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2013
Trabajo prctico
Especie animal
Rumiantes
Equinos
Cerdos
Perros
Gatos
Aves
Vena de eleccin
Vena yugular, caudal (bovinos) o
mamaria
Vena yugular
Vena de la oreja, coccgea y cava
anterior
Vena ceflica antebraquial o vena
safena
Vena ceflica antebraquial o vena
safena
Vena radial o alar
una aguja. La puncin de la vena cava es peligrosa y deber ser practicada por una
persona experta.
PERRO Y GATO: es muy til el servicio de un ayudante experto en el
manejo de animales. Las venas ceflica y safena son usadas comnmente en el
perro y en el gato. Con una mano el ayudante sujeta con suavidad la cabeza del
animal y con la otra lo rodea por detrs, tomando el codo del mismo y extendiendo
el miembro anterior. Con el pulgar y los otros dedos de esta mano se fija la piel
para sujetar el vaso firmemente. El operador inmoviliza el vaso con el pulgar e
inserta la aguja (calibre 18, 22, 25 o 38 mm dependiendo del tamao del animal)
arriba de este punto. Tambin se puede extraer sangre de la vena yugular en el
gato y menos frecuentemente en el perro; el procedimiento es semejante al
descrito para otras especies.
La cantidad de muestra obtenida a travs de la puncin debe tenerse en
cuenta en las diferentes razas, es as como para las razas de mayor tamao
puede obtenerse por puncin sin causar trastornos hasta 15 mL de sangre, y en
razas pequeas la muestra no se puede exceder de 10 mL.
AVES: igualmente que para las otras especies la sujecin o inmovilizacin
es de gran importancia para el xito del procedimiento. Existen varios sitios de
puncin que sern elegidos de acuerdo a la experiencia del operador. La vena
radial (alar), es el sitio de puncin ms comnmente elegido por su facilidad; se
elige una de las dos alas, se levanta, se sujeta el ala libre junto con las patas del
animal. Seguidamente quien realiza la puncin inmoviliza con los dedos pulgar e
ndice la vena alar, previo a sto se debe desplumar el recorrido de la vena con el
fin de visualizarla mejor. Con aguja nmero 21 se hace insercin sobre la vena en
un ngulo de 15, se debe tener cuidado de no extravasar ya que la pared de la
vena es muy delgada y podra ocurrir con facilidad, observndose hematoma
inmediatamente, si esto no sucede se procede a extraer la muestra,
aproximadamente de 1 a 2 mL de sangre en aves de mayor tamao, y en aves
ms pequeas 0,5 mL ya que una cantidad mayor puede producir anemias en esta
especie. Otros sitios de puncin menos utilizados son la vena atlantooccipital
ubicada entre el atlas y la regin occipital, la insercin de la aguja debe hacerse
perpendicular al sitio antes mencionado. La puncin intracardaca debe realizarse
con mucho cuidado ya que un error en ella, al puncionar las aurculas puede
causar la muerte inmediata del animal.
MICOLOGA
Las consideraciones para la toma de muestra son similares a las de
bacteriologa.
Micosis superficiales: si se sospecha de dermatofitos, realizar raspajes de
piel profundos y tomar muestras y pelo del centro y el margen de la lesin. La raz
de los pelos es muy importante en este caso. Desinfectar previamente con jabn
(sin accin fungicida) seguido con alcohol. El instrumento con el que realicemos el
raspaje debe estar estril al igual que el recipiente que contendr la muestra. Si no
se observan lesiones, se recomienda usar un cepillo fino para recolectar pelos
para cultivarlos. Deben ser enviados al laboratorio en un tubo estril tapado con un
algodn o sobre de celofn. No enviar la muestra en medio de cultivo porque
proliferan los hongos contaminantes.
Micosis profundas: las muestras (tejidos y rganos) deben ser enviadas en
condiciones semejantes a las de bacteriologa.
Anlisis de alimentos: los granos forrajeros, los balanceados o la cama
deben ser enviados, un mnimo de 50 grs., en fundas de papel al laboratorio. Si
existe demora para su envo debe refrigerarse.
