Mtodos de Caracterizacin de Biomateriales

Gustavo A. Abraham y Teresita R. Cuadrado

Instituto de Investigaciones en Ciencia y Tecnologa de Materiales (INTEMA) (UNMdPCONICET), J. B. Justo 4302, B7608FDQ Mar del Plata, Argentina.
Resumen
Las propiedades en masa y superficie de los biomateriales utilizados en la fabricacin de
las partes constitutivas de un dispositivo biomdico, implante o sistema de diagnstico definen la
biocompatibilidad de los mismos, el comportamiento biomecnico y las prestaciones deseadas a
corto y largo plazo. Los fenmenos de interaccin que se desencadenan en el momento de poner
en contacto al biomaterial con el medio biolgico, los cuales son precursores de eventos
posteriores, estn determinados por la estructura y composicin de la superficie a escala
molecular (nanometro: milolonsima parte de un metro).
La herramienta ideal para caracterizar la superficie de un biomaterial debera permitir la
observacin de la muestra en contacto con un medio que se asemeje a las condiciones impuestas
por la aplicacin especfica registrando los procesos moleculares que ocurren en la intercara en
tiempo real. El espesor de la zona que debemos considerar superficie o interfase depende del tipo
de propiedades a que nos estamos refiriendo. Esta puede ser simplemente una capa atmica o
puede extenderse a decenas o cientos de capas. La mayora de las aplicaciones en que estn
comprometidas superficies (lubricacin, corrosin, interaccin biolgica, etc.) requieren una
comprensin de las propiedades de superficies reales las cuales aunque parezcan limpias a
simple vista presentan impurezas, molculas o residuos resultado de los contactos previos con
otros elementos (aire, vapores, fluidos biolgicos, etc).
En este captulo se presentan y describen los mtodos ms usados en la caracterizacin de
biomateriales, las herramietnas disponibles para el anlisis cualitativo y cuantitativo de los
mismos as como para la determinacin de sus propiedades en masa y superficie. Quedan
excludos aquellos mtodos destinados a la evaluacin de propiedades mecnicas dado que este
tema en particular se trata en un captulo aparte.
Introduccin
Los biomateriales, tanto naturales como sintticos, poseen caractersticas en masa y
superficie que definen su biocompatib ilidad y bioestabilidad, las cuales deben conocerce a los
efectos de predecir el comportamiento del dispositivo durante el periodo de aplicacin clnica.
Entre los parmetros evaluados podemos mencionar temperaturas de transicin vtrea, puntos de
fusin, capacidad calorfica, cristalinidad, coeficiente de dilatacin, cintica de reaccin,
composicin qumica, pureza, cantidad e identidad de aditivos, estabilidad y degradabilidad en
presencia de diferentes medios, porosidad, rugosidad, hidrofilicidad, etc.
Las diferentes tcnicas disponibles (cromatografa, difraccin de rayos X, espectroscopa
infrarroja, microscopa electrnica de barrido, microscopa de sonda de barrido, anlisis trmico
diferencial, etc.) plantean requerimientos especficos en cuanto a cantidad de muestra,
geometras de probetas particulares o procesos de acondicionamientos previos de los materiales a
ensayar ms o menos laboriosos. Algunas de las tcnicas son de naturaleza destructiva o otras
no destructiva, proporcionan informacin cualitativa o cuantitativa, absoluta o
complementaria, brindando resultados de mayor o menor resolucin o sensibilidad. Por lo tanto,
los mtodos apropiados a utilizar en cada caso debern seleccionarse teniendo en cuenta el

objetivo del ensayo y el destino de la informacin obtenida (por ejemplo: escala de

investigacin, control y anlisis de calidad, desarrollo de dispositivos o produccin industrial).
Determinacin de estructuras
La energa asociada con la radiacin electromagntica en el rango infrarrojo (justo por
encima de la longitud de onda del visible, aproximadamente entre 4000 y 600 cm-1 ) es suficiente
para provocar la excitacin de vibraciones de los enlaces qumicos. La Espectroscopa
Infrarroja por Transformada de Fourier, FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) y
Raman involucran el uso de esta radiacin para caracterizar los enlaces qumicos, por lo que
ambas tcnicas se consideran siempre en conjunto, aunque son significativamente diferentes. La
vibracin de una estructura determinada se analiza en trminos de los grados de libertad que
dicha estructura posee. Mientras en un experimento de FTIR se emplea una lmpara de mercurio
u otra fuente de amplio espectro, en Raman se emplea una fuente lser. El experimento Raman
involucra un corrimiento en la longitud de onda del haz monocromtico que incide sobre la
muestra. Esos pequeos cambios se deben a la emisin resultante de los choques inelsticos de
los electrones excitados. Ambas tcnicas proporcionan una informacin muy valiosa de la
estructura qumica y la zona debajo de 1500 cm-1 se denomina huella digital dado que permite
la identificacin de sustancias en forma unvoca.

Figura 1: Absorbancia en infrarrojo de algunos grupos funcionales comunes.

La tcnica de Difraccin de Rayos X, XRD (X-ray diffraction) proporciona informacin
sobre la estructura qumica y cristalina de un material. Los rayos X son radiacin
electromagntica de longitud de onda de aproximadamente 1 (10-10 m), que es del orden de la
distancia interatmica (ent re los rayos gamma y los ultravioleta). Cada slido cristalino posee un
patrn caracterstico de difraccin que puede emplearse, como en FTIR, para su identificacin.
Dado que los polmeros son amorfos o semicristalinos, a travs de este mtodo se puede
determinar el grado de cristalinidad de los mismos. En la Figura 2 se muestra claramente la
formacin de estructuras cristalinas en microsferas de poli(cido lctico) (PLA, polister
biodegradable) originalmente amorfas a medida que avanza el tiempo de degradacin hidroltica
in vitro. Estos tipo materiales polimricos son muy usados en la preparacin de sistemas de
liberacin controlada de drogas, suturas, tornillos y barrras de osteosntesis en el rea de ciruga
maxilofacial, etc. Esta tcnica resulta de gran utilidad en la elucidacin de la composicin,
pureza y estructura cristalina de los materiales metlicos y biocermicos. De esta manera se
puede obtener valiosa informacin de por ejemplo, -almina para uso en implantes (cuya
pureza debe ser mayor a 99.5% de xido de aluminio), estabilidad de zirconias, estructura y
parmetros de red de hidroxiapatita, fosfatos de calcio, carbn piroltico o aleaciones metlicas
de inters en implantes como aceros inoxidables, aleaciones CoCr, titanio y sus aleaciones, etc.

