Estudio Químico Computacional Sobre La Formación Del Intermediario L-THDP en El Ciclo Catalítico de La Enzima Acetohidroxi Sintasa

Universidad de Concepcin
Facultad de Ciencias Qumicas

Departamento de Fsico Qumica
Grupo de Qumica Biolgica y Computacional
Estudio qumico computacional sobre la

formacin del intermediario LThDP en el
ciclo cataltico de la enzima acetohidroxi
sintasa
Tesis para optar al grado acadmico de Licenciado en Qumica y al

ttulo profesional de Qumico
Omar Blas Alvarado Carripn
Concepcin, Octubre del 2012
Resumen
El cido acetohidroxi sintasa (AHAS) es una enzima tiamina dependiente que
cataliza los primeros pasos de la ruta biosinttica de los aminocidos de cadena
ramificada valina, leucina e isoleucina. Esta enzima se encuentra en plantas, hongos
y bacterias por lo que es el principal blanco de accin de herbicidas, fungicidas y
agentes antimicrobianos. El ciclo cataltico de la AHAS est constituido por cuatro
pasos principales. En el primer paso el intermediario iluro realiza un ataque
nucleoflico sobre una molcula de piruvato para dar paso a la formacin del
intermediario (2S)2LactilThDP (LThDP). La formacin de este intermediario
necesita adems la presencia de un hidrgeno el cual en la AHAS es de
procedencia desconocida, debido a la inexistencia de grupos ionizables cercanos a
las zonas del sitio activo de la enzima. Por este motivo en la presente tesis se
estudi el mecanismo de reaccin para la formacin del LThDP, postulando que
el grupo encargado de promover la transferencia protnica es el grupo amino del
anillo de pirimidina cuando este se encuentra bajo la forma APH. Para ello se
realiz una exploracin de la superficie de energa potencial (SEP) de la reaccin
considerando a los sustratos aislados en fase gas. Adems se realizaron clculos de
las funciones de Fukui para el sustrato piruvato, para el estado de transicin y para
el intermediario iluro bajo las formas AP y APH con el fin de contrastar la
reactividad de ambas formas tautomericas. Por ltimo se realizaron clculos
termodinmicos utilizando medios de distintas constante dielctrica, con el
propsito de verificar la estabilidad de formacin del intermediario iluro bajo la
forma APH debido a la protonacin
del anillo pirimidnico por parte del
aminocido glutamato. Los clculos computacionales se realizaron con el paquete

computacional GAUSSIAN 03, empleando la teora de los funcionales de densidad
(DFT) a nivel B3LYP/631++G(d,p) para la exploracin de la SEP y B3LYP(C
PCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) para los clculos termodinmicos, en
tanto los estudios de reactividad se realizaron con el paquete computacional Jaguar
7.7, empleando B3LYP/631++G(d,p). Los resultados obtenidos indicaron que la
formacin del LThDP ocurre de manera concertada, mostrando una barrera de
activacin de aproximadamente 21 Kcal/mol. Adems se observ que es el iluro
bajo la forma AP quien realiza el ataque nucleoflico sobre la molcula de piruvato.
Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin
Abstract
Acetohydroxy acid synthase (AHAS) is a thiaminedependent enzyme that catalyzes
the first steps in the biosynthetic pathway of branched chain amino acids valine,
leucine and isoleucine. This enzyme is found in plants, fungi and bacteria making it
the main target of action of herbicides, fungicides and antimicrobial agents. The
catalytic cycle of AHAS consists of four main steps. In the first step the
intermediate ylide performs a nucleophilic attack on a molecule of pyruvate to
make way for the formation of the intermediate (2S)2lactylThDP (LThDP). The
formation of this intermediate also needs the presence of a hydrogen which is of
unknown origin in the AHAS, due to the absence of ionizable groups in the active
site of the enzyme. For this reason in this thesis studied the reaction mechanism for
the formation of LThDP, postulating that the group responsible for the
protonation is the amino group of the pyrimidine ring when the form is APH. In
order to validate this hypothesis, the potential energy surface (PES) was explored
considering the reaction between isolated substrates in gaseous phase. Furthermore,
Fukui function calculations were performed for the substrate pyruvate, for the
transition state and for the intermediate ylide under the forms and AP and APHin
order to compare the reactivity of both tautomeric forms. Finally thermodynamic
calculations were performed using different dielectric media, in order to verify the
stability of the intermediate ylide formation under the form APH owing to
protonation of the pyrimidine ring by the amino acid glutamate. The computations
were performed using the GAUSSIAN 03 software package, using the density
functional theory (DFT) at B3LYP/631++G(d,p) for the exploration of the SEP
and B3LYP(CPCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) for thermodynamic
calculations, while reactivity studies were performed using the software package
Jaguar 7.7 employing B3LYP/631++G(d,p). The results obtained indicated that the
formation of LThDP occurs in a concerted way, showing an activation barrier of
approximately 21 Kcal / mol. Also was observed that the ylide in the AP form is
responsible for the nucleophilic attack on the molecule of pyruvate.
ii
ndice general
CAPITULO 1: Introduccin..1
1.2 Propuestas de investigacin ................................................................................... 6
1.3 Propuestas de investigacin ................................................................................. 11
1.4 Hiptesis y objetivos del trabajo de tesis ............................................................ 13
1.4.1 Hiptesis .............................................................................................. 13
1.4.2 Objetivos .............................................................................................. 13
CAPITULO 2: Metodologa..................................................................................... 14
2.1 Construccin de la SEP con los sustratos aislados ............................................ 15
2.2 Clculos de reactividad ....................................................................................... 17
2.3 Clculos termodinmicos ................................................................................... 18
2.3.1 Clculos en fase gas ............................................................................. 18
2.3.2 Clculos en solucin ............................................................................ 19
CAPITULO 3: Resultados y discusin .................................................................... 20
3.1 Exploracin de la SEP con los sustratos aislados .............................................. 21
3.1.1 SEP a nivel semiempirico ................................................................... 21
3.1.2 Correccin DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p) ................ 28
3.1.3 Optimizacin de los puntos crticos de SEP DFT al nivel B3LYP/6
31++G(d,p) .................................................................................................... 30
3.2 Estudio de reactividad ........................................................................................ 36
3.3 Anlisis termodinmico ...................................................................................... 39
CAPITULO 4: Conclusiones y proyecciones ......................................................... 41
4.1 Conclusiones ....................................................................................................... 42
4.2 Proyecciones ....................................................................................................... 43
Bibliografa ................................................................................................................ 44
iii
ndice de figuras
Figura 1: sntesis de (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2hidroxibutirato................... 6
Figura 2: estructura del cofactor tiamina difosfato con diedrosp yT .................. 7
Figura 3: mecanismo de protonacin del cofactor ThDP correspondiente a las
etapas de activacin del cofactor para formacin del intermediario Iluro ................ 8
Figura 4: estructura del cofactor FAD, las unidades de riboflavina, adenina, ribosa y
el grupo difosfato ......................................................................................................... 9
Figura 5: ciclo cataltico de la enzima AHAS reportado en literatura ..................... 10
Figura 6: mecanismo de formacin del intermediario LThDP en literatura ......... 12
Figura 7: mecanismo postulado para la formacin del intermediario LThDP ............... 12
Figura 8: coordenadas de reaccin para exploracin de SEP en la formacin del
intermediario LThDP............................................................................................... 15
Figura 9: equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con R1=
CH2CH2OH. ............................................................................................................. 18
Figura 10: ciclo termodinmico para calculo de G del equilibrio en solucin .... 19
Figura 11: representacin 3D de la SEP a nivel semiempirico PM3....................... 22
Figura 12: representacin bidimensional de la SEP a nivel semiempirico PM3..... 22
Figura 13: estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel PM3 optimizados en
fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transicin ET1, (C) intermediario I, (D)
estado de transicin ET2, (E) producto LThDP .................................................... 23
Figura 14: estructura rotulada del cofactor ThDP, correspondiente al intermediario
I................................................................................................................................... 24
Figura 15: mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del intermediario
LThDP mediante clculos a nivel PM3................................................................... 27
Figura 16: diagrama de energa para SEP a nivel semiemprico PM3..................... 27
iv
Figura 17: representacin 3D de la superficie de energa potencial a nivel DFT ... 28

