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rea de Enfermedades Infecciosas

2013

Trabajo prctico

Toma de muestras y diagnstico de


las principales enfermedades
infecciosas

TOMA Y REMISIN DE MUESTRAS


El diagnstico de las enfermedades que afectan a las diferentes especies
animales es de fundamental importancia para la aplicacin rpida de medidas
teraputicas y de control. La validez del resultado de un anlisis de laboratorio
para confirmar la sospecha de una enfermedad est directamente relacionada con
la calidad de las muestras remitidas para el diagnstico. El profesional tiene la
responsabilidad de seleccionar, recolectar, preservar y enviar adecuadamente las
muestras a fin de optimizar el diagnstico virolgico, bacteriolgico, micolgico y
serolgico de las enfermedades infecciosas. Se recordarn pautas bsicas de
extraccin y manipulacin de las mismas.
La muestra, o grupo de muestras, debe estar perfectamente identificada y
acompaada de la siguiente informacin:
1) Nombre, direccin, telfono, e-mail o fax del veterinario.
2) Nombre, direccin, telfono, e-mail o fax del establecimiento y del
propietario.
3) Tipo de explotacin y sistema de produccin.
4) Descripcin de los animales muestreados: especie, raza, sexo, edad,
estado fisiolgico y nutricional; cada muestra con un nmero o identificacin
individual.
5) Descripcin de las condiciones de extraccin de la muestra.
6) Se debe incluir una historia clnica con:
a) Nmero de animales del rodeo y categora, nmero de animales
expuestos y nmero de animales afectados.
b) Duracin de la enfermedad, morbilidad, mortalidad.
c) Pasturas sobre las que se encuentran los animales y tipo de forraje o
alimento (silo, concentrados, minerales) que hayan consumido.
d) Descripcin de los signos y hallazgos de necropsia si los hubiera.
e) Tratamientos, resultados obtenidos y vacunas aplicadas.
f) Otras enfermedades que se hayan observado en los das precedentes.
g) Indicar si el animal estaba muerto o fue sacrificado.
h) Hallazgos de necropsia.
i) Diagnstico presuntivo.
j) Anlisis o estudios solicitados.
En el caso de pequeos animales el protocolo de envo de muestra debe
contar con los siguientes datos:
1) Nombre, direccin, telfono, e-mail o fax del veterinario.
2) Nombre, direccin, telfono, e-mail o fax del propietario de la mascota.
3) Nombre del animal, especie, raza, sexo, edad, estado fisiolgico y
nutricional.
4) Descripcin de las condiciones de extraccin de muestra.
5) Nmero y especie de animales con los que convive y nmero de animales
afectados.
6) Duracin de la enfermedad.

7) Descripcin de los signos clnicos y hallazgos de necropsia si los hubiera.


8) Tratamientos, resultados obtenidos y vacunas aplicadas.
9) Otras enfermedades que se hayan observado en los das precedentes.
10) Diagnstico presuntivo.
11) Anlisis o estudios solicitados.
En cualquier situacin, las mejores muestras provienen de la necropsia de
un animal enfermo sacrificado o de animales vivos en distintos estados de la
enfermedad. Se debe recordar que en el estado agnico ocurre invasin de
bacterias intestinales las que se difunden en los tejidos y por ende el diagnstico
bacteriolgico e histopatolgico se puede complicar, ya que algunos de dichos
organismos son patgenos potenciales.
Para la toma de muestras (tanto in vivo como en la necropsia) es necesario
contar con una vestimenta adecuada (mameluco, delantal, guantes, botas de
goma, barbijo, etc.); recordar SIEMPRE el cambio de la indumentaria una vez
finalizada la tarea.
BACTERIOLOGA
El diagnstico microbiolgico debe comenzar mucho antes que una
determinada muestra sea recogida. De la mayora de los microbios que se han
determinado como patgenos, probablemente el 90% de ellos pueden ser
identificados si se tiene en cuenta la especie involucrada, los signos clnicos,
lesiones y otras circunstancias que rodean al proceso tales como localizacin
geogrfica, poca del ao, edad y el sistema de cra, entre otros. El conocimiento
de los microorganismos con relacin a estos aspectos es esencial para una
eficiente utilizacin de las tcnicas de diagnstico en el laboratorio y la correcta
interpretacin de los resultados.
Las muestras para estudios bacteriolgicos deben tomarse ANTES de la
administracin de antimicrobianos, si esto no fuera posible se deber esperar y
tomar la muestra luego de una semana de suspendido el tratamiento.
Los rganos enviados deben proceder de animales vivos, sacrificados por
el veterinario o muertos recientemente (2 a 4 horas mximo) y refrigerados de
inmediato. Deben ser animales que hayan manifestado signos de la enfermedad
aunque idealmente no deben estar moribundos. Los animales con fiebre y los que
comienzan a manifestar los primeros signos son los ms adecuados para
muestrear.
Siempre debemos usar material estril. Para evitar que la muestra se
deshidrate y lograr una adecuada conservacin, es necesario utilizar medios de
transporte o PBS (solucin buffer fosfato). Los envases utilizados para el envo de
muestras deben ser en lo posible irrompibles, hermticos y de dimensiones
adecuadas. Las precauciones a considerar varan con la clase de muestra,
temperatura ambiente, transporte y duracin del viaje; en lneas generales, el
tiempo entre la obtencin de la muestra y su llegada al laboratorio no debe
extenderse ms de 24 horas, especialmente cuando no se utilizan medios de
transporte.

Las muestras seleccionadas (leche, sangre, suero, fetos, rganos,


hisopados, etc.) deben enviarse con el medio de transporte ms especfico y estar
acompaadas del informe del veterinario.
En bacteriologa, NUNCA utilizar formol para tomar o enviar la muestra.
El xito y valor final de analizar una muestra clnica en el laboratorio de
bacteriologa, depende inicialmente del cuidado ejercido en la seleccin,
recoleccin y envo de la misma. La muestra seleccionada debe ser aquella que
contenga el agente causal y evitar su contaminacin con organismos del medio
ambiente.
Materiales
Envases estriles con cierre hermtico: recipientes de vidrios de boca ancha,
limpios y enjuagados con agua destilada, secados en estufa y estriles. El
esterilizado se puede lograr en autoclave a 121 C durante 20 minutos o de lo
contrario en horno seco a 160 C - 180 C durante 2 horas.
Los envases de uso culinario, frascos de dulce, mayonesa, etc. provistos de tapa a
rosca pueden adaptarse perfectamente, como as tambin la olla de presin que
eventualmente reemplazara al autoclave.
El material de vidrio envuelto en papel y esterilizado en el horno de cocina,
estar estril cuando el papel adquiere color caramelo. Este material de vidrio
una vez estril debe guardarse en cajas conservando sus propiedades por largo
tiempo.
Existen en el comercio recipientes colectores de plstico, descartables,
estriles, prcticos y accesibles.
El instrumental (pinzas, tijeras y bistur) que se utiliza para la extraccin de
muestras debe estar limpio, seco y bien afilado. Previo a su uso, se sumergen en
un recipiente con alcohol y se flamean, logrando as asegurar la asepsia. Se
deben descartar los desinfectantes qumicos (cloroxilenol, iodo, etc.) que impiden
el cultivo bacteriano posterior.
Tubos estriles y cierre hermtico,
Para extraccin de sangre se puede utilizar tubos estriles tipo Venojet:
- Sin anticoagulante: para envo de sueros, leche, orina y otros
lquidos.
- Con anticoagulante: * Heparina, para envo de sangre si se solicita
cultivo bacteriano o cultivo de clulas linfoides (viremias,
tuberculosis, entre otras).
* EDTA o Heparina para bsqueda de
hemoparsitos y envo de lquido articular o cefalorraqudeo.
Jeringas y agujas estriles: para la extraccin de sangre, lquido articular,
lquido cefalorraqudeo, contenido estomacal, etc.
Bolsas hermticas: para incluir rganos o fetos. Las bolsas de congelacin de
alimentos de un plstico fino y resistente son muy prcticas. Es importante dejar
escurrir el rgano para eliminar lquidos y hacer varios nudos para optimizar la
hermeticidad del cierre. En ningn caso mezcle diferentes rganos en la misma
bolsa y recuerde identificar cada una de ellas.
Hisopos con medio de transporte (Amies, Stuart, etc.): el medio de transporte
evita la desecacin de las clulas y limita el deterioro de la muestra. Son muy

