Chergui Achour

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE MOULOUD MAMMERI DE TIZI OUZOU
FACULTE DES SCIENCES BIOLOGIQUES ET DES SCIENCES AGRONOMIQUES
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE-MICROBIOLOGIE
MEMOIRE DE MAGISTER
Spcialit: Sciences Biologiques
Option: Biochimie applique aux bio-industries
Prsent par :
Mr CHERGUI Achour
SUJET :
Caractrisation de bactriocines anti-listeria produites par

des souches lactiques isoles partir du lait de chamelle
Devant le jury :
Prsident : Mr. MATI ABDERRAHMANE. Professeur lUMMTO.
Rapporteur : Mr. HOUALI KARIM. Maitre de confrences A lUMMTO.
Examinateurs : Mr. DJENANE DJAMAL. Professeur lUMMTO.
Mr. RIBA AMAR. Maitre de confrences A lUMBB.
Mr. OUELHADJ AKLI. Maitre de confrences B lUMMTO.
Anne universitaire : 2013 / 2014
REMERCIEMENTS
Au terme de ce travail, je remercie avant tout, le bon dieu, crateur de toutes les
cratures, mobiles soient elles ou immobiles. Je le remercie pour son uvre et pour ce quil a
fait de moi: Mon dieu nous ne savons rien sauf ce que tu nous as fait savoir, tu es le savant, tu
es le sage.
Mes remerciements les plus distingus pour mon promoteur, le Docteur HOUALI
Karim, maitre de confrences luniversit Mouloud MAMMERI de Tizi-Ouzou, pour ce
quil a transmis pour moi comme savoir et comme caractres de bonne personnalit. Quil
trouve ici, les sentiments de mon profond respect.
Merci pour Mr MATI. A, mon professeur, davoir accpt de prsid le jury qui a
valu ce travail, dautre part, je le remercie chaleureusement davoir t celui qui ma form
durant mon cursus.
Je remercie Mr Djennane. D, mon professeur, dtre aussi un membre du jury et lun
de mes formateurs.
Merci pour Mr OUELHADJ. A et Mr RIB. A, davoir accept dtre membres du jury
pour valuer ce travail, pour lenrichir par leurs remarques et ainsi valoriser, son contenu
scientifique et sa prsentation.
Je remercie Mme Iratni Ghenima et Mlle Meguenni Nassima, maitres assistantes
luniversit Mouloud MAMMERI de Tizi-Ouzou, pour leurs soutiens moral et matriel, pour
leurs instructions et leur esprit dquipe.
Je remercie Monsieur BARIZ Karim, maitre assistant luniversit Mouloud
MAMMERI de Tizi-Ouzou, pour son aide lors de lentretien des souches bactriennes et pour
ses astuces pratiques, les plus performantes.
Je remercie tous les membres du laboratoire LABAB: Mr SEBBANE. H, Mme
SEBBANE ALMI. D, Mme BEDOUHANE, Mme SENANI. N, Mme SENOUCI. C, Mme SI
AHMED. S ainsi que les deux ingnieurs: Samia et Hassina, pour leur aide et leur
disponibilit.
Je remercie Mlle SALMI Djouza pour sa comprhension et ses services, et pour tout
cet esprit dquipe durant les manipulations et aussi pour son esprit de critique qui nous a
permis davancer plus loin. Je remercie aussi Mlle ISSELNANE Souad pour son aide.
Je tiens remercier chaleureusement, mon professeur et mon voisin, Mr ALILI Nacer,
enseignant la facult des sciences biologiques et des sciences agronomiques, pour son aide
colossale et son soutien moral, quil trouve ici les sentiments de mon profond respect.
Mes remerciements particuliers pour mon frre Sofiane pour son aide matriel, car
cest grce lui que jai pu visualiser mes rsultats, je le remercie aussi pour sa
comprhension.
DEDICACES
Je ddie ce travail,
A mes parents, Mnd Ouramdane CHERGUI et Djamila ABDICHE, qui mont offert
leur ducation, arme de croyance, de patience, de volont et surtout de simplicit.
A mon frre Nourdine,
A mon promoteur, Monsieur HOUALI Karim, maitre de confrences et vice doyen
luniversit Mouloud MAMMERI de Tizi-Ouzou, que je respecte beaucoup et que je vois un
pilier essentiel pour la science. A lui le total mrite du fruit de ce travail, car, si jai aboutit
a aujourdhui, cest bien grce un encadrement parfait et des sacrifices non ngligeables
par cette personne.
A mes chers amis, Ammar BELKESSAM et Djamel BENNOUAR, qui ont t, et le
sont toujours, des frres moi, dans toutes les situations.
A la sage Samira, qui est pour moi le meilleur guide du respect et de la
comprhension, la vraie image de lducation et tout simplement, la femme idale.
A mon oncle Aziz et sa femme Amina, qui mont fournit leur aide pendant tout ce
long chemin de mes travaux.
Exceptionnellement ma sur adorable Lydia, notre petite toile naissante.
RESUME
Les bactriocines sont des molcules antimicrobiennes de nature peptidique, de poids
molculaire gnralement infrieur 10 KDa. Elles sont produites par des bactries et actives
contre des souches phyllogntiquement proches.
Nous avons test le pouvoir bactriocinogne de souches isoles du lait camelin par la
mthode de diffusion des puits, suivi du test dinactivation aux protases (GONZALEZ et al,
2007). Les souches ayant donn les meilleures zones dinhibition ont t slectionnes, il
sagit des souches : Lactococcus lactis ssp lactis CH05, Lactococcus lactis ssp raffinolactis
CH07, Lactococcus lactis ssp lactis CH08 et Lactobacillus brevis/buchnerii.
Les peptides antibactriens sont extraits par la mthode dadsorption/dsorption de
YANG (1992), puis spars par une PAGE-SDS et leur activit est dtecte par la technique
du zymogramme (NISSEN-MEYER et al, 1992).
Nous avons dautre part, ralis une caractrisation gntique de ces molcules. Pour
se faire, les deux souches de CH05 et CH07 sont choisies. Nous avons procd par la mthode
de cure des plasmides en utilisant deux antibiotiques, la rifampicine et la novobiocine, comme
agents curant. Les mutants Bac- obtenus ont subi les tests dactivit par la mthode de
diffusion des puits ainsi que par la technique du zymogramme, en utilisant comme tmoin
positif, les souches sauvages Bac+.
Les 4 souches ont donn des zones dinhibition lgard de la souche cible Listeria
innocua F, par le test de diffusion des puits avec des diamtres de 14mm, 13mm, 08mm et
16mm, pour les souches CH05, CH07, CH08 et CH15 respectivement. Ainsi que par la
technique du zymogramme avec des zones dinhibition situes entre 5 et 10KDa. Les
bactriocines produites par les trois souches de lactococcus sont sensibles aux protases
utilises, tandis que celles produites par le lactobacille y rsistent.
La disparition des zones dinhibition aprs la cure des plasmides, confirme
lemplacement plasmidique des clusters gntiques des bactriocines produites par les
souches de Lactococcus. Dautre part, lapparition de la sensibilit des mmes souches leurs
bactriocines, aprs la cure plasmidique, indique que les gnes dimmunit sont galement
ploasmidiques. Enfin, notre travail sachve avec la dtermination des CMI des extraits
bactriociniques des deux souches modles. Les valeurs trouves sont respectivement : 14,28
UA/ml et 7,14UA/ml.
Mots-cls : lait de chamelle, Lactococcus, Lactobacillus, bactriocines, zymogramme, cure
plasmidique, Listeria.
SUMMARY
The bacteriocins are of the antimicrobic molecules of peptide nature, of molecular
weight generally lower than 10 KDa. They are produced by bacteria and active against stocks
phyllo-gntically close.
We tested the capacity bacteriocinogene of stocks isolated from milk cameline by the
method of diffusion of the wells, follow-up of the test of inactivation to proteases
(GONZALEZ et al., 2007).The stocks having given the best zones of inhibition were selected,
it acts of the stocks: Lactococcus lactis ssp lactis CH05, Lactococcus lactis ssp raffinolactis
CH07, Lactococcus lactis ssp lactis CH08 and Lactobacillus brevis/buchnerii.
Antibacterian peptids are extracted by the method of adsorption/desorption of YANG
(1992), then separated by a SDS-PAGE and their activity is detected by the zymogramme
method (Nissen-meyer et al., 1992).
We in addition, carried out a genetic characterization of these molecules.To be done,
the two stocks of CH05 and CH07 are selected.We proceeded by the method of cure of the
plasmides by using two antibiotics, the rifampicine and novobiocin, like agents cleaning.The
Bac- mutants obtained underwent the tests of activity by the method of diffusion of the wells
like by the method of the zymogramme, while using like positive witness, the stocks wild
Bac+.
The 4 stocks gave zones of inhibition with regard to the stock targets Listeria innocua
F, by the test of diffusion of the wells with diameters of 14mm, 13mm, 08mm and 16mm, for
stocks CH05, CH07, CH08 and CH15 respectively.Like by the method of the zymogramme
with zones of inhibition located between 5 and 10KDa.The bacteriocins produced by the three
stocks of lactococcus are sensitive to the proteases used, while those produced by the
lactobacille resist it.
The disappearance of the zones of inhibition after the cure of the plasmides, confirms
the site plasmidic of the genetic clusters bacteriocins produced by the stocks of Lactococcus.
In addition, the appearance of the sensitivity of the same stocks to their bacteriocins, after the
plasmidic cure, indicates that the genes of immunity are also plasmidic. Lastly, our work is
completed with the determination of CMI of the extracts bacteriocinic of the two model
stocks.The found values are respectively: 14,28 UA/ml and 7,1A/ml.
Key words: milk of chamelle, Lactococcus, Lactobacillus, bacteriocins, zymogramme,
plasmidic curing, Listeria.
Liste des abrviations