Figura 18: representacin 2D de la superficie de energa potencial a nivel DFT. .. 29
Figura 19: estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel DFT optimizados en
fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transicin ET, (C) producto LThDP......... 30
Figura 20: estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel DFT ..................... 31
Figura 21: estructura del estado de transicin ET con el stretching simultneo de las
coordenadas de reaccin C2C2 y H4O2.......................................................... 32
Figura 22: esquema de los clculos IRC aplicados al estado de transicin ET....... 32
Figura 23: estabilizacin por enlace de hidrogeno del sitio preferencial de
protonacin del anillo de aminopirimidina en la forma AP con R igual a 5(2
[hidroxidifosfato]etil)4metil1,3tiazol3io.............................................................. 33
Figura 24: mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del intermediario
LThDP mediante clculos a nivel B3LYP/631++G(d,p)....................................... 35
Figura 25: diagrama de energa para la SEP a nivel B3LYP/631++g(d,p) .............. 35
Figura 26: funciones de Fukui f - para el (A) APHIluro, (B) APIluro, (C) estado
+
de transicin ET y (D) piruvato. Funcin de Fukui f para (E) piruvato ............... 36
-
Figura 27: ndices atmicos de Fukui f para APIluro y APHIluro. Con R1=
CH2CH2OH .............................................................................................................. 37
Figura 28: ndices atmicos de Fukui (A) f -y (B) f +para la molcula de piruvato
.................................................................................................................................... 37
Figura 29: ndices atmicos de Fukui f - y f + , en parntesis, para el estado de
transicin ET de la SEP DFT. Con R1= CH2CH2OH.......................................... 38
Figura 30: equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con R1=
CH2CH2OH .............................................................................................................. 39
ndice de tablas
Tabla I: valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y de los ngulos diedros p
y T para los puntos crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel
semiempirico utilizando el hamiltoniano PM3......................................................... 23
Tabla II: valores de longitudes y ngulos de enlace para los puntos crticos de la
SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el hamiltoniano PM3
.................................................................................................................................... 24
Tabla III: valores de cargas atmicas tras MPA para los puntos crticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel PM3........................................................................ 24
Tabla IV: valores de longitudes de enlace del anillo pirimidnico para los puntos
crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el
hamiltoniano PM3 ..................................................................................................... 26
Tabla V: ordenes de enlace de Mulliken del anillo pirimidnico para los puntos
crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el
hamiltoniano PM3 ..................................................................................................... 26
Tabla VI: valores de cargas atmicas tras MPA para el anillo pirimidnico del
cofactor ThDP en el mecanismo de reaccin obtenido a nivel PM3..................... 26
Tabla VII: valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y los ngulos diedrosp
yT para los puntos crticos de la SEP en fase gas a con el mtodo DFT a nivel 6
31++G(d,p)................................................................................................................. 30
Tabla VIII: valores de longitudes de enlace de los puntos crticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............................................. 31
Tabla IX: valores de ngulos de enlace para los puntos crticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel B3LYP/631++G(d,p) ............................................ 31
Tabla X: valores de ordenes de enlace para los puntos crticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............................................. 31
vi
Tabla XI: valores de cargas atmicas tras anlisis NBO para los puntos de crticos
de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p) ................................................................... 33
Tabla XII: valores de longitudes de enlace para el anillo pirimidnico de los puntos
crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............... 34
Tabla XIII: valores de ordenes de enlace NBO para el anillo pirimidnico de los
puntos crticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ... 34
Tabla XIV: valores de cargas atmicas del tipo NBO para el anillo pirimidnico del
cofactor ThDP en el mecanismo de reaccin a nivel B3LYP/631++G(d,p) ...... 34
Tabla XV: valores de G para la reaccin acido base entre el residuo altamente
conservado Glu139, simulado con una molcula de acido actico y APIluro....... 39
vii
Capitulo 1: Introduccin
Captulo 1
Introduccin
n este captulo se dar una breve descripcin de lo que son las enzimas y
sus propiedades. Posteriormente, se expondrn aspectos generales de la
enzima AHAS tales como: los organismos en que se encuentra, las
reacciones que cataliza, los cofactores que posee y el ciclo cataltico que hasta el
momento se le ha postulado en literatura. Esto permitir revelar las interrogantes
asociadas a la enzima y as dar paso a la propuesta de trabajo en que est enfocada
esta tesis.
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1.1 Enzimas.
Las enzimas son protenas globulares, de gran tamao y que funcionan como
catalizadores biolgicos. Estn formadas por largas cadenas de aminocidos unidos
a travs de enlaces peptdicos. Estas cadenas de residuos de aminocidos
presentan una secuencia definida, la cual otorga las propiedades especficas que
posee cada enzima. En este sentido las enzimas pueden presentar diferentes
estructuras de ordenamiento: la primera de ellas corresponde a la secuencia de
aminocidos de la cual est constituida la enzima y es lo que se considera como la
estructura primaria. El siguiente nivel de organizacin abarca a las hlices alfa y a la
conformacin beta plegada, estas dos formas estn determinadas por el tipo de
interaccin entre las cadenas laterales de aminocidos de distintos polipeptidos
dentro de la enzima y son las que componen las estructuras secundarias. La
estructura terciaria corresponde a la disposicin tridimensional de todos los tomos
que componen la protena. Por ltimo se encuentra la estructura cuaternaria, la
cual se compone de complejos de ms de una cadena polipeptdica. Estos tipos de
plegamientos estn regidos por las interacciones entre los enlaces no covalentes
presentes en el ambiente enzimtico. Estas interacciones corresponden a enlaces de
hidrgeno, enlaces inicos y a fuerzas de Van der Waals las cuales ayudan a
mantener la forma de las enzimas. Es as como la distribucin de los
aminocidos polares y no polares orientan la forma en que se pliegan las enzimas.
Las cadenas laterales apolares tienden a agruparse en el interior de la enzima,
mientras que las cadenas laterales polares, tienden por s mismas a disponerse cerca
del exterior. En general una enzima siempre se pliega de tal forma que su
estructura adopte la menor energa libre posible. Las diferencias de plegamientos y
formas, definen las llamadas isoenzimas o isozimas. Estas enzimas corresponden a
enzimas que difieren en su secuencia de aminocidos y por ende en su
ordenamiento estructural. Sin embargo se caracterizan principalmente por catalizar
la misma reaccin qumica que otras enzimas, pero mostrando diferentes
parmetros cinticos.
Cada enzima acta sobre un sustrato especfico y generalmente cataliza
exclusivamente una sola reaccin, aunque esto vara dependiendo de la cantidad de
cofactores que presente cada enzima en su composicin. La regin en que las
enzimas llevan a cabo la reaccin con los sustratos se denomina sitio activo. Las
enzimas en su sitio activo requieren adems de la presencia de molculas no
proteicas para ejercer su actividad cataltica que se denominan cofactores, estas
pueden ser metales divalentes o molculas orgnicas que reciben el nombre de
coenzimas.
En un principio se pensaba que esta interaccin enzimasustrato ocurra bajo el
modelo de llave cerradura, pero sin embargo este modelo falla al intentar explicar
la estabilizacin de los estados de transicin. Por este motivo Daniel Koshland
sugiere en 1958 el modelo de acoplamiento o encaje inducido, en donde se
establece que las enzimas son estructuras bastante flexibles con lo que el sitio activo
podra cambiar su conformacin estructural debido a la interaccin con el sustrato.
Como resultado, las cadenas aminoacdicas que componen el sitio activo
interactan especficamente con los distintos cofactores y sustratos, permitiendo a la
enzima llevar a cabo su funcin cataltica. Existe un tercer modelo, llamado tensin
sobre el sustrato, que es derivado del modelo de Koshland. En este modelo el
sustrato es tensionado hacia la formacin del producto como resultado de una
transicin conformacional inducida por la enzima, la cual deforma los ngulos de
enlace y activa al sustrato.
Una manera de cuantificar la interaccin enzimasustrato es a partir de la constante
de Michaelis (Km), obtenida desde la ecuacin de MichaelisMenten. Esta
constante tiene una gran importancia prctica debido a que es independiente de la
concentracin de la enzima, permite el clculo de la concentracin de sustrato que
conduce a la velocidad correspondiente al 50% de la velocidad mxima de reaccin
y constituye una medida de afinidad de las enzimas por el sustrato. Dentro de este
mbito existen adems otros factores que influyen en la interaccin enzimasustrato
y que estn directamente relacionados con la actividad enzimtica. Entre ellos se
encuentran la temperatura, la cual cuando aumenta tambin lo hace la velocidad
enzimtica, pero si esta aumenta demasiado se produce la desnaturalizacin del
ambiente proteico, con lo que se anula la actividad enzimtica. Otro factor es el
pH, el cual es especfico para la actividad mxima en cada enzima y basta un
pequeo cambio para provocar la desnaturalizacin de esta, que en otras palabras
se refiere a la modificacin de todas las estructuras de la enzima, excepto la
estructura primaria. Los diferentes tipos de cofactores, el efecto de la concentracin
de sustrato y de los productos finales, la existencia de isoenzimas, adems de
modificaciones alostricas y covalentes en la estructura proteica de las enzimas,
tambin provocan variaciones de la actividad enzimtica. Uno de los factores ms
importantes que influyen en la actividad enzimtica y que generan un gran inters
debido a sus aplicaciones, es la presencia de inhibidores. Estos pueden clasificarse
segn la forma en que interactan con las enzimas, la cual puede ser de forma
reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima
para producir una protena que no tiene actividad enzimtica y a partir de la cual es
imposible regenerar la enzima original. En cambio los reversibles se unen
covalentemente a la enzima pero posteriormente puede ser liberado, por lo que se
habla de una unin temporal. Dentro de esta ltima clasificacin estos pueden
subdividirse segn la manera en que intervienen en la reaccin, de forma
competitiva y no competitiva con respecto al sustrato.
En la actualidad se conoce un gran nmero de enzimas, las cuales catalizan una
amplia gama de reacciones en los ms diversos organismos. Por este motivo la
Unin Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular ha desarrollado una
nomenclatura para identificar a las enzimas, basada en los denominados nmeros
EC (Enzyme Commission), donde la clasificacin comienza con las letras EC,
seguidas por cuatro nmeros los cuales estn separados por puntos. El primer
nmero indica la clase principal de la enzima y los siguientes son especificaciones
progresivas. Las clases principales se dividen en: 1. Oxidoreductasas: que catalizan
reacciones de oxidorreduccin; 2. Transferasas: que transfieren grupos activos a
otras unidades receptoras, pero no transfieren molculas de agua; 3. Hidrolasas: las
cuales catalizan reacciones de hidrlisis con la consiguiente obtencin de
monmeros a partir de polmeros; 4. Liasas: que catalizan reacciones en las que se
adicionan grupos a dobles enlaces o se forman dobles enlaces a travs de la
eliminacin de grupos H2O, CO2 y NH3; 5. Isomerasas: que transfieren grupos
dentro de la misma molcula para formar ismeros; 6. Ligasas: que catalizan la
degradacin o sntesis de los enlaces CC, CS, CO y CN mediante el
acoplamiento de molculas de alto valor energtico.
Dentro de la clasificacin de las transferasas se encuentra una de las enzimas ms
importantes para la vida de organismos tales como bacterias, hongos y plantas. La
enzima acetohidroxi sintasa, conocida comnmente como AHAS o acetolactato
sintasa se denomina con el nmero EC 2.2.1.6. El primer nmero se debe a que la
AHAS participa en las primeras etapas de la ruta biosinttica de los aminocidos de
cadena ramificada valina, leucina e isoleucina, por lo que sus productos son
transferidos a otras enzimas de la ruta biosinttica, (transferasa). El segundo
nmero, el 2, se debe a que las molculas transferidas poseen al menos un grupo
cetnico en su estructura. En tanto el tercer nmero, el 1, denota que la enzima
corresponde a una transcetolasa (transfiere molculas formadas por la
condensacin de dos tomos de carbono). Por ltimo el numero 6 corresponde
solo a un nmero arbitrario de clasificacin para las transferasas.
La produccin de los aminocidos de cadena ramificada en la que est involucrada
la AHAS es de vital importancia para el desarrollo y crecimiento de los organismos
antes mencionados. La inhibicin de esta enzima y por ende de la produccin de
estos aminocidos conduce a la muerte de los organismos. Con esta caracterstica la
AHAS se ha convertido en el principal blanco de inhibidores, entre los que se
encuentran herbicidas, fungicidas y agentes antimicrobianos. Los herbicidas se
utilizan en las plantaciones para la eliminacin de malezas, las cuales son dainas ya
que compiten directamente con los cultivos por el acceso al agua, al sol y a los
nutrientes. En tanto los agentes antimicrobianos se han desarrollado para la
eliminacin de bacterias responsables de enfermedades tales como la
tuberculosis.
1.2 AHAS.
El acido acetohidroxi sintasa (AHAS; EC 2.2.1.6) es una enzima que se encuentra
en plantas, algas, hongos y bacterias, tal como se mencion anteriormente. Su
funcin es catalizar los primeros pasos comunes que posee la ruta biosinttica de
los aminocidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina. Las reacciones
que cataliza la AHAS consisten en la condensacin de dos molculas de ceto
cidos, figura 1. En primera instancia cataliza la descarboxilacion, de forma
irreversible y no oxidativa, de una molcula de piruvato.
Figura 1. Sntesis de (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2hidroxibutirato. Los tomos de

