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Lisis
Alcalina
Introduccin
Nicole Huacte - Patricia Jara Daniela
Rojo
3. Neutralizacin:
El lisado es neutralizado adicionando acetato de potasio acidificado,
as se provoca la renaturacin del DNA del plsmido. Lo que ocurre es
que hace regresar a un pH menos drstico y se vuelven a formar los
puentes de hidrgeno. Sin embargo, el DNA cromosomal es muy largo
y por tanto no logra establecer bien sus puentes de hidrgeno y
forma un agregado junto con el SDS y las protenas bacterianas, el
cual precipita. Al centrifugar, en el sobrenadante queda el DNA del
plsmido y en el fondo el cromosomal.
4. Aclaracin del lisado:
Aqu se obtiene el DNA del plsmido a travs del sobrenadante, que
luego se precipita con etanol al 70% y para asegurar se adiciona
luego etanol absoluto.
Materiales
1. Bacterias E.coli, se entregaron dos tubos con bacterias que contienen
plsmidos diferentes el cual se selecciono el denominado P, que es
el que contiene el conocido pGLO. Este fue el que posteriormente se
cargaron en el gel para realizar la electroforesis.
2. Buffer P1, que contiene EDTA Tris-Cl
3. RNAsa A
4. Buffer P2, que contiene SDS y NaOH
5. Buffer P3, que contiene Acetato de Potasio y cido Actico
6. Etanol 70%
7. Etanol Absoluto
8. Micropipetas
9. Tubos Ependorff
10.Centrifuga
11.Estufa
12.Cubeta con hielo
13.Agua libre de nucleasa
Resultados
Para poder cuantificar y observar los resultados obtenidos se realiza una
electroforesis en gel de agarosa, esta consiste en una separacin de tamao
molecular al ser expuesto por una carga elctrica, adems se utiliza en el
mismo gel un colorante que es intercalante a los cidos nuclicos, que es el
bromuro de etidio.
La muestra utilizada fue la denomida P, y que fue cargada en el posillo
nmero dos del gel.
Conclusin
En la experiencia de extraccin de lisis alcalina, se deben tomar ciertas
precauciones para obtener un resultado esperado que es la obtencin de
DNA del plsmido.
Es muy fcil que la muestra se contamine, ya sea por una mala
manipulacin o por los reactivos que no funcionan bien.
Es por ello que cada paso se debe tomar con cuidado y adems se debe
mantener en la muestra una temperatura baja.