ABC : protine cassette se liant avec lATP.
Amp : gne de rsistance lampicilline.
APS: Persulfate dammonium.
B. Cereus : Bacillus Cereus.
Bac+ : variant producteur de bactriocines.
Bac- : variant non producteur de bactriocines.
Bac S : variant sensible la bactriocine parentale.
BET: Bromure d'Ethidium.
BHIB: Bouillon cur cervelle.
Pb : Paires de bases.
BSA : Srum albumine bovine.
CMI : Concentration minimale inhibitrice.
Dha : Didshydroalanine.
Dhb : 2, 3-Didshydrobutyrine.
DMPG : Dimyristoyl-phophatidylglycrol.
EDTA: acide Ethylne diamine ttra actique.
EIItMan : Mannose permase du systme phosphotransfrase
Em : Erythromycine.
HPLC: Chromatographie Liquide Haute Performance.
Imm+ : variant producteur de la protine dauto-immunit.
IR : squences rptitives inverses.
IS : Squence dinsertion.
L. Monocytogenes: Listeria monocytogenes.
LAB: bactrie dacide lactique.
LTR : Longues rptitions terminales.
MRS: Man Rogosa et Sharp.
Min: Minute.
NICE: Nisine Controlled Expression.
ORF : Open Reading Frame.
Ori : Origine de rplication.
SDS-PAGE: lectrophorse sur gel de polyacrylamide au sulfate dodcylique de sodium.
PBS: Phosphate Buffered Saline.
PHK: Phospho-hexo-kinase.
S. Salivarius: Streptococcus salivarius.
S. Pyogenes: Streptococcus pyogenes.
SDS: Dodcyl sulfate de sodium.
Souche CH: souche isole partir du lait de chamelle.
TEMED: N, N, N', N'-Tetramthyl ethylnediamine.
Tn : Transposon.
TRIS: 2-amino-2-hydroxymthyl-1,3-propanediol.
UTR: untranslated region.
YGNGV : Tyrosine-Glycine-Asparagine-Glycine-Valine.
Zi : Zone dinhibition.
Liste des tableaux

Tableau I : Distribution des groupes de souches lactiques utilises pour le test dactivit par
la mthode de diffusion des puits aprs le curage des plasmides ........................................... 53
Tableau II : Valeurs des diamtres des zones dinhibition dues lactivit bactriocinogne
anti-listeria, des souches lactiques tudies ............................................................................ 56
Tableau III : rsultats de la cure plasmidique en Concentrations minimales inhibitrices
...............................................................................................................................................65
Liste des figures

Figure 1 : Organisation gntique des clusters de gnes impliqus dans la biosynthse et la
rgulation de la biosynthse des lantibiotiques ......................................................................... 4
Figure 2 : Schma de biosynthse, de sa rgulation et dimmunit de la souche productrice
pour la nisine ............................................................................................................................. 5
Figure 3 : Schma de la biosynthse, la rgulation de la biosynthse et limmunit des
bactriocines de classe IIa ......................................................................................................... 6
Figure 4 : Schma montrant linsertion du transposon accompagne de la duplication dune
squence cible de lADN receveur .......................................................................................... 12
Figure 5 : Principe du mcanisme de transposition pour les transposons ADN .................... 14
Figure 6 : Principe du mcanisme de transposition pour les rtrotransposons
.................................................................................................................................................. 16
Figure 7 : Formation de pores membranaires par le complexe nisine-lipide II selon. 23
Figure 8 : Schma montrant la structure de la mannose permase du systme
phosphotransfrase ...25
Figure 9 : Mode daction utilis par les bactriocines de classe IIa et par les lactococcines A
et B (classe IId) ....................................................................................................................... 25
Figure 10: Mode daction des bactriocines de classe Iia ...................................................... 27
Figure 11: Modle dinteraction de la protine dimmunit avec la mannose permase
phosphotransfrase EIItMan pour les bactriocines de classe IIa et certaines bactriocines de
classe IId (Lactococcines A et B) ........................................................................................... 31
Figure 12 : schma rsumant le protocole du test de diffusion des
puits...42
Figure
13 :
schma
rsumant
le
protocole
dinactivation
aux
protases43
Figure
14 :
schma
rsumant
le
protocole
de
purification
des
bactriocines..46
Figure 15: schma dtaill des tapes de prparation de la gamme de dilution de la
rifampicine 10X....................................................... ....49
Figure 16 : schma dtaill des tapes de prparation de la gamme de dilution de la
rifampicine 1X ................................................................................... .....50
Figure 17 : Schma illustrant les tapes de dtermination des CMI des bactriocines .... 55
Figure 18 : Activit des bactriocines produites par la souche CH05 ................................... 57
Figure 19 : Activit des bactriocines produites par la souche CH07 .................................. 58.
Figure 20 : Activit des bactriocines produites par la souche CH08 .................................. 58.
Figure 21 : Activit des bactriocines produites par la souche CH5 (et essai de dsorption)
.................................................................................................................................................. 59
Figure 22 : Activit des bactriocines produites par la souche CH07 (avec essai de
dsorption) ...............................................................................................................................60
Figure 23: Inactivation aux protases, des bactriocines produites par la souche CH05....... 61
Figure 24 : Inactivation aux protases des bactriocines produites par la souche CH07....... 62
Figure 25 : Diffrence daspect entre un gel dagarose ensemenc A par la souche cible et un
gel dagarose strile B, et qui justifie lapparition des zones dinhibition sur le zymogramme
.................................................................................................................................................63
Figure 26 : Bandes lectrophortiques ( gauche) des deux souches CH05 et CH07
respectivement, ainsi que leurs zones dinhibition par la technique du zymogramme ( droite)
.................................................................................................................................................64
respectivement, ainsi que leurs zones dinhibition par la technique du zymogramme ( droite)
.................................................................................................................................................64
Figure 28 : Rsultat de llectrophorse de lADN bactrien total et illustrant les profils
plasmidiques pour les variants CH05 (A), CH05 cure (A), CH07 (B) et CH07 cure (B).
................................................................................................................................................66
Figure 29: Disparition de lactivit bactriocinique de la souche CH07 aprs la cure
plasmidique
..................................................................................................................................................67
Figure 30 : Disparition de lactivit bactriocinique de la souche CH05 aprs la cure
plasmidique
................................................................................................................................................. 68
Figure 31 : Disparition de la zone dinhibition aprs la cure plasmidique de la souche CH07,
par la mthode du zymogramme .............................................................................................69
par la mthode du zymogramme .............................................................................................70
Figure 33 : Disparition, par effet de la cure plasmidique, de la bande protique correspondant
la bactriocine produite par la souche CH07 .......................................................................71
Figure 34 : Immunit de la souche CH05 sa propre bactriocine (A) et la sensibilit de son
variant cur la bactriocine parentale (B), par la mthode de diffusion sur puits ............... 72
Figure 35 : Immunit de la souche CH07 sa propres bactriocine (A) et la sensibilit de son
variant cur la bactriocine parentale (B), par la mthode de diffusion sur puits ............... 72
Figure 36: Dtermination de la CMI de la suspension bactriocinique de la souche CH05, par
la mthode du titrage sur milieu glos ..................................................................................73
Figure 37 : Dtermination de la CMI de la suspension bactriocinique de la souche CH07,
par la mthode du titrage sur milieu glos ............................................................................74.
Liste des annexes

Annexe 1 : listes du Matriel et ractifs utiliss.
Annexe 2: Composition des ractifs et des colorants.
Annexe 3 : Composition des ractifs utiliss pour lextraction de lADN bactrien.
Annexe 4: Composition des milieux de culture utiliss.
Annexe 5: Prparation du gel tricine SDS-PAGE.
Annexe 6 : Rpartition des chantillons sur le gel dlectrophorse des bactriocines.
Annexe 7 : Rpartition des chantillons sur le gel dagarose pour llectrophorse de lADN
bactrien.
Annexe 8 : Composition du gel 20% utilis en PAGE-SDS pour la sparation des
bactriocines, des autres protines bactriennes.
Annexe 9: Tableau didentification des acides amins et leur reprsentation abrge.
Table des matires

Introduction gnrale......................................................................... 1
Chapitre I : synthse bibliographique.
Les lments gntiques codant les bactriocines ................................................................ 7
I-1-Le chromosome.................................................................................................................... 7
I-2-Les lments non chromosomiques .................................................................................... 7
I-2-1-Les plasmides ................................................................................................................... 7
I-2-1-1-Dfinition ...................................................................................................................... 7
I-2-1-2-Caractristiques gnrales ............................................................................................ 8
I-2-1-3-Proprits des plasmides des bactriocines .................................................................. 8
I-2-2-Les transposons .............................................................................................................. 10
Modes daction des bactriocines ........................................................................................ 18
1-Rle des diffrentes rgions de la bactriocine ................................................................... 18
2-Le spectre dactivit.............................................................................................................. 21
3-Mode daction ...................................................................................................................... 22
3-1-Mode daction des diffrentes classes de bactriocines ................................................... 22
3-1-1-Mode daction des bactriocines de classe I ................................................................. 22
3-1-2-Mode daction des bactriocines de classe II ................................................................ 24
3-1-3-Mode daction des bactriocines de classe III ............................................................... 27
3-2-Quantification de lactivit antibactrienne ...................................................................... 27
3-2-1-Dtermination du titre en bactriocines......................................................................... 27
3-2-2-Facteurs physico-chimiques influenant lactivit des bactriocines ............... 28
Lauto-immunit et la rsistance aux bactriocines ........................................................... 30
1-Lauto-immunit .................................................................................................................. 30
1-1-Lauto-immunit des lantibiotiques .................................................................................. 30
1-2-Lauto-immunit des bactriocines de classe II ............................................................... 30
2-La rsistance aux bactriocines ............................................................................................ 32
2-1-Les diffrents types de rsistants ...................................................................................... 33
2-2-Les caractristiques des rsistants .................................................................................... 34
2-3-Le mcanisme de rsistance des cellules cible aux bactriocines..................................... 35
2-3-1-La rsistance aux lantibiotiques .................................................................................... 35
2-3-2-La rsistance aux bactriocines de classe IIa ................................................................ 36
2-3-3-Les cross-rsistances ..................................................................................................... 37
Chapitre II : Partie exprimentale