prcticos porque permiten tomar muestras de animales vivos (hisopados rectales,


nasofarngeos, vaginales, oculares, cutneos, etc.) o de rganos durante una
necropsia. Su transporte es barato y disminuye riesgos biolgicos. Para colocar en
forma correcta la muestra tomada con un hisopo, debemos hacerlo girar sobre s
mismo, frotando contra las paredes tisulares para descamar clulas.
Guantes: para proteger al operador y evitar la contaminacin de las muestras
con las manos del mismo, adems se pueden utilizar para enviar muestras, ej.
heces, simplemente dando vuelta el guante despus de tomar la muestra
anudando la boca del mismo.
Cajas de telgopor: siempre que se enven muestras refrigeradas se recomienda
utilizar estas cajas. No son totalmente estancas, por lo que se deber asegurar
que el contenido interior est debidamente embalado. Se recomienda que las
muestras sean enviadas en un envase irrompible dentro de la caja de telgopor (ver
triple envase, en remisin de muestras) y consultar con las empresas
transportadoras si existen requisitos determinados (ej: tamao de cajas).
Bloques de hielo-gel: imprescindibles para los envos refrigerados. No utilizar
nunca agua congelada.
Rotulador indeleble o lpiz de grafito: para poder identificar los recipientes, las
bolsas de plstico, los tubos o los hisopos.
Protocolo de toma de muestras: es un componente muy importante del envo y
sin embargo con frecuencia est ausente, lo que plantea graves problemas a la
hora de decidir los anlisis o estudios que se deben realizar en el laboratorio.
Material de necropsia: Guantes, bistur, pinzas, tijeras, mechero, desinfectante,
barbijo, mameluco, botas, costtomo, sierras, jeringas y agujas.
Para el caso del transporte de animales vivos: utilizar una caja resistente, hacer
suficientes orificios de aireacin en la caja, especialmente en verano, no poner
agua ni comida, colocar en el fondo de la caja material absorbente para los
excrementos, se recomienda enviar a ltima hora de la tarde.
Muestras
Tejidos y rganos: la muestra se tomar al abrigo de la llama, con las
mejores condiciones ambientales de asepsia y como mximo una hora despus
de la muerte del animal, en climas con alta temperatura, y 12 horas como mximo
en climas con bajas temperaturas. El tamao de las muestras debe ser de 3 x 3
cm como mnimo, se debe quemar la superficie con una esptula previamente
flameada, luego abrir el tejido con tijeras u hojas de bistur estriles y cortar una
pequea porcin del mismo. Las muestras se colocan en bolsas individuales de
polietileno u otros recipientes estriles. Enviarlas refrigeradas al laboratorio en un
lapso no mayor de 4 horas. Los rganos de eleccin son en general, bazo,
pulmn, hgado, rin y hueso largo. Las muestras de intestino se envasarn por
separado y con sus extremos anudados para mantener su contenido intacto. Las
muestras de cerebro deben enviarse refrigeradas. Se recomienda enviar piel en
casos de piodermias profundas y de aquellas que no respondan a tratamientos; en
las lesiones superficiales generalmente no se toman muestras para cultivo.
Hisopados: los hisopos son la forma de eleccin para tomar y enviar
muestras de secreciones (nasal, farngea, ocular, cutnea, cervical, vaginal, etc.),

exudados, contenido de abscesos, etc. La muestra se debe tomar con hisopos de


algodn estriles. Raspar la zona afectada evitando el contacto con cualquier otra
parte, introducir dentro de un tubo estril con por lo menos 3 mL de medio de
transporte adecuado (por ejemplo AMIES o STUART) o en solucin fisiolgica
estril otorgndole as las condiciones necesarias para mantener viables a los
grmenes. Embeber adecuadamente la muestra con el medio de transporte y
romper el mango del hisopo para eliminar la parte que ha estado en contacto con
las manos, tapar el tubo evitando contaminar su interior. Identificarlo y enviarlo al
laboratorio refrigerado.
Este tipo de muestra es muy til en animales vivos o en necropsias.
Permiten recoger muestras de exudados con alto contenido en clulas en
cavidades:
Nasal
Traqueobronquial (evitar arrastrar mucus traqueobronquial)
Endocervical y vaginal, evitar arrastrar mucus vaginal introduciendo el hisopo
en el hueco del espculo hasta el crvix.
Conjuntival (frotar suavemente el fondo de saco conjuntival)
ticos: en otitis (sobre todo en pequeos animales) se recomienda realizar
hisopados para hacer tinciones de Gram o cultivos. Estos son muy tiles en
casos de otitis media. Se puede detectar levaduras (Pityrosporum canis) o
bacterias del gnero Proteus y Pseudomonas.
Rectal (evitar arrastrar heces, vaciando previamente el recto)
Heridas abiertas y exudados: se debe previamente lavar y secar la zona.
En necropsias: se pueden tomar muestras de rganos introduciendo el hisopo
profundamente en la cavidad y frotando contra las paredes hacindolo girar
sobre s mismo.
Heces: las muestras de materia fecal pueden provenir tanto de un animal
vivo como muerto, deben ser recolectadas directamente del recto para evitar
contaminacin, puestas en bolsas de polietileno o en un envase hermtico donde
puede colocarse directamente el contenido intestinal o bien un trozo de intestino.
Debido a la alta probabilidad de contaminacin se debe evitar el envo de excretas
expuestas al ambiente.
En caso de animales grandes, la muestra puede ser recolectada del recto
del animal colocndose previamente un guante plstico que cubra inclusive el
brazo. La manga del guante puede ser invertida y luego del cierre enviar al
laboratorio.
La muestra se enva refrigerada, no congelada y con mnimo tiempo de
transporte. Este tipo de cultivo se hace para detectar fundamentalmente
enterobacterias y requiere la utilizacin de medios selectivos para inhibir la flora
normal. Se utiliza el cultivo fecal cuando se sospecha de la presencia de
patgenos especficos tales como Salmonella spp., Escherichia coli, Rhodococcus
equi, Campylobacter spp. o Clostridium perfringens, entre los ms frecuentes;
agentes virales y otros.

Los hallazgos de necropsia pueden proveer buenos datos si se obtienen en


sitios precisos de las lesiones en el intestino, especialmente para el aislamiento y
conteo de Clostridium spp.
Orina: se debe tener mucho cuidado en la toma de este tipo de muestra
pues es importante no slo aislar el germen sino tambin en algunos casos, hacer
recuento de colonias. La muestra ideal es la tomada por cistocentesis. El sondeo
vesical y la orina de chorro medio por miccin espontnea puede contaminarse.
Se deben utilizar jeringas, agujas y sondas estriles. En el caso de aquellas
especies en las que se puede realizar cistocentesis se debe rasurar y realizar una
limpieza y desinfeccin minuciosa del rea a punzar. Dos tres mililitros es un
volumen de muestra suficiente. La muestra se debe enviar en un recipiente estril,
hermtico y refrigerada, nunca congelada. Las bacterias pueden multiplicarse o
morirse rpidamente en la orina segn la acidez, por este motivo se requiere
rapidez en el procesamiento.
El cultivo de esta muestra debera ser rutinario, especialmente en casos donde no
hay respuesta a los tratamientos, generalmente debido a resistencia a los
antimicrobianos de los grmenes involucrados.
Fluidos, exudados y aspirados: se debe rasurar, lavar y desinfectar el sitio
de la puncin, recolectar la muestra con jeringa y aguja estril. Introducir la aguja
en forma perpendicular a la zona de puncin y a la profundidad necesaria de
acuerdo al caso. Aspirar la muestra hasta obtener una cantidad suficiente (1-2
mL). Cuando la muestra no puede ser aspirada por la densidad del material, se
puede inyectar en el sitio solucin salina estril. Identificar y enviar refrigerado al
laboratorio en tubos estriles con tapa a rosca, de no ser posible enviar en la
jeringa (con su capuchn). Se pueden usar catteres estriles para muestras
profundas. Si se pudiera elegir, los aspirados o raspados son mejores que los
hisopados pero ms difciles de realizar. Conviene tomar al menos dos hisopados,
y destinarlos uno para cultivo y otro para observacin microscpica. Por ejemplo
en casos de piotrax o pleuritis se hacen aspirados y con ellos se pueden hacer
frotis y cultivos.
Lquido cefalorraqudeo o sinovial: tomar muestra con una jeringa estril. Se
debe procurar una asepsia ptima en el punto de inyeccin y evitar la
contaminacin con sangre. Enviar refrigerada y en tubos con anticoagulante.
Heridas, abscesos y drenajes: se pueden hacer cultivo y observaciones
directas de la muestra o frotis coloreados con Gram u otra coloracin especfica.
Las observaciones microscpicas pueden ser tiles en lesiones granulomatosas
producidos por (Nocardia, Actinomyces o micosis).
Leche: las muestras de leche deben ser tomadas de animales que no hayan
recibido tratamiento con antimicrobianos durante los ltimos 10 das. Estas deben
ser recolectadas en envases estriles bien cerrados y luego enviar refrigeradas al
laboratorio en el menor tiempo posible.