carbono en negro, los de oxigeno en rojo y los de hidrgenos en blanco.
Posteriormente la enzima puede formar dos tipos de productos, dependiendo de

cul sea el segundoceto cido en reaccionar. Si este corresponde a una segunda
molcula de piruvato, se produce la formacin de (2S)2acetolactato (AL), el cual
es el precursor de los aminocidos de cadena ramificada valina y leucina. Pero si el
segundo sustrato corresponde a una molcula de 2cetobutirato (2CB) se produce
la formacin de (2S)2aceto2hidroxibutirato (AHB) el cual es el precursor del
aminocido de cadena ramificada isoleucina.
La AHAS pertenece a la familia de las enzimas tiamina dependiente, ya que para su
actividad cataltica requiere del cofactor tiamina difosfato (ThDP). Pero adems, la
AHAS requiere de la presencia de otros dos cofactores. El primero corresponde al
metal divalente Mg y el segundo corresponde al cofactor flavina adenina
dinucleotido (FAD).
El cofactor encargado de llevar a cabo las reacciones al interior de la enzima es el
cofactor
3[(4amino2metilpirimidina5il)metil]5(2[hidroxidifosfato]etil)4
metil1,3tiazolio, el cual es el derivado activo de la vitamina B1 y es conocido

comnmente como ThDP. Este cofactor est formado por un anillo tiazolio y por
un anillo pirimidnico. El anillo pirimidnico se encuentra sustituido en la posicin
2 por un grupo metilo y en la posicin 4 por un grupo amino. Ambos anillos estn
enlazados a travs de un carbono puente con el cual forman los ngulos diedrosP
= N3C7C5C4 y T = C2N3C7C5 tal como se muestra en la figura 2. Las
tres conformaciones bsicas que puede adoptar el ThDP debido a la torsin de
estos diedros son: la conformacin tipo F ( 90, 0), la conformacin tipo S (
150, 100) y la conformacin tipo V ( 70, 95), en donde el primer valor
corresponde al diedrop y el segundo al diedroT, respectivamente.
FP
6`
1`N
CH3
4
7`
CH2
2+
5`
3N
FT
H3C 2` N 4` NH2
3`
H 2
6
CH2
5
S
1
Mg
O
O
CH2
7
O
O
OH
Figura 2. Estructura del cofactor tiamina difosfato con diedros p y T.
La conformacin tipo V es la que confiere la actividad al ThDP, debido a la

cercana existente entre el grupo imino del anillo pirimidnico y el hidrgeno
enlazado al carbono C2 en el anillo tiazolio, entre los cuales existe una distancia
promedio de 3.0 . Esta cercana permite la abstraccin del hidrgeno enlazado al
carbono C2 por parte del grupo imino, produciendo de esta manera la formacin
de la especie activa conocida como iluro, figura 3. Estas etapas de activacin
consideran un equilibrio tautomerico que comienza con la protonacin del
nitrgeno N1 por parte del aminocido altamente conservado acido glutmico
(Glu139 en la AHAS). Con esto el anillo de aminopirimidina pasa de la forma 4
aminopirimidina (AP) a la forma 4aminopirimidinio (APH). Luego, el grupo
amino cuaternario cede uno de sus protones y el anillo queda en la forma 1,4
iminopirimidina (IP). Por ltimo, el grupo imino del anillo de pirimidina en la
forma IP extrae el tomo de hidrgeno enlazado al carbono C2 formando la
especie altamente reactiva iluro. Se ha postulado que estas etapas de activacin son
comunes para todas las enzimas tiamina dependientes, al igual que los dos
primeros pasos del ciclo cataltico de la AHAS.
Figura 3. Mecanismo de protonacin del cofactor ThDP correspondiente a las etapas de

activacin del cofactor (verde) para formacin del intermediario iluro (azul).
Por otra parte en lo que respecta al anillo tiazolio, ste adems de estar unido al
carbono puente, se encuentra enlazado por su otro extremo a un grupo
etilhidroxidifosfato, el cual a su vez esta unido al metal divalente Mg. Este metal
cumple la funcin de anclar al ThDP al sitio activo de la AHAS al interactuar con
dos aminocidos del ambiente enzimtico, los cuales corresponden especficamente
a un cido asprtico y a una asparraguina.
El otro cofactor presente en la AHAS y que no interacciona con sustratos debido a
que la AHAS no lleva a cabo reacciones de oxidoreduccin, es el cofactor flavina
adenina dinucleotido (FAD). Este cofactor est compuesto por una unidad de
riboflavina (vitamina B2), que est unida a un grupo pirofosfato, el cual que est
enlazado a una ribosa, la que a su vez est unida a una adenina, figura 4. Se ha
postulado que el FAD confiere dos propiedades fundamntales a la AHAS, una de
ellas consiste en el aumento de la actividad cataltica de la enzima cuando este
cofactor se encuentra presente y la otra es que estimula a la AHAS a adoptar la
conformacin de tetrmero, confiriendo al FAD un rol estructural dentro de la
enzima.
H2N
N
N
CH3
N
HO
O
P
O
HO
OH H3 C
P
O
HO
OH
N
OH
OH
NH
O
Figura 4. Estructura del cofactor FAD, las unidades de riboflavina, adenina, ribosa y el
grupo difosfato se muestran con los colores: azul, rojo, verde y amarillo, respectivamente.
El ciclo cataltico de la AHAS postulado hasta el momento se muestra en la

figura 5. Consta de cuatro pasos principales, el primero de estos pasos se compone
de un ataque nucleoflico por parte del carbono C2 del intermediario iluro sobre el
carbono carbonlico de una molcula de piruvato, generando al intermediario (2S)
2[(1carboxi1hidroxi)etil]tiaminadifosfato tambin conocido como 2lactil
tiaminadifosfato (LThDP). En el segundo paso el LThDP sufre una
descarboxilacin dando origen al segundo intermediario del ciclo cataltico: el 2(1
hidroxietil)tiaminadifosfato (HEThDP). Una caracterstica importante de este
intermediario es que sus dos estructuras resonantes correspondientes a la forma de
enamina y la forma activa C2carbanin poseen diferente reactividad, siendo ms
estable la forma de enamina. En tanto la forma C2carbanin es la que contina
con el ciclo cataltico de la AHAS, dando origen al tercer paso del ciclo. En este
tercer paso el HEThDP, en su forma aninica, reacciona con el segundo ceto
cido, el cual puede ser una molcula de piruvato o una molcula de 2cetobutirato.
En esta etapa el carbono C2 realiza un ataque nucleoflico sobre el carbono
carbonlico de la segunda molcula de sustrato en cuestin, formando el
intermediario
(1S,2S)2[(2carboxi1,2dihidoxi1,2dimetil)etil]tiaminadifosfato,
comnmente conocido como 2acetolactatotiaminadifosfato (ALThDP), cuando

reacciona con una molcula de piruvato, como tambin el intermediario (1S,2S)2
[(2carboxi1,2dihidoxi2etil1metil)etil]tiaminadifosfato que comnmente recibe
el nombre de 2acetohidroxibutiratotiaminadifosfato (AHBThDP) cuando
reacciona con la molcula de 2cetobutirato, respectivamente.
Figura 5. Ciclo cataltico de la enzima AHAS reportado en literatura.
De acuerdo a lo postulado en bibliografa, un punto a destacar en este tercer paso

