PRACTICA N9

NUMERACIN E IDENTIFICACIN DE Staphylococcus aureus

I.

INTRODUCCION
Staphilococcus aureus, es un microorganismo Gram (+), anaerobio facultativo y se
halla ampliamente distribuido en carnes, leches, quesos y ambientes naturales como
suelo, polvo, aire, etc. Es altamente vulnerable a la destruccin por tratamiento
trmico y a casi todos los agentes sanitizantes. As la presencia de esta bacteria o sus
enterotoxinas en alimentos procesados o en equipos de procesamiento de
alimentos generalmente es un indicador de una sanidad deficiente.
Los alimentos se examinan para determinar la presencia de S. aureus a fin de
confirmar que ste es el agente causante de enfermedades transmitidas por
alimentos. Las conclusiones deben de tratarse con mucho cuidado. La presencia de
una gran cantidad de S. aureus en los alimentos puede indicar una manipulacin o
condiciones sanitarias deficientes. Sin embargo, no es suficiente evidencia para
aseverar que un alimento sea la causa de envenenamiento. Se debe demostrar que S.
aureus aislado produce enterotoxinas. Las cepas del gnero Staphylococcus que
producen intoxicacin alimentaria pertenecen a la especie Staphylococcus aureus,
casi todas las cepas de esta especie elaboran una enzima denominada coagulasa, de
all que una de las principales pruebas para determinar la presencia de esta bacteria
es la coagulasa utilizando plasma de conejo.
La presencia en los alimentos de nmeros mayores de 104 clulas de S.aureus por
gramo, pueden producir cantidades suficientes de enterotoxina (1ng/g) de forma que
desencadenen intoxicacin por estafilococos en los consumidores.
Los alimentos cocidos, cuando se vuelven a contaminar mediante una manipulacin
inadecuada, promueven la fcil multiplicacin de S. aureus, especialmente a la
escasa competencia microbiana que resulta de la coccin.
Los alimentos producidos o almacenados de forma inapropiada han estado
vinculados frecuentemente con brotes de intoxicacin por estafilococos. Los
reportes indican que la contaminacin del alimento ocurre despus de la coccin,
dado que la bacteria se halla en nmeros mayores y raras veces iguales a las dosis
infectante.
Los alimentos contaminados son principalmente productos de confitera, dulces y
bocadillos as como tambin pasteles de crema, natillas ya que tienen presin

osmtica alta por su contenido de azcar y tambin por presentar zonas de escasa
humedad que siguen siendo adecuadas para el crecimiento de estafilococos.
Otro alimento de alto riesgo es el jamn que contiene muchas sales como
conservantes o saborizantes, estos aditivos para el curado inhiben ms a los
microorganismos competidores que a los estafilococos.
En trminos generales, se espera que los estafilococos vivan, al menos en nmero
escaso en cualquier alimento de origen animal o en aquellos que son manipulados
directamente por las personas, a no ser que se apliquen fases de tratamiento trmico
para llevar a cabo su destruccin.
II.

III.

OBJETIVOS
Conocer los procedimientos para un anlisis de numeracin de
Staphylococcus.
Determinar cuntos microorganismos hay en la muestra
Determinar la presencia o no de la toxina (entetotoxinas).
Valorar el manipulo del alimento
Determinar la presencia de Staphylococcus aureus de muestras de queso.

MATERIALES
Material biolgico
Queso fresco.

Material de laboratorio
Diluyentes

Agua peptonada + Citrato de sodio al 2%.

Medios de cultivo
Agar Baird Parker (yema de huevo + telurito de potasio)
Medio DNAsa.
Otros

Tubos de ensayo de dilucin

Frascos estriles.
Placas Petri
Pipetas estriles de 10mL y 1mL
Asa bacteriolgica, gradillas, mechero, algodn y alcohol.

IV. PROCEDIMIENTO

1. Dilucin de la muestra: se pesan 3 gramos de queso y se coloca en un frasco

pequeo luego se agrega agua peptonada con citrato de sodio al 2% la finalidad
es hacer una dilucin 10-1.