Figura 2: Patrones de difraccin de rayos X de microesferas de poli(cido lctico) (PLA) a

diferentes tiempos de degradacin
La Cromatografa Gaseosa, GC (Gas chromatography), es una tcnica que permite
separar compuestos orgnicos voltiles. Un cromatgrafo de gases consiste en una fase mvil
que fluye, un inyector, una columna de separacin que contiene una fase estacionaria y un
detector. Los compuestos orgnicos se separan debido a la existencia de una particin entre
ambas fases. Un ejemplo de aplicacin lo constituye la determinacin del contenido de
metacrilato de metilo residual en muestras de cementos seos acrlicos. La polimerizacin del
MMA in situ en la cavidad femoral progresa hasta la vitrificacin del PMMA, despus de la cual
el coeficiente de difusin del monmero disminuye, permaneciendo en la matriz polimrica sin
reaccionar. El contenido de monmero residual afecta a las propiedades mecnicas y puede
originar eventos biolgicos adversos durante la aplicacin clnica tales como hipotensin o
citotoxicidad. Otras tcnicas cromatogrficas incluyen la Cromatografa en Capa Fina (TLC),
la Cromatografa Lquida de alta Prestacin (HPLC), entre otras.
Por ltimo, entre los mtodos para determinar la estructura qumica, microestructura y
estereoregularidad de polmeros o tacticidad, composicin y secuencias copolimricas,
relaciones de reactividad de monmeros y otras caractersticas se encuentra la espectroscopia de
Resonancia Magntica Nuclear, NMR (Nuclear magnetic resonance spectroscopy), ya sea en
solucin como en estado slido. La NMR involucra cambios en el estado de espn del ncleo de
un tomo. Los ncleos ms comunes estudiados mediante NMR con 1 H, 13 C, 19 F, 15N y 29 Si. La
NMR de protn y carbono (1 H NMR y 13 C NMR) constituye una herramienta de suma
importancia en la sntesis y caracterizacin de biomateriales polimricos. El requisito de
solubilidad en alguno de los disolventes deuterados disponibles (comnmente DCCl3 , DMSO-d6 ,
D2 O, CD3-CO-CD3 , CF3 COOD) es fundamental para efectuar el anlisis mediante esta tcnica
en solucin. En la Figura 3 se muestra un ejemplo de un espectro obtenido mediante 1 H NMR de
poli(-caprolactona) (PCL), polister biodegradable sinttico empleado en numerosas
aplicaciones, y la asignacin de las seales correspondientes a los protones de la unidad
repetitiva. En el caso de oligmeros o polmeros lineales de bajo peso molecular, la relacin de
absorciones de los grupos finales y de las unidades repetitivas permite la determinacin del peso
molecular. Asimismo en el caso de polmeros ramificados, es posible determinar el grado de
ramificacin. Tambin se muestran los espectros de quitina y quitosano, polisacridos
biodegradables altamente biocompatibles.

a)
b)
Figura 3: Espectros de resonancia magntica nuclear de protn a) PCL, polister biodegradable
usado en el campo de liberacin controlada de frmacos e ingeniera de tejidos. b) comparacin
de espectros de los polisacridos quitina y quitosano.
Determinacin de pesos moleculares
La Cromatografa de Permeacin de Geles, GPC (Gel permeation chromatography),
tambin llamada cromatografa por exclusin de tamaos (Size exclusion chromatography,
SEC), permite la determinacin pesos moleculares y distribucin de pesos moleculares de
polmeros. El equipo de GPC consta de una zona de bombeo, zona de inyeccin, conjunto de
columnas empacadas con un relleno de partculas porosas, un detector y un registrador. Por todo
el sistema circula permanentemente un solvente a velocidad constante. La muestra disuelta en el
solvente es inyectada al sistema y fluye a travs de varias columnas en serie que se mantienen a
temperatura constante.
Las molculas ms pequeas tienen mayor facilidad de acceso a los poros del relleno y
difunden dentro y fuera de los mismos siguiendo un camino tortuoso a medida que avanzan en la
columna. Las molculas ms grandes no pueden penetrar en los poros y atraviesan las columnas
en forma ms rpida. De esta manera se logra la separacin de las molculas en funcin del
volmen hidrodinmico de las mismas, saliendo las molculas ms grandes a tiempos de elusin
menores. Los detectores ms usados son el ndice de refraccin, que mide la diferencia en el
ndice de refraccin entre el disolvente puro y la solucin que sale de las columnas, y el detector
ultravioleta, que mide la absorbancia de grupos cromforos. Los pesos moleculares obtenidos
son relativos a los patrones empleados en la calibracin, normalmente poliestireno, poli(xido de
etileno) o poli(metacrilato de metilo). La Figura 4 muestra una curva tpica obtenida por esta
tcnica con la distribucin de pesos moleculares de una muestra polimrica. Para Mw, peso
molecular promedio en peso, se utiliz el smbolo del cuadrado vaco y para la polidispersidad
(Mw/Mn) el cuadrado relleno, Mn es el peso molecular promedio en nmero.