En los bovinos, ovinos y caprinos, se debe lavar, enjuagar y secar la ubre,


con una solucin de alcohol al 70% desinfectarse las manos y con la misma
solucin utilizando un algodn desinfectar los pezones, dejar secar 2 minutos
previos al muestreo. Eliminar los dos primeros chorros de leche antes de tomar la
muestra. Ordear recogiendo en un recipiente estril, sin tocar sus bordes, 3 mL
aproximadamente tomando proporcionalmente de los cuartos afectados. En caso
de que la infeccin est localizada en uno de los cuartos o se requiera localizar el
cuarto afectado, siguiendo las mismas recomendaciones, tomar de 2 a 3 mL de
leche del cuarto afectado o de cada cuarto por separado. Identificar la muestra
correctamente y mantenerla refrigerada hasta la llegada al laboratorio.
Para cultivar, realizar frotis directos y tincin de Gram es necesario desgrasar la
muestra.
Sangre: las tcnicas de extraccin de sangre venosa varan de una especie
a otra, segn la localizacin de los vasos sanguneos y segn el espesor y dureza
de la piel. Se debe rasurar el rea a punzar, limpiar muy bien con alcohol 70% y
luego aplicar un hisopo o gasa con tintura de iodo al 2%. La asepsia debe
realizarse en sentido contrario al crecimiento del pelo del animal y en forma
circular del centro hacia la periferia. No tocar el lugar de puncin con los dedos y
utilizar aguja y jeringa estriles. Tambin se puede utilizar el sistema de tubos al
vaco (tipo Vacutainer), que por ser un sistema cerrado presta mayor garanta en
cuanto a asepsia y preservacin de las muestras. Una vez extrada la sangre
sacar el aire de la jeringa y retirar la aguja antes de llenar el tubo donde se
depositar la muestra, para evitar la ruptura de los glbulos rojos (hemlisis).
Homogenizar la sangre con el anticoagulante (heparina, EDTA, etc.) para evitar la
formacin de cogulos. Colocar en envase estril y si tiene tapa de goma
desinfectar con alcohol el exterior de la tapa.
Se debe enviar refrigerado entre 4 C y 8 C al laboratorio antes de las 24
horas de su extraccin. Proteger los tubos de los golpes. Despus de la puncin el
sitio debe quedar seco, limpio y libre de sangre, ya que la humedad y la materia
orgnica favorecen las contaminaciones.
Sitios de puncin

Especie animal
Rumiantes
Equinos
Cerdos
Perros
Gatos
Aves

Vena de eleccin
Vena yugular, caudal (bovinos) o
mamaria
Vena yugular
Vena de la oreja, coccgea y cava
anterior
Vena ceflica antebraquial o vena
safena
Vena ceflica antebraquial o vena
safena
Vena radial o alar

BOVINOS: se puede extraer sangre de las venas yugular, mamaria


(abdominal subcutnea) y caudales y de las arterias cartida, caudal y braquiales.
La vena yugular puede ser ingurgitada presionando con los dedos el canal
yugular. El vaso prominente se observa bien en la mayora de las vacas y se
palpa fcilmente en los animales obesos. Tiene aproximadamente 2 cm de
dimetro. Se introduce en la vena una aguja larga calibre 14 y de 5 cm de longitud,
o calibre 16 y 10 cm de longitud en un ngulo de 45 respecto a la piel y paralelo
al vaso. Otra opcin es introducir una aguja ms fina, calibre 18 de 3,8 cm. Luego
de introducir la aguja se hace una leve succin con la jeringa. Puede ocurrir que
la aguja atraviese la vena y que la punta quede fuera del vaso, entonces retirando
la aguja lentamente se ubicar la punta de la aguja dentro de la luz del vaso.
Extrada la sangre, se quita la presin sobre la vena y antes de sacar la aguja, se
aplica presin manual sobre el sitio de puncin (sin hacer friccin) por 30 a 60
segundos despus, para evitar hemorragias y hematomas. La vena mamaria se
punza en forma semejante. La vena caudal se encuentra muy cerca de la arteria,
para realizar la puncin se alza la cola y se clava una aguja pequea calibre 20
22 de 25mm y a 15 cm de la base de la cola verticalmente en la lnea media hasta
que penetre en el vaso. Se debe identificar la sangre como venosa o arterial; esta
ltima es ms roja y emerge con mayor presin.
OVEJAS: la vena yugular es la ms usada pero la vena y arterias femorales
son tambin fciles de punzar. Se hace una particin en la lana, a veces
previamente cortada, para exponer un rea de piel limpia. Realizar la asepsia
correspondiente. La vena yugular se encuentra con frecuencia debajo de la piel
pero puede estar incluida en el tejido adiposo. La piel es blanda y la aguja (calibre
18-22 de 25 mm) penetra con facilidad, por lo que debemos evitar atravesar el
vaso.
CABALLO: se aborda la vena yugular. Con el pulgar izquierdo en el surco
yugular a la mitad de su trayecto en el cuello, se comprime y sujeta la vena. Se
clava la aguja (calibre 18-20 de 38 mm de longitud) en ngulo aproximado de 15
con la piel, 1 cm arriba del pulgar que est sujetando el vaso. Se introduce la
aguja1 2 cm bajo la piel, se aumenta el ngulo a 45 y se empuja para que entre
en la vena. La puncin debe hacerse en un solo movimiento suave y continuo.
Esto ayuda a disminuir el sangrado al retirar la aguja. De la cartida puede
obtenerse sangre arterial, este procedimiento requiere prctica y no debe ser
intentado por una persona inexperta. Es ms fcil obtener sangre arterial de la
gran arteria metatarsiana, situada en una canaladura sobre la cara antero-externa
del corvejn, entre el tercero y cuarto huesos metatarsianos. Se inyecta en la piel
un poco de anestsico local, despus de unos minutos, se pincha la arteria con
una aguja de calibre 20 y 25 mm, mantenida en ngulo recto con el vaso,
firmemente encajado en el surco seo.
CERDO: se usan las venas de las orejas, cola y cava anterior. De la oreja
se toma sangre por una incisin pequea de la vena con bistur o por puncin con

una aguja. La puncin de la vena cava es peligrosa y deber ser practicada por una
persona experta.
PERRO Y GATO: es muy til el servicio de un ayudante experto en el
manejo de animales. Las venas ceflica y safena son usadas comnmente en el
perro y en el gato. Con una mano el ayudante sujeta con suavidad la cabeza del
animal y con la otra lo rodea por detrs, tomando el codo del mismo y extendiendo
el miembro anterior. Con el pulgar y los otros dedos de esta mano se fija la piel
para sujetar el vaso firmemente. El operador inmoviliza el vaso con el pulgar e
inserta la aguja (calibre 18, 22, 25 o 38 mm dependiendo del tamao del animal)
arriba de este punto. Tambin se puede extraer sangre de la vena yugular en el
gato y menos frecuentemente en el perro; el procedimiento es semejante al
descrito para otras especies.
La cantidad de muestra obtenida a travs de la puncin debe tenerse en
cuenta en las diferentes razas, es as como para las razas de mayor tamao
puede obtenerse por puncin sin causar trastornos hasta 15 mL de sangre, y en
razas pequeas la muestra no se puede exceder de 10 mL.
AVES: igualmente que para las otras especies la sujecin o inmovilizacin
es de gran importancia para el xito del procedimiento. Existen varios sitios de
puncin que sern elegidos de acuerdo a la experiencia del operador. La vena
radial (alar), es el sitio de puncin ms comnmente elegido por su facilidad; se
elige una de las dos alas, se levanta, se sujeta el ala libre junto con las patas del
animal. Seguidamente quien realiza la puncin inmoviliza con los dedos pulgar e
ndice la vena alar, previo a sto se debe desplumar el recorrido de la vena con el
fin de visualizarla mejor. Con aguja nmero 21 se hace insercin sobre la vena en
un ngulo de 15, se debe tener cuidado de no extravasar ya que la pared de la
vena es muy delgada y podra ocurrir con facilidad, observndose hematoma
inmediatamente, si esto no sucede se procede a extraer la muestra,
aproximadamente de 1 a 2 mL de sangre en aves de mayor tamao, y en aves
ms pequeas 0,5 mL ya que una cantidad mayor puede producir anemias en esta
especie. Otros sitios de puncin menos utilizados son la vena atlantooccipital
ubicada entre el atlas y la regin occipital, la insercin de la aguja debe hacerse
perpendicular al sitio antes mencionado. La puncin intracardaca debe realizarse
con mucho cuidado ya que un error en ella, al puncionar las aurculas puede
causar la muerte inmediata del animal.

MICOLOGA
Las consideraciones para la toma de muestra son similares a las de
bacteriologa.
Micosis superficiales: si se sospecha de dermatofitos, realizar raspajes de
piel profundos y tomar muestras y pelo del centro y el margen de la lesin. La raz
de los pelos es muy importante en este caso. Desinfectar previamente con jabn
(sin accin fungicida) seguido con alcohol. El instrumento con el que realicemos el

raspaje debe estar estril al igual que el recipiente que contendr la muestra. Si no
se observan lesiones, se recomienda usar un cepillo fino para recolectar pelos
para cultivarlos. Deben ser enviados al laboratorio en un tubo estril tapado con un
algodn o sobre de celofn. No enviar la muestra en medio de cultivo porque
proliferan los hongos contaminantes.
Micosis profundas: las muestras (tejidos y rganos) deben ser enviadas en
condiciones semejantes a las de bacteriologa.
Anlisis de alimentos: los granos forrajeros, los balanceados o la cama
deben ser enviados, un mnimo de 50 grs., en fundas de papel al laboratorio. Si
existe demora para su envo debe refrigerarse.
Fetos: si se sospecha de infeccin mictica es importante incluir una
muestra de lquido abomasal (cuarto estmago), tomada de la misma forma como
se recolectan abscesos o lquidos articulares pero enviando la muestra sin
refrigerar. Se debe adems recoger una muestra mediante raspado cutneo del
feto, lavando la zona con agua y jabn, desinfectar con alcohol al 70% o un
antisptico adecuado, dejar secar por 2 minutos, con una hoja de bistur, o una
placa portaobjetos, raspar la zona afectada, si hubiese pelos afectados, stos
deben arrancarse desde su raz, con la ayuda de pinzas. Enviar la muestra al
laboratorio (en placa de Petri, sobre de papel o entre dos portaobjetos), sin
refrigerar.