Fetos: si se sospecha de infeccin mictica es importante incluir una
muestra de lquido abomasal (cuarto estmago), tomada de la misma forma como
se recolectan abscesos o lquidos articulares pero enviando la muestra sin
refrigerar. Se debe adems recoger una muestra mediante raspado cutneo del
feto, lavando la zona con agua y jabn, desinfectar con alcohol al 70% o un
antisptico adecuado, dejar secar por 2 minutos, con una hoja de bistur, o una
placa portaobjetos, raspar la zona afectada, si hubiese pelos afectados, stos
deben arrancarse desde su raz, con la ayuda de pinzas. Enviar la muestra al
laboratorio (en placa de Petri, sobre de papel o entre dos portaobjetos), sin
refrigerar.
VIROLOGIA
El diagnstico de enfermedades virales puede requerir el envo de muestras
de suero (sangre sin anticoagulante) con el fin de llevar a cabo pruebas
serolgicas, sangre entera (sangre con anticoagulante), exudados y de tejidos
para aislamiento y estudios estructurales.
colocar con letra grande y clara: Manjese con cuidado. Material biolgico
refrigerado. Flechas u otros smbolos que indiquen la posicin de la caja.
Para armar un sistema de envo se pueden utilizar los envases de toma de
muestra, de reactivos de laboratorio o de alimentos que sean de material
resistente.
Los datos del espcimen, notas y otro tipo de informacin que describan la
muestra, se envan debidamente protegidos, dentro de un sobre y en funda
plstica, entre el recipiente secundario y terciario.
DIAGNSTICO
DIRECTO O ETIOLGICO
INDIRECTO O INMUNOLGICO
HUMORAL
CELULAR
Prueba de
tuberculina
in vitro
SECUNDARIA
PRIMARIA
IFI, ELISA, RIA
TERCIARIA
Fijacin del complemento,
seroneutralizacin, inhibicin
de la hemaglutinacin
EN TUBO
EN PLACA
SAT, 2-Mercaptoetanol
BPA
Deteccin
de
interfern
gamma
DIAGNSTICO ETIOLGICO
CULTIVO BACTERIANO
El cultivo es el proceso de crecimiento de microorganismos de una muestra,
potencialmente sospechosa, de un sitio de infeccin (el ambiente in vivo),
aplicando los mtodos de recoleccin de muestras, en un ambiente artificial de
laboratorio (el ambiente in vitro). Una vez que los microorganismos crecen en el
cultivo, en placa o en tubo, la mayora de las poblaciones bacterianas se observan
con facilidad y estn presentes en cantidades suficientes para permitir la
realizacin de pruebas bioqumicas para la identificacin del microorganismo.
AISLAMIENTO VIRAL
Los substratos ms corrientemente empleados para la propagacin de los
virus son los cultivos celulares.
Un cultivo celular es obtenido de explantos de rganos o de embriones de
animales. Estas clulas obtenidas aspticamente se disocian tratndolas con una
enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspensin de clulas
libres as obtenidas se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o
plstico en donde las clulas se adhieren y multiplican formando una fina capa de
clulas que se llama monocapa celular.
Esta monocapa de clulas crece en un medio de cultivo complejo que
contiene albmina, vitaminas, sales, glucosa, y dems, en un sistema buffer. Se
previene la contaminacin adicionndole al medio antibiticos adecuados y en
algunos casos, antifngicos.
Los cultivos celulares en monocapa son los ms usados, aunque hay otros
sistemas (cultivos en suspensin, explantos, cultivos de rganos).
Luego de inoculado, con la muestra sospechosa, el cultivo se incuba a 37C
por un perodo de tiempo variable y esperando la aparicin de efecto citoptico,
toxicidad o degeneracin celular, de acuerdo al virus considerado. El efecto se
observa con microscopio.
Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparacin con
cualquier cambio morfolgico observado en los cultivos inoculados.
El efecto citoptico es la visualizacin de cambios morfolgicos
caractersticos en las clulas inoculadas producidas por la accin del virus sobre el
cultivo celular. Cuando los virus no producen este efecto, se puede recurrir a
tcnicas que ponen en evidencia la presencia de aquel en el cultivo. Las ms
usadas son: hemadsorcin, hemoaglutinacin y tinciones con anticuerpos
monoclonales.