es que al igual que en el paso nmero uno del ciclo, aqu tambin es necesaria la
presencia de algn residuo cercano al cofactor que posea un grupo ionizable capaz
de protonar al oxgeno carbonlico del segundo ceto cido. Por ltimo, en el paso
nmero cuatro del ciclo cataltico el producto es liberado tras el rompimiento del
enlace C2C2 y el cofactor ThDP es regenerado en la forma de iluro el cual se
reinserta nuevamente en el ciclo. Pero, adems en este cuarto paso, nuevamente es
necesaria la presencia de algn residuo cercano al cofactor que posea un grupo
ionizable, el cual ahora debe promover la extraccin del hidrgeno ubicado en el
primer hidroxilo formado de los intermediarios ALThDP o AHBThDP, segn
sea el caso, con el fin de formar los productos (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2
hidroxibutirato, respectivamente. Sin embargo, a raz de los anlisis de la
estructura cristalina de la AHAS presentados en literatura, los aminocidos
cercanos al sitio activo de la enzima y principalmente aquellos que se encuentran
10
prximos al grupo amino del anillo pirimidnico y al carbono C2 del anillo tiazolio,
no poseen grupos ionizables capaces de realizar estas funciones. Debido a estas
interrogantes, se ha postulado para los pasos nmero 3 y 4 del ciclo, la posibilidad
de que el mecanismo ocurra intramolecularmente sin la presencia de grupos
ionizables pertenecientes a cadenas laterales cercanas al sitio activo.
1.3 Propuesta de investigacin.

En los ltimos 30 aos se han publicado una gran cantidad de artculos
relacionados con esta enzima, con el fin de comprender en su totalidad los
mecanismos de activacin e inhibicin. Entre los aspectos ms relevantes que se
han publicado se encuentran por ejemplo la obtencin de la estructura cristalina de
la AHAS a partir de extracciones de la enzima realizadas a diversas bacterias, clases
de hongos y tipos de plantas. Adems se han realizado estudios enfocados tanto en
su actividad cataltica, como tambin en la deteccin de los intermediarios
presentes en el ciclo cataltico, para los cuales adems se han determinado las
constantes de velocidad de formacin. Sin embargo, a pesar de esta gran
cantidad de estudios realizados, aun existen interrogantes relacionadas con esta
enzima. Entre estas interrogantes se encuentran aspectos relacionados directamente
con su ciclo cataltico, referentes a la forma en que ocurren los mecanismos de
reaccin que dan paso la formacin de los intermediarios en los distintos pasos del
ciclo cataltico, adems de la ausencia de grupos ionizables cercanos al sitio activo
capaces de promover transferencias protnicas para la formacin de estos
intermediarios. En lo que respecta a estas interrogantes, uno de los pasos del ciclo
cataltico de la AHAS que se ve principalmente afectado por la falta de estos grupos
ionizables y del cual adems se desconoce la forma en que ocurre su mecanismo de
reaccin, es el paso nmero 1 del ciclo cataltico, correspondiente a la formacin
del LThDP. Tal como se describi en la seccin anterior, este paso consta de un
ataque nucleoflico por parte del cofactor tiamina difosfato (ThDP) hacia el primer
sustrato incorporado en el ciclo cataltico de la AHAS correspondiente a una
molcula de piruvato cuando el cofactor ThDP se encuentra bajo la forma de iluro,
figura 6.
11
Figura 6. Mecanismo de formacin del intermediario LThDP en literatura.
Adems, en este paso se requiere de la protonacin del oxgeno carbonlico de la

molcula de piruvato, para la formacin del intermediario LThDP. Pero, debido
a que en el sitio activo de la enzima no existe la presencia de algn cido o de un
grupo de similares caractersticas, el origen del protn requerido en esta etapa
del ciclo cataltico es desconocido.
Como una posible respuesta a esta interrogante, en la presente tesis se ha propuesto
un mecanismo para la formacin del intermediario LThDP, el cual no requiere de
la presencia de un grupo con carcter cido aledao al sitio activo de la enzima.
Con esto se postula que el origen del hidrgeno requerido en esta etapa del ciclo
cataltico proviene del mismo cofactor ThDP, especficamente del grupo imino
cuaternario presente en el anillo de pirimidina cuando este se encuentra en la
forma de APH, figura 7.
Figura 7. Mecanismo postulado para la formacin del intermediario LThDP.
12
1.4 Hiptesis y objetivos del trabajo de tesis.

1.4.1 Hiptesis.
La protonacin del oxgeno carbonlico de la molcula de piruvato en la

formacin del intermediario LThDP, se lleva a cabo por el grupo 4imino
del intermediario iluro, cuando este se encuentra con el anillo pirimidnico
bajo la forma de APH.
1.4.2 Objetivos.
Objetivo general: modelar tericamente mediante mtodos mecnico

cunticos el mecanismo de reaccin postulado para la formacin del
intermediario LThDP desde el punto de vista de la cintica, reactividad y
termodinmica.
Objetivos especficos:
1. Cintica: explorar el mecanismo de reaccin y determinar la barrera

de activacin para la formacin del LThDP, considerando los
sustratos aislados en fase gas, mediante la construccin de una
superficie de energa potencial (SEP) con el anillo pirimidnico en la
forma de APH al momento de realizar la trasferencia protnica.
2. Reactividad: calcular las funciones de Fukui y los ndices atmicos

de Fukui para los reactantes y estado de transicin.
3. Termodinmica: calcular los DG en fase gas y en solucin para la

reaccin acido base entre el residuo altamente conservado GLU139
y el intermediario iluro bajo las formas AP y APH, utilizando
solventes con distintos valores de constante dielctrica.
13
Capitulo 2: Metodologa
Capitulo 2
Metodologa
n este captulo se presenta la metodologa empleada para la construccin

de las SEP con los sustratos aislados en fase gas a nivel semiemprico y las
posteriores correcciones energticas para las estructuras obtenidas
empleando la teora de los funcionales de densidad (DFT), adems se indica la

metodologa utilizada para los clculos termodinmicos tanto en fase gas como en
solucin. Tambin se presenta la metodologa empleada para el clculo de las
funciones de Fukui a las distintas molculas de inters.
14
2.1 Construccin de la SEP con los sustratos aislados.

Para la construccin y exploracin de la superficie de energa potencial (SEP) en
fase gas y con los sustratos aislados, se consideraron dos coordenadas de reaccin
tal como se observa en la figura 8. Una de las coordenadas corresponde al ataque
nucleoflico entre el carbono C2 y el carbono carbonilico C2 (R1) y la otra
corresponde a la transferencia protnica de uno de los hidrogeno enlazados al
grupo 4amino cuaternario hacia el oxgeno carbonilico del piruvato (R2).
H3C
CH3COO
N.
.
H4`
H3C
CH2
N
..
N
H
OH
CH2
CC2
R1
R2 O
O2 a
CH3
C2a
C1CO2
Figura 8. Coordenadas de reaccin para exploracin de SEP en la formacin del

intermediario LThDP.
Con el propsito de considerar de una manera simple el ambiente apoenzimatico

en la construccin de la SEP se realizaron tres aproximaciones. En primer lugar, en
todos los clculos se consider al cofactor ThDP en la conformacin tipo V con
valores para P de 66 y T de +96, obtenidos de la estructura cristalina de la
AHAS. En segundo lugar, en todos los clculos realizados al intermediario L
ThDP, este siempre se consider con la estructura del enantimero S. Por ltimo,
en todas las estructuras se incluy al residuo altamente conservado glutamato,
debido a la importante interaccin que posee con el tomo N1 del anillo
pirimidnico. Este aminocido fue reemplazado por una molcula de acido
actico, con el fin de simular de una forma simple el grupo carboxlato del acido
glutmico. Lo mismo se hizo con el grupo hidrxidifosfato, el cual se
reemplazo con un grupo hidroxilo debido a que su rol solo consta en anclar el
ThDP al sitio activo, por lo que no tiene ninguna contribucin en la actividad
cataltica del cofactor. Adems, en ninguno de los clculos se incluye el
metal divalente Mg ya que su rol es coordinar el grupo difosfato del ThDP y
adems no tiene participacin directa en la catlisis.
15
Posteriormente esta estructura se optimiz utilizando el hamiltoniano PM3
(Parameterized Model number 3) con el programa MOPAC 2009. Una vez
optimizada la molcula se restringi la longitud de enlace C1C2 a una distancia
de 1.55 y se optimiz nuevamente. A continuacin, con este resultado se
generaron 73 estructuras diferentes, las cuales se obtuvieron al cambiar la distancia
de la coordenada de reaccin R1 desde 1.40 hasta 5.00 con intervalos de 0.05
. En cada una de estas estructuras se restringieron longitudes de enlaces, ngulos
de enlaces y ngulos diedros con la finalidad de resaltar solo lo cambios de energa
producidos nicamente por las coordenadas de reaccin en estudio y adems para
reproducir de cierta forma la rigidez del cofactor en el sitio activo de la enzima.
Luego, en cada una de estas estructuras la coordenada R2 fue variada entre 3.70
y 0.9 con intervalos de 0.034 , asegurando de esta manera que ambas
coordenadas de reaccin, tanto R1 como R2, tuviesen un total de 72 pasos cada
una. A continuacin la energa de cada una de las 5300 estructuras se grafic en
funcin de la coordenadas R1 y R2 con el programa SigmaPlot 10.0,
construyendo de esta manera la SEP a nivel semiemprico utilizando el
hamiltoniano PM3. Para encontrar los estados de transicin en esta superficie se
seleccionaron estructuras representativas correspondientes a la regin de los puntos
de silla de la superficie y se procedi a su optimizacin y posteriores clculos de
frecuencia con el programa MOPAC 2009.
Sin embargo, debido a las conocidas limitaciones que presenta el mtodo
PM3, la SEP PM3 fue corregida utilizando Density Functional Theory
(DFT) a nivel B3LYP/631++g(d,p). Para esto con el software GAUSSIAN
03se realizaron clculos single points de las estructuras optimizadas a nivel PM3.
Posteriormente estas energas corregidas se graficaron versus las coordenadas de
reaccin R1 y R2 para obtener la SEP corregida a nivel DFT. A las estructuras
optimizadas al nivel B3LYP/631++g(d,p) de los posibles estados de transicin de la
SEP se les realiz un clculo IRC(Intrinsic Reaction Coordinate) al mismo nivel
de teora, con la finalidad de confirmar el estado de transicin correspondiente a la
reaccin de inters. Este clculo condujo hacia reactantes y producto, y sus
resultados fueron comparados con las estructuras optimizadas a nivel B3LYP/6
31++g(d,p) del sistema reactantes y del producto obtenidas a partir de la SEP DFT.
16
2.2 Clculos de reactividad.

Para los estudios de reactividad se calcularon las funciones de Fukui y los ndices
+
-
atmicos de Fukui f y f . Estas funciones e ndices atmicos permitieron
visualizar y cuantificar respectivamente, la reactividad de las distintas especies

-
involucradas en la reaccin de formacin del LThDP. La funcin f (r)refleja la
reactividad global de la molcula respecto a un centro electroflico. En tanto la

+
funcin f (r) refleja la reactividad hacia un eventual ataque nucleoflico. Estas
funciones estn definidas por las ecuaciones 1 y 2.
f + = ( r N +d (r ) - r N (r )) /d
(1)
f - = ( r N -d (r ) - r N (r )) /d
(2)
Con estas ecuaciones las funciones de Fukui fueron calculadas mediante una
aproximacin de diferencias finitas, donde N es el nmero de electrones, es la
densidad electrnica de cierto tomo(r) yes una fraccin de un electrn, donde
el valor utilizado fue de 0.01. En tanto para el anlisis de los ndices atmicos de
Fukui, estos se calcularon simultneamente con los de las funciones de
Fukui mediante la metodologa implementada en el paquete computacional Jaguar
7.7y con la ayuda de la interfaz grafica Maestro 9.1.
Los resultados de las funciones de Fukui fueron entregados y visualizados como
isosuperficies, mientras las funciones atmicas de Fukui, tambin conocidas como
las funciones condesadas de Fukui, se obtuvieron por el clculo descrito en las
ecuaciones 1 y 2, correspondientes al cambio de densidad electrnica entre las
molculas neutras y sus especies radicales, donde se registr la poblacin
electrnica sobre los tomos de las molculas analizadas. Para la obtencin
de las poblaciones atmicas se realizaron clculos del tipo MPA (Mulliken
Population Analysis), anlisis implementado en la metodologa de Jaguar 7.7 para
el clculo de funciones de Fukui.
17
2.3 Clculos termodinmicos.

2.3.1 Clculos en fase gas.
Las estructuras que se muestran en la figura 9, fueron optimizadas en fase gas con
el software GAUSSIAN 03 y utilizando la teora de los funcionales de densidad al
nivel B3LYP/631++G(d,p). Posteriormente sobre las estructuras optimizadas se
realizaron clculos de frecuencia al nivel de teora a B3LYP/6311G.
Figura 9. Equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con R1= CH2CH2OH.
Los resultados de las funciones termodinmicas entregadas por los clculos de

frecuencia fueron obtenidos de acuerdo a las ecuaciones 3, 4 y 5. Donde ESCF es la
energa potencial (SelfConsistent Field Energy), ZPE es la energa del punto cero
(Zero Point Energy), kB es la constante de boltzmann, T la temperatura y EInt es la
suma de las energas trasnacional, rotacional, vibracional. Con el valor de la
energa libre de las molculas de la figura 9 se calcul el valor del DG para
reaccin acido base entre en residuo y los tautmeros APIluro y APHIluro.
Etot = ESCF + ZPE + EInt
(3)
H corr = Etot + kBT
(4)
Gcorr = H corr - TStot
(5)
18
2.3.2 Clculos en solucin.
Las estructuras de la figura 9 fueron optimizadas en fase gas. Los efectos de
solvatacin implcita fueron modelados de acuerdo al modelo CPCM (Conductor
Polarizable Continuum Model), tal como est implementado en Gaussian 03.
Las constantes dielctricas de los medios considerados fueron 2.01 y 32.63,
como paradigmas de medios apolares y polares respectivamente, con el fin de
resaltar el efecto del ambiente enzimtico, tratando de simular en primer lugar las
estabilizaciones producidas por las fuerzas de Van der Waals que otorgan los
residuos cercanos al sitio activo y que generan un ambiente hidrofbico de una
constante dielctrica con valores entre 2 y 4. Para el segundo caso se intento
simular el ambiente enzimtico en el interior de la enzima, pero ahora
considerando las estabilizaciones de carcter electrosttico por parte de
aminocidos que presentan grupos ionizados. Adems todos los clculos
fueron hechos considerando al residuo altamente conservado glutamato
interactuando con el tomo N1 como una forma simple de considerar el ambiente
apoenzimatico. Este residuo fue reemplazado por una molcula de acido actico,
con el fin de simular de una forma simple el grupo carboxlato del acido glutmico.
Las energas libres en solucin fueron calculadas a nivel B3LYP(CPCM)/6
311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p), mediante el empleo del ciclo termodinmico,
que se muestra en la figura 10, tomando la diferencia entre elG del equilibrio en
fase gas y los valores de G de solvatacin obtenidos de los clculos single points
en solucin de las molculas involucradas (ecuacin 6).
Figura 10. Ciclo termodinmico para calculo deG del equilibrio en solucin.
D solucionG 0 = D gas G 0 + D solvBG 0 - D solvAG 0
(6)
19
Capitulo 3: resultados y discusin
Capitulo 3
Resultados y discusin
n este captulo se presenta la SEP con los sustratos aislados en fase gas
realizada a nivel semiemprico PM3 y su posterior refinamiento con el
mtodo DFT a nivel 631++G(d,p). Tambin se presenta el resultado de
los ndices de reactividades correspondientes a las funciones de Fukui para el iluro

con el anillo pirimidnico en la forma AP y APH, para la molcula de piruvato y
para el estado de transicin. Adems, se presentan los valores del cambio de la
energa libre en condiciones estndar obtenido del anlisis termodinmico
realizado para la reaccin
acido base entre el residuo altamente conservado
GLU139 y APIluro.
20
3.1
Exploracin de la SEP con los sustratos aislados.

3.1.1 SEP a nivel semiemprico PM3.
La exploracin de la SEP a nivel semiemprico con el hamiltoniano PM3, figuras

11 y 12, muestran que el mecanismo de reaccin para la formacin del LThDP
presenta la formacin de un intermediario y la presencia de dos estados de
transicin. La primera etapa del mecanismo consiste en el desplazamiento de la
molcula de piruvato hacia el cofactor ThDP, promoviendo el ataque nucleoflico
por parte del carbono C2 hacia el carbono carbonlico C2 de la molcula de
piruvato, alcanzando de esta forma el primer estado de transicin ET1. Este estado
de transicin est caracterizado con solo una frecuencia imaginaria de 407 cmy
que corresponde al stretching de la coordenada C2C2. La barrera de activacin
observada, calculada a nivel PM3, es aproximadamente de 29 Kcal/mol. Durante
esta etapa no se observa transferencia protnica. A continuacin, el ataque
nucleoflico se completa formando el intermediario I, con una longitud de enlace
C2C2 de aproximadamente 1.55 , que corresponde a la longitud promedio de
un enlace simple carbonocarbono. Luego, una vez formado este intermediario, se
produce la transferencia protnica desde el grupo 4NH2 al oxgeno carbonilico
O2, formando finalmente el producto LThDP, va el estado de transicin ET2.
Este estado de transicin tambin esta caracterizado con una sola frecuencia
imaginaria igual a 2004 cm, correspondiente al stretching H4O2. La barrera
de activacin observada, calculada a nivel PM3, para esta ltima etapa es
aproximadamente de 5 Kcal/mol.
Cabe destacar que estas barreras de activacin se obtuvieron a partir de las
estructuras de los puntos crticos de la reaccin que fueron optimizadas en fase gas
sin restricciones, una vez construida la SEP. Ya que no corresponden a las
estructuras con las que se construyo la superficie, las cuales fueron restringidas en
algunas variables tales como longitudes de enlaces, ngulos de enlaces y ngulos
diedros. Estas nuevas optimizaciones se realizaron utilizando el hamiltoniano PM3
en MOPAC 2009.
21
Figura 11. Representacin 3D de la SEP a nivel semiempirico PM3.
Figura 12. Representacin bidimensional de la SEP a nivel semiempirico PM3.
Los valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y de los ngulos diedros p y