Matriels et mthodes ........................................................................................................... 38
1-Matriels................................................................................................................38
1-1-Matriel biologique .......................................................................................................... 38
1-2-Appareillage ..................................................................................................................... 38
2-Mthodes ..................................................................................................... 39
2-1-Revivification des germes................................................................................................. 39
2-2-Test d'activit par la mthode de diffusion des puits ........................................................ 39
2-2-1- Prparation du surnageant actif .................................................................................... 39
2-2-2- Prparation de linoculum de la souche indicatrice ..................................................... 39
2-2-3-Ralisation du test ......................................................................................................... 40
2-2-4-Confirmation de la nature protique des bactriocines ................................................. 40
2-3-Purification des bactriocines ........................................................................................... 44
2-3-1-Ensemencement des bactries lactiques productrices de bactriocines ........................ 44
2-3-2-Sparation des bactriocines par Electrophorse PAGE-SDS ...................................... 44
2-3-3-Expression de l'activit antimicrobienne par la technique du zymogramme ................ 44
2-4-Caractrisation gntique des bactriocines par la mthode de la cure plasmidiqu.......... 47
2-4-1-Cure des plasmides ........................................................................................................ 47
2-4-2-Contrle de la cure ........................................................................................................ 51
2-4-2-1-Extraction de lADN bactrien .................................................................................. 52
2-4-2-2-Electrophorse de lADN bactrien ........................................................................... 53
2-4-3-Confirmation de la localisation gntique des bactriocines par le test dactivit par la
mthode de diffusion des puits ................................................................................................ 53
2-4-4-Confirmation de la localisation gntique des bactriocines par la technique du
zymogramme ........................................................................................................................... 53
2-5-Caractrisation gntique des protines dimmunit aux bactriocines ........................... 54
2-6-Dtermination de la concentration minimale inhibitrice des bactriocines en unit
arbitraire (U.A/ml) .................................................................................................................. 54
Rsultats et discussions ......................................................................................................... 56
1-Test dinhibition par la mthode de diffusion des puits et sensibilit aux protases ........... 56
2-Purification des bactriocines et test dactivit par la technique du zymogramme ............. 62
3-Caractrisation gntique des bactriocines ........................................................................ 65
3-1-Vrification de la cure plasmidique........66
3-2-Caractrisation gntique des bactriocines par le test dactivit par la diffusion des puits
.................................................................................................................................................. 67
3-3-Caractrisation gntique des bactriocines par la technique du zymogramme................69
4-Caractrisation gntique de limmunit aux bactriocines .............................................. ..71
5-Dtermination des concentrations minimales inhibitrices des bactriocines ...................... 73
Conclusion .............................................................................................................................. 75
Rfrences bibliographiques
Annexes
Introduction gnrale
Introduction gnrale
La rsistance bactrienne aux agents antimicrobiens apparat de nos jours comme une
des proccupations majeures de sant publique. L'mergence et la dissmination de souches
bactriennes rsistantes rsultent de l'usage anarchique et abusif des antibiotiques
conventionnels, combin aux nombreuses mutations gntiques qui surviennent dans le
monde bactrien (PERRETEN et al., 1997). L'tendue de cette rsistance est renforce par le
retard enregistr dans le dveloppement et l'laboration de nouveaux agents antimicrobiens
(DIMARCQ et HOFFMANN, 2001).
Afin d'radiquer cette rsistance sans cesse croissante, il devient impratif et urgent de
dvelopper de nouvelles classes de composs antimicrobiens. cet gard, l'utilisation des
peptides antimicrobiens est prconise en raison de leur capacit contenir l'apparition de la
rsistance au sein des souches bactriennes impliques (PAPAGIANI, 2003; YEAMAN et
YOUNT, 2003). De par leur nature, leur varit et leurs diffrents mcanismes d'actions, les
peptides antimicrobiens notamment les bactriocines reprsentent une alternative intressante
parmi les nouvelles stratgies de contrle de la multirsistance bactrienne aux antibiotiques
(TWOMEY et al., 2002 ; PAPAGIANI, 2003; NASCIMENTO et al., 2005 ; TRAUTNER et
al., 2005).
Les bactriocines sont des peptides ou protines produites par des genres bactriens
possdant des activits antimicrobiennes, habituellement spcifiques et contre les bactries
des espces apparentes, sans tre ltales la souche productrice (BAYOUB et al., 2006).
Lutilisation des bactriocines dans le domaine alimentaire est avantageuse non seulement en
raison de leur large spectre dactivit, mais aussi parce quelles sont non toxiques, facilement
dgradables par les enzymes digestives et ne compromettent pas la prise des mdicaments
(RYAN et al., 1998). La combinaison de bactriocines avec des traitements physiques,
comme le traitement haute pression ou dans un champ lectrique, offre une conservation
plus efficace des produits alimentaires, fournissant ainsi une barrire complmentaire aux
formes les plus rsistantes comme les endospores bactriennes (GALVAREZ et al., 2007).
Aujourdhui les bactriocines des bactries Gram-positives rpertories dans la
littrature sont plus nombreuses que celles des bactries Gram-ngatives, sans doute parce
quelles ont t plus recherches. Ce sont des peptides bactricides gnralement dune taille
infrieure 10 Kda, cationiques, amphiphiles, et agissent en permabilisant la membrane des
cellules cibles (NES et al., 1996). Parmi ces bactriocines, celles produites par les bactries
lactiques (BAL) ont reu un intrt particulier en raison des possibilits quelles offrent
dapplications potentielles comme conservateurs naturels dans lindustrie alimentaire
(ENNAHAR et al., 2003).
La production de bactriocines par les bactries lactiques a t dmontre par plusieurs
auteurs, aprs expression vis--vis d'une bactrie cible appartenant le plus souvent au genre
Listeria, par la mthode de diffusion des puits (GALVEZ et al, 2007) et par le dpt de
disques imprgns du surnageant de la culture bactrienne (LABIOUI et al., 2005).
Cependant, trs peu de travaux sont effectus sur les bactries lactiques
bactriocinognes issues du lait de chamelle.
Introduction gnrale
Lexploitation du lait camelin comme source disolement de bactries lactiques
bactriocinognes dcoule de plusieurs caractristiques propres ce produit, dabord, ce lait
est caractris par sa richesse en composs antimicrobiens naturels dont le systme
enzymatique lactoproxydase, ce qui diminue la charge microbienne totale, do sa longue
conservabilit. De plus, les conditions de la traite et dentreposage de cette denre laissent
supposer la puissance dun systme antimicrobien performant engendrant une certaine
stabilit microbiologique de ce produit.
Dautre part, le lait de chamelle est un milieu favorable pour la croissance dune flore
bactrienne protectrice. Contrairement au lait de vache, le lait camelin est caractris par son
pH peu acide. Pour toutes ces raisons, nous avons donc utilis cette source pour la
caractrisation de bactriocines anti-listeria. Nous avons, dautre part choisi ce germe comme
souche cible, car il sagit dun pathogne alimentaire psychrophile pouvant se dvelopper
mme aux tempratures de rfrigration (+4C). Ce qui influence la qualit hyginique et la
conservation des produits alimentaires. Ceci nous a motivs vers la recherche dagents antilisteria par lutilisation dune souche physiologiquement proche du pathogne Listeria
monocytognes afin dviter le risque de contamination vu le manque de moyen prventifs
suffisants dans notre laboratoire, il sagit de la souche Listeria innocua. F collecte
luniversit de Nantes.
Ce travail de recherche se droule au laboratoire de Microbiologie Applique de
lUniversit Mouloud MAMMERI de Tizi-Ouzou, et consiste caractriser des bactriocines
anti-listeria produites par des souches lactiques des genres Lactococcus et Lactobacillus
isoles partir du lait de chamelle Camelus dromedarius de la rgion de BISKRA. Il est
noter que ce travail fait suite aux dmarches dIRID et AMMAR ralises en 2009, dans
lesquelles, les chantillons frais du lait camelin ont t ramens de la rgion de BISKRA et les
souches lactiques ont t isoles et caractrises. Dans le mme travail, les caractristiques
physico-chimiques du lait camelin ont t tudies et donc les conditions de culture des
souches lactiques sont connues. Dautre part, une prsentation dtaille du germe cible
Listeria ainsi quune classification des bactriocines ont t faites
Dans le prsent manuscrit, nous nous sommes bass sur lidentification des
bactriocines produites par ces souches, notamment le volet gntique. Cest la raison pour
laquelle nous avons consacr la majeure partie de la synthse bibliographique pour la
prsentation de lorganisation des locus gntiques codant ces molcules.
Notre dmarche pratique est oriente vers lutilisation de protocoles simples et
ralisables afin de pouvoir obtenir les donnes ncessaires quant la nature chimique et la
localisation gntique des bactriocines produites par ces souches lactiques.
Pour se faire, on se propose de raliser les manipulations suivantes :
- Test dactivit sur milieu solide par la mthode de diffusion des puits ;
- Curage des plasmides en vue de caractriser la localisation gntique des bactriocines ;
- Sparation lectrophortique suivie dun test dactivit par la mthode du zymogramme.
Chapitre I :
Synthse bibliographique
Les lments gntiques

codant les bactriocines
Chapitre I : Synthse bibliographique
Les lments gntiques codant les bactriocines
Les bactriocines sont des peptides antimicrobiens synthtiss par voie ribosomale et
les gnes impliqus dans leur production sont organiss en une ou plusieurs structures oprons
qui peuvent tre localises sur le chromosome bactrien ou le plus souvent sur un plasmide
(MERZOUG et al., 2010). Ces gnes peuvent tre insrs sur le chromosome partir d'un
plasmide, par l'intermdiaire de transposons (TESSEMA et al., 2011).
La comparaison des clusters gntiques de plusieurs bactriocines rvle un certain
nombre de gnes conservs codant pour des protines avec des fonctionnalits similaires.
Lorganisation du locus impliqu dans la production dune bactriocine consiste au minimum
en un gne de structure, gnralement co-transcrit avec son gne dimmunit qui protge la
souche productrice des effets de la bactriocine. Habituellement, un autre groupe de gnes
comporte les lments ncessaires au transport ddi et parfois un troisime locus correspond
un systme rgulation qui permet linduction de la production de la bactriocine
(MORISSET et al., 2005). Dans le cas des lantibiotiques, on trouve aussi les gnes codant
pour les enzymes responsables des modifications post-traductionnelles (BELGUESMIA et al.,
2011).
Les deux figures 1 et 2 montrent les schmas dorganisation des clusters gntiques
des lantibiotiques et leurs voies de biosynthse et de rgulation respectivement, tandis que la
figure 3 schmatise les modes de biosynthse et de rgulation pour les bactriocines de classe
IIa.
Figure 1 : Organisation gntique des clusters de gnes impliqus dans la biosynthse et la

rgulation de la biosynthse des lantibiotiques (ASADUZZAMAN et SONOMOTO, 2009).
Figure 2 : Schma de biosynthse, de sa rgulation et dimmunit de la souche productrice

pour la nisine (WIDDICK et al., 2003).
Figure 3 : Schma de la biosynthse, la rgulation de la biosynthse et limmunit des

