PRACTICA N 10

INVESTIGACIN DE Listeria monocytogenes

I.

INTRODUCCIN
Listeria monocytogenes, es un bacilo Gram positivo, no esporulado de 1,0 - 2,0 de
largo x 0,5 u de dimetro, son muy mviles, tienen de 1 a 5 flagelo peritricos lo cual
les confiere una movilidad caracterstica en tumbos y un desarrollo en paraguas
cuando se cultiva a 25C. El gnero se puede diferenciarse fcilmente a base de su
B hemolisis y la fermentacin de manitol, ramnosa y xilosa; desarrollan a 37C,
pero pueden sobrevivir a temperaturas extremas de -4C y 50C. Es sensible a la
desecacin y a pH bajo, es sensible a la cloracin del agua y a la pasteurizacin.
Requiere un AW mnimo de 0.93.
Muchas de las caractersticas exclusivas de Listeria hacen que sea un
microorganismo difcil de controlar en los alimentos; puede desarrollar en un
amplio rango de temperaturas y pH, sobrevive a la congelacin y es relativamente
resistente a la temperatura. Listeria es comensal en el tracto gastrointestinal de
bovinos, caprinos y equinos. Se ha comprobado que personas infectadas pueden
eliminar Listeria durante su enfermedad y periodo de convalecencia.
En leches con alto grado de contaminacin algunas clulas pueden permanecer
viables. Desarrolla en alimentos mantenidos a temperatura ambiente y en
condiciones de refrigeracin. El modo de transmisin es por contacto directo con
animales portadores o sus carcasas contaminadas, por ingestin de alimentos y
aguas contaminadas y por contacto directo con tejidos de animales infectados. El
gnero y en especial Listeria monocytogenes tiene una gran importancia en la salud
pblica y es necesario su deteccin e identificacin en los alimentos con fines de
vigilancia, monitoreo y diagnstico.

II.

OBJETIVOS
Determinar e identificar gnero Listeria a partir de leche.
Realizar una evaluacin de cuanto es el riesgo de infeccin en la muestra
por la bacteria.
El riesgo que se corre al consumir leche contaminada con Listeria.

III.

MATERIALES
Muestra biolgica:
Leche fresco
Materiales de laboratorio
Medios de cultivo

IV.

Agar listeria
Cado de enriquecimiento para Listeria

Frasco pequeo esterilizado

Tubos de ensayo de dilucin.
Placas Petri
Pipetas estriles de 10mL y 1mL
Asa bacteriolgica
Gradillas
Estufa.
Mecheros, algodn, alcohol

PROCEDIMIENTO
PASO 1:
pre-enriquecimiento

Medio LEB sea

medio de preenriquecimiento

En un frasco
estril colocar
25ml de leche
fresca.

Agregar 225ml caldo

de enriquecimiento
para Listeria. Llevar a
incubar por 4h a 37C.

Luego se le agrega al
medio suplemento
selectivo para caldo
LEB y se incuba a
37C por 24h

PASO 2: SIEMBRA EN PLACA (medio selectivo, agar listeria)

V.

Luego del enriquecimiento, se lleva a sembrar en placa, mtodo en

superficie por estra.

Lectura: En iluminacin oblicua, colonias pequeas, borde ntido,

ligeramente abombadas, con superficie lisa (brillante), tornasoladas, azul
verdosas, centro poco transparente o verde amarillento (se puede confundir
con Enterococcus).

Realizar prueba de CAMP, positivo para listeria.

RESULTADOS
De las observaciones:

ENRIQUECIMIENTO:
Se observ turbidez del frasco de
enriquecimiento.

SIEMBRA EN PLACA:
Se obtuvo el siguiente resultado:

Se encontraron colonias caractersticas del Gnero Listeria.

Se le realizo tincin Gram y se pudo observar bacterias de Listeria
VI.

VII.

CONCLUSIONES
De la muestra analizada se concluye que la muestra presentaba listeria por
tanto no es apto para el consumo humano.
Se determina que la muestra analizada est contaminada con Listeria
CUESTIONARIO

Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP)

Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de coleccin de S. aureus
y R. equi:
Staphylococcus aureus
Rhodococcus equi
ATCC 49444 ATCC 6339
NCTC 7428 NCTC 1621
ATCC 25923
CIP 5710
Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas
colecciones nacionales e internacionales.
En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estra de la cepa de S. aureus y,
paralelamente una de R. equi, separadas lo suficiente para que entre stas se puedan
estriar perpendicularmente las cepas sospechosas de Listeria, sin que lleguen a
tocarse (aproximadamente 5 mm de separacin). Despus de 24 y 48 h de
incubacin a 35C observar el sinergismo entre las hemolisinas de S. aureus, R. equi
y Listeria que se manifiesta como una zona hemoltica ms intensa.

La figura, muestra la disposicin de las estras de los cultivos en una placa para la
prueba de CAMP. La hemlisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se incrementa
cerca de la estra de S. aureus, y la hemlisis de L. ivanovii se aumenta cerca de la
estra de R. equi. Las especies restantes no son hemolticas en esta prueba.
Diseo de la inoculacin en placas de agar sangre de carnero. Las lneas
horizontales representan las estras de la inoculacin de cinco cepas. Las lneas
verticales representan las estras de inoculacin de S. aureus (S) y R. equi (R). Las
lneas sombreadas indican el incremento de hemlisis en esas regiones.
Cmo se observan las colonias en Medio Oxford?
Despus de la incubacin, se registran el crecimiento de microorganismos. La
mayora de las cepas de L. monocytogenes y otras Listeria spp. forman colonias

blancas de aproximadamente 1mm de dimetro que est rodeado de un halo negro

tras pasar 24 horas. Despus de 48 horas, estas colonias tpicamente tienen un
dimetro de 2-3mm, permaneciendo negras con un halo negro, pero desarrollando
un centro hundido. La caracterstica de ennegrecimiento es causada por la reaccin
positiva a la asculina exhibida por Listeria spp.

Mtodos normalizados para Listeria.

Un mtodo basado en las Normas ISO correspondientes para Salmonella (EN/ISO
6579) y Listeria monocytogenes (EN/ISO 11290-2), u otros mtodos, siempre que
estn validados con respecto al mtodo de referencia establecido, debiendo estar
registrados, certificados por terceros conforme al protocolo de la norma EN/ISO
16140 u otros protocolos similares internacionalmente aceptados.
Listeria ISO 11290 Listeria ISO 11290-1/2
monocytogenes).

VIII.

(Deteccin y recuento de L.

BIBLIOGRAFIA
Pascual M. y V. Caldern. 2000. Microbiologa Alimentaria: metodologa analtica
para alimentos y bebidas. Editorial Daz de Santos. Segunda edicin. MadridEspaa.
James M. Jay. 2002. Microbiologa moderna de los alimentos. Editorial Acribia S.A.
Cuarta edicin. Zaragoza-Espaa.
Direccin general de Salud Ambiental (DIGESA). Manual de Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 2001. Lima-Per.