T para los diferentes puntos crticos de la SEP optimizados sin restriccin de
variables se presentan en la tabla I. Para la regin de los reactantes, del
intermediario y del producto se tomaron las estructuras de menor energa
encontradas en la SEP. Mientras que para los estados de transicin se tomaron las
estructuras encontradas en las zonas de puntos de silla de la superficie.
22
En la figura 13 se muestran los resultados de las estructuras optimizadas en fase gas

de los puntos crticos de esta SEP. Adems, para resaltar los cambios estructurales
ocurridos durante el transcurso de la reaccin, en la tabla II se presentan los valores
de algunas longitudes y ngulos de enlace, pertenecientes principalmente a la
molcula de piruvato y al grupo imino del anillo pirimidnico. Por otro lado en la
tabla III, se presentan las cargas atmicas obtenidas del anlisis poblacional de
Mulliken (MPA) para los tomos ms relevantes involucrados en el ataque
nucleoflico y en la transferencia protnica. En esta ltima tabla y con el fin de
comparar la variacin de la carga sobre los nitrgenos N4, figura 14, tambin se
presentan las cargas atmicas del nitrgeno N3.
Figura 13. Estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel PM3 optimizados en fase gas:
(A) reactantes, (B) estado de transicin ET1, (C) intermediario I, (D) estado de transicin
ET2, (E) producto LThDP.
23
Figura 14. Estructura rotulada del cofactor ThDP, correspondiente al intermediario I.
En el sistema de reactantes la molcula de piruvato presenta una geometra trigonal

plana, con valores de algunos de enlaces cercanos a los 120. En esta regin de la
SEP, el piruvato se encuentra a una distancia de 4.05 del intermediario iluro,
orientando su grupo carbonilo hacia el grupo imino cuaternario del anillo
pirimidnico. Por su parte el nitrgeno N4 en esta regin registra la mayor
densidad de carga positiva, en comparacin a los dems puntos crticos de la SEP,
ya que a medida que avanza la reaccin la carga atmica del nitrgeno N4 adopta
valores negativos, especficamente en el segundo estado de transicin y en el
producto. Adems, el enlace N4C4 muestra una longitud de enlace de 1.33 ,la
cual es menor que el valor de longitud de enlace promedio para un enlace doble
carbononitrgeno, correspondiente a 1.38 . As, el anillo pirimidnico se
encuentra bajo la forma de APH, acorde a lo postulado en literaturapara otras
enzimas ThDP dependientes.
24

A medida que la reaccin avanza y se sita en la regin del primer estado de
transicin ET1, los valores de los ngulos de enlaces de la molcula de piruvato
comienzan a sufrir modificaciones. Claro ejemplo de esto es la disminucin del
valor del ngulo de enlace C1C2O2 desde 122 a 114. Esto da cuenta del
cambio de geometra que sufre el piruvato, pasando de una geometra trigonal plana
a una geometra tetradrica, producto del ataque nucleoflico realizado por el
carbono C2. Adems como consecuencia de lo ocurrido en esta etapa de la
reaccin, la densidad de carga negativa sobre el carbono C2 disminuye,
produciendo una variacin en la carga atmica de 0.220 a 0.359 desde los
reactantes hasta el intermediario I. En tanto la longitud del enlace C2O2
aumenta de 1.21 a 1.34 , aumentando tambin la carga negativa sobre el
oxgeno O2.
Una vez en la regin del intermediario I, la molcula de piruvato se encuentra
enlazada al cofactor ThDP, adoptando una geometra tetradrica con ngulos de
enlace cercanos a los 109. Sin embrago la orientacin del oxgeno carbonilico O2
de la molcula de piruvato no ha sufrido modificaciones con respecto a la que
presentaba en el sistema de reactantes. Esto se debe principalmente a que el
cofactor ThDP no ha perdido su conformacin tipo V, la cual se mantiene durante
todo el transcurso de la reaccin, al igual que el ngulo de enlace H4N4C4.
Como consecuencia, la transferencia protnica desde el grupo imino cuaternario
del anillo pirimidnico hacia el oxgeno carbonilico O2 se encuentra favorecida,
quedando el oxgeno O2 a una distancia de 1.68 con respecto al hidrgeno
H4. Finalmente, el aumento de la densidad de carga negativa sobre el nitrgeno
N4 al atravesar la zona del segundo estado de transicin ET2 y posteriormente al
llegar a la formacin del intermediario LThDP, indica que el anillo pirimidnico
queda bajo la forma de IP, acorde a los postulado en bibliografa para otras
enzimas ThDP dependientes. Con un valor de 1.31 para la longitud del
enlace N4C4 y una carga atmica sobre el nitrgeno N4 de 0.276.
En lo que respecta al anillo pirimidnico, tanto los valores de las longitudes de
enlace, tabla IV, como los valores de los rdenes de enlace, tabla V, ambos
obtenidos por MPA, muestran que desde el sistema de reactantes y hasta la zona
del intermediario I, los enlace del anillo se encuentran deslocalizados.
25
A medida que la reaccin avanza y pasa desde el intermediario I hasta la formacin

del producto LThDP, las longitudes de los enlaces C4C5 y C4N3 aumentan,
disminuyendo sus ordenes de enlace y formando enlaces simple carbonocarbono y
carbononitrgeno, respectivamente. Esto provoca que la densidad de carga
negativa sobre el carbono C4 disminuya, tabla VI. Lo mismo ocurre con los
enlaces C6N1 y N1C2, los cuales tambin sufren un aumento en sus longitudes
de enlaces en estas etapas de la reaccin, disminuyendo sus ordenes de enlace y
provocando un aumento en la densidad de carga negativa sobre el nitrgeno N1
(tabla III). A pesar de esto, el nitrgeno N1 se mantiene con una carga parcial
positiva durante toda la reaccin. En cuanto a los enlaces C5C6 y C2N3, estos
mantienen sus ordenes de enlaces constantes durante toda la reaccin, con valores
correspondientes a rdenes de enlaces intermedios entre un enlace simple y un
enlace doble.
26

De acuerdo a los resultados obtenidos de la exploracin de la SEP utilizando el
hamiltoniano PM3, se propone el siguiente mecanismo para la formacin de
intermediario LThDP, figura 15.
Figura 15. Mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del intermediario LThDP
mediante clculos a nivel PM3.
Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de energa que se muestra

en la figura 16. La barrera de activacin, en trminos de energa electrnica, para
este mecanismo de reaccin es de 32.65 Kcal/mol, considerando la barrera
energtica del estado de transicin ET2 con respecto al sistema de reactantes,
debido a que la etapa limitante de la reaccin corresponde a la segunda etapa del
mecanismo.
Figura 16. Diagrama de energa para SEP a nivel semiemprico PM3.
27

3.1.2 Correccin DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p).
La correccin DFT de la SEP fue necesaria debido a las conocidas limitaciones del
mtodo PM3, a causa de las simplificaciones en la descripcin electrnica de este
mtodo, como por ejemplo considerar solo a los electrones de valencia y la
utilizacin de un mnimo de funciones bases. Estas simplificaciones traen como
consecuencia valores errneos de las cargas sobre los tomos de nitrgeno y una
sobre estimacin de las barreras de activacin. Sin embargo, los mtodos
semiempricos siguen siendo una buena alternativa para una exploracin preliminar
de la superficie de energa potencial para un posterior refinamiento a nivel DFT.
Figura 17. Representacin 3D de la superficie de energa potencial a nivel DFT.
La correccin de la SEP se llev a cabo de acuerdo a la metodologa descrita en la

seccin 2.1. Los resultados de esta correccin se muestran en las figuras 17 y 18.
Esta nueva superficie de energa potencial muestra diferencias importantes en su
topologa con respecto a aquella obtenida a nivel PM3. La zona correspondiente al
intermediario I, ya no presenta la estabilidad energtica descrita por el mtodo
PM3. Como consecuencia, las zonas de los puntos de silla correspondientes a los
estados de transicin ET1 y ET2 han desaparecido. Ahora en esta nueva SEP, es
posible observar que la reaccin ocurre mediante un mecanismo concertado, va un
estado de transicin asncrono, donde la coordenada de reaccin R1,
correspondiente al ataque nucleoflico del carbono C2 sobre el carbono carbonilico
28

C2, se adelanta a la coordenada de reaccin R2. De esta manera, se observa que a
medida que se acerca la molcula de piruvato hacia el cofactor ThDP, se comienza
a producir el ataque nucleoflico. Mientras esto ocurre, la distancia entre el oxgeno
O2 y el hidrgeno H4 disminuye paulatinamente. Ya en la zona del estado de
transicin ET y hasta la formacin del producto LThDP, se lleva a cabo la
transferencia protnica, rompindose el enlace entre el hidrgeno H4 y el
nitrgeno N4 y formndose el enlace O2H4, mientras el ataque nucleoflico se
completa.
Figura 18. Representacin 2D de la superficie de energa potencial a nivel DFT.
Debido a que la metodologa implementada para corregir la SEP a nivel DFT solo
consisti en realizar clculos single points sobre estructuras optimizadas a nivel
PM3, fue necesario realizar optimizaciones al nivel B3LYP/631++G(d,p) para los
puntos crticos de la SEP DFT. Para las regiones correspondientes al sistema de
reactantes y al producto LThDP, se tomaron las estructuras de menor energa
encontradas en la superficie. En tanto, para la identificacin del estado de
transicin ET se tomaron varias estructuras aproximadas, pertenecientes a la regin
de punto de silla de la SEP. A todas las estructuras optimizadas se les realizaron
clculos de frecuencia, para cuantificar la barrera energtica del mecanismo en
trminos del cambio de energa libre.
29

3.1.3 Optimizacin de los puntos crticos de SEP DFT al nivel
B3LYP/631++G(d,p).
Los valores de las coordenadas de reaccin R1, R2 y de los ngulos diedros p y
T para los diferentes puntos crticos de la SEP DFT, optimizados al nivel
B3LYP/631++G(d,p), se presentan en la tabla VII. Adems, en la figura 19 se
muestran los resultados de las estructuras optimizadas de los puntos crticos de la
SEP.
Figura 19. Estructuras de los puntos crticos de la SEP a nivel DFT optimizados en fase
gas: (A) reactantes, (B) estado de transicin ET, (C) producto LThDP.
30

En las tablas VIII y IX, se presentan los valores de algunas longitudes y ngulos de
enlace de los puntos crticos, pertenecientes principalmente a las molculas de
piruvato, acido actico y al grupo imino del anillo pirimidnico, figura 20. En tanto,
en la tabla X se muestran algunos rdenes de enlace, obtenidos del clculo NBO
(Natural Bond Orbital). Clculo que realiza un anlisis de los rdenes de enlaces y
de las hibridaciones basado en la poblacin electrnica obtenida del anlisis NPA
(Natural Population Analysis), anlisis incorporado en el clculo NBO.
Figura 20. Estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel DFT.
31

La optimizacin y caracterizacin del estado de transicin calculado al nivel
B3LYP/631++G(d,p) mostr como resultado una nica frecuencia imaginaria de
222 cm,correspondiente al stretching simultaneo de las coordenadas de reaccin
C2C2 y H4O2, como se muestra en la figura 21.
Figura 21. Estructura del estado de transicin ET con el stretching simultneo de las
coordenadas de reaccin C2C2y H4O2.
Con la finalidad de corroborar que el estado de transicin encontrado corresponde

a la reaccin de inters, se llev a cabo un clculo IRC. El resultado condujo al
producto y al sistema de los reactantes previamente optimizados, tal como se
muestra en la figura 22.
Figura 22. Esquema de los clculos IRC aplicados al estado de transicin ET.
32

De acuerdo a los resultados, se observa que en la zona de los reactantes el piruvato
se encuentra a 4.96 de distancia de la molcula iluro y a 3.51 de distancia con
respecto a la coordenada de reaccin R2, orientando su grupo carboxlato hacia el
grupo 4NH2. A medida que la molcula de piruvato se acerca al carbono C2 del
iluro, sta cambia su orientacin y es el oxigeno O2quien queda ms prximo al
grupo 4NH2, otorgando la configuracin tipo S presente en el LThDP. Una vez
que la reaccin cruza la zona del estado de transicin y hasta la formacin del L
ThDP, la longitud de enlace entre el carbono C4 del anillo pirimidnico y el
nitrgeno N4 del grupo imino disminuye, debido a la transferencia protnica
desde el grupo 4NH2 hacia el oxigeno O2. Como consecuencia, la densidad de
carga negativa sobre el N4 aumenta en la formacin del LThDP, tabla XI. De
igual forma, la distancia del enlace de hidrgeno formado entre el residuo y el
nitrgeno N1, disminuye desde 1.57 a 1.43 , sin producirse transferencia
protnica, quedando el anillo de pirimidnico en la forma de 4iminopirimidina.
Adems, estructuralmente se observa que durante toda la reaccin el sitio

preferencial de protonacin del anillo de pirimidina, correspondiente al nitrgeno
N1, se encuentra desprotonado, figura 23, al igual que en la estructura cristalina de
la AHAS. Mostrando que el grupo imino cuaternario puede formarse debido a la
estabilizacin de la carga negativa sobre el nitrgeno N1 por parte del enlace de
hidrgeno formado con el residuo, el cual esta a una distancia de 1.57 del
nitrgeno N1 en la zona de los reactantes y en el estado de transicin ET.
H3C
H3C
O
O
H
1.57
:N
H3C
O
H
:N
R
N
..
..
NH2
H3C
R
N
..
NH2
1.33
Figura 23. Estabilizacin por enlace de hidrogeno del sitio preferencial de protonacin del
anillo de aminopirimidina en la forma AP con R igual a 5(2[hidroxidifosfato]etil)4metil
1,3tiazol3io.
33

Adicionalmente, el anillo pirimidnico durante la reaccin se encuentra con sus
enlace deslocalizados, segn las longitudes y rdenes de enlace que muestra el
anillo, tablas XII y XIII, respectivamente. En tanto, las cargas parciales para los
tomos de anillo pirimidnico, obtenidas del anlisis NBO, se presentan en la XIV.
As, las principales diferencias que ha otorgado el refinamiento de la SEP a nivel

B3LYP/631++G(d,p) en comparacin a la construida con el mtodo PM3, recaen
principalmente en que el mecanismo de reaccin ocurre de manera concertada y
no por etapas y que para la formacin del grupo imino del anillo pirimidnico no
necesaria la protonacin del nitrgeno N1. De esta manera, segn los resultados
obtenidos es posible que el anillo pirimidnico no se encuentre bajo la forma de
APH al momento de realizar tanto el ataque nucleoflico sobre el carbono
carbonlico C2, como la transferencia protnica hacia el oxigeno carbonilico O2.
34

En virtud de los resultados obtenidos de la SEP corregida a nivel DFT, se propone
el siguiente mecanismo, figura 24, para la formacin del intermediario LThDP.
Figura 24. Mecanismo de reaccin propuesto para la formacin del intermediario LThDP
mediante clculos a nivel B3LYP/631++G(d,p).
Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de energa que se muestra

en la figura 25. La barrera de activacin observada para la formacin del
intermediario LThDP es de aproximadamente 21 Kcal/mol. El valor de esta
barrera de activacin est por debajo de la barrera de activacin terica informada
en otros estudios, la cual tiene un valor de 35.83 Kcal/mol segn clculos realizados
en fase gas y con los sustratos aislados a nivel DFT. La barrera de activacin
experimental es de 16.21 Kcal/mol.
Figura 25. Diagrama de energa para la SEP a nivel B3LYP/631++g(d,p).
35
3.2
Estudio de reactividad.
Con el fin de complementar los resultados anteriores se realiz un estudio de

+
-
reactividad en trminos de las funciones de Fukui f y f de las diferentes especies
+
-
participantes en la reaccin. Las funciones f y f se calcularon de acuerdo a la
metodologa implementada en Jaguar 7.7 y los resultados se muestran en la

figura 26, en la cual las funciones se visualizan como isosuperficies. Para las
molculas de APIluro, APHIluro y para el estado de transicin ET obtenido de
-
la SEP DFT se calcul la funcin f . En tanto, para la molcula de piruvato se
calcularon las funciones f +y f -. Las zonas azules de la funcin f - corresponden a

regiones que pierden densidad electrnica, cuando la molcula se somete a un
ataque electroflico o cuando la molcula acta como un nuclefilo. Por otro lado,
las zonas rojas de la funcin f +corresponden

a regiones que ganan densidad
electrnica cuando la molcula sufre un ataque nucleoflico o cuando la molcula

acta como un electrfilo.
Figura 26. Funciones de Fukui f para el (A) APHIluro, (B) APIluro, (C) estado de
transicin ET y (D) piruvato. Funcin de Fukui f + para (E) piruvato.
36

Los tomos que no poseen regiones coloreadas no presentan reactividad. En este
sentido, en la estructura del iluro en la forma APH se puede apreciar que los
centros nucleoflicos ms importantes corresponden a los oxgenos carboxlicos del
residuo, en cambio el carcter nucleoflico del carbono C2 del anillo de tiazolio es
muy bajo. Sin embargo, en el caso del iluro bajo la forma AP se observa que el
tomo con mayor carcter nucleoflico corresponde al carbono C2, como es de
esperar para que se produzca el ataque nucleoflico a la molcula de piruvato. Por
-
otro lado, los ndices atmicos de Fukui fC2 calculados sobre el carbono C2,
resultan ser 0.34 y 0.00 para las formas AP y APH, respectivamente, figura 27.
Estos resultados sugieren que el ataque nucleoflico del iluro sobre el piruvato
requiere al iluro en su forma AP (APIluro).
Figura 27. ndices atmicos de Fukui f para APIluro y APHIluro. Con R1=
CH2CH2OH.
En lo que respecta al sustrato, la molcula de piruvato, muestra un importante

carcter nucleoflico sobre todos los tomos de oxgenos y el carbono C2muestra
caractersticas de electrfilo. Los ndices de Fukui atmicos para el carbono C2y
-
el oxigeno carbonilico son fC+2a = 0.51 y el foo
O2a
= 0.24, figura 28. Estas caractersticas
complementarias entre APIluro y el piruvato sugieren que la reaccin de

formacin del LThDP ocurra mediante el mecanismo postulado a nivel DFT.
+
Figura 28. ndices atmicos de Fukui (A) f y (B) f para la molcula de piruvato.
37

En el estado de transicin ET se puede observar que las funciones de Fukui antes
mencionadas se mantienen y los lbulos estn dirigidos en la orientacin correcta.
Es decir el lbulo del tomo C2 est orientado hacia el carbono C2y el lbulo del
oxigeno carbonilico est orientado hacia el hidrgeno del grupo 4NH2. En este
estado de transicin postulado, el ndice local de Fukui sobre el oxigeno carbonilico
de la molcula de piruvato alcanza el valor mximo de 0.27, figura 29, que
comparado con su respectivo valor en la molcula de piruvato aislada de 0.24,
indica el aumento en el carcter nucleoflico de este oxigeno como consecuencia
del ataque del iluro sobre el carbono C2.
-
+
Figura 29. ndices atmicos de Fukui f y f , en parntesis, para el estado de transicin
ET de la SEP DFT. Con R1= CH2CH2OH.

+
En la figura 29, la funcin condensada de Fukui f se muestra entre parntesis.
Aqu se observa que otra de las variaciones presentes en el estado de transicin ET,
-
es la disminucin de los ndices de Fukui f para los nitrgenos N1, N4 y para el
+
carbono C2. La funcin condensada de Fukui f para el carbono C2 tambin
disminuye en esta etapa de la reaccin.