bactriocines de classe IIa (STRAUME et al, 2007).
La biosynthse d'une bactriocine ncessite l'action d'une multitude de gnes dont les
produits peuvent interagir selon des mcanismes complexes trs peu connus. Ces gnes
codent pour des protines d'induction, de structure, de modification (dans le cas des
lantibiotiques), de transport, de clivage et d'immunit. Dans le cas de la nisine, la biosynthse
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est initie par l'mission d'un signal provoqu par un facteur d'induction. La protine
membranaire, souvent une histidine kinase, effectue la phosphorylation lors de la
reconnaissance du peptide inducteur qui interagit avec les promoteurs situs sur l'opron de la
bactriocine. Il a galement t dmontr que les biosynthses de la nisine et de la
carnobactriocine B2 sont induites par la bactriocine elle-mme (NEVES et al., 2005).
Tandis que chez les bactriocines de classe II, la biosynthse est induite suite au
clivage d'un peptide leader inactif et similaire la bactriocine (KJOS et al., 2011). Le
transport des bactriocines l'extrieur de la cellule est assur selon deux mcanismes
distincts. Des transporteurs de type ABC ATP-Binding Cassette ) identifis chez
Streptoccocus mutans 286 et 287 sont prfrentiellement utiliss lors de la biosynthse des
mutacines non-lantibiotiques (TAGG et al., 2005).
Toutefois, un nombre restreint de bactriocines l'exemple de l'acidicine B et de
l'enterocine P sont scrtes via la voie sec dpendante (HERRANZ et DRIESSEN, 2005).
la suite de la scrtion des bactriocines matures, l'immunit est confre la souche
productrice grce des protines d'immunit dont le mcanisme d'action exact reste peu
connu.
1-Le chromosome
La localisation des gnes de bactriocines peut tre chromosomique comme dans le
cas de la Carnobactriocine BM1 (JASNIEWSKI, 2008). Les gnes impliqus dans la
production sont gnralement organiss sous forme dopron. Les gnes de structure et le
gne dimmunit qui inhibe laction de la bactriocine produite, sont le plus souvent cotranscrits sauf quand ils sont disjoints comme dans le systme Carnobactriocine A (DORTU
et THONART, 2008). Les lments ncessaires au transport de la bactriocine sont localiss
sur un autre locus. Un troisime locus codant le systme de transduction du signal a pu tre
identifi et permettrait linduction de la production du peptide antimicrobien (DIEP et al.,
2002 ; EIJSINK et al., 2002).
Lanalyse par PCR du gnome dune souche de lactobacillus plantarum C11, a
dmontr la localisation chromosomique du cluster gntique des gnes codant la plantaricine
(BEN OMAR et al., 2006). De mme que pour lentrocine AS-48 produite par Enterococcus
feacium isole du fromage de chvre, et active contre L. Monocytogenes et B. Cereus
(ABRIOUEL et al., 2005).
2-Les lments non chromosomiques
2-1-Le plasmide
2-1-1-Dfinition
Un plasmide dsigne en microbiologie ou en biologie molculaire une molcule
dADN surnumraire distincte de lADN chromosomique, capable de rplication autonome
(cest dire indpendamment du gnome bactrien), et non essentielle la survie de la cellule
(PAOLETTI et al., 2003).
Les plasmides sont de petits fragments dADN double brin, prsents dans la cellule
bactrienne (MEDRAOUI, 2012). Les plasmides sont gnralement circulaires comme ils
peuvent aussi exister sous forme linaire capable dutiliser la machinerie de leur hte pour se
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rpliquer. Les plus connus sont bien sr les plasmides bactriens, largement utiliss en
biologie molculaire comme vecteurs pour amplifier et transporter les ADN manipuls
(GRAZIANI, 2002).
Une cellule bactrienne peut en contenir une copie, pour les grands plasmides, ou des
centaines pour des plasmides artificiels (construits par gnie gntique des fins de clonage
de gnes). Les bactries en comportent gnralement 5 30 copies, les levures entre 50 et 100
exemplaires par cellule. Le nombre de copies dun mme plasmide dans une cellule
bactrienne est contrl par la fonction Ori de lorigine de la rplication. Lorsque ce nombre
est trs lev, de fortes homologies ADN/ADN apparaissent.
Puisque la rplication de ces plasmides est soumise au mme systme de rgulation, ils
ne peuvent pas coexister dans une mme cellule, on dit quils sont incompatibles. Les
plasmides sont ainsi classs en groupe dincompatibilit Inc (BELKADI, 2010). Par
consquent, plusieurs plasmides diffrents peuvent coexister dans une mme cellule sous
conditions de leur compatibilit mutuelle. Certains plasmides sont capables de sintgrer aux
chromosomes ; on appelle ces plasmides des pisomes (BELKADI, 2010).
2-1-2-Caractristiques gnrales
Les plasmides possdent plusieurs proprits confrant aux bactries une meilleure
adaptation lenvironnement en portant des gnes codant des fonctions accessoires utiles
mais non indispensables au mtabolisme normal de la cellule hte (BELKADI, 2010). La
rplication d'un plasmide est effectue par la machinerie cellulaire mais l'origine de
rplication et certains facteurs de rplication sont propres au plasmide. Le nombre de copies
du plasmide est ainsi dfini par le plasmide lui-mme.
Un systme simple de stabilisation consiste donc augmenter le nombre de copies de
sorte que leur distribution alatoire permette d'en retrouver au moins un dans chaque cellule
fille aprs la division (VAN MELDEREN, 2002).
En effet, la probabilit qu'une cellule se retrouve sans copie du plasmide est de 2-n o n
est le nombre de copies avant la division. Ainsi, un plasmide prsent en 10 copies risque d'tre
perdu toutes les 1024 divisions. Avec 20 copies, cette probabilit tombe moins d'une chance
sur un million (probabilit encore diminue par l'encombrement volumique des plasmides
dans la cellule) (HAYES, 2003).
Les plasmides participent aux transferts horizontaux de gnes entre les populations
bactriennes, et donc la dissmination des gnes confrant des avantages slectifs (par
exemple des rsistances aux antibiotiques ou des facteurs de virulence). La mobilit des
plasmides (par conjugaison) au sein des populations bactriennes accrot le spectre dhte des
gnes impliqus dans la virulence (plasmides conjugatifs). Ces gnes offrent en contrepartie
un avantage slectif pour le plasmide et les bactries htes. On conoit donc la nature quasi
ubiquitaire et persistante des plasmides chez les bactries pathognes (RICK, 2005).
2-1-3-Proprits des plasmides des bactriocines

Autres les proprits de rsistance aux antibiotiques, les plasmides codent des
fonctions accessoires, comme les fonctions de virulence (JOHNSON et al., 2009), dadhsion
aux cellules pithliales (DUDLEY et al., 2006), de dgradation de certains mtabolites
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(CLEASSON et al., 2006 ; JONES et al., 2007 ; LI et al., 2007 ; FANG et al., 2008) et la
production de bactriocines (MILLET et al., 2008 ; OSHIMA et al., 2008 ; SMAJS et al.,
2008 ; CHEIKHYOUSSEF et al., 2010 ).
Les plasmides des bactriocines codent la synthse d'une protine extracellulaire dont
la biosynthse est ltale pour la bactrie productrice ainsi que pour les autres bactries
nonproductrices environnantes. Cependant, ces plasmides codent aussi une deuxime protine
intracellulaire de rsistance cette premire toxine (LIPPS, 2008). Les bactriocines agissent
sur des fonctions vitales de la bactrie. Chez E. coli, on trouvera diffrentes catgories de
bactriocines, comme les colicines codes par les plasmides col. La caractrisation de
nouvelles bactriocines large spectre et le dveloppement de variant par le gnie gntique a
offert de nouvelles opportunits biotechnologiques.
Dans lindustrie agroalimentaire, lapplication des bactriocines et des cultures
protectrices a pu rduire lincidence des pathognes alimentaires, et amliorer la protection
des produits animaux par la rduction de la transmission des bactries pathognes dans la
chaine alimentaire (GALVEZ et al., 2010). Ainsi, pour savoir maitriser le rendement des
souches en bactriocines, les scientifiques agissent sur les dterminants gntiques codant ces
biomolcules, et pour se faire, une caractrisation de la localisation chromosomique ou
plasmidique ncessite dtre effectue. Dans la majeure partie, linformation gntique est
porte par un plasmide.
La mesentricine Y105 est une petite bactriocine non-lantibiotique (de classe II)
code par un plasmide de 35 Kb port par Leuconostoc mesenteroides Y105, et active contre
Listeria Monocytogenes (FREMAUX, 2006).
En utilisant la RT-PCR, on a clon un fragment Dra II de 8Kb, il contient le gne de
structure de la mesentericine Y105, mesY, codant le prcurseur de la bactriocine avec une
extension de 24 AA N-terminaux se terminant par un motif double Glycine (Gly-Gly) formant
le site de clivage du peptide leader ce qui fait que cette bactriocine appartient la classe II,
quatre autres gnes sont associs mes Y, dans deux oprons divergents. Par addition mes Y,
le premier opron est prsum codant une protine similaire celle code par lORF2 de
lopron de la leucocine A. Le deuxime opron contient trois ORFs, les deux premiers, mes
D et mes E codant respectivement le systme transporteur ABC et le facteur accessoire, quant
au troisime, son rle na pas encore t caractris (YANN, 2005).
Les rsultats concernant lexpression htrologue de mes Y clon dans la souche
lactobacillus NCK64 suggrent que les fonctions de scrtion et de maturation ddies pour la
lacticine F (une autre bactriocine de classe II), sont bien efficaces pour la mesentricine
Y105, cette caractristique est trs intressante pour le dveloppement de starters de ferments
industriels produisant de multiples activit bactricides (CENATIEMPO, 2005).
Des tudes rcentes ont dmontr le caractre de production de bactriocine par un
mgaplasmide pMP118 chez la souche lactique lactobacillus salivaris UCC118 (ZHANG et
al, 2010). Les fonctions codes par le mgaplasmide sont aussi retrouves dans le rle
probiotique de la souche, et les mmes tudes ont rapport que le systme bactriocine cod
par ce plasmide a une activit contre le pathogne alimentaire Listeria Monocytogenes
(CORR et al, 2007).
PHILIP et al (2010) ont obtenu des rsultats intressants quant la localisation

gntique dun cocktail de bactriocines (BLIS : Bacteriocin-like inhibitory substances)
produites par une souche de Streptococcus salivarius.
Les locis gntiques sont retrouvs sur des grosses molcules dADN extra
chromosomiques appeles mgaplasmides dont les tailles sont estimes entre 160 et 220 Kb.
Ces mgaplasmides sont extrmement diversifis par leurs tailles et leurs compositions et sont
essentiellement caractriss comme des rpertoires gntiques du caractre bactriocinogne
des souches de S. Salivarius. Leur remarquable caractristique est leur contenu en locis codant
les lantibiotiques, il sagit de SalA (codant la Salivaricine A), SalB (codant la Salivaricine B),
Salivaricine G32, Salivaricine 9 et Streptine (WESCOMBE et al., 2006).
SalA1, un variant de SalA a t tudi, une souche de S. Pyogenes contenant le loci
SalA1 perturb ou tronqu tait incapable de produire la bactriocine active (PHILIP et al.,
2010). Dautre part, le gne SalY codant la protine dimmunit de SalA apparat fonctionnel
dans la majorit des souches de S. Pyogenes (PHILIP et al., 2010) ainsi des travaux rcents
ont postul que SalY est important la survie des souches en leur confrant une protection
intracellulaire vis vis de laction destructrice des peptides cationiques (PHELPS et al.,
2007). Dans les travaux raliss par HENG (2010), il a t dmontr que SalY est aussi
exprim par une souche de S. Salivarius en absence de lexpression de la molcule bioactive
SalA. Pour S. Salivarius, cependant, il apparat probablement que, lexpression de SalY
confre un avantage de survie la bactrie hte en comptition avec les autres bactries
productrices de SalA dans la mme niche.
La Salivaricine B, un lantibiotique auto-inductible de 2,740 Kda et cod par huit locis
gntiques qui sont typiquement adjacents du locus SalA2 dans lADN du mgaplasmide
(HYINK et al., 2007).
SalB a une activit bactricide contre S. Pyogenes (HYINK et al, 2007). Des locis
hautement homologues ceux codant SalB ont t identifis et partiellement caractriss dans
deux souches de Streptococcus mitis (HENG, 2010).
Il est ainsi spcul que le locus codant SalB est originaire de S. Mitis ou acquis par
cette dernire partir de S. Salivarius via une transformation naturelle (HENG, 2010).
Le mgaplasmide pSsalK12 (codant SalA et SalB) port par la souche probiotique S.
Salivarius K12 a t montr comme transmissible entre les bactries S. Salivarius in vitro et in
vivo (BISHOP et al., 2009).
2-2-Les transposons
La premire vocation de gnes mobiles venait dexpriences de gntique chez le
mais. Lors de caractrisation de plasmide, il a t observ dtranges recombinaisons de gnes
de rsistance aux antibiotiques tel le gne amp, saccompagnant du mme accroissement de
taille du plasmide receveur. On avait la preuve directe dune addition de matriel gntique
(10Kb) (PHILIPPON et PROTS, 2002 ; PRESCOTT et al., 2004).
Par dfinition, les transposons sont des squences dADN capables de changer de
localisation dans le gnome sans jamais apparatre ltat libre. Ils ne peuvent se rpliquer
mais codent pour les dterminants de la transposition et ceux dautres fonctions telle la
rsistance aux antibiotiques et la production de bactriocines (WATSON et al., 2009).
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La transposition est un mcanisme dvolution rapide consistant dans laddition pure

et simple de gnes (ADN) de taille dfinie au sein dun gnome (chromosome bactrien ou
plasmide) et en labsence dhomologie de squences nuclotidiques (recombinaison
illgitime) (PHILIPPON et PROTS, 2002). Selon WESSLER et al (2010), certains segments
dADN bien individualiss sont des lments gntiques transposables, ou transposons :
prsents en un point dun rplicon, chromosome ou plasmide, ils sont capables daller
sinsrer ailleurs sur le mme rplicon ou sur un rplicon diffrent. Ces lments mobiles
nont pas dexistence autonome stable. Leur seule faon de subsister dans une bactrie est de
sintgrer dans un rplicon et dtre
dupliqus avec lui.
Le squenage de pSsalK12, un mgaplasmide de S. Salivaius K12, a mis en vidence
la prsence de plusieurs lments gntiques mobiles (squences dinsertion : IS), qui
flanquent les locis des deux bactriocines Salivaricine A et Salivaricine B, ce qui induit
lacquisition de ces locis par dautres bactries htes par le mcanisme de transposition
(HYINK et al., 2007).
2-2-1-Structure des transposons
Le transposon est constitu dun fragment dADN limit de part et dautre par des
squences rptitives inverses (IR) appartenant des squences dinsertion (IS). Les
squences dinsertion portent les gnes ncessaires la transposition, la transposase (lments
rgulateurs de la transposition) et les marqueurs spcifiques (ex : rsistance aux antibiotiques
et production de bactriocines) (BELKADI, 2010).
Il faut dailleurs noter que le rsultat final dun vnement de transposition est
linsertion du transposon entre deux paires de bases de lADN cible : il sagit donc dune
addition et non dun change de matriel gntique (RAISONNIER, 2007). Deux
caractristiques sont communes tous les transposons ( lexception des transposons
conjugatifs).
Dune part, ils possdent des squences rptes inverses leurs extrmits, dont la
taille varie dune plusieurs dizaines de Pb. Dautre part, linsertion dun transposon conduit
toujours la duplication dune courte squence de lADN receveur, appele squence cible.
Avant lvnement de transposition, une seule copie de la squence cible est prsente sur
lADN receveur et cette squence est absente du transposon lui mme.
Aprs transposition, le transposon se retrouve encadr par cette squence, orient dans
un mme sens. La longueur de la squence cible varie dun transposon lautre, mais est
identique pour toutes les insertions dun mme transposon. Elle est de 5 ou de 9 Pb pour la
plupart des transposons (RAISONNIER, 2007).
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Figure 4 : Schma montrant linsertion du transposon accompagne de la duplication dune

squence cible de lADN receveur (RAISONNIER, 2007).
2-2-2-Le mcanisme de la transposition
La srie de ractions qui permet lintgration des transposons dans une molcule
dADN cible est illustre dans la figure 4. La premire tape consiste en un clivage de lADN
receveur au niveau de la squence cible, avec un dcalage de quelques bases (5ou 9 pour la
majorit des transposons) (STANILA, 2003). Le transposon prend place dans la brche ainsi
cre. Enfin les lacunes dADN simple brin sont combles et les diffrents segments dADN
runis par ligation.
Pour un transposon donn, la squence cible est diffrente chaque vnement de
transposition. Ce fait est remarquable. Il signifie quun transposon a la proprit de pouvoir
sintgrer en de multiples points dune molcule dADN et, plus gnralement, dun gnome
(MATINCA et STANILA, 2002).
Cependant de nombreux transposons ne sintgrent pas tout fait au hasard mais dans
certains sites privilgis ou points chauds (hot-spots). Il semble que ces derniers
correspondent des zones o la conformation de lADN est propice au processus de
transposition (WESSLER et al., 2010).
En faveur de cette hypothse, il faut signaler que nombre de points chauds soient
dune particulire richesse en bases adnine et thymine. On sait, en effet, que les rgions
riches en adnine et thymine possdent une plus grande plasticit que les rgions riches en
cytosine et guanine. La frquence de transposition dun lment gntique transposable est
gnralement faible, autour de 10-3 10-4 par gnration bactrienne chez E. Coli, 37C.
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Un contrle des vnements de transposition est vital pour la bactrie hte, en effet, la
transposition est un processus la fois mutagne et gnrateur de remaniements gnomiques
profonds. Dans ces conditions, des vnements de transposition itratifs, non contrls,
auraient de graves effets dltres. Do la ncessit dune rgulation gntique de la
transposition, dont les mcanismes molculaires varient dun transposon lautre (BURRUS
et al., 2002).
2-2-3-Les diffrents types de transposons
Les transposons peuvent tre rpartis en trois familles, en fonction de leur organisation
globale et de leur mcanisme de transposition :
Les transposons ADN
Ces transposons contiennent la fois les squences dADN qui servent de sites de
recombinaison et des gnes qui codent des protines participant la recombinaison. Les sites
de recombinaison sont aux extrmits de llment et sont organiss en squences rptes
inverses (SRI). Ces rptitions terminales inverses de taille variable de 25 Pb quelques
centaines de paires de bases, ne sont pas des rptitions exactes de squences et contiennent
les squences de la reconnaissance de la recombinase. Les recombinases responsables de la
transposition sont gnralement appeles les transposases (ou parfois, les intgrases)
(MATINCA, 2002).
Les transposons ADN contiennent un gne codant leur propre transposase. Ils peuvent
contenir quelques gnes supplmentaires, codant parfois des protines qui rgulent la
transposition ou qui assurent une fonction utile llment ou sa cellule hte. Par exemple
de nombreux transposons bactriens portent des gnes qui codent des protines permettant la
rsistance un ou plusieurs antibiotiques. La prsence du transposon permet donc la cellule
hte dtre rsistante ces antibiotiques. Les squences dADN encadrant le transposon
comportent un court segment de squence duplique (2 20 Pb). Ces segments sont organiss
en rptitions directes, ils sont appels les duplications du site cible qui sont engendrs par le
processus de recombinaison (WESSLER et al., 2010). La figure 5 rsume le processus de
transposition.
13
Figure 5 : Principe du mcanisme de transposition pour les transposons ADN.

(RAISONNIER, 2007). Universit Pierre et Marie CURIE.
Les rtrotransposons de type viral
Les rtrotransposons (et mme les rtrovirus) contiennent galement des rptitions
terminales qui sont les sites de liaison et daction de la recombinase. Ces rptitions
terminales, la diffrence de celles des transposons ADN, ne sont pas inverses, elles sont
plus longues et organises aux deux extrmits de llment en rptitions directes et sont
appeles les longues rptitions terminales ou LTR (PEDULLA et al., 2003). Les
rtrotransposons de type viral codent deux protines ncessaires leur mobilit : une intgrase
(la transposase) et une transcriptase inverse (RAISONNIER, 2007).
La transcriptase inverse ou RT (reverse transcriptase) est une ADN polymrase dun
type particulier, qui peut utiliser une matrice compose dARN pour synthtiser de lADN,
cette enzyme est ncessaire la transposition parce quun intermdiaire ARN est impliqu
dans la raction de transposition.
Le fait que ces lments convertissent de lARN en ADN, linverse du flux habituel
de linformation biologique (ADN vers ARN), leur vaut le nom de rtro (Figure 6). La
distinction entre un rtrotransposon de type viral et un rtrovirus rside dans le fait que le
gnome dun rtrovirus est encapsid dans une particule virale, schappe de la cellule hte et
infecte une nouvelle cellule. Au contraire, les rtrotransposons ne peuvent que se dplacer
vers de nouveaux sites dans lADN dune cellule (BOLTNER et al, 2002).
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Comme les transposons ADN, ces lments sont encadrs par de courtes duplications
du site cible, produite pendant la recombinaison (BOLTNER et al., 2002).
les rtrotransposons poly A
Les rtrotransposons poly A ne possdent pas les rptitions terminales prsentes chez
les autres classes de transposons (HUGUES et al., 2002). Au lieu de cela, les deux extrmits
de llment prsentent des squences distinctes. Une des extrmits est appele 5UTR
(untranslated region), tandis que lautre est compose dune rgion dite 3UTR suivie dune
srie de paires de bases A : T appele squence poly A. Ces lments sont galement encadrs
par de courtes duplications des sites cible (DUFOUR et al., 2000).
Les rtrotransposons poly A contiennent deux gnes, appels ORF1 et ORF2. ORF1
code une protine se liant lARN. ORF2 code une protine prsentant la fois une activit
transciptase inverse et une activit endonuclase. Cette protine, bien que distincte des
transposases et des intgrases codes par les autres classes dlments, a des rles essentiels
pendant la recombinaison. Comme les rtrotransposons ADN et les transposons de types viral,
les rtrotransposons poly A se prsentent couramment dans les formes autonomes et non
autonomes (WESSLER et al., 2007). De plus, lanalyse de squence met en vidence
beaucoup dlments tronqus, qui ne possdent pas la squence 5UTR complte et ont
perdu leur capacit de transposition (DELAHAYE, 2009).
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Figure 6 : Principe du mcanisme de transposition pour les rtrotransposons (RAISONNIER,

2007). Universit Pierre et Marie CURIE.
2-2-4-Diffrents lments gntiques transposables
Les squences dinsertion
Les squences dinsertion sont les lments gntiques transposables les plus simples.
Dune longueur denviron 1000 Pb, elles possdent uniquement linformation gntique
ncessaire au processus de transposition, soit des squences rptes inverses leurs
extrmits et une ou deux phases de lecture ouvertes codant pour une transposase. Des
squences dinsertion ont t mises en vidence chez de nombreuses espces bactriennes.
Les mieux caractrises sont celles identifies chez E. Coli. Certaines squences
dinsertion sont portes uniquement par le chromosome comme les squences IS1, IS4 et IS5.
Dautres, les squences IS2 et IS3, sont reprsentes la fois sur le chromosome et le
plasmide F : cest par leur intermdiaire que seffectuent certaines des fusions chromosomeplasmide F qui donnent naissance aux bactries Hfr (DELAHAYE, 2009).
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Les transposons composites

Ces lments gntique transposables sont constitus dune rgion centrale flanque
de squences dinsertion appeles modules IS. Les modules IS apportent les squences
rptes inverses qui bordent le transposon et linformation gntique ncessaire
laccomplissement du processus de transposition (DELAHAYE, 2009). La rgion centrale
porte des marqueurs, cest dire des gnes qui confrent de nouveaux caractres la bactrie
hte. La nature de ces gnes est variable selon les transposons : il peut sagir de gne de
rsistance aux antibiotiques ou aux mtaux lourds, de gnes mtaboliques ou de gnes de
virulence et de production de bactriocines (WESSLER et al., 2010).
Les locis de certains lantibiotiques ont t dcrits comme tant inclus dans des
transposons composites. C'est le cas de la lacticine 481 et la lacticine 3147 qui sont encadres
par des copies de squences d'insertion (IS), respectivement IS 1647 et IS 946 (DUFOUR et
al., 2000 ; GALIMAND et al., 2005). Bien que seule la production de nisine, de la lacticine
481 et de la lacticine 3147 soit lie l'existence d'un transposon, il apparat que les IS, trs
frquemment prsentes dans le gnome des lactocoques et parfois contigus aux gnes des
bactriocines, constituent des lments importants dans l'change gntique intra et
interespce chez ces bactries (GALIMAND et al., 2005).
Les transposons de la famille TnA
Les transposons appartenant cette famille ont surtout t identifis chez des bacilles
Gram ngatif, entrobactries et Pseudomonas, mais aussi chez des staphylocoques et des
entrocoques. Ils forment un groupe homogne dont le chef de file est le transposon Tn3
(KANEKO et al., 2000). Mis en vidence chez Salmonella, le transposon Tn3 a une taille
denviron 5Kb et confre la rsistance lampicilline par production de -lactamase
(WESSLER et al., 2010). Il possde ses extrmits des squences rptes inverses de
38pb et contient trois gnes : les gnes bla, tnpA et tnpR. Le gne bla est le gne de structure
de la -lactamase responsable de linactivation de lampicilline, le produit du gne tnpA est
une transposase, protine indispensable la ralisation des premires tapes de la
transposition. Le gne tnpR code une protine qui est la fois rpresseur et enzyme.
Le rpresseur contrle la transcription du gne tnpR, cest dire sa propre synthse, et
celle du gne de la transposase. Lenzyme appele rsolvase, permet lachvement du
processus de transposition ; elle exerce son activit enzymatique sur le site res ou site de
rsolution interne qui est localis dans la rgion intercistronique sparant les gnes tnpA et
tnpR (WATSON et al., 2009). Les autres transposons de la famille TnA ont une structure
similaire celle de Tn3. Ils diffrent par la position relative des gnes intervenant dans les
processus de la transposition et la nature des marqueurs. (WESSLER et al., 2010).
La rsistance lerythromycine (Em) et la vancomycine (Van) a t transfre
partir de souche dEnterococcus feacalis FA2-2 vers la souche Enterococcus feacalis NKH15
une frquence de 10-4, les transconjugants rsistant Van et Em ont acquis les plasmides
dsigns par pMG2200 de 106 kpb et pMG2201 de 65,7kpb respectivement. PMG2200
confre la bactrie hte la rsistance la vancomycine et une activit bactriocinogne,
pMG2201 confre quant lui la rsistance lrythromycine et la production de cytolysine.
Le squenage complet de lADN du plasmide pMG2201 a montr que ce dernier est porteur
dun transposon Tn1549 codant la rsistance la Vancomycine et la production de
bactriocine. (CHEMBL, 2010).
17
2-2-5-Les principaux modes de transposition

Dans la transposition rplicative, le transposon est dupliqu au cours de la raction.
Une copie du transposon reste en place, tandis que lautre copie sinsre dans le site receveur.
Ce processus aboutit lintgration dun nombre toujours plus lev de copies du transposon
au sein du gnome de la bactrie hte (cependant il faut rappeler que chaque vnement de
transposition est trs rare). Ce mode de transposition caractrise les transposons de la famille
TnA. Il peut galement sobserver chez certaines squences dinsertion et le phage
(WESSLER et al., 2010).
Dans la transposition non rplicative, le site donneur ne conserve pas de copie du
transposon. On assiste une vritable opration de type couper-coller, au cours de laquelle le
transposon se dsinsre du site donneur et vient sintgrer dans le site receveur (DALE,
2004). A lissue de ce processus, lADN donneur peut, ou non, tre endommag. Dans le
premier cas, on parle de transposition non conservative.
Ce mode concerne la plupart des squences dinsertion, les transposons composites et le
phage . Dans lautre cas, on parle de transposition conservative. Ce mode est caractristique
des transposons conjugatifs. A linstar de certains phages, ces lments gntiques sinsrent
et se dsinsrent dun ADN sans, en rgle gnrale, en modifier la squence. On dit que leur
excision est propre (ROCES et al, 2009).
18
Mode daction des

bactriocines
Mode daction des bactriocines
Le mode daction des bactriocines est bas sur leur interaction avec la surface
cellulaire des bactries cibles. Les souches du genre Listeria constituent le meilleur modle de
souche cible. Cette bactrie est, en effet, une des cibles privilgies des bactriocines de
classe IIa (NAGHMOUCHI., 2007). Comme toutes les bactries Gram positif, Listeria
possde un peptidoglycane qui forme un rseau solide et poreux travers lequel certaines
molcules peuvent diffuser. Sa paroi est aussi compose d'acides teichoques, chargs
ngativement, connects soit au peptidoglycane, soit aux lipides membranaires (dans ce cas
on parle d'acides lipoteichoques). Ce sont les lipides membranaires qui constituent l'armature
de la membrane. Il s'agit de molcules amphiphiles possdant une tte polaire, une rgion
interface et un coeur hydrophobe qui s'organisent spontanment en bicouche dans un milieu
aqueux (CHATTERJEE et al., 2005).
1-Rle des diffrentes rgions de la bactriocine
Ltude des relations entre structure et fonction des bactriocines est fonde sur des
comparaisons de structures primaires et des prdictions de structures secondaires. Les spectres
dactivit sont tudis dans le but didentifier les rgions du peptide jouant un rle dans la
reconnaissance de la souche cible et/ou dans lactivit antimicrobienne propre la
bactriocine. Toutes les parties de la molcule ainsi que lintgrit de la squence en rsidus
dacides amins (Tryptophane notamment) semblent jouer un rle important soit dans la
reconnaissance de la souche cible, soit dans lactivit antibactrienne du peptide. En effet, des
bactriocines mutes ou tronques prsentent le plus souvent une activit antibactrienne
rduite voire inexistante. (FIMLAND et al., 2006).
Les motifs en hlice seraient indispensables lactivit antibactrienne des
bactriocines (FIMLAND et al., 2002). Dautres lments structuraux semblent importants
dans lactivit de ces peptides comme la prsence dun deuxime pont disulfure, de rsidus
dacides amins chargs positivement et de rsidus tryptophane. De plus en plus dtudes sont
mens afin didentifier les motifs structuraux directement impliqus dans lactivit
antibactrienne de ces peptides (ASADUZZAMAN et al., 2006).
La rgion N terminale
Plusieurs lments de cette rgion ont t proposs comme essentiels dans lactivit de
la bactriocine, notamment la squence consensus YGNGV (voir annexe 9, tableau
didentification des acides amins), le feuillet , les charges positives et les ponts disulfure.
Le motif YGNGV
Ce motif, trs conserv dans toutes les bactriocines de sous classe IIa, serait intgr
dans une structure en feuillet (KRUIJFF, 2006). Cette squence a t longtemps considre
comme la partie responsable de lactivit anti-Listeria chez les bactriocines de la sous classe
IIa. En effet, toute modification ou dltion au niveau de ce motif entrainent une diminution
importante voire perte totale dactivit vis--vis du genre Listeria (WIEDEMANN et al.,
2006). Cependant, des bactriocines appartenant la mme sous classe et prsentant des
altrations au niveau de cette squence consensus comme la piscicocine GS526 (SUZUKI et
al., 2005), conservent encore une activit anti-Listeria, ce qui remet en cause la thorie si
dessus.
18
Le feuillet
Deux fonctions ont t proposes pour le feuillet :

