapport signal sur bruit obtenu, la rsistance des molcules lexcitation et
la dsexcitation STED, et la stabilit des tats mo-

SPECTRA ANALYSE n 244 Mai - Juin 2005

lculaires impliqus (10).

Pour linstant, cette technique requiert cependant
une instrumentation picoseconde et femtoseconde
dlicate et chre. Les uorophores adapts cette
microscopie ne sont pas nombreux. Des rsultats
prometteurs ont nanmoins dj t obtenus en
immunouorescence (11), et lingnierie des molcules uorescentes devrait permettre la cration
de uorophores spciquement adapts cette
nouvelle technique (12).

III - Modlisation du microscope

Les modles de formation dimage permettent de
comprendre comment le microscope dforme le
signal mis par le spcimen. Nous avons dvelopp une modlisation rigoureuse des microscopes
de uorescence (13-16).
En rgle gnrale, les expressions donnant les
rponses impulsionelles optiques (RIO) en illumination et en dtection ne sont pas identiques.
Lutilisation des expressions rigoureuses en dtection est indispensable si lon dsire tudier
les phnomnes de polarisation en fluorescence
ou si une grande diffrence existe entre les diffrents indices de rfraction, par exemple en
cristallographie (14,16). On peut cependant dire
que pour les applications biologiques, les RIO
dexcitation et de dtection sont trs proches, ce
qui justifie lapproximation classique consistant
dire que la RIO du microscope confocal est
obtenue en levant au carr celle du microscope
classique
Nos modles permettent de calculer les RIO utilises pour la dconvolution des donnes (voir
IV-Dconvolution), mais aussi de vrier les
conditions dutilisation du microscope, un point

Technique Instrumentale

Techniques damlioration de la rsolution en microscopie de uorescence :

de la production des photons au traitement des images
important pour prciser les protocoles dacquisition (17) et sappliquent aussi aux nouvelles congurations optiques comme le microscope 4Pi
ou le microscope STED. En eet, ces instruments
ncessitent une parfaite superposition de deux
faisceaux dexcitation (microscope 4Pi) ou dun
faisceau dexcitation et dun faisceau dmission
stimule (microscope STED). De ce fait, ils sont
trs sensibles aux aberrations induites par les diffrents milieux traverss.

IV - Dconvolution
Lorsque le meilleur de linstrument a t obtenu,
on peut encore amliorer les donnes obtenues par
des techniques de dconvolution, utilises pour simultanment amliorer la rsolution des images,
et les dbruiter. Les mesures quantitatives sont
alors de bien meilleure qualit. Un problme des

Figure 7

Modle de formation dimage Monte-Carlo.

Figure 8

algorithmes de dconvolution courants est quils

supposent la RIO invariante dans limage. Cette
hypothse est en ralit souvent prise en dfaut.
Nous avons donc dvelopp une mthode de dconvolution Monte-Carlo, permettant de tenir
compte de cette non-invariance spatiale de la RIO
(18). Cette mthode vise reproduire de manire
numrique le processus de formation des images,
point par point dans le volume de donnes. A chaque point de lobjet est ainsi associ une RIO dans
limage nale (gure 7).
En dconvolution Monte-Carlo, on considre
lobjet comme un ensemble de point, et limage
comme un ensemble de RIO. On essaye alors de
reconstruire une image ressemblant le plus possible limage enregistre. Ce faisant, on reconstruit
simultanment lobjet donnant naissance cette
image. Contrairement aux algorithmes classiques,
il est alors possible dutiliser non pas une RIO,
mais une famille de RIO, lalgorithme slectionnant automatiquement celle qui est adapte la
rgion du spcimen considr.
La gure 8 montre les rsultats obtenus en simulation pour une pile de billes de 0,5 m de diamtre
(microscope confocal, NA=1.4). La gure 8a prsente lobjet de dpart. La gure 8b montre limage
simule, tenant compte dune variation spatiale
de la RIO avec la profondeur. La bille du fond est
plus oue que la bille du haut, cause de laberration sphrique induite par la dirence dindices

de rfraction entre le milieu dimmersion (huile)

et le spcimen (eau). La gure 8c montre le rsultat incorrect dune dconvolution classique laide
de lalgorithme Maximum A Posteriori. La gure
8d montre le rsultat dune dconvolution MonteCarlo tenant compte de la variation de la RIO avec
la profondeur. Les intensits et les formes sont
maintenant correctement restaures.
On pourrait aussi tenir compte de variations induites par le spcimen lui-mme (19). Les modles
de calcul de RIO actuels supposent que le spcimen est homogne. Lextension de ces modles
des spcimens htrognes est en cours (20). Une
cartographie des indices dans le spcimen (21)
permettra alors une correction numrique des
donnes.

Dconvolution tenant
compte de la variation
spatiale de la RIO. (a) :
objet original, (b) :
convolution variant
avec la profondeur,
(c) : dconvolution
classique, et (d) :
dconvolution MonteCarlo.

V - Conclusion
Ltude des spcimens biologiques en microscopie
optique ncessite de nouveaux dveloppements
visant amliorer encore la rsolution.
Trois axes sont activement explors. La matrise
des phnomnes dmission photonique par ingnierie de la Rponse Impulsionnelle Optique
permet de rduire le volume dmission, et donc
daffiner les plus petits dtails dtectables. La
comprhension des mcanismes de formation
des images, en particulier dans les spcimens h-

SPECTRA ANALYSE n 244 Mai - Juin 2005

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trognes doit permettre de maintenir la qualit
des donnes acquises, par des solutions matrielles (optique adaptative) ou numriques (restauration des images). Enfin, lorsque le meilleur
de linstrument a t obtenu, on peut encore
amliorer la rsolution par dconvolution des

donnes laide de la RIO de linstrument, qui

peut tre mesure ou calcule. La combinaison
de ces diverses approches permet denvisager
avec ralisme le dveloppement de techniques
de nanoscopie en champ lointain, avec une rsolution finale de quelques dizaines de nm en

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