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EL METODO DE KJELDAHL
El Metodo de Kjeldahl se emplea para la determinacin del nitrgeno total y
la posterior cuantificacin de protena bruta o verdadera de una muestra. Se
basa en la digestin del analito en cido sulfrico concentrado a ebullicin,
con la adicin de un catalizador. La muestra se digiere hasta disolucin y
oxidacin de la misma. El nitrgeno contenido en la muestra se convierte en
sulfato de Amonio.
Aadiendo un exceso de solucin de sodio hidrxido, el ion amonio es
liberado , destilado y recogido sobre una solucin de cido brico. El borato
acido de amonio producido se titula con una solucin de un acido fuerte
como el HCl previamente valorado. Este mtodo fue desarrollado en 1883
por el investigador Johann Kjeldahl.
REACCIONES EN LA PAGINA 132
METODO DE BIURET
Este mtodo se emplea para la cuantificacin de protenas ya que los
compuestos que contienen enlazes peptidicos al formar complejos de
coordinacin con los iones cpricos y 4 atomos de nitrgeno provenientes
de los pptidos, producen
un color violeta-rosado
bajo condiciones
alcalinas. la intensidad del color (absorbancia) es proporcional al contenido
protico de la muestra. se cuantifica espectrofotomtricamente a (540nm).
el reactivo incluye sulfato de cobre, naoh, y tartrato de sodio y potasio el
cual se utiliza para estabilizar el in cobre en la solucin alcalina
METODO DE BRADFORD
Este mtodo se basa en la reaccin de la forma anionica de residuos de
arginina, lisisna histidina, triptfano tirosina y fenilalanina de la protena,
con la forma cationica del reactivo azul de comassie G-250; SE ADHIERE A
LA PROTENA y vira DE un color ROJIZO A AZUL al encontrarse en el entorno
hidrofbico del interior de la protena, EL MXIMO DE ABSORCIN DEL
COLORANTE se presenta A 595nm. La mayor interferencia que se puede
presentar son los detergentes como el sds y el triton x-100.
METODO DE ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA
las protenas muestran un fuerte grado de absorcin a 280nm en uv,
principalmente debido a los residuos de aminocidos aromaticos como el
triptfano, la tirosina y fenilalanina, dado que cada protena tiene una
compoasicin nica de aminocidos aromticos, el coeficiente de absorcion
molar
deben ser determinados para protenas individuales para la
estimacin del contenido protico.
Metodo de Biuret
Curva de calibracin concentracin del patrn: 5mg/ml
Metodo de Biuret
0.3
0.2
Absorbancia 540 nm
0.1
0.0
0
[Proteina]
Tub Concentrac
o
ion
1
0,1
2
0,3
3
0,5
4
0,7
5
0,9
6
1,2
7
1,5
MUESTR
AS
ABS
%PROT
Abs 540
nm
0,043
0,078
0,124
0,164
0,215
0,224
0,277
Preparacion de tubos:
METODO DE BRADFORD
Curva de calibracin concentracin del patrn: 1mg/ml
Metodo de Bradford
0.6
0.5
0.4
Absorbancia 595 nm 0.3
0.2
0.1
0
0
0.05 0.1
[Proteina] (mg/ml)
Tubo
1
2
3
4
5
6
*Abs 5950 %
muestra
nm
Proteina
Prolamin
as
0,058
0,40
Glutelina
s
0,316
2,80
*Factor de dilucin 25. (respecto a la solucin original)
(muestra de clculos)
0.35
Absorcion U.V
1.2
1
0.8
Absorbancia 280 nm 0.6
0.4
0.2
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
[Proteina] mg/ml
Tubo
1
2
3
4
5
6
Concentra
cion
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Abs
280 nm
0,191
0,342
0,506
0,695
0,854
0,955
F.
*Abs
%
proteica
280 nm Proteina
albuminas
2,623
20,35
Globulinas
2,018
15,59
Prolaminas
1,056
8,02
Glutelinas
1,898
14,65
*Factor de dilucin: 5. (respecto a la solucin original)
(muestra de clculos)
RESUMEN DE RESULTADOS
MUESTRA
HARINA
ALBUMIN
AS
GLOBULI
NAS
PROLAMI
NAS
KJELDAH
L
21,38
BIURET
UV
ND
BRADFOR
D
ND
ND
LITERATU
RA*
21-26%
3,95
4,129
ND
20,35
4,5
2,95
1,420
ND
15,59
14,1
0,98
0,839
0,40
8,02
0,2
GLUTELIN
AS
6,00
2,625
2,80
14,65
2,6
esta fraccin proteica no fue aislada completamente ya que los dos ensayos
arrojan valores muy bajos (1,42-2,95), siendo que el porcentaje real est
alrededor del 14%. Sin embargo esta hiptesis no es del todo viable puesto
que las globulinas son muy solubles en soluciones salinas diluidas y se
habran extrado escasamente el 20% de la protena. Por otro lado, las
glutelinas el porcentaje se mantiene casi constante en los mtodos de
Biuret y Bradford y aumenta drsticamente en el kjeldahl, lo que sugiere un
error netamente experimental en este mtodo, posiblemente se deba a que
en el momento de darle paso al NaOH al 50 % a travs del embudo se filtro
un poco de base hacia el erlenmeyer que contena el destilado, siendo as el
volumen de HCl gastado al titular la muestra seria mucho mayor al que
gastara el NH4+ generado por la protena, afectando de esta forma los
resultados. Por ltimo las prolaminas, se cuantificaron alrededor de [0,440,98] valores bajos pero cercanos al terico ya que el contenido de esta
protena en la arveja es bastante bajo con respecto a las dems.
Se puede concluir entonces que: