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1.1.1.5. Microscopia de contraste de fases e interferencia de Nomarski.

Las clulas vivas se pueden observar con nitidez en un microscopio de contraste de
fases o de contraste de fases interferencial. La posibilidad de que algunos componentes
de la clula puedan perderse o distorsionarse durante la preparacin de las muestras no
ha dejado de preocupar a los especialistas en microscopia. La nica solucin a este
problema es examinar las clulas mientras an estn vivas, sin ningn tipo de fijacin
ni congelacin. Para este propsito son tiles microscopios con sistemas pticos
especiales.
Cuando la luz pasa a travs de una clula viva, la fase de la onda luminosa vara en
relacin al ndice de refraccin de la clula: la luz que pasa a travs de una zona
relativamente gruesa o densa de la clula, como por ejemplo el ncleo, se retrasa y su
fase queda desplazada de forma correspondiente respecto a la de la luz que ha pasado a
travs de una regin adyacente de citoplasma, ms fina. El microscopio de contraste de
fases y el microscopio de contraste de fases interferencial aprovechan los efectos de
interferencia que se producen cuando se combinan estos dos grupos de ondas, creando
de esta forma una imagen de la estructura celular. Ambos tipos de microscopios pticos
se utilizan habitualmente para visualizar clulas vivas.
1930 Labedeff : Disea primer microscopio de contraste interferencial.
1932 Frits Zernike : Inventa microscopio de contraste de fases.
1952 Nomarski : Inventa y patenta el sistema de contraste Interferencial que
lleva su nombre.
1953 Premio Nobel de Fsica otorgado a Zernike.

Objetivo
La microscopia de contraste de fases y la del microscopio de interferencia nos dan la
posibilidad de observar clulas vivas y sin ninguna preparacin , ya que al realizar otros
procedimientos existe la posibilidad de que algunos de sus componentes puedan
perderse o distorsionarse por mtodos como la fijacin, coloracin, congelacin, y
otros, asi, estos instrumentos pticos ayudan a resolver el problema.

Principio de la microscopia de contraste

Las clulas vivas son transparentes a la luz visible, por lo tanto los rayos de luz
pasan a travs sin sufrir prdidas en intensidad.
La luz transmitida a travs de las clulas
vivientes, sin embargo, encuentra a su paso,
regiones de ndices de refraccin diferentes, y
diferentes grosores y/o densidades, lo que es
capaz de alterar su velocidad y su direccin.
En la Figura 1 se da la representacin
esquemtica
en
donde
dos
regiones
adyacentes de una misma clula, A y B, de un
diferente grosor, t1 y t2 y con diferentes
ndices de refraccin, n1 y n2, son atravesadas
por un rayo luminoso. Las variaciones en
grosor e ndices de refraccin son capaces de producir una diferencia en el curso ptico
de la luz transmitida por las dos regiones. En este caso especfico, le toma ms tiempo
pasar a la luz a travs de la fraccin B, cuyo ndice de refraccin es mayor (n2) y por lo
tanto esta retrasada la onda del rayo en velocidad con respecto al que es capaz de
atravesar la porcin A, cuyo ndice de refraccin es ms bajo.
Si la diferencia de los ndices de refraccin es pequea, la magnitud del cambio de
fase inducido igualmente es muy pequea y se mide en trminos de longitudes de onda
(). As, en la representacin de la Figura 1, el rayo que pasa a travs de la parte B se
muestra retrasado 1/4 de longitud de onda ( /4) y emerge fuera de fase. con respecto
a la transmisin que nos muestra la parte A.
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Diseo del instrumento ptico

El sistema ptico del microscopio de contraste de fases difiere del microscopio
ordinario (de luz) solamente en la adicin de un diafragma anular colocado debajo de la
platina para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho y una placa de difraccin
montada en el objetivo, un diagrama representado en la Figura 2, muestra el diseo de
un microscopio de contraste de fase y el curso que siguen los rayos que pasan a travs
de una estructura celular.
La fase relativa de luz desviada, saldra 1/4 de longitud de onda retrasado, s es
capturada y cambiada con la introduccin de un material retrasador de fase, en aquella
parte de la placa de difraccin que sea cubierta por cualquiera de los dos rayos,
aumentando an ms, otro 1/4 de longitud de onda y logrando retrasar en rayo
luminoso en total 1/2 longitud de onda, con lo que se logra que este rayo quede
totalmente fuera de fase con respecto a la luz no desviada.
Cuando la diferencia se presenta es por que los ndices de refraccin son diferentes y
el microscopio de contraste de fase transforma estas variaciones en brillo o intensidad.
Las estructuras celulares presentan muchas irregularidades y son objetos pticamente
no homogneos as, la luz que "choca" con el objeto se presenta desviada.

Contraste de fase oscuro o positivo: cuando los rayos de luz, la desviada y la no

desviada tienden a cancelarse creando una interferencia destructiva y hacer que el
objeto aparezca mucho ms oscuro que los alrededores.
Contraste de fase brillante o negativo: se presenta cuando retrasamos la luz no
desviada y la hacemos 1/4 de longitud de onda menor, lo que hace que salga al tiempo
con la luz desviada, que tiene un retraso de 1/4 de longitud de onda, logrando de esta
manera que salgan al mismo tiempo y se recombinen para dar brillo, creando una
interferencia constructiva aumentando en esta forma el objeto mientras su contorno
permanece con menos intensidad.
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/phasecontrast/phase.html

Microscopio de interferencia

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La

microscopia de interferencia o tcnica DIC (Diffential

Interference Contrast) Nomarski, permite la visualizacin de especmenes mucho ms
densos gracias a que la imagen proyectada es tridimensional. Los principios pticos y
la operacin del DIC, son bien diferentes a los de microscopia de contraste y su
operacin es compleja.
Como los cambios de fase producidos por las estructuras celulares son muy
pequeos y por lo general de fracciones de longitud de onda, para poder medir este
cambio con precisin es necesario separar por completo la luz que se transmite
directamente de la desviada por el objeto, tal como lo hace el microscopio de
interferencia.

Nomarski differential interference contrast microscopy.

Fundamentalmente, la luz que se
emplea en este caso es polarizada
(blanca o monocromtica), o sea que
tiene la propiedad de concentrar los
rayos dispersos en uno solo y se
adicionan a los lentes objetivos cuatro
componentes
pticos:
Polarizador,
prisma DIC, sealador DIC y un
analizador.
El objeto espcimen que se
encuentra en fase toma direcciones
diferentes de acuerdo con los valores de
grosor e ndices de refraccin que
presente. El prisma (birrefringente)
situado sobre la parte posterior del
plano focal del objetivo es usado para

recombinar las dos ondas en un solo rayo.

El objeto atravesado por los dos rayos vuelve a otro prisma (Wollaston) que es el
que en realidad crea la interferencia (destructiva o constructiva), as el plano
polarizado es recapturado por un analizador, que transforma esto en ondas de vibracin
de la misma longitud y habilita la interferencia como respuesta a estas dos ltimas
acciones tenemos que diferentes regiones del objeto estudiado apareceran con ms
brillo o menos brillo sobre un fondo oscuro.
Los espacios laterales de las dos ondas se miden en trminos de micrmetros y no
se exceden en el tamao de la resolucin perceptible al ojo humano, logrando asi que
no se presente una doble imagen al observador.
En esta microscopia incluir el tipo Nomarski (prisma), lo que obtendremos ser
una apariencia seudo tridimensional del objeto.

Aplicaciones

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Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de fases,

del microscopio de contraste de fases interferencial y del microscopio
de campo oscuro estriba en que los tres permiten observar las clulas en
accin y estudiar los movimientos implicados en procesos como la
mitosis o la migracin celular. Puesto que muchos movimientos son
demasiado lentos para ser observados a tiempo real, normalmente
resulta til hacer pelculas o vdeos por el sistema de aceleracin de
movimiento (microcinematografa). En esto casos, se toman fotografas sucesivas,
separadas por breves perodos de tiempo, de modo que cuando la pelcula o video
registrados se proyectan a la velocidad normal los acontecimientos aparecen muy
acelerados.
Esta
tcnica
microscpica
se usa para
medir ndice
de refraccin y
concentracin
de slidos de
las estructuras
celulares utilizando un metodo de refractometra por inmersin, as se sumergen las
clulas en una solucin isotnica cuyo ndice de refraccin puede variarse.
Esta refractometra se ha empleado para ser medidos en procesos como la divisin
celular y el desarrollo de esporas fungicas. Igualmente es til para determinar masa
seca y espesor de las estructuras celulares.
2. Microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
2.1. Fundamento
La posibilidad de que algunos de los componentes celulares se distorsionen en el
momento del corte y preparacin, ha conducido a los cientficos a crear microscopios
con los cuales se pueda observar clulas vivas sin ningn tipo de fijacin ni de
congelacin para este propsito se utilizan sistemas pticos especiales (1).
C uando la luz pasa a travs de una clula viva, la fase de la onda luminosa vara con
relacin al ndice de refraccin de la clula crendose una interferencia, que retrasa la
onda luminosa cuando atraviesa una zona relativamente densa la microscopia de
interferencia diferencial de Nomarski, aprovecha estos efectos de interferencia, para
crear una imagen de la estructura celular viva, ntida y tridimensional (1).
Existen en principio tres tipos de microscopios de interferencias: los microscopios
de interferencia de longitud desdoblada, los de dos ondas y los de ondas mltiples. Los
de una sola onda, generalmente se denominan microscopios de contraste de fases. Los
de dos ondas, son los autnticos microscopios de interferencia. En el sistema de
iluminacin, sistemas pticos diversos, desdoblan el rayo incidente en haces prximos
unos del otro en forma variable segn lo desee el operador un segundo sistema ptico,
simtrico al primero, pero situado detrs del objetivo, recompone los dos haces
hacindolos interferir para construir la imagen. Los de ondas mltiples, no son
utilizados en microscopia biolgica sino en metalografa, para medida de la profundidad
de las estructuras (3).
2.2. Partes del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
Los componentes bsicos del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski son
iguales al microscopio ptico, difiriendo en los sistemas que transmiten el rayo de luz
incidente (3) estos son:
Filtro polarizador plano: polariza el rayo de luz incidente que proviene de la
lmpara en uno solo y con una misma longitud.
Prismas de Nomarski modificado por Wollaston: son dos, uno ubicado dentro del
condensador birrefringente que genera dos rayos de luz paralelos formado un
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ngulo de 90? el
segundo se ubica en la
parte
posterior
del
objetivo, es ajustable y
en l convergen los dos
rayos de luz generados
por el prisma inferior
para
que
se
recompongan.
Filtro polarizador o
analizador: se ubica en
la parte superior de los
objetivos y del prisma
superior y su funcin
es
recombinar
los
rayos de luz, para
producir
la
imagen
seudotridimensional
observada a travs del
ocular.

2.3. Principio ptico

del
microscopio
de
interferencia

diferencial de Nomarski
La microscopia de contraste de interferencia diferencial de Nomarski usa la
combinacin de un sistema de luz polarizado y dos rayos divididos para crear fases de
diferencias en la muestra. Esto provee una imagen tridimensional de la muestra sin los
halos que rodean a la clula en las imgenes generadas en los microscopios de fase de
contraste (2).
El principio del sistema es el siguiente: se utiliza luz blanca polarizada por el filtro
plano, este rayo de luz monocromtico incide en el condensador completamente
abierto y el prisma de Nomarski birrefringente que se encuentra dentro de l, genera
dos rayos de luz paralelos, uno incide sobre la muestra a analizar y el segundo pasa en
forma paralela sobre la muestra.
Ocurre una diferencia de la trayectoria local del rayo que atraviesa el espcimen
causado por el ndice de refraccin y de grosor, creando una fase distorsionada del rayo
incidente que se representa por el desplazamiento del mismo luego estos rayos
atraviesan los lentes del objetivo y tambin al segundo prisma de Nomarski, all
ubicado, en diferentes porciones, debido a la ruta desigual en la trayectoria ptica con
la cual inciden en l se forma una imagen doble de la muestra lateral y
longitudinalmente. Al atravesar estos rayos polarizados y an paralelos, el filtro
analizador los transforma a un mismo plano de vibracin, es aqu en donde ocurre la
onda de interferencia constructiva o destructiva, que es ocasionada por las diferencias
en la trayectoria ptica dentro de la muestra y se manifiestan al observarse en la
imagen reas brillantes y opacas o reas claras u oscuras. En donde no ocurre la
interaccin entre el par de rayos, se produce un fondo gris uniforme.
Los espacios laterales de las dos ondas se miden en trminos de micrmetros y no
se exceden en el tamao de la resolucin perceptible al ojo humano, logrando as que
no se presente una doble imagen al observador, sino una apariencia seudo
tridimensional del objeto estudiado sobre un fondo uniforme.
2.4. Utilidades del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
El uso de este microscopio hace posible determinar el ndice de refraccin, la
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concentracin de slidos, la masa seca y el espesor de las estructuras celulares y estos

cambios han sido estudiados en los procesos como la mitosis o la migracin celular
unido a un mtodo de refractometra por inmersin4.
2.5. Ventajas
Produce una imagen brillante contra un fondo oscuro sin halos de difraccin de
una clula viva.
Determinacin del ndice de refraccin
Determinacin de slidos, masa seca y espesor de las estructuras celulares
2.6. Desventajas
Alto costo del equipo por los diferentes aditamentos utilizados en el microscopio
Costo alto y mantenimiento cuidadoso de la muestra de clulas vivas
La microcinematografa requerida para mirar los procesos que realiza la clula in
vivo requiere de equipos especiales y personal entrenado
3. Bibliografa
1. Alberts, A., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K y Watson, J. 1994. Biologa
molecular de la clula. Ediciones Omega. Barcelona, Espaa. Pg.153154.
2. Gerhardt, P. 1994. Methods for general and molecular bacteriology. American
Society for Microbiology. Washington, D. C. USA. Pp. 1418
3. Locquin, M y Langeron, M. 1985. Manual de Microscopia. Editorial Labor. Barcelona,
Espaa. Pg. 4245.
4. Wilson, G y Morrison, J. 1991. Citologa. CECSA. Mxico, D. F. Mxico. Pg. 296.307.

Bibliografa recomendada
Alberts, A. 1996. La clula. Ediciones Omega, Barcelona, Espaa. pg. 155.

Celis, J. 1994. Cell biology. A laboratory hanbook. Academic press, Inc. 2: 515.
Gerhardt, P., et al. 1994. Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology.
Washington, D.C., USA. pp. 1418.

Wilson, G. y Morrison, J. 1991. Citologa. CECSA. Mexico, D.F., Mxico. pg. 296307.

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