Figura 4: Cromatograma tpico de GPC mostrando los pesos moleculares promedio. A la

derecha se observa la variacin del peso molecular y polidispersidad de una espuma de PLLA
con el tiempo de degradacin en solucin buffer pH = 7.4 y 37C.
Evaluacin de las propiedades trmicas
El anlisis trmico puede definirse como la medida de propiedades fsicas y qumicas de
los materiales en funcin de la temperatura (las medidas ms usuales son: entalpa, capacidad
calorfica, masa y coeficiente de expansin trmica). La familia de mtodos de anlisis trmico
disponible es bastante amplia. Las principales tcnicas pueden agruparse como se muestra en la
Tabla 1:
Tabla 1: Mtodos de anlisis trmico
Propiedad
Masa
Voltiles
Temperatura
Calor o flujo de calor
Dimensiones
Propiedades Mecnicas
Propiedades pticas

Tcnica
Termogravimetra
Deteccin de gases
Anlisis de gases
Anlisis trmico diferencial
Calorimetra diferencial de
barrido
Termodilatometra
Anlisis termomecnico
Anlisis dinmico- mecnico
Termomicroscopa
Otras

Acrnimo
TGA
EGD
EGA
DTA
DSC
TD
TMA
DMA, DMTA

La primera clase de mtodos termoanalticos est asociada con la prdida de masa y puede
determinarse de dos maneras. La primera forma involucra el uso de una balanza o un sensor
similar para seguir los cambios de masa (TGA). La segunda se basa en la deteccin y anlisis de
los gases de descomposicin producidos (EGD y EGA). Ambas tcnicas estn muy relacionadas
y son complementarias, como todos los mtodos termoanalticos.
El Anlisis Trmico Diferencial (ATD) es una tcnica en la cual la temperatura de la
muestra es comparada con la de un material inerte de referencia a medida que avanza el
programa de calentamiento o enfriamiento establecido. La temperatura de la muestra y la de la
referencia deben ser iguales hasta la ocurrencia en la muestra de algn evento trmico, como
fusin, cambio de estructura cristalina, descomposicin, o transicin vtrea; en cuyo caso la

temperatura de la misma se hace menor (si el cambio es endotrmico) o mayor (si es exotrmico)
que la de la referencia. Cuando la muestra y la referencia estn a la misma temperatura, la seal
neta de los termopares es cero, pero cuando un evento trmico ocurre en la muestra, existir una
diferencia de temperatura que es detectada por el voltaje neto de los termopares.
La Calorimetra Diferenc ial de Barrido, DSC (Differential scanning calorimetry) es una
tcnica muy similar al ATD, dado que tambin se utiliza una muestra y un material de referencia
pero la celda tiene un diseo diferente (ver Figura 5). La muestra (de aproximadamente 10 mg)
se coloca en recipientes (cpsulas hermticas o no) de aluminio u oro. Como referencia puede
utilizarse simplemente una de las cpsulas vacas. La muestra y la referencia deben mantenerse a
la misma temperatura durante el programa de calentamiento, determinndose el flujo de calor
que se desarrolla entre ambas en funcin de la temperatura.

Figura 5: Esquema de la celda de un calormetro DSC

El rea de los picos es una medida de la energa requerida para mantener la referencia y la
muestra a igual temperatura. La constante de calibracin que traduce el rea de los picos a
caloras es conocida y constante, siendo posible as un anlisis cuantitativo. El intervalo de
trabajo va desde 100C (nitrgeno lquido) hasta 600C. Mediante DSC se obtiene un
termograma donde la ordenada representa la capacidad calorfica (Cp) y la abscisa la temperatura
T a tiempo t, donde puede identificarse claramente toda transformacin endo o exotrmica que
sufre la muestra a medida que vara la temperatura (ver Figura 6). Dado que los picos
determinados pueden ser el resultado de varios procesos simultneos en muchos casos esta
tcnica requiere de la realizacin de otros estudios complementarios. Las aplicaciones incluyen
el clculo de Cp, efectos trmicos, pureza, temperatura de transicin vtrea (Tg), temperatura de
cristalizacin (Tc), temperatura de fusin (Tm), cinticas de reaccin, entalpas de fusin y
cristalizacin, porcentaje de cristalinidad y diagramas de fase entre muchas otras.
Determinacin de Tg: La temperatura de transicin vtrea es una propiedad de la parte
amorfa de un polmero y por lo tanto es un parmetro que caracteriza a estos materiales. Por
debajo de ella la movilidad es limitada y no existe suficiente energa trmica para que los
segmentos de cadena se muevan; el polmero se encuentra en un estado vtreo. A la Tg, se
produce el movimiento cooperativo de segmentos de molculas de 40 o 50 tomos de carbono y
el material se define en estado gomoso. La Tg puede medirse de diferentes maneras, ya que el
cambio en la morfologa del polmero va acompaado de bruscos cambios en las propiedades
como ndice de refraccin, capacidad calorfica, conductividad trmica, constante dielctrica,
mdulos mecnicos, volumen especfico, entre otras.
No todos los mtodos brindan el mismo valor de Tg debido en parte a las diferentes
constantes de tiempo de las celdas de medida. La Tg aumenta al aumentar la velocidad del
programa trmico impuesto porque las cadenas de polmero no pueden responder
instantneamente a los cambios de temperatura. Muchas veces el elevado grado de cristalinidad
de un polmero termoplstico o el alto nmero de puntos de entrecruzamiento de uno

termorrgido hace que esta transicin no sea detectable por no ser suficiente la sensibilidad del
mtodo. Algunos materiales altamente entrecruzados o con fuerzas intermoleculares muy fuertes
pueden alcanzar la degradacin antes de la Tg.
Durante la transicin vtrea se observa un cambio de pendiente de la curva Cp vs T debido
justamente a la diferencia en la Cp entre los estados vtreo y gomoso. La fusin es una transicin
de primer orden, pues vara la funcin de estado entalpa (H). En la Tg vara la derivada de la
entalpa con respecto al tiempo (dH/dt), es entonces una transicin de segundo orden. Para
determinar el valor de Tg se puede tomar el punto medio de la transicin (punto de infleccin de
la curva) o bien prolongar los tramos rectos y tomar la interseccin de stos como la lnea de
base y definir Tg en base al valor de temperatura al inicio o al final de la transicin.

Figura 6: Termograma de un polmero semicristalino obtenido por DSC.

La Termodilatometra (TD) est relacionada con los cambios dimensionales (longitud y
volumen) en funcin de la temperatura sin la aplicacin de ninguna carga externa. El coeficiente
de expansin se determina siguiendo la variacin de longitud en una direccin en particular con
respecto a la temperatura impuesta. En el captulo de Propiedades Mecnicas de Biomateriales
se hace referencia al anlisis termomecnico de materiales.
Caracterizacin de superficies de biomateriales
La Figura 7 presenta un esquema de los mtodos que se disponen tanto para el anlisis de
superficies de biomateriales como del sistema formado por la superficie de un material y los
elementos biolgicos adsorbidos, adheridos o ligados a los mismos, luego de un determinado
periodo de contacto. El primer enfoque tiene por objetivo la determinacin de los parmetros,
propiedades, composicin superficial y topografa del material que forma parte de un dado
dispositivo. El segundo enfoque es utilizado fudamentalmente en el campo de la ciencia de los
biomateriales para estudiar la respuesta biolgica (biocompartibilidad, hemocompatibilidad,
citotoxicidad, etc.) en presencia de estos sustratos caracterizados analizando los elementos
biolgicos en superficie, buscando correlaciones e identificando las propiedades significativas
del material que permitan predecir el comportamiento de los dispositivos in vivo.
Preparacin de muestras de biomateriales para el anlisis de propiedades superficiales:
La muestra debe ser semejante a la que va a ser sometida a un implante o ensayo biolgico. De
esta manera debe tenerse especial cuidado en la etapa de preparacin de las mismas evitando
alteraciones de la superficie mediante depsito o adsorcin de elementos, generacin de huellas
de corte, etc. Si la muestra es envasada para transporte o almacenamiento previo al anlisis
superficial, debe analizarse la posibilidad de contaminacin superficial. Por ejemplo: el papel
blanco o marrn de sobres puede transferir iones metlicos a la superficie de la muestra, algunos
plsticos empleados en envases han sido fabricados con aceites de silicona u otros aditivos que

pueden tambin transferirse a la muestra. Por este motivo el material de envase debe reunir
ciertos requisitos de pureza y calidad de fbrica.

Figura 7: Mtodos disponibles para la caracterizacin superficial de biomateriales

Anlisis de muestras: Todos los mtodos empleados para analizar superficies pueden
potencialmente introducir alteraciones. Para construir una imagen completa de la superficie y
extraer conclusiones definitivas acerca de la naturaleza de la misma deben emplearse un
conjunto de mtodos de anlisis que aportan informacin complementaria y coherente (Tabla 2).
En la Figura 8 se compara la sensibilidad de las diferentes tcnicas en relacin con la
profundidad de las capas superficiales de material que asequible con cada una.
Se detallarn a continuacin algunas de las tcnicas relevantes para la caracterizacin de
superficies de biomateriales y evaluacin de los fenmenos de interaccin de las mismas con el
medio biolgico.
Mtodos Espectroscpicos
a)
Mtodos de espectroscopa vibracional: La espectroscopa vibracional, en particular la
espectroscopa infrarroja (FTIR) brinda informacin acerca de la estructura molecular. El
espectro infrarrojo se origina por la absorcin de radiacin de frecuencia que est en resonancia
con una transicin vibracional determinada. La Reflectancia Total Interna Atenuada (ATRFTIR) es la aplicacin de este mtodo espectroscpico a la observacin de superficies acoplado
con el fenmeno fsico de refleccin total interna (refleccin y refraccin de radiacin

electromagntica en la interfase de dos medios de diferente ndice de refraccin) para restringir

el volmen de anlisis a la regin superficial de la muestra. El haz infrarrojo es reflejado en la
cara interna de un prisma transparente y con alta reflectancia, mientras que la superficie a ser
examinada es colocada en perfecto contacto con la cara del prisma en el que ocurre la reflexin.
Tabla 2: Caractersticas y capacidades de algunos mtodos comunes para el anlisis de
superficies de biomateriales
Mtodo
ngulos de contacto

Espectroscopa
electrnica para
anlisis qumicos
(ESCA o XPS)
Espectroscopa
electrnica Auger [2]

Espectrometra de
masas de iones
secundarios (SIMS)
Esp. infrarroja por
reflexin total
atenuada
(ATR-FTIR)
Microscopa de
efecto tnel (STM)
[4]

Principio

Profundidad
analizada

Resolucin
espacial

Sensibilidad
analtica

La energa superficial se
3 20
estima a partir del mojado de
lquidos sobre superficies
Los rayos X producen la
10 250
emisin de electrones de
energa caracterstica

1 mm [1]
8 150 m

Baja o alta
dependiendo de la
comp.qumica
0.1 % (atmica)

Un haz de electrones
50 100
enfocados sobre la superficie
produce la emisin de
electrones Auger
Un bombardeo de iones lleva 10 a 1 m [3]
a la emisin de iones
secundarios desde la
superficie
La radiacin infrarroja es
1 5 m
absorbida por vibraciones
moleculares excitadas

100

0.1 % (atmica)

500

Muy alta

10 m

1 mol %

tomos individuales

40
(usualmente)

Alta, no cuantitativa

Medida de la corriente tnel

cuntica entre una sonda
metlica y una superficie
conductora
Espectroscopa
Se mide y visualiza
electrnica de barrido espacialmente la emisin de
(SEM, ESEM)
electrones secundarios
causada por un haz de
electrones enfocado hacia la
superficie

[1] El tamao de una gota pequea es 1 mm. Sin embargo la resolucin espacial de la lnea interfacial en el borde de
la gota es aproximadamente 0.1 m. [2] La espectroscopa electrnica Auger daa la superficie de materiales
orgnicos y se emplea usualmente para materiales inorgnicos. [3] SIMS esttico aproxi madamente 10 ; SIMS
dinmico hasta 1 m. [4] Para materiales aislantes se emplea microscopa de fuerza atmica (AFM), que tiene una
resolucin espacial cercana a la del STM.

El desarrollo de esta tcnica permite la aplicacin de la espectroscopa infrarroja al estudio

de superficies polimricas pticamente planas, pulidas y suficientemente flexibles como para
permitir ser presionados en contacto con la cara del prisma. La profundidad de penetracin del
haz es de 1 a 5 m, por lo que proporciona informacin de una regin importante prxima a la
superficie. Se puede obtener informacin acerca de la estructura molecular del material, de
interacciones inter e intra moleculares, cristalinidad, conformacin y orientacin de molculas
(ejemplo: protenas), etc. Asimismo pueden observarse superficies polimricas inmersas en agua
u otro lquido, en estos experimentos se sustrae posteriormente la seal correspondiente a la fase
lquida. Otros mtodos IR como reflectancia difusa y reflexin externa mejoran notablement e la
capacidad de la espectroscopa vibracional para estudiar superficies.