VIROLOGIA
El diagnstico de enfermedades virales puede requerir el envo de muestras
de suero (sangre sin anticoagulante) con el fin de llevar a cabo pruebas
serolgicas, sangre entera (sangre con anticoagulante), exudados y de tejidos
para aislamiento y estudios estructurales.

OTROS LABORATORIOS AUXILIARES DE DIAGNSTICO


Histopatologa: las muestras se colocarn en envases con formol al 10%,
en algunos casos se puede utilizar Bouin, conservando una relacin uno en diez
(una parte de muestra y 9 partes de formol), el formol debe cubrir a la muestra en
su totalidad. Los trozos seleccionados tendrn que contener parte de tejido normal
y parte de tejido afectado, deben ser de 1 x 1cm aproximadamente. Los
recipientes para las muestras deben ser de boca ancha para que puedan salir
ntegras y fcilmente. Las muestras para estudios histopatolgicos no necesitan
refrigeracin y nunca deben congelarse. De acuerdo al caso se destinarn a
estudios histopatolgicos que permitirn poner en evidencia el agente infeccioso
actuante, tanto por su presencia como por su efecto celular, o bien por la
presencia de cuerpos de inclusin intracelulares (citoplasmticos o nucleares).

Toxicologa: las muestras se enviarn refrigeradas y pueden ser:


a) Vegetales txicos: se enviar la planta entera en bolsas de plstico.
b) Vegetales para determinacin de oxalatos o cido cianhdrico, en
este caso congelar inmediatamente de extrada la muestra.
c) rganos o tejidos: la muestra de aproximadamente 200 g se
colocar en bolsas de polietileno.
d) Alimentos: granos, alimento balanceado para la determinacin de
micotoxinas, la muestra es de 200 g y se coloca en bolsas de polietileno.
e) Contenido ruminal o estomacal: 200 a 500 mL en recipiente de vidrio
o plstico.
Bioqumica clnica: las muestras se enviarn refrigeradas y pueden ser
para:
a) Determinacin de desrdenes metablicos (Ca, P, Mg, otros).
Muestra: 20 a 30 mL de suero limpio sin hemlisis.
b) Determinacin de cobre en hgado. Muestra: trozos de 50 g del
rgano en envases bien cerrados y enviar refrigerado.
c) Determinacin de hematocrito, hemoglobina, recuento y frmula.
Muestra: sangre entera con anticoagulante y un frotis realizado en los primeros
15 minutos de extrada la sangre, enviar refrigerado.
d) Determinacin de cuerpos cetnicos, densidad, glucosa, otros.
Muestra: 150 mL de orina con cristales de timol o gotas de formol para evitar la
descomposicin.
e) Determinacin de pH y sales minerales en agua: Muestra: 250 mL de
agua en envase estril.
Hematologa: la muestra es sangre con anticoagulante (EDTA, oxalatos,
citrato de sodio, otros) en la proporcin indicada para cada reactivo.
Parasitologa: para el anlisis de endoparsitos: se remiten muestras de
materia fecal refrigeradas sin ms agregados, siempre que lleguen dentro de las
24 horas al laboratorio, si esto no ocurre se aade formol al 5 %.
Para anlisis de ectoparsitos: pulgas, piojos garrapatas, caros, etc. Se
envan individualmente en alcohol 70 o un raspado de piel, que se coloca en
alcohol 70 .

PREPARACIN Y ENVO DE MUESTRAS


Las muestras deben ser protegidas del posible deterioro luego de
recolectarlas. Se deben acondicionar para prevenir posible oxidacin, secado,
calentamiento, que produzcan un aumento de la actividad enzimtica de la
bacteria o de las clulas y fluidos de la muestra. Por supuesto, el modo ms
eficiente para evitar este deterioro es el envo y procesamiento del material lo ms
rpido posible. Los responsables de la toma de muestra, fundamentalmente en
lugares lejanos a los laboratorios, deben conocer horarios de transportes para

minimizar estos problemas. Tambin es importante avisar al laboratorio receptor el


horario esperado de arribo para acelerar el procesamiento. Una importante
recomendacin es, en lo posible, evitar feriados y si son de urgencia enviar al
principio de semana.
Los medios de transporte bacteriolgicos (Stuart, Amies, agar semislido)
no permiten el crecimiento pero proveen un ambiente hmedo, pH fisiolgico,
potencial reductor que otorgan mayor probabilidad de vida al microorganismo en
trnsito. Existen productos comerciales (Culturette, etc.) que contienen hisopos
descartables con una ampolla fcilmente rompible conteniendo medio de
transporte Stuart. Para el caso de sospecha de agentes anaerobios, se pueden
utilizar medios para anaerobios y en caso de distancias largas se recomienda
sumergir los trozos de rganos en glicerina bufferada pH 7 al 30% estril.
El acondicionamiento seguro de las muestras para el diagnstico
microbiolgico es responsabilidad de todos los involucrados en el proceso: el
profesional, el tcnico de laboratorio y el personal de correos y/o transporte. El
embalaje de materiales infecciosos debe evitar la fuga de los mismos por rotura o
mal empaque del envo. El correcto acondicionamiento de los materiales
infecciosos enviados genera menores riesgos de exposicin accidental tanto para
el personal de laboratorio como para toda persona que entre en contacto durante
el envo. Por otra parte, se asegura que las muestras lleguen en las condiciones
adecuadas lo que redundar en la calidad del estudio que se realice.
Los agentes infecciosos y el material de diagnstico deben ser enviados en
un sistema triple bsico de embalaje de acuerdo a las recomendaciones de la
Organizacin Mundial de la Salud WHO/EMC/97.3.
El sistema consta de tres envases:
1.- Recipiente primario: es un recipiente estanco, a prueba de filtraciones,
etiquetado, que contiene el espcimen (tubo pequeo o vial). Cada muestra debe
ser enviada en recipientes individuales y bien identificada. Entre cada frasco o
recipiente que contenga la muestra, se coloca un material que amortige los
golpes, mantenga fijas las muestras y absorba la humedad (especialmente cuando
se use hielo seco como refrigerante). La parte externa del recipiente debe ser
cuidadosamente examinada y debe limpiarse en caso que haya sangre, materia
fecal u otros contaminantes antes de embalarlo para su envo.
2.- Recipiente secundario: consiste en un segundo recipiente estanco, a prueba de
filtraciones que encierra y protege el/los recipiente/s primario/s. Se pueden colocar
varios recipientes primarios envueltos en un recipiente secundario. Se debe usar
suficiente material absorbente para proteger a todos los recipientes primarios y
evitar los choques entre ellos.
3.- Recipiente terciario o envoltorio externo: el recipiente secundario se coloca en
un paquete de envo que protege su contenido de los elementos externos.
Preferentemente el recipiente debe ser de un material aislante de la temperatura
externa, siendo las ms recomendadas las cajas de telgopor por su bajo peso y
fcil manipulacin. La caja externa se cierra de tal manera que todas las esquinas
y/o tapas queden selladas con cinta adhesiva (aumenta la resistencia del
recipiente y garantiza el aislamiento de las muestras). Si las condiciones lo
permiten, envolver la caja externa con papel empaque, sellar con cinta adhesiva y

colocar con letra grande y clara: Manjese con cuidado. Material biolgico
refrigerado. Flechas u otros smbolos que indiquen la posicin de la caja.
Para armar un sistema de envo se pueden utilizar los envases de toma de
muestra, de reactivos de laboratorio o de alimentos que sean de material
resistente.
Los datos del espcimen, notas y otro tipo de informacin que describan la
muestra, se envan debidamente protegidos, dentro de un sobre y en funda
plstica, entre el recipiente secundario y terciario.

Diagnstico de enfermedades infecciosas

DIAGNSTICO

DIRECTO O ETIOLGICO

INDIRECTO O INMUNOLGICO

Deteccin del agente


etiolgico/toxina

Deteccin de la respuesta inmunolgica


in vivo

Cultivo y aislamiento viral y


bacteriano: en placa y en
tubo. Pruebas bioqumicas
Coloraciones no especficas
y especficas
IFD
ELISA
Frotis/Extendidos
PCR
Microscopa electrnica

HUMORAL

CELULAR

Prueba de
tuberculina
in vitro

SECUNDARIA

PRIMARIA
IFI, ELISA, RIA

AGLUTINACIN (antgeno particulado)

TERCIARIA
Fijacin del complemento,
seroneutralizacin, inhibicin
de la hemaglutinacin

PRECIPITACIN (antgeno soluble)


