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COD: 10-71
APLICACIN DE LA PCR:
DIAGNSTICO DE PARSITOS
FUNDAMENTO TERICO
La PCR es una tcnica que permite llevar a cabo la sntesis in vitro de fragmentos de
ADN. Est basada en una reaccin enzimtica catalizada por una ADN polimerasa, que produce
mltiples copias (amplificacin) de un mismo fragmento de ADN. Para la reaccin se requiere:
El ADN que va a copiarse, que servir como molde a la ADN polimerasa para hacer
las copias.
Polimerasa termoestable, habitualmente se utiliza la polimerasa de la bacteria
Thermus aquaticus conocida como Taq polimerasa.
Cebadores o primers especficos, que se unirn a los extremos del fragmento de
ADN que quiere amplificarse. En este caso, se unirn a un fragmento de ADN del
genoma del parsito. Se utiliza la especificidad de los cebadores para amplificar una
regin del genoma del parsito cuando se encuentra presente en una muestra.
Desoxirribonucletidos trifosfato, o dNTPs (dATP, dTTP, dCTP,dGTP), que son
los sustratos para la sntesis de ADN,
y un medio de reaccin adecuado, que contenga iones magnesio y otras sales
necesarias para que se produzca la reaccin enzimtica, y que se consigue utilizando
un tampn de reaccin apropiado para la enzima
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cada una de las dos cadenas sirve como molde para la copia de un nuevo fragmento
de ADN.
Etapa de cebado o annealing. las reacciones se enfran con rapidez a una
temperatura que puede variar entre 50-65 C y se incuban a esta temperatura durante
un periodo de entre 30s a 1 minuto para que los cebadores se unan a las secuencias
complementarias en las cadenas molde. Los cebadores son fragmentos cortos de
ADN, entre 15 y 35 nucletidos, de secuencia inversa y complementaria a los
extremos de la regin de ADN que va a copiarse. Son adems especficos, de modo
que se unen exclusivamente a los extremos del fragmento de ADN a amplificar, y
no se unen a ninguna otra secuencia de ADN cercana.
Etapa de polimerizacin. Las reacciones se incuban durante un periodo de entre
30s a 1 minuto a 72C, temperatura ptima de actuacin de la ADN polimerasa, que
aadir los desoxirribonucletidos trifosfato al extremo de los cebadores e ir
sintetizando las cadenas de ADN copia. Al final de esta etapa, se obtienen dos
molculas de ADN por cada molcula de ADN original de la muestra
Estas tres etapas forman un ciclo que se repite unas 30 veces. En cada nuevo ciclo, tanto
las cadenas de ADN original como las cadenas copiadas sirven como molde para la sntesis de
nuevas copias, de modo que el nmero de molculas de ADN se duplica en cada ciclo
(aumentando la cantidad de molculas de ADN de forma geomtrica).
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de
fragmentos
de
ADN
Como los cebadores que se utilizarn n la reaccin son especficos para secuencias de
ADN presentes en el genoma de un parsito (cebadores especficos de especie), la PCR puede
utilizarse para detectar la presencia de ADN del parsito en cuestin en una muestra que
contenga tambin ADN que no sea del propio parsito (ADN del hospedador).
OBJETIVOS DE LA PRCTICA
Se utilizar la tcnica de Reaccin en Cadena de Polimerasa, o PCR, para diagnosticar
la presencia del protozoo parsito Perkinsus olseni en muestras procedentes de dos de sus
hospedadores habituales, la almeja fina (Tapes decussatus) y la almeja japonesa (Tapes
philippinarum).
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MATERIALES NECESARIOS
Agua ultrapura estril.
ADN de almejas (4 muestras), extrado individualmente de dos individuos sanos y
dos individuos afectados por el parsito.
Controles de la tcnica, control positivo (ADN de un animal fuertemente infectado
por el parsito), y control negativo (agua estril).
Tampn de PCR, 10x.
Mezcla de desoxirribonucletidos trifosfato (dNTPs), 10 mM cada uno.
Cebadores PK1 y PK2, 200 micromolar cada uno, especficos para amplificar un
fragmento del espaciador IGS de los genes ribosmicos del genoma de Perkinsus
olseni.
Enzima Taq polimerasa, 10U/L.
Microtubos estriles, 0,2 mL.
Gradilla para microtubos.
Micropipetas automticas, p2 (0,2-2 L), p10 (1-10 L), y p20 (2-20 L).
Puntas de pipeta estriles.
Termociclador.
Agarosa.
Tampn de electroforesis TAE, 1x.
Colorante SYBR-Safe, 10.000x.
Tampn para cargar muestras en gel de agarosa.
Marcador de peso molecular.
Matraz Erlenmeyer, 250 mL.
Balanza.
Microondas.
Cubeta de electroforesis.
Fuente de alimentacin.
Transiluminador.
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METODOLOGA
1.
Preparar las reacciones de PCR, una reaccin para cada una de las muestras a
amplificar: 4 muestras de almejas, 1 control positivo y 1 control negativo.
2.
3.
4.
DESARROLLO DE LA PRCTICA
l
l
l
l
l
l
l
94C 5 minutos
30 seg.
30 seg.
x 30 veces
30 seg.
10 minutos
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b.
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c.
d.
e.
Retirar el peine y dejar libres los extremos del gel. Colocarlo en la cubeta de
electroforesis y cubrirlo con tampn TAE 1x para llevar a cabo una electroforesis
en gel horizontal sumergida.
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Marcador
peso
molecular Muestras:
5 6
8 9 10 11 12 13 14 15
500 pb
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 C+ C-
Muestras:
C-
C+ 1
800 pb
500 pb
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