Figura 8: Comparacin de la sensibilidad de algunas tcnicas analticas

b)
Espectroscopa Electrnica para Anlisis Qumico, ESCA (Electron spectroscopy for
chemical analysis), tambin llamada Espectroscopa Fotoelectrnica de Rayos X, XPS (X-ray
photoelectron spectroscopy) es utilizada para determinar la composicin elemental de superficies
slidas. El principio de ESCA se basa en la emisin de electrones desde el material en respuesta
a la irradiacin de la superficie con un haz monocromtico de rayos X. La energa cintica de los
fotoelectrones emitidos es nica para los diferentes elementos y sensible al estado qumico de los
tomos. Dado que los electrones emitidos tienen poca capacidad de penetracin de solo aquellos
emitidos desde 100 o menos de profundidad del material pueden escapar de la superficie y ser
detectados. El espectro ESCA, tpicamente de 1.000 eV de ancho, permite identificar y
cuantificar el porcentaje de tomos de los elementos presentes desde Li hasta U, excepto H y He
con una sensibilidad del orden de 0,1 % tomos. Los espectros de alta resolucin (ancho: 20 eV)
detecta corrimientos asociados al entorno qumico de los elementos existentes as como detalles
acerca de estructuras aromticas o insaturadas. Entre otras ventajas se puede mencionar que no
es necesaria una preparacin especial de la muestra, pueden estudiarse superficies hidratadas
(congeladas), con un dao mnimo a la muestra y existe una teora slida para interpretar la
informacin obtenida. Por ejemplo, en la Tabla 3 se muestra la composicin de distintos
poliuretanos segmentados con diferentes modificadores de extremo de cadena (SME) empleados
en la fabricacin de dispositivos en el rea cardio vascular. Las cadenas macromoleculares (Mw
del orden de 190.000) son modificadas en sus extremos para mejorar la biocompatibilidad o la
bioestabilidad de estos materiales en base a la estrategia del enriquecimiento superficial de los
mismos con determinados grupos funcionales ligados covalentemente a la estructura.
Tabla 3: Anlisis por ESCA de una serie de poliuretanos con modificadores de superficie
Material

SME

Biomer
Biospanb
Biospan-Db
Biospan-Sb
Biospan-Fb
a

Hidrocarbono
Silicona
Fluorocarbono

C
80,7
79,3
77,6
54,0
76,9

Composicin atmica (%)

O
N
Si
16,6
2,7
17,1
3,5
20,5
1,9
23,0
0,9
22,0
18,2
1,7
-

F
3,1

Ethicon Corp.; The Polymer Techonology Group, Inc.

c)
Espectroscopa electrnica Auger, AES (Auger electron spectroscopy), ha sido usada
para investigar morfologa superficial, realizar anlisis elemental y establecer perfiles de

composicin en profundidad. Un haz focalizado de electrones se usa para exitar los electrones
Auger de la superficie, los cuales son luego detectados y analizados. No se requiere preparacin
especial de la muestra y la adquisicin de datos es rpida (unos pocos minutos) y reproducible.
Este mtodo no puede aplicarse a muestras orgnicas dado que las mismas son alteradas qumica
y morfolgicamente por el haz de electrones. Por lo tanto AES es de uso limitado para la
caracterizacin de sustratos polimricos o biolgicos.
d)
Espectrometra de Masas de Iones Secundarios, SIMS (Secondary ion mass
spectroscopy). Puede utilizarse para el anlisis de superficies orgnicas e inorgnicas
identificando todos los elementos as como iones atmicos y moleculares y fragmentos de masa
alta presente a concentraciones muy bajas. Las superficies son bombardeadas con un haz de
iones o tomos focalizados y la energa del haz incidente (aproximadamente 5-25 keV) es
transferida a la superficie del material produciendo una emisin de partculas secundarias
algunas de las cuales estn ionizadas. Estas ltimas son separadas en funcin de la relacin
masa/carga elctrica donde las especies positivas y negativas son detectadas por separado. De
esta forma se obtiene un espectro de masas de una capa superficial de 10. Al igual que ESCA
requiere de una instrumentacin compleja y cmara de alto vaco. Sin embargo, SIMS
proporciona una informacin nica y complementaria a la obtenida por ESCA.
La distincin entre SIMS esttico y dinmico se basa en la dosis de iones acelerados
bombardeados hacia la superficie. SIMS esttico o de bajo flujo produce un dao mnimo en la
muestra y los fragmentos emitidos son caractersticos de la estructura molecular de la superficie.
Dado que una superficie tpica presenta 1013 -1015 tomos por cm2 el haz utiliza una dosis del
orden de 1013 iones/cm2 . La tcnica de alto flujo, SIMS dinmico, produce ablacin rpida de la
superficie durante el anlisis y puede utilizarse para conocer cambios en la composicin
elemental a medida que se avanza en profundidad. El mtodo SIMS de temperatura programada
ofrece informacin de energas de adsorcin y ayuda a distinguir fenmenos de adsorcin fsica
o qumica.
Mtodos Termodinmicos
e)
Mtodos de ngulo de Contacto (Contact angle): la medida del ngulo que forma la
tangente del perfil de una gota de lquido sobre una superficie slida, considerando que la gota se
encuentra en reposo y equilibrio con dicho slido, brinda informacin de la energa superficial
del sustrato. El ngulo de contacto a menudo se toma como parmetro indicativo de la
humectabilidad o mojabilidad (wettability) de la superficie de un materia l, y correlaciona
frecuentemente con los fenmenos de interaccin que ocurren con el medio biolgico. El balance
de fuerzas entre la tensin superficial lquido-vapor (lv )de una gota de lquido y la tensin
interfacial entre el sustrato slido y la gota (sl) puesta de manifiesto a travs del ngulo de
contacto () de la gota con la superficie puede usarse para caracterizar la energa de la superficie
sv. Estas tensiones se relacionan mediante la siguiente ecuacin: sv = sl + lv. cos
El ngulo de contacto para superficies inmviles es sensible a 3-10 de la superficie.
Experimentalmente se han desarrollado diferentes mtodos para evaluar el ngulo (Figura 9).
El mtodo de burbuja de aire en agua es til para estudiar interfases hidratadas y el mtodo de
Wilhelmy incrementa la reproducibilidad y exactitud de las determinaciones. En modo dinmico
se puede evaluar la histresis comparando ngulos obtenidos en avance y retroceso, la cual se
observa en presencia de superficies rugosas, de qumica heterognea o en sustratos reorientables
con molculas mviles en superficie. En resmen, a los efectos de obtener valores reproducibles
de se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: la medida es sensible al operador; la
rugosidad y heterogeneidad de la superficie influencia los resultados; los lquidos usados se
contaminan fcilmente reduciendo lv , dado que los polmeros en muchos casos poseen gran