Inmunodifusin en gel de agar

EN TUBO

EN PLACA

SAT, 2-Mercaptoetanol

BPA

Deteccin
de
interfern
gamma

DIAGNSTICO ETIOLGICO
CULTIVO BACTERIANO
El cultivo es el proceso de crecimiento de microorganismos de una muestra,
potencialmente sospechosa, de un sitio de infeccin (el ambiente in vivo),
aplicando los mtodos de recoleccin de muestras, en un ambiente artificial de
laboratorio (el ambiente in vitro). Una vez que los microorganismos crecen en el
cultivo, en placa o en tubo, la mayora de las poblaciones bacterianas se observan
con facilidad y estn presentes en cantidades suficientes para permitir la
realizacin de pruebas bioqumicas para la identificacin del microorganismo.
AISLAMIENTO VIRAL
Los substratos ms corrientemente empleados para la propagacin de los
virus son los cultivos celulares.
Un cultivo celular es obtenido de explantos de rganos o de embriones de
animales. Estas clulas obtenidas aspticamente se disocian tratndolas con una
enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspensin de clulas
libres as obtenidas se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o
plstico en donde las clulas se adhieren y multiplican formando una fina capa de
clulas que se llama monocapa celular.
Esta monocapa de clulas crece en un medio de cultivo complejo que
contiene albmina, vitaminas, sales, glucosa, y dems, en un sistema buffer. Se
previene la contaminacin adicionndole al medio antibiticos adecuados y en
algunos casos, antifngicos.
Los cultivos celulares en monocapa son los ms usados, aunque hay otros
sistemas (cultivos en suspensin, explantos, cultivos de rganos).
Luego de inoculado, con la muestra sospechosa, el cultivo se incuba a 37C
por un perodo de tiempo variable y esperando la aparicin de efecto citoptico,
toxicidad o degeneracin celular, de acuerdo al virus considerado. El efecto se
observa con microscopio.
Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparacin con
cualquier cambio morfolgico observado en los cultivos inoculados.
El efecto citoptico es la visualizacin de cambios morfolgicos
caractersticos en las clulas inoculadas producidas por la accin del virus sobre el
cultivo celular. Cuando los virus no producen este efecto, se puede recurrir a
tcnicas que ponen en evidencia la presencia de aquel en el cultivo. Las ms
usadas son: hemadsorcin, hemoaglutinacin y tinciones con anticuerpos
monoclonales.

EXAMEN DE MUESTRAS AL MICROSCOPIO. Frotis sanguneos y extendidos.


Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y
segn los colorantes que empleemos durante el proceso, podemos hablar de
diferentes modalidades de tincin.
Examen microscpico directo de las muestras
No se utiliza ningn tipo de colorante. La tcnica consiste en el montaje
directo de la muestra o examen en fresco: las muestras clnicas o de cultivos se
extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observacin
y posteriormente se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del
material. El material que es demasiado espeso puede diluirse con igual volumen
de solucin salina fisiolgica estril para permitir la diferenciacin.
Tincin Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se
tien con la misma tonalidad (tinta china, azul metileno de Loeffler, azul de
lactofenol)
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite visualizar
estructuras de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes
proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos
de las paredes celulares de los hongos.
La tinta china o nigrosina permite observar clulas capsuladas. Los
polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece como un
halo claro alrededor de los microorganismos
Tincin Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se
diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su
propia constitucin qumica. Los ejemplos clsicos son la tincin de Gram y la de
Ziehl-Neelsen.
Los colorantes se utilizan para distinguir diferentes tipos de clulas o para
revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos,
esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, entre
otros.
Los extendidos o frotis realizados sobre un portaobjetos generalmente son
fijados antes de teirlos. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente,
aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos
y alcoholes. Luego se prosigue con el proceso de tincin.

INMUNOFLORESCENCIA (IF)
Es una tcnica utilizada generalmente para la deteccin de molculas
usando Ac marcados con colorantes fluorescentes como el isotiocianato de
fluorescena, la rodamina o la ficoeritrina. Estas sustancias al ser excitadas con
una luz de longitud de onda del rango ultravioleta (190-380nm), emiten luz visible
de longitud de onda mayor que se observa como una fluorescencia amarilloverdosa o anaranjado rojizo, segn se haya empleado isotiocianato o rodamina.
Esta tcnica posee dos variantes: inmunofluorescencia directa e indirecta.

Inmunofluorescencia directa (IFD)


Objetivo: prueba de interaccin primaria que se realiza para detectar antgenos
presentes en una muestra de tejido o clulas de una monocapa infectada
mediante el uso de anticuerpos marcado con una sustancia fluorescente.
Ejemplos: campilobacteriosis genital bovina, carbunclo bacteridiano y
enfermedades clostridiales, rinotraquetis infecciosa bovina, diarrea vrica bovina,
peste porcina clsica. Por medio de esta tcnica tambin es posible detectar el
virus de la rabia en encfalos de animales infectados.

ENZIMAINMUNOENSAYO (EIA)
El enzimoinmunoensayo es una tcnica verstil y muy sensible, que puede
utilizarse para detectar y medir en una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados
que se emplean tienen como marcadores a diversas enzimas. Las enzimas ms
utilizadas son la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la -galactosidasa.
Esta tcnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que
se realiza: cuando es en placa, se denomina ELISA; sobre tejidos,
inmunohistoqumica y sobre clulas, inmunocitoqumica.
ELISA
Existen muchas variantes de ELISA y su diseo depende de lo que se
quiera determinar. Pueden utilizarse para detectar o cuantificar tanto antgenos
como anticuerpos, pueden aplicarse fcilmente a diversos fluidos como leche u
orina, requieren pequeos volmenes de muestra y son relativamente rpidas.
El ELISA se realiza en placas de poliestireno de 96 pocillos y se basa en el
uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima. Al estar uno de los
componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado
sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar
inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un
sustrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable, a simple
vista (cualitativo) o mediante el uso de un espectrofotmetro se puede expresar
como densidad ptica (cuantitativo). En cada placa se colocan controles del
sistema y controles positivos y negativos de absorbancia conocida.
Los ELISA utilizados para detectar antgenos son:
ELISA directo: las placas se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones
en las que se sospecha que se encuentre el antgeno. Luego se coloca el Ac
marcado con una enzima.
ELISA sndwich o de captura: se liga a la placa un anticuerpo monoclonal o
policlonal como captura de antgeno. Se agrega el material sospechoso de
contener al antgeno y luego se aaden anticuerpos especficos antiespecie
marcados con la enzima.

ELISA competitivo: puede utilizarse para determinar la concentracin tanto de Ag


como Ac. El mtodo se basa en la competencia entre el Ag de la muestra y el Ag
marcado con una enzima, por la unin con el Ac de captura. Si el Ag de la muestra
(Ag sin marcar) tiene afinidad por el Ac de captura, desplaza al conjugado (Ag
marcado), que se elimina con los lavados, disminuyendo as la cantidad de enzima
presente en el pocillo y por consiguiente la cantidad de color generado al agregar
la mezcla de sustrato-cromgeno. Cuanto menor sea la intensidad del color
generado, es decir menor absorbancia medida con el espectrofotmetro, mayor
ser la concentracin de Ag en la muestra problema.
Ejemplos de agentes etiolgicos y de antgenos que se detectan por ELISA:
enterotoxina de E. coli, Brucella abortus, toxina tetnica, Vilef (virus de la leucemia
felina), parvovirus, virus de la leucosis bovina, rotavirus, virus de la diarrea vrica
bovina (PI), virus de la fiebre aftosa, virus de anemia infecciosa equina.
Ejemplos de enfermedades en aves que se diagnostican por ELISA: NewCastle,
bronquitis infecciosa, bursitis infecciosa, reovirosis aviar, micoplasmosis,
pasteurelosis, encefalomielitis aviar, leucosis aviar, salmonelosis, anemia de los
pollos.

Inmunohistoqumica (IHQ) e Inmunocitoqumica (ICQ)


Cuando el anlisis se realiza sobre cortes de tejidos o clulas, se denomina
inmunohistoqumica e inmunocitoqumica, respectivamente. Estas pruebas se
realizan sobre tejidos o clulas de manera similar a las IF.
La inmunohistoqumica permite evidenciar la presencia de un Ag especfico
sobre un corte de tejido determinado y ubicar en que estructuras del mismo se
encuentra. Los mtodos de IHQ pueden clasificarse en directos o indirectos. En el
primer caso, el nico Ac a utilizar se encuentra conjugado con la enzima
reconocindose la unin del mismo con el antgeno tras el agregado del sustrato
cromgeno. En el segundo caso, existen distintos mtodos: mtodo de dos pasos
(el Ac primario unido a su Ag es detectado mediante un segundo Ac marcado),
mtodo de tres pasos (se agrega un tercer Ac dirigido contra el Ac secundario),
mtodo de la avidina-biotina (conjugacin del Ac secundario con biotina que
permite la unin especfica con la avidina conjugada con la enzima de inters).
Esta prueba se lee con microscopio ptico, observndose una reaccin positiva
como un precipitado color (de acuerdo al revelador), sobre las estructuras
histolgicas que contengan el antgeno buscado.
Ejemplo: virus de la diarrea vrica bovina (esta prueba puede emplearse
como prueba tamiz para la deteccin de individuos persistentemente infectados
(PI), tuberculosis, deteccin de Lawsonia intracellularis, Campylobacter sp.
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
La reaccin en cadena de la polimerasa conocida como PCR por sus siglas
en ingls (polymerase chain reaction), es una tcnica de biologa molecular que
amplifica un fragmento de ADN de bacterias, virus, animales y humanos, con el
objetivo de aumentar las probabilidades de identificar los mismos.
Desde hace muchos aos se utiliza esta tcnica para investigaciones
cientficas. Actualmente se ha puesto a punto para el diagnstico de rutina de
muchas enfermedades infecciosas.
Ejemplos: toxinas bacterianas, parvovirus, Lawsonia intracellularis.
Microscopa electrnica de transmisin y de barrido
La microscopa electrnica es una tcnica que requiere instrumentos de alta
complejidad y personal altamente especializado.
Si bien su uso se limita exclusivamente a actividades de investigacin, la mayor
utilidad de la microscopa electrnica de transmisin es en oncologa, siendo til
en el diagnstico de neoplasias malignas, ya que permite identificar el tipo y la
diferenciacin de una neoplasia. Para el diagnstico de enfermedades infecciosas
por ejemplo, permite demostrar elementos de diferenciacin no apreciables a
microscopa de luz como desmosomas, que se encuentran alterados en Fiebre
Aftosa. Otras aplicaciones son la identificacin de partculas virales intranucleares
y citoplasmticas, y en enfermedades respiratorias donde se ha detectado

ultraestructuralmente un trastorno importante del transporte mucociliar donde se


observan cilios con alteraciones en nmero y disposicin del esqueleto ciliar
microtubular.
La microscopa electrnica de barrido permite el estudio de superficies celulares.
La imagen se obtiene rastreando la superficie de la muestra y se utiliza en el
estudio de enfermedades del tallo piloso donde existen anomalas estructurales y
de superficie de los pelos, que pueden identificarse fcilmente con esta tcnica.