INMUNOFLORESCENCIA (IF)
Es una tcnica utilizada generalmente para la deteccin de molculas
usando Ac marcados con colorantes fluorescentes como el isotiocianato de
fluorescena, la rodamina o la ficoeritrina. Estas sustancias al ser excitadas con
una luz de longitud de onda del rango ultravioleta (190-380nm), emiten luz visible
de longitud de onda mayor que se observa como una fluorescencia amarilloverdosa o anaranjado rojizo, segn se haya empleado isotiocianato o rodamina.
Esta tcnica posee dos variantes: inmunofluorescencia directa e indirecta.
ENZIMAINMUNOENSAYO (EIA)
El enzimoinmunoensayo es una tcnica verstil y muy sensible, que puede
utilizarse para detectar y medir en una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados
que se emplean tienen como marcadores a diversas enzimas. Las enzimas ms
utilizadas son la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la -galactosidasa.
Esta tcnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que
se realiza: cuando es en placa, se denomina ELISA; sobre tejidos,
inmunohistoqumica y sobre clulas, inmunocitoqumica.
ELISA
Existen muchas variantes de ELISA y su diseo depende de lo que se
quiera determinar. Pueden utilizarse para detectar o cuantificar tanto antgenos
como anticuerpos, pueden aplicarse fcilmente a diversos fluidos como leche u
orina, requieren pequeos volmenes de muestra y son relativamente rpidas.
El ELISA se realiza en placas de poliestireno de 96 pocillos y se basa en el
uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima. Al estar uno de los
componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado
sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar
inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un
sustrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable, a simple
vista (cualitativo) o mediante el uso de un espectrofotmetro se puede expresar
como densidad ptica (cuantitativo). En cada placa se colocan controles del
sistema y controles positivos y negativos de absorbancia conocida.
Los ELISA utilizados para detectar antgenos son:
ELISA directo: las placas se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones
en las que se sospecha que se encuentre el antgeno. Luego se coloca el Ac
marcado con una enzima.
ELISA sndwich o de captura: se liga a la placa un anticuerpo monoclonal o
policlonal como captura de antgeno. Se agrega el material sospechoso de
contener al antgeno y luego se aaden anticuerpos especficos antiespecie
marcados con la enzima.
DIAGNSTICO INMUNOLGICO
INMUNIDAD HUMORAL
Pruebas serolgicas para el diagnstico de enfermedades infecciosas.
Una amplia variedad de enfermedades infecciosas pueden ser
diagnosticadas mediante el empleo de pruebas serolgicas. Para la realizacin de
las mismas pueden tomarse muestras de sangre, plasma seminal, leche, mucus
crvico-vaginal, entre otros lquidos corporales as como lquido torcico o
abdominal.
Para la extraccin de la muestra es imprescindible utilizar materiales limpios
y secos (agujas de calibre adecuado, jeringas, tubos rotulados correctamente,
tapones) para evitar la contaminacin y hemlisis de la misma. Tambin es
importante conocer qu diagnsticos se realizarn para determinar el volumen de
la muestra a tomar.
Las muestras de sangre se colocan en un tubo sin anticoagulante,
preferentemente de vidrio. Se debe esperar la coagulacin y la retraccin del
cogulo, por lo menos 20-30 minutos luego de extrada la muestra. Lo
recomendado es esperar 1-2 horas a temperatura ambiente, cuanto ms tiempo
transcurra para que la retraccin tenga lugar, mayor cantidad de suero se
obtendr, aunque la cantidad de suero nunca ser mayor a un 40% del volumen
original de sangre. Debido a que tanto la coagulacin como la retraccin son
procesos enzimticos, se producirn ms rpido si la sangre se incuba en estufa a
37C durante 1-2 horas y luego se refrigera durante 30 minutos ms. Obtenido el
suero se separar el mismo con ayuda de una pipeta, para su procesamiento
inmediato o su conservacin tanto refrigerado (no ms de 7 das a 4C) o
congelado (-20C) en alcuotas, si se quiere conservar por un mayor perodo de
tiempo. Nunca congelar los sueros con cogulo. El fraccionamiento de la muestra
evitar la desnaturalizacin y agregacin de las protenas resultante de
congelaciones y descongelaciones sucesivas. En caso de utilizar otras muestras
como fuente de anticuerpos, debern conservarse de la misma manera.