La premire serait dexposer le motif consensus YGNGV lors du contact avec la
membrane cytoplasmique et de permettre une bonne reconnaissance par un ventuel rcepteur
spcifique pour un positionnement correct de la bactriocine assurant lexpression de son
activit (TWOMEY et al., 2002). Cette squence interviendrait dans la premire tape de la
fixation la membrane en stabilisant la structure en feuillet intervenant dans ladsorption
la membrane de cellule cible (BAUER et al., 2005). La structure en feuillet favoriserait la
formation dun bloc de rsidus dacides amins chargs positivement pour permettre
ladsorption via des interactions lectrostatiques sur les phospholipides membranaires, au
niveau des ttes polaires charges ngativement (BIRRI et al., 2010).
La deuxime fonction de cette structure serait la formation dun bloc hydrophobe
facilitant ultrieurement linsertion de la bactriocine au sein de la bicouche lipidique
(WILLEY et al., 2007).
Les ponts disulfures
La prsence du pont disulfure ne semble pas obligatoire pour lactivit de ces peptides
biocides (SIMON et al., 2002). Cependant, la disparition de ces ponts (blocage des thiols ou
mutagense) au niveau de la mesentericine Y105 a entrain une perte importante de son
activit (SIMON, 2002). Il est fort probable que le pont disulfure permette de conserver une
structuration en feuillet servant faciliter le contact avec la membrane via des interactions
lectrostatiques.
Lactivit des bactriocines serait corrle avec le nombre de ponts disulfure prsents dans
leur structure (RICHARD et al., 2006). Pour les bactriocines prsentant quatre rsidus
cystines, il semblerait que la prsence dun pont disulfure form entre les deux rsidus Cterminaux, soit indispensable lactivit (BHUGALOO-VIAL et al., 1999). Ce pont aiderait
la stabilit de la structure en feuillet , mme en milieu polaire, puisque les prdictions de
structure effectues sur la pdiocine PA-1 prvoient le mme pourcentage de structure dans
un milieu polaire que dans un milieu apolaire (WATSON et al, 2001).
Les peptides possdant un pont disulfure supplmentaire prsentent une activit spectre
plus
large que ceux ayant un seul pont disulfure (EIJSINK et al., 1998). Lintroduction dun
second pont disulfure dans la Sakacine P entraine un largissement de son spectre dactivit
alors que la suppression du second pont disulfure de la Pdiocine PA-1 provoque une
rduction de son spectre (FIMLAND et al., 2000). Il a t suggr que le deuxime pont
disulfure, comme celui plac dans la rgion Nterminale, permettrait la formation dun bloc de
charges positives favorisant ladsorption sur les phospholipides ngatifs de la membrane
bactrienne (BELGUESMIA et al., 2011). Ce second bloc faciliterait donc cette tape
dadsorption et par consquent, lactivit de la bactriocine. Cependant, bien que la Sakacine
G possde un deuxime pont disulfure, elle prsente une activit trs proche de celle de la
msentericine Y105 qui nen possde quun seul (SIMON et al., 2002).
19

La rgion C-terminale
Des travaux sur la partie C-terminale de bactriocines de la sous classe IIa ont montr
un rle dcisif dans la spcificit du spectre daction et ce malgr une grande variabilit dans
cette rgion contrairement la rgion N-terminale qui est relativement conserve (MORGAN
et al., 2005).
Tout comme la rgion N-terminale, la rgion C-terminale interviendrait, via des
interactions lectrostatiques, dans lancrage prliminaire, de la bactriocine sur la membrane
de cellule cible. De nombreux auteurs ont mis lhypothse que ce serait la partie C
terminale en hlice et non la partie N-terminale et sa squence anti-Listeria qui serait
responsable de la spcificit de la cible (JOHNSEN et al., 2004).
Une combinaison entre la rgion N-Terminale dune bactriocine avec la rgion
CTerminale dune autre bactriocine, a donn des molcules hybrides, avec un spectre
dactivit identique celui de la bactriocine dont la partie C-Terminale est originaire. De
plus, un fragment compos de 15 rsidus, correspondant la rgion C-terminale de la
pdiocine PA-1, diminue lactivit de cette bactriocine lorsquil est ajout la culture
contenant cette dernire. Ce phnomne dinhibition est d probablement loccupation dun
site spcifique prsent sur la membrane de la cellule cible par le fragment empchant ainsi
ladsorption de la pdiocine PA-1 (MORGAN et al., 2005).
Lhlice
Lhlice serait capable, du fait de son orientation, de sinsrer dans linterface

Hydrophile/Hydrophobe de la membrane. Cette orientation oblique perturberait la membrane
et faciliterait la pntration de la bactriocine dans la bicouche lipidique (CASTELLANO et
al., 2007). Les tudes sur les structures hlicodales de la rgion C-terminale permettent de
mieux comprendre linsertion du peptide dans la membrane mais pas la spcificit de ce
dernier (NISSEN-MEYER et al., 2009).
Les acides amins aromatiques
Les acides amins aromatiques, notamment le tryptophane, semblent trs important pour
lactivit des bactriocines, en particulier lorsquils sont placs dans la rgion Cterminale.
Pour la grande majorit des bactriocines de la sous classe IIa (87% des cas), un rsidu
tryptophane est prsent au dbut de la rgion C-terminale. Un autre rsidu tryptophane se
trouve soit la fin soit au milieu de lhlice de la rgion C-terminale (83% des cas)
(NISSEN-MEYER et al., 2009).
Pour les bactriocines qui ne prsentent quun seul tryptophane, 50% dentre elles
possdent une phnylalanine la place du deuxime tryptophane. La phnylalanine est un
acide amin aromatique qui possde un fort encombrement strique. Une substitution du
tryptophane central par un autre rsidu entraine une chute de lactivit antimicrobienne pour
la pdiocine PA-1 (FIMLAND et al., 2002) ou pour la mesentericine Y105 (WIEDEMANN et
al., 2006). Ces deux rsidus aromatiques pntrent dans la partie hydrophobe de la membrane
lipidique lors de lancrage de ces deux bactriocines (CASTANO et al., 2005).
20
Les rsidus tryptophane perturberaient la membrane et permettraient ainsi linsertion de

lhlice C-terminale. Toute substitution de lun ou lautre des deux rsidus tryptophane de la
sakacine P, prsums encadrer lhlice amphiphile, provoque une perte importante
dactivit. La substitution la moins dltre est celle effectue avec la phnylalanine
(FIMLAND et al., 2002). Les effets de ces substitutions sont partiellement attnus voire
compltement annuls par la cration dun second pont disulfure. Les deux rsidus
tryptophane interviendraient dans la stabilisation dune structure en pingle cheveux
permettant le rapprochement de ces deux rsidus dans lespace (FIMLAND et al., 2002).
2-Le spectre dactivit
Les bactriocines produites par les bactries lactiques sont des peptides antimicrobiens
de faible poids molculaire appartenant aux bactriocines de classe IIa. Elles ont une activit
inhibitrice dirige contre les bactries proches de la souche productrice. Leur spectre d'action
est gnralement troit. Cependant, la plupart des molcules agissent sur des pathognes
alimentaires tels que Listeria monocytognes, Bacillus sp, Micrococcus sp, des espces
hautement pathognes telles que Staphylococcus aureus, Clostridium sp, et mme sur dautres
bactries lactiques (DORTU et TONART, 2009). Les bactriocines des bactries lactiques
exercent leur activit ltale uniquement sur les bactries Gram positif en provoquant ou non
la lyse cellulaire. Le spectre dactivit est gnralement plus large que celui des colicines
produites par les souches dEscherichia coli (CASCALES et al., 2007) ou des microcines
produites essentiellement par la famille des Enterobacteriacea (DUQUESNE et al., 2007).
Les bactriocines des autres classes sont gnralement connues pour possder un
spectre dactivit troit, limit la mme espce ou des bactries phyllogntiquement
proches de la souche productrice. Linhibition du genre Listeria nest pas exclusive aux
bactriocines de classe IIa, car, sans toutefois possder la squence consensus YGNGV dans
leur rgion N-terminale, certains peptides expriment de fortes activits antagonistes envers le
genre Listeria et ont un spectre dinhibition plus large (BOUSBIA et al., 2010).
Des bactriocines ayant des squences proches peuvent prsenter des spectres daction
diffrents (MORENCY et al., 2001). Ce qui laisse supposer une grande spcificit daction ou
de rsistance. De plus, les concentrations minimales inhibitrices (CMI) varient beaucoup
dune espce bactrienne lautre et mme entre souches dune mme espce (ENNAHAR et
al., 2000). Il est noter que les spectres dinhibition des bactriocines sont le plus souvent
tablis de surnageant de culture ou de prparations semi-purifies. Ce rsultat est donc
reprsentatif de lactivit antibactrienne globale dune souche et non de lactivit dune seule
bactriocine.
Cest pour cela que lorsquune souche produit plusieurs bactriocines, linterprtation
du spectre dinhibition est seulement possible si celui-ci est ralis partir de bactriocines
purifies ou synthtises chimiquement. De plus, lactivit antibactrienne de la bactriocine
est conditionne par des facteurs physico-chimiques du milieu qui peuvent alors modifier le
seuil de sensibilit des souches et ainsi aboutir des spectres dactivit errons (SERVIN,
2004).
21

3-Mode daction
Il est gnralement admis que les bactriocines produites par les bactries lactiques agissent
sur les cellules cibles en deux temps : Adsorption de la bactriocine sur la surface cellulaire
suivie dun effet ltale (NICHOLAS et al., 2005). Aprs leur adsorption sur les bactries
sensibles, les bactriocines comme les antibiotiques peuvent avoir trois types deffets :
Un effet bactriostatique cest dire un ralentissement ou un arrt de la croissance, sans
mortalit cellulaire. Une reprise de la croissance peut tre observe dans certains cas aprs un
certains temps de contact entre les bactries et la bactriocine.
Un effet bactricide, une mort cellulaire est observe mais les bactries gardent leur
intgrit physique, car il ny a pas de lyse.
Un effet bactriolytique, la mort des bactries est due principalement leur lyse.
Leffet observ pour une bactriocine donne dpend souvent des conditions
exprimentales, comme la concentration et la puret du peptide, la souche cible, la population
cellulaire initiale ainsi que le milieu de culture. Ltat physiologique des bactries cibles joue
galement un rle trs important dans ce type dtude (PENFOLD et al., 2004).
3-1-Mode daction des diffrentes classes de bactriocines
3-1-1-Mode daction des bactriocines de classe I
Les lantibiotiques interagissent avec la membrane cellulaire par des interactions
lectrostatiques ou par liaison des rcepteurs spcifiques tels que le lipide II
(Undecaprenylpyrophosphoryl-MurNAc-pentapeptides-GlcNAc),
un
prcurseur
de
peptidoglycanes. Suite cette liaison, les lantibiotiques peuvent former des pores larges et
non spcifiques dans la membrane cytoplasmique. De mme, le lipide II intervient comme
molcule d'amarrage lors de l'interaction nisine-membrane initiale, facilitant l'adoption d'une
conformation adquate de la molcule de nisine pour la formation des pores (HASPER et al.,
2006).
Ce qui va causer l'efflux rapide des petits composs cytoplasmiques tels que les ions,
les acides amins, l'ATP, etc. Cette augmentation de la permabilit membranaire va conduire
la dissipation des deux composantes de la force proton motrice (le gradient de pH et le
gradient lectrochimique) et la cessation rapide des activits cellulaires et la mort de la
cellule.
L'interaction avec le lipide II permet d'augmenter la stabilit des pores forms et de
rduire la concentration du lantibiotique ncessaire la formation des pores, mais peut
galement conduire l'inhibition de la synthse de la paroi cellulaire (BAUER et al., 2005 ;
PATTON et al., 2005).
Des peptides gnrs par mutagense dirige ont permis de montrer que la capacit de
la nisine d'inhiber la biosynthse du peptidoglycane tait indpendante de son aptitude
former des pores (WIEDEMANN et al., 2001). Les lantibiotiques de type A dissipent la force
proton-motrice par formation de pores et interfrent avec la synthse des peptidoglycanes
alors que la plupart des lantibiotiques de type B agissent par inhibition de la synthse des
peptidoglycanes.
22
Nanmoins, certains forment galement des pores dans la membrane des cellules
cibles (BAUER et al., 2005; PATTON et al., 2005). La nisine, un lantibiotique de type A,
interagit avec le lipide II au niveau du MurNAc (voire figure 7) tandis que la mersacidine, un
lantibiotique de type B, interagit avec le GlcNAc du lipide II (WILLEY et al., 2007).
Figure 7 : Formation de pores membranaires par le complexe nisine-lipide II selon