DIAGNSTICO INMUNOLGICO

INMUNIDAD HUMORAL
Pruebas serolgicas para el diagnstico de enfermedades infecciosas.
Una amplia variedad de enfermedades infecciosas pueden ser
diagnosticadas mediante el empleo de pruebas serolgicas. Para la realizacin de
las mismas pueden tomarse muestras de sangre, plasma seminal, leche, mucus
crvico-vaginal, entre otros lquidos corporales as como lquido torcico o
abdominal.
Para la extraccin de la muestra es imprescindible utilizar materiales limpios
y secos (agujas de calibre adecuado, jeringas, tubos rotulados correctamente,
tapones) para evitar la contaminacin y hemlisis de la misma. Tambin es
importante conocer qu diagnsticos se realizarn para determinar el volumen de
la muestra a tomar.
Las muestras de sangre se colocan en un tubo sin anticoagulante,
preferentemente de vidrio. Se debe esperar la coagulacin y la retraccin del
cogulo, por lo menos 20-30 minutos luego de extrada la muestra. Lo
recomendado es esperar 1-2 horas a temperatura ambiente, cuanto ms tiempo
transcurra para que la retraccin tenga lugar, mayor cantidad de suero se
obtendr, aunque la cantidad de suero nunca ser mayor a un 40% del volumen
original de sangre. Debido a que tanto la coagulacin como la retraccin son
procesos enzimticos, se producirn ms rpido si la sangre se incuba en estufa a
37C durante 1-2 horas y luego se refrigera durante 30 minutos ms. Obtenido el
suero se separar el mismo con ayuda de una pipeta, para su procesamiento
inmediato o su conservacin tanto refrigerado (no ms de 7 das a 4C) o
congelado (-20C) en alcuotas, si se quiere conservar por un mayor perodo de
tiempo. Nunca congelar los sueros con cogulo. El fraccionamiento de la muestra
evitar la desnaturalizacin y agregacin de las protenas resultante de
congelaciones y descongelaciones sucesivas. En caso de utilizar otras muestras
como fuente de anticuerpos, debern conservarse de la misma manera.
El suero o el plasma no debe conservarse por ms de 6 horas en
refrigeracin sin ser separado de los dems componentes sanguneos, ya que
sto trae como consecuencia alteraciones en los diferentes metabolitos de la
sangre a determinar y por lo tanto, errores en los resultados de laboratorio.

La utilizacin de suero est indicada para el diagnstico de la mayora de


las enfermedades infecciosas que cuenten con tcnicas serolgicas
estandarizadas. Para determinadas enfermedades (ejemplos: rinotraquetis
infecciosa bovina, diarrea vrica bovina, leptospirosis) es fundamental efectuar un
doble muestreo con intervalo no inferior a 3 semanas, (muestreo pareado) a fin de
determinar la seroconversin. Se entiende por conversin serolgica, la variacin
en 3 o ms veces el ttulo de anticuerpos entre el primer y segundo muestreo.
Las caractersticas deseables de un suero es que sea translcido e inodoro.
Por lo tanto no deben utilizarse para la realizacin de las pruebas serolgicas
sueros hemolizados o contaminados.

Esquema general del momento ptimo para recoleccin de muestras

Agente

Ac (anticuerpos)
S1

S2

Aislamiento

Das
0

Incubacin

10

Lesiones

25

Convalescencia

S1 y S2: momentos ptimos para la extraccin de muestras para serologa


(muestras pareadas)

Pruebas de interaccin primaria

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)


Objetivo: deteccin de anticuerpos en suero o demostracin e identificacin de
antgenos en tejidos o cultivos celulares. Cuando por IFI deseamos detectar un

anticuerpo, se emplea el antgeno que procede de un frotis tisular, un corte o un


cultivo de tejidos colocado sobre un portaobjetos. Se utiliza como conjugado un
anticuerpo anti-Ig marcado con sustancias fluorescentes para detectar la unin
entre un anticuerpo no marcado con su antgeno especfico.
Ejemplo: moquillo canino.
ELISA
Como se explic anteriormente esta prueba puede utilizarse tanto para
deteccin de Ag como para deteccin de Ac. El ELISA ms comnmente utilizado
para determinar la presencia de Ac en una muestra problema es el ELISA indirecto
que utiliza como conjugado un anticuerpo-antiinmunoglobulina (antiIg) marcado
con una enzima. Para detectar la presencia de este conjugado, se agrega a la
reaccin un sustrato especfico de dicha enzima y un cromgeno que permita
observar la accin de la enzima sobre su sustrato. La intensidad del color es
directamente proporcional a la cantidad de anti-Ig marcada que se haya captado, y
sta a su vez ser proporcional a la cantidad de Ac que se encuentren en la
muestra problema.
Ejemplo: paratuberculosis, anemia infecciosa equina, VIF, salmonelosis
aviar, brucelosis.

Radioinmunoensayo (RIA)
Objetivo: es una prueba de interaccin primaria que utiliza un radioistopo como
marcador del conjugado. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar
concentraciones muy pequeas de una sustancia. Estas pruebas deben ser

ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los potenciales


peligros para la salud y la contaminacin ambiental que supone el manipuleo de
sustancias radiactivas.
Ejemplo: virus de la leucosis bovina.

Inmunoblotting. Western Blot


Objetivo: identificar antgenos o anticuerpos en una muestra de composicin
heterognea. El Western Blot combina la separacin electrofortica de protenas
de una mezcla de acuerdo a su peso molecular, con la deteccin inmunolgica de
Ag individuales mediante el uso de Ac especficos para esos Ag. Tambin se
pueden identificar los anticuerpos generados contra diferentes fracciones de un
patgeno, que componen una respuesta policlonal contra el mismo.
Dada su alta especificidad, el Western Blot se utiliza en muchos casos como
prueba confirmatoria (p.ej: SIDA) y ha probado ser una herramienta muy til para
identificar los Ag ms importantes de microorganismos complejos y parsitos.
Ejemplo: virus de la fiebre aftosa.

Pruebas de interaccin secundaria


AGLUTINACIN
Las pruebas de seroaglutinacin detectan la presencia de los Ac IgM e IgG
a partir de la interaccin entre anticuerpos bivalentes (IgG) o polivalentes (IgM) y
un antgeno en solucin sobre una superficie celular o sobre una partcula. Si los
antgenos son particulados (bacterias, eritrocitos y otros) y estn en suspensin,
aglutinan al unirse a los Ac especficos, producindose un entrecruzamiento entre
determinantes antignicos de partculas adyacentes. La aglutinacin se observa
macroscpicamente en forma de grumos. Los Ac IgM aglutinan ms intensamente
que los IgG ya que al ser molculas pentavalentes, poseen un mayor nmero de
sitios de unin.
Estas pruebas se pueden leer a simple vista: macroaglutinacin o bajo
aumento (microscopio ptico o lupa) microaglutinacin. La interpretacin es
similar para todas las pruebas de aglutinacin:
REACCIN POSITIVA presencia de aglutinado o grumos, indicando que el
antgeno y el anticuerpo se encuentran presentes en la reaccin y se han unido.
REACCIN NEGATIVA ausencia de los mismos.
El ttulo de un suero se determina por la ms alta dilucin que causa un
determinado grado de aglutinacin.
Ejemplo: BPA, 2 mercaptoetanol, SAT.

PRECIPITACIN
Inmunodifusin en gel de agar
Es una prueba de precipitacin cualitativa que se realiza en medio
semislido (gel de agar o agarosa). La tcnica de doble difusin puede utilizarse
para identificar tanto la presencia de antgenos como la de anticuerpos solubles en
los lquidos corporales. Al difundir el antgeno y el anticuerpo en el gel, se pondrn
en contacto y precipitarn formando una banda o halo.
Interpretacin:
REACCIN POSITIVA: formacin de bandas de precipitacin, sueros positivos.
REACCIN NEGATIVA: no se forman bandas de precipitacin en el gel de agar,
sueros negativos.
Ejemplo: para detectar la presencia de anticuerpos contra el virus de la anemia
infecciosa equina (AIE) como prueba oficial de diagnstico de la enfermedad,
tambin denominada test de Coggins; prueba VIA para diagnstico epidemiolgico
de fiebre aftosa, para identificar el ganado infectado con el virus de la leucemia de
los bovinos.