movilidad de las molculas de la superficie; los lquidos utilizados pueden reorientar la

estructura; los lquidos utilizados pueden disolver la superficie del material o al ser absorbidos
provocar el hinchamiento del mismo; las geometras de las muestras para una correcta medicin
son limitadas; el tamao de la gota as como el tiempo en el que se efecta la lectura pueden
afectar los resultados.

Figura 9: Mtodos para medir ngulo de contacto: a) gota en avance y retoroceso (aumento y
disminucin de tamao de gota); b) estabilidad de gota; c) mtodo de Zisman para medir tensin
superficial crtica; d) ascenso capilar; e) mtodo Wilhelmy; f) burbuja de aire.
Mtodos Microscpicos
e)
Visualizacin de superficies: La Microscopa Electrnica de Barrido, SEM (scanning
electron microscopy) ofrece imgenes de gran resolucin y profundidad de campo con una
calidad tridimensional. El tipo de haz de electrones usado determina la resolucin que ser
mayor cuanto mayor es el voltaje de aceleracin utilizado. En la Figura 10 se aprecian las
diferentes zonas que podemos diferenciar en el volumen de interaccin del haz con el material
bajo anlisis y desde las cuales surgen los electrones o rayos X que se utilizan para generar la
imagen.
Los electrones secundarios son sensibles a cambios en la morfologa superficial. Los
electrones de fondo en cambio dan cuenta de la composicin del material. Como proveen
contraste de nmero atmico las reas del material con mayor nmero atmico sern brillantes.
El equipo SEM convencional opera bajo vaco y usa filamentos de tungsteno o hexaboruro de
lantanio, LaB6 . Los principales requerimientos de la muestra son: ser compatible con operacin
bajo vaco y conductor elctrico. Si la muestra no soporta el vaco se puede hacer un secado de la
misma por el mtodo de CO2 en estado de punto crtico o se puede observar a baja temperatura.
Las muestras no conductoras se recubren con una capa de carbn u oro.

Figura 10: Volumen de interaccin y profundidad de escape relativo de la radiacin empleada

para anlisis SEM
El desarrollo posterior de SEM de bajo voltaje, LVSEM , ampli las posibilidades de
estudio de la qumica superficial y topografa de materiales no conductores, mientras que la
tcnica ESEM (o SEM ambiental, environmental SEM), permite la aplicacin de SEM a
muestras sin recubrimientos metlicos y efectuar estudios de muestras en sumergidas en medio
lquido. El ESEM utiliza un detector de electrones secundarios pudiendo obtenerse imgenes de
muestras hmedas en atmsfera gaseosa o de vapor de agua hasta 20 Torr de presin sin ninguna
preparacin previa. Tambin se puede observar el material en condiciones dinmicas siguiendo
un programa trmico.

Figura 11: Imagen obtenida por ESEM de una gota de agua fijada entre fibras hidroflicas
El microscopio de bajo voltaje, LVSEM, usa filamentos de tugnsteno y toma la seal de
electrones de fondo para generar la imgen pudiendo caracterizar muestras hmedas a 2-3 Torr.
Los rayos X son seales importantes que proveen informacin sobre la composicin qumica de
la muestra midiendo la energa generada por la accin del haz. Esta tcnica se denomina
Espectroscopa de Energa Dispersiva, EDS (Energy dispersive X-ray spectroscopy). Dado
que la altura de cada pico est relacionada con el porcentaje de ese componente en el material es
posible llevar a cabo un anlisis cuantitativo. Las aplicaciones de SEM/EDS en el campo de la
medicina incluyen: anlisis de fallas, comparacin de materiales, evaluacin de procesos de
tratamiento superficial, caracterizacin de defectos, control de calidad de recubrimientos, etc.

En 1982 se avanz mucho con la invencin del Microscopio de Efecto Tnel, STM
(Scanning tunneling microscopy) que ofreca la imagen tridimensional directa de una superficie
conductora con resolucin atmica bajo una variedad amplia de medios. La importancia del
desarrollo del STM es comparable a la invencin del microscopio electrnico en 1930 dado que
este usa un principio completamente diferente al del microscopio electrnico y al del ptico para
obtener las imgenes de la superficie. El microscopio ptico no puede resolver estructuras
atmicas porque la longitud de onda promedio de la luz visible es unas 200 veces mayor que el
dimetro de un tomo (3 ).Usando luz de color verde (longitud de onda aproximada de 0,5 )
el microscopio ptico solo puede resolver datos prximos si entre ellos media al menos una
distancia de 0,25 . Si bien el SEM tiene alto poder de resolucin, los electrones de alta energa
del haz penetran profundamente en la materia y solo pueden resolver algo de la estructura
superficial. La aparicin del STM despert el inters generalizado de los cientficos y constituy
el primer paso para el desarrollo posterior de numerosas tcnicas que se conocen como
Microscopa de Sonda de Barrido, SPM (Scanning probe microscopy). Estos instrumentos
permiten estudiar las caractersticas de los cuerpos en detalle inasequible (escala atmica o
molecular) para los microscopios ordinarios examinndolos a muy corta distancia con una sonda
cuyo espesor puede ser de un solo tomo.