El suero o el plasma no debe conservarse por ms de 6 horas en
refrigeracin sin ser separado de los dems componentes sanguneos, ya que
sto trae como consecuencia alteraciones en los diferentes metabolitos de la
sangre a determinar y por lo tanto, errores en los resultados de laboratorio.
Agente
Ac (anticuerpos)
S1
S2
Aislamiento
Das
0
Incubacin
10
Lesiones
25
Convalescencia
Radioinmunoensayo (RIA)
Objetivo: es una prueba de interaccin primaria que utiliza un radioistopo como
marcador del conjugado. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar
concentraciones muy pequeas de una sustancia. Estas pruebas deben ser
PRECIPITACIN
Inmunodifusin en gel de agar
Es una prueba de precipitacin cualitativa que se realiza en medio
semislido (gel de agar o agarosa). La tcnica de doble difusin puede utilizarse
para identificar tanto la presencia de antgenos como la de anticuerpos solubles en
los lquidos corporales. Al difundir el antgeno y el anticuerpo en el gel, se pondrn
en contacto y precipitarn formando una banda o halo.
Interpretacin:
REACCIN POSITIVA: formacin de bandas de precipitacin, sueros positivos.
REACCIN NEGATIVA: no se forman bandas de precipitacin en el gel de agar,
sueros negativos.
Ejemplo: para detectar la presencia de anticuerpos contra el virus de la anemia
infecciosa equina (AIE) como prueba oficial de diagnstico de la enfermedad,
tambin denominada test de Coggins; prueba VIA para diagnstico epidemiolgico
de fiebre aftosa, para identificar el ganado infectado con el virus de la leucemia de
los bovinos.
INMUNIDAD CELULAR
In vivo
Pruebas de hipersensibilidad tipo 4
Las reacciones de tipo 4 se caracterizan por la sensibilizacin de una
poblacin de las clulas T. En posteriores enfrentamientos con el antgeno esta
poblacin inicia una serie de reacciones inmunolgicas que culminan con el aflujo
de linfocitos y macrfagos al lugar del estmulo antignico. Este aflujo se produce
en un perodo de 24 y 72 h y por ello se denomina frecuentemente
hipersensibilidad retardada.
La reaccin de hipersensibilidad es in vivo. Por ejemplo, en un animal
sensibilizado al Mycobacterium bovis la inyeccin intradrmica de un extracto
purificado de la pared celular bacteriana provocar en el lugar de inyeccin una
reaccin de hipersensibilidad de tipo retardado, presentndose un infiltrado celular
que provocar un engrosamiento drmico.
Lectura
La lectura de las reacciones se har a las 72 h de la inoculacin. Se levanta
la cola hasta estirar ligeramente el pliegue, con el dedo ndice y el pulgar de la otra
mano, se palpa el pliegue para comprobar si hay engrosamiento, tomando la
medida exacta con el calibre. Se registran en el protocolo de tuberculinizacin las
mediciones pre y pos inoculacin y la diferencia entre las mismas, tomndose esta
ltima como valor para su interpretacin.
Ejemplo: pre inoculacin: 2 mm, pos inoculacin: 8mm. Lectura final: 6 mm.
Interpretacin
El profesional que realiza la prueba tuberculnica de rutina en un rodeo
debe actuar con criterio epidemiolgico, tomando en cuenta la totalidad del rodeo
y no interpretar los resultados considerando a los animales aisladamente.
En la primera prueba, cuando se desconoce si el rodeo est infectado o no,
RODEO CON SITUACION DESCONOCIDA, el veterinario acreditado debe aplicar
la tuberculina a:
- todos los bovinos mayores de 3 meses de edad en establecimientos lecheros y
cabaas
- todos los bovinos mayores a 12 meses de edad en establecimientos de carne.
Se aplica el siguiente criterio general:
Negativo: Un engrosamiento menor de tres (3) mm.
Positivo: Un engrosamiento de la piel de cinco (5) mm o mayor.
Sospechoso: Un engrosamiento de tres (3) mm o mayor y menor de cinco (5) mm.