Pruebas de interaccin terciaria


Fijacin de Complemento
Objetivo: se basa en la capacidad del complemento para unirse a los complejos
antgenos-anticuerpo (fijacin). Se puede utilizar esta reaccin para medir las
concentraciones de anticuerpos semicuantitativamente.
La prueba se desarrolla en dos fases, una primera que es una reaccin
antgeno- anticuerpo en un medio lquido y una segunda consistente en la adicin
de complemento, una hemolisina dependiente de complemento y eritrocitos. Si en
la primer fase se ha producido reaccin antgeno- anticuerpo, es decir si el suero
analizado contena anticuerpos frente al antgeno, el complemento queda fijado y
no puede activar la hemlisis de los glbulos rojos. Si el suero no contena
anticuerpos el complemento se une a la hemolisina y lisa los eritrocitos.
Ejemplo: virus de la encefalomielitis equina, virus de la fiebre aftosa, virus de la
estomatitis vesicular, perineumona bovina, pleuroneumona porcina
Pruebas de bloqueo de actividad viral
Estas pruebas detectan anticuerpos sintetizados contra los antgenos
virales, mediante el bloqueo de la accin del virus.
Pruebas de neutralizacin: las pruebas de neutralizacin y en particular las de
neutralizacin vrica, son uno de los estndares habituales para medir los niveles

de inmunidad protectora frente a un patgeno. Normalmente la prueba se realiza


en dos pasos. Primero se incuba el antgeno (patgeno) con el suero del animal a
analizar y luego, la solucin de Ag con el suero, se inocula en un animal o en un
cultivo celular. Si el suero contena anticuerpos neutralizantes, se bloquea la
capacidad infectiva del patgeno y; por lo tanto, no produce la infeccin del animal
o del cultivo. Este mismo sistema puede utilizarse con toxinas o bacterias. Sin
embargo no suele ser til para diferenciar respuestas entre animales infectados y
vacunados ya que la mayora de las vacunas inducen anticuerpos neutralizantes.
Ej.: rinotraquetis infecciosa bovina, fiebre aftosa, diarrea vrica bovina.
Inhibicin de la hemoaglutinacin: se basa en la capacidad de algunos patgenos
para causar la aglutinacin de los eritrocitos de mamferos y de aves. Los
anticuerpos contra dichos patgenos bloquean sus lugares de unin inhibiendo la
aglutinacin de los eritrocitos. La inhibicin de este fenmeno por un anticuerpo se
utiliza tanto como un mtodo para identificar un virus especfico, como para medir
las concentraciones de anticuerpos en el suero. Ejemplo: entre los
microorganismos hemaglutinantes estn los ortomixovirus, paramixovirus, virus
alfa, flavivirus, bunyavirus, algunos adenovirus, reovirus, parvovirus y coronovirus.
Inhibicin de la hemoadsorcin: los cultivos celulares infectados con ciertos tipos
de virus (Orthomixovirus-Paramixovirus) pueden adsorber glbulos rojos en su
superficie por la presencia de protenas virales especficas (hemoaglutininas),
recientemente sintetizadas y que poseen afinidad para la unin a glbulos rojos de
varias especies. Es una tcnica de fcil realizacin y permite detectar infecciones
no citopticas.

INMUNIDAD CELULAR
In vivo
Pruebas de hipersensibilidad tipo 4
Las reacciones de tipo 4 se caracterizan por la sensibilizacin de una
poblacin de las clulas T. En posteriores enfrentamientos con el antgeno esta
poblacin inicia una serie de reacciones inmunolgicas que culminan con el aflujo
de linfocitos y macrfagos al lugar del estmulo antignico. Este aflujo se produce
en un perodo de 24 y 72 h y por ello se denomina frecuentemente
hipersensibilidad retardada.
La reaccin de hipersensibilidad es in vivo. Por ejemplo, en un animal
sensibilizado al Mycobacterium bovis la inyeccin intradrmica de un extracto
purificado de la pared celular bacteriana provocar en el lugar de inyeccin una
reaccin de hipersensibilidad de tipo retardado, presentndose un infiltrado celular
que provocar un engrosamiento drmico.

Esta reaccin inmunolgica no est restringida a las micobacterias y es


tambin caracterstica de la respuesta inmunitaria a otras infecciones bacterianas,
como Brucella, Neisseria, infecciones fngicas como la blastomicosis y un amplio
rango de enfermedades parasitarias, particularmente Schistosoma.
Prueba de tuberculina
Reactivo
Las tuberculinas que deben utilizarse en el diagnstico de la tuberculosis en
animales son:
1. El derivado proteico purificado (PPD) de tuberculina bovina, elaborada
con Mycobacterium bovis (cepa AN5) de 1mg/ml de concentracin.
2. El derivado proteico purificado (PPD) aviar, elaborada con una cepa de
Mycobacterium avium (cepa D4) de 0,5 mg/ml de concentracin.
Las nicas tuberculinas PPD autorizadas en el pas son las elaboradas por
el SENASA y las producidas por los laboratorios particulares que fueron
controladas y aprobadas por este Organismo.
La tuberculina PPD debe ser transportada y conservada en fro (+2 C a +8
C) y protegida de la luz solar directa durante el trabajo de campo. Una vez
utilizado parte del reactivo, el sobrante, si no se va a utilizar en el mismo da, debe
descartarse, no se puede volver a utilizar.
BOVINOS
Las pruebas tuberculnicas que se aplican a bovinos son tres:
1. Prueba ano-caudal de rutina (con PPD bovina) considerada prueba de
rutina.
2. Prueba cervical simple de saneamiento con PPD bovina
3. Prueba cervical comparativa (con PPD bovina y aviar).
Para someter a los mismos animales a un nuevo examen, deben transcurrir un
espacio de tiempo NO menor 60 das desde la ltima prueba
1. Prueba ano-caudal de rutina (con PPD bovina)
Tcnica
La prueba tuberculnica de rutina es intradrmica, aplicada en el tercio
medio del pliegue ano-caudal interno, a unos 6 cm de la base de la cola y en el
centro del pliegue. Antes de la inyeccin se debe medir con el calibre el grosor del
pliegue anocaudal interno. Luego se realiza la inoculacin de 0,1 mL de del
derivado proteico purificado (PPD bovina), previa limpieza de la regin sin usar
sustancias qumicas irritantes. La aguja debe insertarse intradrmicamente en
toda su longitud en las capas superficiales de la piel, retirarla un poco e inyectar la
tuberculina. En una inyeccin bien aplicada aparecer una ppula en el sitio
inoculado.

Lectura
La lectura de las reacciones se har a las 72 h de la inoculacin. Se levanta
la cola hasta estirar ligeramente el pliegue, con el dedo ndice y el pulgar de la otra
mano, se palpa el pliegue para comprobar si hay engrosamiento, tomando la
medida exacta con el calibre. Se registran en el protocolo de tuberculinizacin las
mediciones pre y pos inoculacin y la diferencia entre las mismas, tomndose esta
ltima como valor para su interpretacin.
Ejemplo: pre inoculacin: 2 mm, pos inoculacin: 8mm. Lectura final: 6 mm.
Interpretacin
El profesional que realiza la prueba tuberculnica de rutina en un rodeo
debe actuar con criterio epidemiolgico, tomando en cuenta la totalidad del rodeo
y no interpretar los resultados considerando a los animales aisladamente.
En la primera prueba, cuando se desconoce si el rodeo est infectado o no,
RODEO CON SITUACION DESCONOCIDA, el veterinario acreditado debe aplicar
la tuberculina a:
- todos los bovinos mayores de 3 meses de edad en establecimientos lecheros y
cabaas
- todos los bovinos mayores a 12 meses de edad en establecimientos de carne.
Se aplica el siguiente criterio general:
Negativo: Un engrosamiento menor de tres (3) mm.
Positivo: Un engrosamiento de la piel de cinco (5) mm o mayor.
Sospechoso: Un engrosamiento de tres (3) mm o mayor y menor de cinco (5) mm.
Si todos los animales son negativos se considera RODEO NO
INFECTADO.
Cuando en un rodeo, a la primera prueba solo se encuentran reaccionantes
sospechosos (entre 3 y 5 mm) se considera RODEO SOSPECHOSO. Para
dilucidar su estado se puede optar por remitir los animales sospechosos a
sacrificio y si no se comprueban lesiones macroscpicas tuberculosas en el post
mortem, ni diagnstico positivo histopatolgico y/o bacteriolgico se debe
considerar al rodeo como no infectado. Otra opcin es repetir la prueba anocaudal a los 60 das de la primera, en todos los animales que acusaron reaccin
aplicando los siguientes criterios:
Positivo: si aumenta el tamao de la reaccin.
Negativo: si estos animales presentan una pronunciada reduccin en el tamao de
la reaccin. Se puede considerar el rodeo como no infectado, siempre que en el
grupo no hubiera otro animal reaccionante positivo.
Sospechoso: Si persiste el mismo tamao de la reaccin. Se debe realizar un
tercer examen definitivo a los 60 das del segundo. Esta tercera prueba es
concluyente y todo animal que tuviera una reaccin de 3 mm o mayor debe ser
clasificado reaccionante y el RODEO INFECTADO, a menos que los animales
sospechosos fueran sacrificados y no se comprobara la enfermedad.