Muestra: Queso fresco

Lugar: Mercado
Lambayeque
Fecha: 02/02/15
Hora: 8:00 am

2. Luego se toma 1mL de esta dilucin y se inocula a un tubo con 9mL de

diluyente para hacer una dilucin 10-2.

De la dilucin 10-2 se toma 1mL y se inocula a un tubo con 9mL de diluyente

para hacer una dilucin 10-3.

3. De las diluciones se sembraran por duplicado en placas Petri que contengan

agar Baird Parker por el mtodo en siembra en superficie, colocando 0,1 mL de
inoculo y distribuyndolo cualitativamente con el asa de Drigalsky por toda la
superficie.

4. Incubacin: 35 - 37C durante 24 - 48 horas.

5. Lectura: colonias negras brillantes de margen estrecho y blanco de tamao

mediano, rodeadas de reas claras que se extienden en el medio opaco. La
probabilidad de que estas colonias correspondan a S. aureus es muy elevada.
6. Realizar tinciones de Gram.
7. Realizar el recuento de las colonias caractersticas. Elegir placas que contengas
entre 20 a 200 colonias.
8. Confirmar la presencia de S. aureus realizando prueba de coagulasa y de
termonucleasa.
o Prueba de coagulasa: se incuba en un tubo con caldo nutritivo una azada
con muestra de la colonia caracterstica o sospechosa. Luego de 18 horas
de incubacin colocar 0.5mL de cultivo en 0.5ml de plasma sanguneo.
Lectura: cada 30 minutos durante 24 horas. La positividad se indica por la
coagulacin del medio lo que indica que el microorganismo produce la
enzima coagulasa.
o Prueba de termonucleasa: se ha comprobado que existe una estrecha
relacin entre produccin de termonucleasa y enterotoxina estafiloccicas.
Calentar la cepa del supuesto S. aureus a 98C durante 10 minutos.
Enfriar.la muestra asi tratada se centrifuga a 27 000 rpm durante 20
minutos o a 7 500 rpm durante 45 minutos. El sobrenadante se utiliza para
la prueba de termonucleasa.

En placas de Petri, se vierten, aspticamente, 5ml de agar DNasa-azul de

toluidina. Una vez solidificado el medio, se hacen pocillos de 3mm de
dimetro. Con pipeta Pasteur, se llenan los pocillos con el sobrenadante del
centrifugado de la muestra. Incubar, sin invertir las placas a 45C durante
2-4 horas. Pasado este tiempo, se vierte sobre la superficie del medio
solucin de azul de toluidina. En caso positivo, aparecen zonas rosadas
alrededor de los pocillos.
Se hacen tinciones

Lectura: colonias negras, borde blanco, halo transparente, medianas

Confirmar: pruebas de coagulasa y termonucleasa.

IV.

RESULTADOS
Despus de la incubacin de 24 48 horas se tuvo los siguientes resultados:

10-1

10-2

10-3

A las 48 horas de
incubacin se obtuvieron
colonias caractersticas
de S. aureus en mayor
cantidad en las placas
sembradas con la
dilucin 10-1.

Se realiza el clculo de la siguiente manera:

1. Calcular el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o ml,
multiplicando el nmero de colonias en la placa por el factor de dilucin.
Cuando la prueba es negativa se expresa como <10 UFC/g ml.
Cuando la prueba es positiva se multiplica el nmero de colonias por el factor
de dilucin.
Computo del recuento estndar en placa
Recuento por
duplicado
(48horas)

Promedio

Dilucin

Crecimiento

10-1

Colonias negras con

halo

Incontables

---

Colonias negras con

halo

320/412

366

Colonias negras con

halo

128/192

155

10-2
10-3

Computo del estimado del recuento estndar en placa.