Si todos los animales son negativos se considera RODEO NO
INFECTADO.
Cuando en un rodeo, a la primera prueba solo se encuentran reaccionantes
sospechosos (entre 3 y 5 mm) se considera RODEO SOSPECHOSO. Para
dilucidar su estado se puede optar por remitir los animales sospechosos a
sacrificio y si no se comprueban lesiones macroscpicas tuberculosas en el post
mortem, ni diagnstico positivo histopatolgico y/o bacteriolgico se debe
considerar al rodeo como no infectado. Otra opcin es repetir la prueba anocaudal a los 60 das de la primera, en todos los animales que acusaron reaccin
aplicando los siguientes criterios:
Positivo: si aumenta el tamao de la reaccin.
Negativo: si estos animales presentan una pronunciada reduccin en el tamao de
la reaccin. Se puede considerar el rodeo como no infectado, siempre que en el
grupo no hubiera otro animal reaccionante positivo.
Sospechoso: Si persiste el mismo tamao de la reaccin. Se debe realizar un
tercer examen definitivo a los 60 das del segundo. Esta tercera prueba es
concluyente y todo animal que tuviera una reaccin de 3 mm o mayor debe ser
clasificado reaccionante y el RODEO INFECTADO, a menos que los animales
sospechosos fueran sacrificados y no se comprobara la enfermedad.
CAPRINOS
Prueba ano-caudal de rutina (con PPD bovina) o prueba cervical simple
(con PPD bovina). Se siguen las especificaciones del protocolo definido para
bovinos.
OVINOS
Prueba axial comparativa con tuberculinas PPD bovina y PPD aviar, debido
a que los ovinos son tambin susceptibles a la infeccin con M. avium subsp
paratuberculosis.
Se inocula 0,1 mL de PPD bovina en la axila derecha y 0,1 mL de PPD
aviar en la axila izquierda. La lectura se realiza a las 72 hs por palpacin y medida
con el calibre. La interpretacin se realiza de acuerdo a lo establecido para la
prueba cervical comparativa de los bovinos.
AVES
Las aves son susceptibles solamente al Mycobacterium avium por lo que en
esta prueba se utiliza exclusivamente PPD aviar. El reactivo se inyecta va
intradrmica en una de la barbillas, la dosis es de 0,05 mL. La lectura se realiza a
las 48 h de aplicada la inyeccin y toda edematizacin de la barbilla se interpreta
como reaccin positiva.
In vitro
Prueba de interfern gamma
Es una prueba diseada para detectar gamma interfern biolgicamente
activo, en el plasma bovino para el diagnstico de tuberculosis a partir de
muestras de sangre. Los animales infectados con Mycobacterium bovis tienen
linfocitos circulantes sensibilizados a los antgenos micobacterianos. stos podran
responder in vitro a la estimulacin con tuberculina PPD secretando gamma
interfern, la que puede detectarse por esa prueba. Los linfocitos de animales no
infectados no responden a la produccin de gamma interfern y de ah que la
deteccin de la misma se correlaciona con la enfermedad.
Otra aplicacin de este sistema para demostrar in vitro inmunidad mediada
por clulas incluye el diagnstico de otra enfermedad causada por Mycobacterium
que es la enfermedad de Johne, conocida como Paratuberculosis. Se ha
demostrado que el ganado infectado con Mycobacterium paratuberculosis puede
identificarse detectando gamma interfern en el plasma recogido a partir de
sangre cultivada con Johnina PPD como antgeno estimulante.
La prueba da gamma interfern provoca la estimulacin de las clulas T
previamente sensibilizadas por la infeccin con Mycobacterium bovis.
ACTIVIDAD
1- a) Indique qu pruebas para diagnstico etiolgico observ durante el prctico.
b) Esquematice los resultados observados.
c) Explique la interpretacin de la misma.
2- a) Indique qu pruebas de aglutinacin observ durante el prctico.
b) Esquematice los resultados observados.
c) Explique la interpretacin de la misma.
3- a) Indique qu pruebas de precipitacin observ durante el prctico.
b) Esquematice los resultados observados.
c) Explique la interpretacin de la misma.
4- a) Indique qu coloraciones observ al microscopio.
b) Esquematice lo observado.