Si existen antecedentes de infeccin en el rodeo se considera RODEO


INFECTADO y se debe aplicar un criterio estricto:
Positivo: Un engrosamiento de tres (3) mm o mayor.
Negativo: Un engrosamiento menor a tres (3) mm.
En sistemas productivos de carne: En caso de obtener en el primer diagnstico
un resultado negativo de todos los animales, se debe realizar UNA segunda
prueba tuberculnica, con la supervisin oficial de SENASA, que deber confirmar
el resultado negativo para obtener la certificacin de ESTABLECIMIENTO
OFICIALMENTE LIBRE.
En rodeos lecheros: En caso de obtener en el primer diagnstico un resultado
tuberculnico negativo de todos los animales, se deben realizar DOS pruebas
tuberculnicas con resultados negativos consecutivos, con supervisin oficial de
SENASA, para lograr la certificacin de ESTABLECIMIENTO OFICIALMENTE
LIBRE.
Si en cualquiera de los establecimientos anteriormente nombrados, en el
primer diagnstico da un resultado tuberculnico positivo de algn animal, se
deben repetir las inoculaciones a todos los bovinos con un intervalo mnimo de 60
das y mximo de 90 das hasta obtener DOS resultados negativos consecutivos
en el caso de sistemas productivos de carne y TRES resultados negativos
consecutivos en el caso de rodeos lecheros, luego de esto el productor puede
solicitar a SENASA la certificacin como de ESTABLECIMIENTO OFICIALMENTE
LIBRE.
De no dar resultados negativos los animales positivos deben ser remitidos a
faena.
Los establecimientos en los cuales se ha diagnosticado la enfermedad y el
propietario realiza peridicamente las pruebas diagnsticas y la eliminacin de
reactores hasta obtener el certificado de establecimiento libre se denominan
ESTABLECIMIENTOS EN SANEAMIENTO.
2. Prueba cervical simple
La sensibilidad de esta prueba es superior a la del pliegue ano-caudal, y se
aplica con el fin de obtener una mayor seguridad en la eliminacin de bovinos
infectados, en rodeos en los que ya se ha comprobado la infeccin, como por
ejemplo confirmar luego de 60 das a los animales que reaccionaron en forma
dudosa a la prueba anocaudal.
El lugar de inoculacin es el tercio medio del cuello. Se corta el pelo para
indicar el lugar donde se aplic la inyeccin en un rea de 5 cm de dimetro y se
mide con un calibre el espesor de la piel.
Se inyectan 0,1 mL de PPD bovina en las capas superficiales de la piel
mediante la insercin de la aguja a 45 de la piel en toda su longitud.
La lectura se realiza a las 72 h. Se palpa la zona de inoculacin para ver si
existe induracin y se mide con calibre el espesor de la piel.

Positivo: engrosamiento igual o mayor a 3 mm


Negativo: engrosamiento menor a 3 mm.
3. Prueba cervical comparativa (con PPD bovina y aviar).
Esta prueba se debe utilizar cuando en un establecimiento se detectan con la
prueba ano-caudal, animales sospechosos en un rea en erradicacin o libre.
El lugar de inoculacin es en el tercio medio del cuello. Se corta el pelo para
indicar el lugar donde se aplic la inyeccin en un rea de 5 cm de dimetro para
cada una, a 10 cm del ligamento nucal PPD aviar y a 12 cm por debajo del mismo
PPD bovina y se mide con un calibre el espesor de la piel.
Se inyectan 0,1 mL de PPD aviar y 0,1 mL de PPD bovina en las capas
superficiales de la piel mediante la insercin de la aguja a 45 de la piel en toda su
longitud.
La lectura se realiza a las 72 h. Se palpa la zona de inoculacin para ver si
existe induracin y se mide con calibre el espesor de la piel.
La interpretacin se debe realizar de acuerdo a los siguientes parmetros:
a) Por diferencia de mm anterior y posterior a las inoculaciones se debe
determinar la respuesta final de cada PPD.
b) La interpretacin debe estar basada en el tamao de la respuesta a la
tuberculina bovina comparada con la aviar.
Positivo: aquel animal con 4 mm o ms de respuesta a la PPD bovina que a la
PPD aviar.
Sospechoso: con ms de 2 mm hasta 4 mm de respuesta a la PPD bovina que a
la PPD aviar.
Negativo: con una respuesta igual o menor a 2 mm.
En otras especies
PORCINOS
Los cerdos son susceptibles a la infeccin con Mycobacterium bovis, M.
tuberculosis y M. avium complex (MAC) por lo que en la prueba deben usarse
ambas tuberculinas, PPD de origen bovino y PPD de origen aviar.
Se realiza la prueba en la base de oreja. Si esta regin estuviera
traumatizada o tuviera algn defecto, se pueden hacer las pruebas en los labios
de la vulva de la cerda o en la conjuncin de la piel y mucosa del ano del macho.
Se debe inyectar 0,1 mL de PPD bovino en el lado derecho y 0,1 mL de PPD aviar
en el lado izquierdo.
La lectura se hace a las 48 h. Toda reaccin tisular comprobada por
palpacin se clasifica como reaccionante, debindose anotar si la misma se debe
a tuberculina bovina o aviar.

CAPRINOS
Prueba ano-caudal de rutina (con PPD bovina) o prueba cervical simple
(con PPD bovina). Se siguen las especificaciones del protocolo definido para
bovinos.
OVINOS
Prueba axial comparativa con tuberculinas PPD bovina y PPD aviar, debido
a que los ovinos son tambin susceptibles a la infeccin con M. avium subsp
paratuberculosis.
Se inocula 0,1 mL de PPD bovina en la axila derecha y 0,1 mL de PPD
aviar en la axila izquierda. La lectura se realiza a las 72 hs por palpacin y medida
con el calibre. La interpretacin se realiza de acuerdo a lo establecido para la
prueba cervical comparativa de los bovinos.
AVES
Las aves son susceptibles solamente al Mycobacterium avium por lo que en
esta prueba se utiliza exclusivamente PPD aviar. El reactivo se inyecta va
intradrmica en una de la barbillas, la dosis es de 0,05 mL. La lectura se realiza a
las 48 h de aplicada la inyeccin y toda edematizacin de la barbilla se interpreta
como reaccin positiva.

In vitro
Prueba de interfern gamma
Es una prueba diseada para detectar gamma interfern biolgicamente
activo, en el plasma bovino para el diagnstico de tuberculosis a partir de
muestras de sangre. Los animales infectados con Mycobacterium bovis tienen
linfocitos circulantes sensibilizados a los antgenos micobacterianos. stos podran
responder in vitro a la estimulacin con tuberculina PPD secretando gamma
interfern, la que puede detectarse por esa prueba. Los linfocitos de animales no
infectados no responden a la produccin de gamma interfern y de ah que la
deteccin de la misma se correlaciona con la enfermedad.
Otra aplicacin de este sistema para demostrar in vitro inmunidad mediada
por clulas incluye el diagnstico de otra enfermedad causada por Mycobacterium
que es la enfermedad de Johne, conocida como Paratuberculosis. Se ha
demostrado que el ganado infectado con Mycobacterium paratuberculosis puede
identificarse detectando gamma interfern en el plasma recogido a partir de
sangre cultivada con Johnina PPD como antgeno estimulante.
La prueba da gamma interfern provoca la estimulacin de las clulas T
previamente sensibilizadas por la infeccin con Mycobacterium bovis.

Para esta prueba se incuban pequeas cantidades de sangre entera


heparinizada con antgeno de PPD. Despus de 24 horas de incubacin se elimina
el plasma y se prueba para gamma interfern usando un anticuerpo monoclonal
de enzima inmuno ensayo.
Pruebas a campo realizadas en Australia durante 1989 y 1990 sobre 10.000
bovinos demostraron que el ensayo es significativamente ms sensible y
especfico que la prueba de tuberculina sobre la piel.
Se puede realizar repetidas veces sobre animales sospechosos sin tener
que esperar 60-90 das como en el caso de la tuberculina, y adems los animales
pueden analizarse todas las veces que sea necesario. Adems se evita la
interpretacin subjetiva de la lectura de la prueba drmica.
Es importante tener en cuenta que para realizar la prueba de gamma
interfern los animales no se hayan sometido a la prueba intradrmica en los
ltimos 60 das. Las muestras de sangre se deben colocar en tubos heparinizados
y transportarse a temperatura ambiente, debindose procesar dentro de las 16
horas siguientes a su obtencin.

ACTIVIDAD
1- a) Indique qu pruebas para diagnstico etiolgico observ durante el prctico.
b) Esquematice los resultados observados.
c) Explique la interpretacin de la misma.
2- a) Indique qu pruebas de aglutinacin observ durante el prctico.
b) Esquematice los resultados observados.
c) Explique la interpretacin de la misma.
3- a) Indique qu pruebas de precipitacin observ durante el prctico.
b) Esquematice los resultados observados.
c) Explique la interpretacin de la misma.
4- a) Indique qu coloraciones observ al microscopio.
b) Esquematice lo observado.