Para el mtodo en superficie solo se sembr una placa por cada dilucin.
Realizamos el clculo con la placa que obtuvo el nmero de colonias ms
aceptable, correspondiente a la dilucin 10-3. Se debe tomar en cuenta que el
inculo es de 0.1ml.
15.5 x 10-4 ufc/gr
Con la tincin de Gram se pudo observar los cocos en racimos que caracteriza a
Staphylococcus aureus.

100
0x

Prueba
de
se realiza esta
caracterstica.

Coagulasa y Catalasa:
prueba a una colonia

Lectura:
Las pruebas resultaron
positivas, es decir, se
confirma que es
S. aureus

Se logr aislar Staphylococcus aureus

V.

CONCLUSIONES:
Logramos identificar Staphylococcus aureus a travs de la prueba de la
coagulasa.
Determinamos que la prueba de coagulasa es de (++)

 Se determin el nmero de Staphylococcus aureus viables a travs del mtodo

de siembra en superficie y utilizando el mtodo de recuento en placa.
En este anlisis se lleg a la conclusin de que la muestra de queso colectada
del Mercado de Lambayeque se obtuvo por el mtodo de siembra en superficie
15.5 x 104 Ufc / mL , con lo que se determina que la muestra si es apta para el
consumo humano.

VI.

CUESTIONARIO:
En que otros alimentos se investigan a S. aureus.
El hbito de tocarse con las manos la cara, mientras se elaboran productos
alimenticios, incrementa el riesgo de contaminacin con el microorganismo. En
todos los brotes se ha comprobado que los manejadores de alimentos tenan lesiones
en la piel y fue aislada la misma cepa enterotoxignica de Staphylococcus aureus de
la nariz de stos y de los alimentos involucrados.
Para que un alimento pueda ser involucrado en un brote de intoxicacin alimentaria,
ste debe ser un buen medio de cultivo que permita el crecimiento del estafilococo y
permanecer cierto tiempo en condiciones adecuadas de temperatura, que permitan el
desarrollo y produccin de las enterotoxinas. Por ejemplo, en algunos productos
vegetales cocidos, Staphylococcus aureus crece bien, ya que en productos crudos el
microorganismo es inhibido por la biota normal. Existen reportes ocasionales de
brotes donde se involucraron productos vegetales cocidos y papas fritas. Productos
enlatados como duraznos, hongos, jamn y sardinas contaminados antes de ser
sometidos al proceso de enlatado, tambin han ocasionado brotes. Alimentos
fermentados elaborados a partir de carne, leche y vegetales, as como productos
deshidratados y de pastelera, se han reportado como responsables de brotes.
Donde se debe investigar ms a S. aureus y que pruebas se utilizan?
El hombre es la fuente ms importante de los estafilococos y es el principal
reservorio. Los animales tambin los albergan y sirven como reservorios, siendo los
bovinos los ms importantes, ya que en ellos puede provocar mastitis. La fuente
principal de Staphylococcus aureus es la nariz del humano, aunque tambin se
encuentra en la piel, heridas infectadas, quemaduras, tracto urogenital y
gastrointestinal, y en casi todo el cuerpo y sus secreciones. En alimentos
involucrados en brotes se ha determinado que los manejadores de alimentos son la