Figura 12: Imagen de resolucin atmica de una capa de cristal de -RuCl3 (3.7 nm de barrido)
En el STM los controles piezoelctricos aproximan la punta a una distancia de 1 a 2 nm
de la superficie de una muestra conductora, cercana en que las nubes electrnicas del tomo del
extremo de la sonda y del tomo m s prximo de la muestra se solapan. Cuando se aplica un
pequeo voltaje a la sonda los electrones atraviesan ese intervalo (efecto tnel) y dan lugar a la
aparicin de una minscula corriente. La intensidad de esta corriente es extraordinariamente
sensible al valor de la distancia de separacin. Un mecanismo detecta estas variaciones de
corriente y ajusta el voltaje al piezoelctrico que es el encargado de reubicar la sonda en sentido
vertical, siguiendo la topografa de la muestra, a los efectos de estabilizar la corriente. Un voltaje
de 0,1 V produce un movimiento de 1 (10-10 m). Las variaciones en el voltaje aplicado al
control piezoelctrico se traducen en una imagen de relieve de la superficie del material al
obligar a la punta a barrer un conjunto de lneas paralelas entre s.
Adems de mostrar la topografa atmica de la superficie el STM revela la composicin
atmica porque la corriente tnel depende de la distancia y de la estructura electrnica de la
superficie. La resolucin lateral del microscopio est limitada por lo afilado que sea la punta
logrndose valores de 6 a 12 . Para llegar a resolucin lateral de 2 la aguja de tugnsteno
debera contar con un solo tomo en la punta. El afilado de las puntas se efecta mediante el
bombardeo con un haz de iones de alta energa. Este microscopio es muy til por su capacidad
de suministrar un mtodo directo y no destructivo de visualizacin de muestras biolgicas. Por
ejemplo; por este mtodo se confirm que la cabeza del virus conocido como 29 mide

400x300x200 y se ha establecido la estructura de coneccin entre la cabeza y la cola del

mismo llamada collar, que desempea un papel significativo en el proceso de infeccin.

Figura 13: Esquema de un microscopio de efecto tnel (STM)

Pero entre las herramientas que han contribuido significativamente al desarrollo de la
ciencia de biomateriales se destaca el Microscopio de Fuerza Atmica, AFM (Atomic force
microscopy). La imagen se obtiene a partir del registro de la deflexin de una punta metlica
debido a la repulsin de la nube electrnica entre el tomo en la punta de la sonda y los tomos
de la superficie. De esta manera, este mtodo puede generar una imagen de la topografa de
materiales no conductores y componentes biolgicos (clulas, tejidos, protenas,etc.) y brindar
informacin acerca de la topografa, elasticidad, friccin, adhesin, densidad de cargas,
estructura y heterogeneidad qumica superficial. La resolucin a escala atmica puede lograrse
en un medio lquido o gaseoso tanto como en vaco. Esto es muy importante para el anlisis de
sistemas biolgicos en medios fisiolgicos reproducibles y para el estudio de fenmenos de
cristalizacin, disolucin o corrosin de materiales en varios solventes en tiempo real. Las
muestras no requieren de procesos previos de recubrimiento , teido, etc. como en el caso de
SEM porque el contraste no depende del nmero atmico. Las imgenes de SPM no producen
dao a las muestras por radiacin tales como se observa en el caso de anlisis SEM de
polmeros, los cuales sufren entrecruzamiento o corte de cadenas. Adems esta tcnica permite
manipular las superficies para crear estructuras moviendo tomo por tomo. La desventaja ms
importante es la baja velocidad de generacin de la imgen (30 segundos a 1 hora).
La estructura de AFM consiste de tres componentes esenciales (Figura 14): 1) Un
actuador piezoelctrico para mover la muestra en relacin con la sonda a los efectos de mantener
la fuerza constante. Los cermicos piezoelectricos cambian de tamao a una escala nfima
cuando vara el potencial elctrico al que se somete. 2) Un transductor de fuerza, brazo de
palanca con un sistema de medicin de la magnitud de la defleccin mediante un diodo laser. Las
dimensiones tpicas del brazo son 100 m de longitud, 30 m de ancho y 3 m de espesor. 3)
Una sonda o punta de prueba (0,5 m) fabricada usualmente de silicio o nitruro de silicio
ubicada en el extremo del brazo. La composicin, geometra, qumica, elasticidad y topografa de
la punta influenciar la medida en cada modo operacional. La magnitud de la fuerza depende de
la genometra de la sonda, y es tpicamente del orden de 100 nN, las cuales pueden producir dao
en muestras blandas. Las fuerzas que se detectan tienen una sensibilidad del orden del picometro

(1 pN = 10-12N). En el modo de contacto la friccin puede generar una imagen distorcionada de

la topografa y daar la superficie de la muestra o afectar la estructura de las macromolculas
observadas. La Figura 15a muestra dos imgenes de una misma muestra de silicio epitaxial (100)
obtenidas mediante AFM modo contacto donde se ha ampliando el campo de observacin del
segundo barrido. La primera imgen permite distinguir terrazas atmicas separadas por escalones
de 0,15 nm de alto (un tomo). La presencia de zonas de topografa claramente diferenciables, en
la segunda observacin, dan cuenta dao producido por el recorrido previo de la sonda.
El modo oscilante o tapping (Figura 16) elimina el problema de la fuerza friccional
contactando la superficie en fo rma intermitente y oscilando con suficiente amplitud para evitar
que la punta quede atrapada por la capa de contaminantes condensados alrededor de la sonda. La
superficie de los materiales inorgnicos se contaminan ms rpido que los polimricos debido a
su mayor energa superficial.