En definitiva, estos resultados complementan el mecanismo de reaccin postulado
a nivel DFT. La nula reactividad del carbanion C2 cuando el anillo pirimidnico se
encuentra bajo la forma del APH deja en evidencia que al momento del ataque
nucleoflico el anillo pirimidnico se encuentra con la forma de AP.
38
3.3 Anlisistermodinmico.
Los resultados de la exploracin de la SEP y de la optimizacin del estado de
transicin a nivel DFT sugieren que durante el ataque nucleoflico del iluro, a la
molcula de piruvato, el anillo pirimidnico se encuentra con el nitrgeno N1
desprotonado y el nitrgeno N4 en su forma imino. Adems, los clculos IRC
indican que el producto LThDP se encuentra tambin con el nitrgeno N1
desprotonado y el nitrgeno N4 se encuentra en su forma imino, a diferencia de lo
reportado para enzimas ThDP dependientes.
Con la finalidad de corroborar estos resultados y determinar el estado de
protonacin del nitrgeno N1 del anillo pirimidnico durante la reaccin, desde el
punto de vista termodinmico se ha estudiado el equilibrio acido base entre el
residuo altamente conservado GLU139, simulado con una molcula de acido
actico y las formas AP y APH del iluro, figura 30, considerando medios de
diferente constante dielctrica. En la tabla XV, se presentan los valores de losG
para cada uno de los medios y en la figura 30 se muestran algunas longitudes de
enlace () y cargas parciales del tipo NBO para algunos de los tomos ms
relevantes de la reaccin.
Figura 30. Equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con R1= CH2CH2OH.
39

En este sentido, el equilibrio involucra directamente la estabilidad de las bases
conjugadas formadas, contrastando la factibilidad de la protonacin del nitrgeno
N1 del anillo pirimidnico por parte del residuo GLU139. Los resultados que se
muestran en la tabla XV indican que en los tres medios considerados la especie
termodinmicamente favorecida es el iluro con el nitrgeno N1 desprotonado, la
forma APIluro. Este resultado est en concordancia con los resultados descritos en
las secciones anteriores, es decir, durante el ataque nucleoflico el anillo
pirimidnico se encuentra con el nitrgeno N1 desprotonado al igual que el
producto LThDP formado. Una mayor estabilizacin de la base conjugada de la
forma APHdebido a la deslocalizacin de la carga negativa del nitrgeno N1 en
el anillo pirimidnico, permite que la forma AP sea energticamente ms estable.
En comparacin, la base conjugada del acido actico posee una menor cantidad de
estructuras resonantes capaces de estabilizar la carga negativa sobre el oxigeno O1.
Estos resultados adems, presentan una concordancia con el estado de protonacin
del residuo GLU139 encontrado en las diferentes estructuras cristalinas obtenidas
de la AHASy con los clculos de los pKa experimentales del nitrgeno N1
y del grupo carboxlato del residuo GLU139, que tiene valores de 7.0 y 9.1,
respectivamente, donde el rango de pH de mayor actividad cataltica que presenta
la AHAS es de 7.5, aproximadamente. Sin embargo, tambin se observa una
fuerte dependencia del valor de DG con el medio, lo que sugiere la posibilidad que
en el sitio activo de la enzima la forma APH pueda existir debido a
estabilizaciones producidas por los residuos aminoacdicos y que por ende es
posible que la forma APHpueda participar en otras etapas del ciclo cataltico de la
AHAS.
40
Capitulo 4: Conclusiones y proyecciones
Capitulo 4
Conclusiones y proyecciones
n este captulo se presentan las conclusiones referentes a los resultados

obtenidos en la presente tesis. Entre ellas se encuentran la determinacin
del mecanismo de reaccin para la formacin del intermediario LThDP,
la limitacin del anlisis energtico de la reaccin al trabajar en fase gas y con los
sustratos asilados y la disyuntiva existente entre cual es la forma del anillo de
pirimidina en el intermediario iluro a la hora de llevar a cabo el primer paso del
ciclo cataltico. Adems se presentan las posibles proyecciones necesarias para
complementar las hiptesis investigadas.
41
4.1 Conclusiones
Los resultados de la presente tesis permiten concluir lo siguiente:
1. La reaccin de formacin del intermediario LThDP ocurre va un
mecanismo concertado, es decir la carboligacion C2C2y la transferencia
protnica desde el grupo 4NH2 hacia el oxigeno carbonilico O2 de la
molcula de piruvato ocurren de forma simultnea.
2. Durante la reaccin el tomo N1 del anillo pirimidnico esta desprotonado.
3. En todo momento el cofactor ThDP se encuentra estabilizado a travs de
un fuerte enlace de hidrogeno formado entre el anillo pirimidnico y el
grupo carboxlico del residuo acido glutmico, a 1.57 , estabilizando la
eventual carga negativa sobre el tomo N1.
4. La estructura optimizada del estado de transicin muestra valores mximos
de los ndices atmicos de Fukui sobre el oxigeno carbonilico de 0.27
comparado con el valor de 0.24 del piruvato aislado, indicando el aumento
de su carcter nucleoflico como consecuencia del ataque del tomo C2 del
iluro sobre el carbono C2de la molcula de piruvato. Tambin se observa
que la funcin de Fukui sobre el tomo C2 est orientada hacia el tomo
C2del piruvato evidenciando el ataque nucleoflico en curso.
5. La barrera de activacin observada es de 21.87 Kcal/mol en
correspondencia al valor reportado en literatura de 16.21 Kcal/mol.
6. La estructura optimizada del producto LThDP muestra que el tomo N4
est en su forma imino mientras que el nitrgeno N1 esta desprotonado.
7. Los resultados adems indican que en los tres medios considerados la
especie termodinmicamente favorecida es el iluro con el nitrgeno N1
desprotonado.
8. La participacin del anillo pirimidnico en la forma APH durante la
reaccin entre el piruvato y el iluro no est avalada por los clculos
qumicos cunticos de esta tesis.
42
4.2 Proyecciones
Con el fin de corroborar el mecanismo de reaccin obtenido, cuantificar la
estabilizacin otorgada por el ambiente enzimtico en la reaccin y
principalmente para determinar cul de las dos formas tautomericas del anillo
de pirimidina es la involucrada en la formacin del intermediario LThDP, para
el presente trabajo de tesis se proponen como proyecciones:
Realizar simulaciones de dinmica molecular, para encontrar una

estructura representativa del sitio activo de la enzima. Con los resultados
de las simulaciones determinar aquellos aminocidos que aporten
mayor estabilidad al cofactor y a la molcula de piruvato, mediante
clculos de energas de interaccin.
Con el resultado de la simulacin de dinmica molecular realizar la

exploracin de la superficie de energa potencial, mediante clculos
hbridos QM/MM, con la finalidad de incorporar el ambiente
enzimtico en la formacin del LThDP y cuantificar su efecto sobre el
mecanismo de reaccin propuesto.
43
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Chemistry. 2003. 28: 76397644.
46

Estudio Químico Computacional Sobre La Formación Del Intermediario L-THDP en El Ciclo Catalítico de La Enzima Acetohidroxi Sintasa

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Universidad de Concepcin

Facultad de Ciencias Qumicas

Estudio qumico computacional sobre la

Tesis para optar al grado acadmico de Licenciado en Qumica y al

Omar Blas Alvarado Carripn

Concepcin, Octubre del 2012

del anillo pirimidnico por parte del

aminocido glutamato. Los clculos computacionales se realizaron con el paquete

Licenciatura en qumicaqumico Universidad de Concepcin

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Figura 17: representacin 3D de la superficie de energa potencial a nivel DFT ... 28

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Figura 1. Sntesis de (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2hidroxibutirato. Los tomos de

Posteriormente la enzima puede formar dos tipos de productos, dependiendo de

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metil1,3tiazolio, el cual es el derivado activo de la vitamina B1 y es conocido

Figura 2. Estructura del cofactor tiamina difosfato con diedros p y T.

La conformacin tipo V es la que confiere la actividad al ThDP, debido a la

Figura 3. Mecanismo de protonacin del cofactor ThDP correspondiente a las etapas de

El ciclo cataltico de la AHAS postulado hasta el momento se muestra en la

comnmente conocido como 2acetolactatotiaminadifosfato (ALThDP), cuando

Figura 5. Ciclo cataltico de la enzima AHAS reportado en literatura.

De acuerdo a lo postulado en bibliografa, un punto a destacar en este tercer paso

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1.3 Propuesta de investigacin.

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Figura 6. Mecanismo de formacin del intermediario LThDP en literatura.

Adems, en este paso se requiere de la protonacin del oxgeno carbonlico de la

Figura 7. Mecanismo postulado para la formacin del intermediario LThDP.

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1.4 Hiptesis y objetivos del trabajo de tesis.

La protonacin del oxgeno carbonlico de la molcula de piruvato en la

Objetivo general: modelar tericamente mediante mtodos mecnico

1. Cintica: explorar el mecanismo de reaccin y determinar la barrera

2. Reactividad: calcular las funciones de Fukui y los ndices atmicos

3. Termodinmica: calcular los DG en fase gas y en solucin para la

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n este captulo se presenta la metodologa empleada para la construccin

empleando la teora de los funcionales de densidad (DFT), adems se indica la

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2.1 Construccin de la SEP con los sustratos aislados.

Figura 8. Coordenadas de reaccin para exploracin de SEP en la formacin del

Con el propsito de considerar de una manera simple el ambiente apoenzimatico

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2.2 Clculos de reactividad.

visualizar y cuantificar respectivamente, la reactividad de las distintas especies

reactividad global de la molcula respecto a un centro electroflico. En tanto la

funciones estn definidas por las ecuaciones 1 y 2.

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2.3 Clculos termodinmicos.

Figura 9. Equilibrio termodinmico entre APIluro y APHIluro. Con R1= CH2CH2OH.

Los resultados de las funciones termodinmicas entregadas por los clculos de

Etot = ESCF + ZPE + EInt

H corr = Etot + kBT

Gcorr = H corr - TStot

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D solucionG 0 = D gas G 0 + D solvBG 0 - D solvAG 0