principal fuente de contaminacin de Staphylococcus aureus, aunque no en todos

los casos ha sido posible determinar la fuente de contaminacin.
La determinacin de la fuente de contaminacin se puede hacer de dos maneras:
1. Identificando el fago de las cepas de Staphylococcus aureus, ya que la mayora
de las cepas responsables de la intoxicacin alimentaria (productoras de
enterotoxina) pertenecen a los serotipos del grupo fgico III, de modo que la
diseminacin puede investigarse mejor que si pertenecieran a grupos fgicos muy
diferentes.
2. Determinando el tipo de toxina producida por los Staphylococcus aureus aislados
de los alimentos, en comparacin con las producidas por cepas de Staphylococcus
aureus aisladas de las posibles fuentes de contaminacin (manipuladores
principalmente), ya que al haber coincidencia en el tipo de toxina producida, puede
pensarse que tuvieron el mismo origen. Este ltimo mtodo es el utilizado con ms
frecuencia en Mxico.
Fundamentar la Prueba de Termonucleasa.
La deteccin de la desoxirribonucleasa termoestable estafiloccica (termonucleasa)
en los alimentos, se utiliza como una prueba indirecta de la presencia de grandes
cantidades de Staphylococcus aureus en los alimentos, as como de la posible
formacin de enterotoxina estafiloccica.
Esta prueba se fundamenta en la reaccin que se produce por una enzima nucleasa
sintetizada por cepas patgenas de Staphylococcus aureus en un medio de DNA
azul de toluidina. Entonces lo que ocurre es que la termonucleasa ataca al DNA
presente en el medio degradndolo. El producto resultante genera un cambio de pH
el cual hace reaccionar al azul de toluidina presente en el medio, generando un halo
rosado alrededor del pozo de siembra en el medio azulado. La produccin de esta
enzima se inhibe en anaerobiosis y se estimula por la presencia de oxgeno, requiere
iones calcio para su actividad enzimtica, posee un pH ptimo de 8,6 y se precipita
de cultivos fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad (resiste temperatura
de 130 C por 16,6 min) es la nica asociacin con el crecimiento de S. aureus. Esta
relacin ha motivado el desarrollo de diferentes mtodos para detectar esta enzima
en el alimento y utilizarla como pesquisaje en los alimentos susceptibles a la
contaminacin de S. aureus.
Fundamente el color negro de las colonias y la formacin del halo en el medio
Baird Parker.

Agar Baird-Parker o tambin denominado agar huevo-telurito-glicina-piruvato

(ETGPA), es un medio moderadamente selectivo y de diferenciacin para el
aislamiento y recuento de Staphylococcus aureus en alimentos, muestras
ambientales y clnicas.
Es un medio que utiliza la capacidad de los estafilococos de reducir el telurito a
telurio y detectar la lecitinasa a partir
de la lecitina del huevo. Adems,
contiene las fuentes de carbono y
nitrgeno
necesarias
para
el
crecimiento del microorganismo. La
glicina, el cloruro de litio y el telurito
potsico
actan
como
agentes
selectivos. La yema de huevo constituye el
sustrato para determinar la produccin de
lecitinasa y, adems, la actividad de lipasa. Los estafilococos producen colonias de
color de gris oscuro a negro debido a la reduccin del telurito; los estafilococos que
producen lecitinasa descomponen la yema de huevo y crean zonas transparentes
alrededor de las colonias correspondientes. Es posible que se forme una zona de
precipitacin debido a la actividad de lipasa.
Los estafilococos coagulasa positivos (Staphylococcus aureus) producen colonias
brillantes, convexas, de color gris oscuro a negro, con o sin una zona opaca
alrededor de las colonias. Los estafilococos con resultado negativo a la coagulasa
producen crecimiento dbil o nulo, con colonias de color gris a negro,
habitualmente sin zonas transparentes ni opacas. A menudo se inhiben los
organismos diferentes de los estafilococos. Si se produce crecimiento, las colonias
pueden adquirir un color de marrn a gris o volverse incoloras, sin zonas
transparentes ni opacas. La identificacin presuntiva que se obtiene de este medio
debe confirmarse con pruebas adicionales.

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS BIBLIOGRAFIA

Pascual M. y V. Caldern. 2000. Microbiologa Alimentaria: metodologa
analtica para alimentos y bebidas. Editorial Daz de Santos. Segunda
edicin. Madrid-Espaa.

 James M. Jay. 2002. Microbiologa moderna de los alimentos. Editorial

Acribia S.A. Cuarta edicin. Zaragoza-Espaa.
Direccin general de Salud Ambiental (DIGESA). Manual de Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2001. Lima-Per.
Jay J. M.; 2000; Microbiologa Moderna de los Alimentos; 4ta edicin;
Editorial Acribia; Zaragoza; Espaa.