Figura 14: Esquema de un microscopio de fuerza atmica (AFM)

La resolucin espacial depende de la geometra de la muestra. Se pueden obtener
imgenes con resolucin atmica a partir de muestras planas en aire o sumergidas en agua o
etanol. Con muestras biolgicas la resolucin est determinada por la relacin entre el tamao de
la punta y el objeto y por las fuerzas aplicables admisibles. La formacin de imgenes de
muestras sumergidas en lquidos permite reducir las fuerzas entre muestra y punta y si se usan
medios salinos las molculas presentan estructuras ms cercanas a las que ocurren en los
procesos celulares. Las primeras observaciones biolgicas se centraron en ADN para lo cual la
molcula se depositaba sobre superficies planas (a escala atmica) de mica (Figura 15b). Para
que la sonda no desplazara las molculas durante el barrido se realizaban tratamientos a la
superficie de la mica para cambiar el signo de las cargas y aumentar su densidad superficial a los
efectos de reforzar el enlace electrosttico con el ADN (molcula polar).
La resolucin alta que brinda el AFM se contrapone con el escaso contenido de los datos
que se pueden extraer, los cuales son fundamentalmente de naturaleza mecnica y fsica. Para
ampliar las posibilidades de estos equipos se han desarrollado nuevos modos de anlisis. La
modificacin qumica y bioqumica de las sondas ha posibilitado mediciones que tienen en
cuenta la naturaleza qumica de los sustratos. De esta forma se han obtenido mapas de
composicin de materiales nanomtricamente heterogneos, han medido fuerzas de interaccin
de molculas nicas entre biopolmeros y diferenciado zonas especficas de membranas
celulares. La capacidad de medida de fuerzas de interaccin entre el material de la sonda y la

muestra incluye repulsin estrica, electrosttica, magntica, Van der Waals, puentes hidrgeno
y fuerzas de adhesin moleculares localizadas.

a)
b)
Figura 15: a) Silicio epitaxial (100), imagen AFM en modo contacto, primer barrido, 1 m
(izquierda); segundo barrido, 2 m (derecha). b) Dos molculas de ADN lineales superpuestas
(imagen SPM sobre mica con 155 nm de barrido).

Figura 16: Comparacin de los distintos modos de barrido en AFM. a) y b) Distorsiones

potenciales del modo de contacto. c) modo tapping.
La Figura 17 muestra las curvas tpicas de fuerza obtenidas con la modalidad de
contacto mecnico y de molcula nica. El primer caso se emplea para medir propiedades
superficiales importantes de naturaleza qumica, tales como por ejemplo, energa superficial,
potencial cero y punto isoelctrico. El segundo ensayo es muy utilizado en estudios de adhesin
de molculas sobre sustratos especficos, de interaccin ligando-receptor, antgeno-anticuerpo y
ADN-ADN, as como tambin el efecto de varios analitos tienen sobre la relacin entre los pares
antes mencionados. Por ejemplo se ha determinado una fuerza de 160 20 pN para separar un
complejo de una protena avidina cuando se une con una molcula de vitamina B12 (biotina)
mediante la tcnica de recubrimiento de la sonda con avidina. Al lograr la adquisicin de
imgenes en 10 a 200 s se pueden observar procesos dinmicos rpidos tales como la formacin
de complejos moleculares (Ejemplo: ADN-polimerasa/ADN) o fenmenos ms lentos como la
divisin celular.
Otra propiedad que se logra con la modificacin qumica de la punta es la habilidad de
extraer molculas especficas de matrices heterogneas. Se han removido protenas de
membranas celulares y secuencias de ADN de un cromosoma. La extraccin del gen deseado fue
verificado por la tcnica de biologa molecular. Si sumado al estiramiento esttico de la molcula
se le aplica una oscilacin se puede determinar la mecnica compleja de la molcula
(componentes elsticos y viscosos) para lo cual se debe registrar la frecuencia y la fase de la
medicin.

Las molculas polimricas o biolgicas pueden sufrir distorsin o dao por la interaccin
con la sonda cuando se trabaja en modo contacto. Esto inconveniente ha sido superado al
desarrollarse el modo alternativo oscilante o tapping donde se aplican fuerzas de menor
magnitud. El brazo oscila cercano a la frecuencia de resonancia (10-100 KHz) con una maplitud
de la sonda de decenas de nm, la cual se mantiene constante mediante el reposicionamiento de la
muestra mediante la accin del piezoelctrico. Dado que tapping es un modo dinmico se puede
extraer informacin de la relacin de fase entre la fuerza que mueve el brazo y la respuesta del
mismo cuando contacta la muestra. El corrimiento de fase permite diferenciar entre regiones de
diferentes propiedades qumicas o mecnicas.

Figura 17: Curvas fuerza-distancia en los modos (A) contacto mecnico y (B) molcula nica.
Muchos estudios se han focalizado en la determinacin de interacciones entre clulas o
clulas y componentes de la matriz extracelular. El conocimiento de estas interacciones es
esencial en el rea de inmunologa e ingeniera de tejidos.
f)
Resonancia de plasmn (Surface plasmon resonance, SPR): La SPR es una tcnica
ptica que est ganando un amplio reconocimiento como una herramienta de valor para
investigar las interacciones biolgicas en superficies de biomateria les. Esta tcnica ofrece un
anlisis en tiempo real de eventos superficiales dinmicos y puede de esta manera definir las
velocidades de absorcin y desorcin de elementos en superficie y analizar diversos fenmenos
de interaccin. En conjunto, los mtodos de microscopa de sonda de barrido, ATR-FTIR,
elipsometra, y SPR permiten un estudio dinmico de eventos superficiales: mientras SPM
permite visualizar cambios superficiales (absorcin de protenas, erosin, etc.). La ATR-FTIR
con muchas limitaciones es capaz de estudiar cambios conformacionales, y la elipsometra
espectral permite determinar espesores e ndices de refraccin de capas absorbidas. La
resonancia de plasmn, puede dar rpidamente informacin de la velocidad y extensin de una
adsorcin, determinar propiedades dielctricas, cinticas de asociacin/disociacin, constantes de
afinidad para una interaccin ligando/ligado, etc.
Lecturas sugeridas
- Ratner B.D., Hoffman A.S., Schoen F.J. y Lemons J.E. Biomaterials Science: An Introduction to Materials in
Medicine. Academic Press, San Diego, CA, 1996.
- Turi, EA. Thermal Characterization of Polymeric Materials. Academic Press, San Diego, CA, 1997.
- Merrett, K., Cornelius, R.M., McClung, W.G., Unsworth, L.D., Sheardown, H. Surface analysis methods for
characterizing polymeric biomaterials. J. Biomater. Sci. Polym. Edn. 13 (6) 593-621 (2002).
- Hirschmugl, C.J. Frontiers in infrared spectroscopy at surfaces and interfaces. Surf. Sci. 500, 577-604 (2002).
- Barbosa, M.A., Campilho, A. Imaging Techniques in Biomaterials. Elsevier Science, B.V. Amsterdam (1994).