(CHATTERJEE et al., 2005).
Les lantibiotiques composs de deux peptides comme la lacticine 3147, agissent
galement par formation de pores dans la membrane des cellules cibles (McAULIFFE et al.,
2001). La lacticine 3147 a un spectre d'action large. Le peptide A1 a une activit qui est plus
leve en prsence du peptide A2. Il a t propos que la lacticine 3147 A1 agit en se liant au
lipide II, inhibant ainsi la synthse des peptidoglycanes et permettant la lacticine 3147 A2 de
former un pore dans la membrane de la cellule cible (MORGAN et al., 2005 ; WIEDEMANN
et al., 2006).
23
3-1-2-Mode daction des bactriocines de classe II

Le mcanisme d'action suppos des bactriocines de classe IIa est l'interaction de la
bactriocine avec la membrane ou un rcepteur spcifique, la mannose permase , pour
ensuite former un pore dans la membrane de la cellule, ce qui induit la permabilisation de la
membrane, la dissipation des deux composantes de la force proton motrice et la mort de la
cellule (AROUS et al., 2004 ; VADYVALOO et al., 2004 ; BAUER et al., 2005). Le
mcanisme de formation des pores n'est pas connu, mme si l'hypothse la plus courante est
l'association de diffrentes molcules de la bactriocine (DIEP et al., 2007).
Toutes les bactriocines de classe IIa prsentent au moins un ou deux ponts disulfures
dans leur structure. La rduction de ces liaisons thioester (les ponts disulfures) par le mercaptothanol diminue l'effet antimicrobien de la bactriocine. Ceci montre clairement
l'importance de ces ponts pour l'activit inhibitrice. FIMLAND et al. (2000) ont montr par
des tudes de mutagense dirige, que le second pont disulfure (24-44) de la pdiocine PA-1
interagissait de faon spcifique avec une cible membranaire qui facilite l'insertion de la
bactriocine dans le coeur hydrophobe de la membrane, en la rendant plus permable.
Le caractre de molcules rceptrices pourrait varier selon les bactriocines de classe
IIa (EIJSINK et al. 2002). Chez L. monocytogenes, la permase EIIt est form d'un complexe
de trois sous-units, les sous units IIC, IID et IIA-IIB codes par l'opron mpt. HECHARD et
al (2001) ont montr que le niveau d'expression de l'opron mpt est en corrlation direct avec
le niveau de sensibilit de L. monocytogenes. Ces rsultats suggrent que les sous-units IIC
et IID de la permase ElIt pourraient tre une cible membranaire pour les bactriocines de
classe IIa (DRIDER et al., 2006).
Les bactriocines de classe IIb ont en gnral un spectre d'action inhibant une large
gamme de bactries Gram+. Elles forment des pores et rendent la membrane permable
diffrentes petites molcules, des cations monovalents ou des anions, ce qui dissipe une ou les
deux composantes de la force proton motrice. Les ions transports sont spcifiques de la
bactriocine (OPPEGARD et al., 2007). Le ratio optimal d'activit entre les deux sous-units
est en gnral de 1:1 mais il est de 4:1 pour la lactocine 705 (CASTELLANO et al., 2007 ;
OPPEGARD et al., 2007). Nanmoins, les mcanismes d'interaction des deux bactriocines
entre elles et avec la membrane cellulaire ne sont que trs peu connus. Il a t montr qu'il n'y
avait pas de liaison au mme rcepteur que pour les bactriocines de classe IIa (la mannose
permase ) (DIEP et al., 2007).
EIItMan est une mannose permase phosphotransfrase implique dans le transport
des sucres (glucose et mannose) chez les bactries Gram positif. Elle est forme de trois
types de sous-units dans lesquelles MptAB est une protine localise la surface de la
membrane cytoplasmique et MptC et MptD sont deux protines transmembranaires (Figure 8)
(DIEP et al., 2007, HECHARD et SAHL, 2002). CASTELLANO et al. (2007) ont montr
que les deux peptides composant la lactocine 705 ont des activits bien spcifiques. La
lactocine 705 interagit avec la surface de la membrane cellulaire et la dshydrate, ce qui
permet la lactocine 705 de former des pores. Les deux figures 8 et 9 montrent
respectivement la structure de la mannose permase et le mode daction utilis par les
bactriocines de classe IIa et par les lactococcine A et B (classe IId).
24
Figure 8 : Schma montrant la structure de la mannose permase du systme

phosphotransfrase (DIEP et al., 2007).
Figure 9 : Mode daction utilis par les bactriocines de classe IIa et par les lactococcines A
et B (classe IId) daprs Dieppe D.B. et al. (Diep et al., 2007).
25
Ce modle suggre que la bactriocine de classe IIa interagit directement avec les deux
sous units transmembranaires MptC et MptD lors du premier contact avec la membrane
cytoplasmique de la bactrie cible (figure 9 A et B). Linteraction entre la bactriocine et
MptC/MptD perturberai la conformation de EIIt Man , provoquant alors la fuite dorganites
intracellulaires et la mort de la bactrie cible (figure 9 C) (DIEP et al., 2007).
YAN et al. (2000), ont montr que l'activit de la leucocine A est corrle des
interactions strochimiques avec une molcule cible chirale : l'nantiomre D. Il apparat, au
regard de la littrature que cette molcule, EIItMan (rcepteur) serait implique dans la voie du
transport du mannose (RAMNATH et al., 2002 ; HECHARD et al., 2001 ; DALET et al.,
2001). EIItMan est une permase permettant le transport de glucose et du mannose et son
expression est contrle par les facteurs ManR et 54. OSCARIZ et al. (2001) ont tudi le
mode d'action de la creine 8 (bactriocine de classe IIa) produite par Bacillus cereus Bc7.
L'interaction de la creine 8 avec la membrane lipidique commence par des
interactions lectrostatiques non spcifiques de la partie Nterminal cationique (hydrophile)
avec les charges ngatives de la membrane phospholipidique. La partie C-terminal
hydrophobe intervient dans la formation des pores, qui est similaire l'action des
bactriocines de classe IIa. GAUSSIER et al. (2002) ont montr que l'association entre
l'interface et la membrane affecte la conformation du peptide mais ne require pas la prsence
d'un rcepteur.
Le mcanisme d'action de la pdiocine PA-1 a t lucid par spectroscopie infrarouge
(GAUSSIER et al. 2002). Les rsultats ont montr que la pdiocine PA-1 n'interagit qu'avec
des vsicules charges ngativement (Dimyristoyl-phophatidylglycrol : DMPG) grce son
extrmit N-terminale. Le peptide affecte la rgion interfaciale des (Dimyristoylphophatidylcholine : DMPG) mais pas le coeur hydrophobe. Cette insertion l'interface est
susceptible de contribuer la dstabilisation de la bicouche lipidique qui conduirait par la
suite la mort cellulaire GAUSSIER et al. 2002).
RAMNATH et al. (2004) ont montr que l'expression htrologue de l'opron de
mptACD de L. monocytogenes chez Lactococcus lactis rend ces souches plus sensibles aux
bactriocines de classe IIa. Les travaux de la mme quipe ont montr que l'expression de la
sous unit IIC tait suffisante pour induire la sensibilit de Lactococcus lactis aux
bactriocines de classe IIa et par consquent propos la sous-unit IIC comme molcule cible
des bactriocines de classe IIa. SUZUKI et al. (2005) ont rapport que la piscicocine CS526,
une bactriocine de classe IIa, induit un efflux rapide de potassium (K+) partir des cellules
cibles, une rduction du niveau de l'adnosine 5'-triphosphate (ATP) intracellulaire, ce qui
causera la dissipation de la force proton motrice, provoquant le mort cellulaire. Le schma de
la figure suivante rsume les effets des bactriocines sur les cellules cibles.
26
Figure 10: Mode daction des bactriocines de classe IIa (DRIDER, 2006).
3-1-3-Mode daction des bactriocines de classe III
Le mode d'action de ces bactriocines diffre compltement des bactriocines des
autres classes. En effet, l'enterolysin A, la zoocin A et la millericin B agissent par l'hydrolyse
des liens peptidiques des peptidoglycanes des cellules sensibles. La zoocin A a un spectre
d'action troit alors que l'enterolysin A et la millericin B ont des spectres d'action large.
L'helveticin J a un mode d'action bactricide (NILSEN et al., 2003).
3-2-Quantification de lactivit antibactrienne
3-2-1-Dtermination du titre en bactriocines
Le dosage des bactriocines prsente plusieurs difficults :
-la quantit de peptides (mg.ml-1) nest proportionnelle son activit que dans les mme
conditions opratoires (pH, sels,....), ainsi la majorit des auteurs expriment la quantit en
bactriocines en activit antimicrobienne vis vis dune souche cible (Unit arbitraire. ml-1 ou
UA.ml-1) plutt quen concentration massique ou molaire.
-les bactriocines sont produites dans des milieux complexes ce qui rend leur dosage par
chromatographie (HPLC) difficile, une purification pralable tant ncessaire.
Cependant la mthode la plus utilise reste celle dite des dilutions critiques
(JASNIEWSKI, 2008). Celle-ci consiste dterminer, contre une souche cible prtablie,
lactivit antibactrienne de dilutions successives au demi de lchantillon tester ; il existe
deux mthodes pour dterminer lactivit, lune en milieu solide et lautre en milieu liquide.
27
La premire mthode en plaques de glose, plus couramment utilise, consiste doser

lactivit antibactrienne contre une souche cible en milieu glos par dpt de lchantillon
dans des puits, ou en gouttes la surface (IZQUIERDO, 2009). Le titre en activit
antibactrienne exprim en UA.ml-1, est dfini comme linverse de la dernire dilution
donnant une zone dinhibition du tapis bactrien. Des droites de rgression peuvent ensuite
tre construites partir de ces rsultats en mettant en relation les diamtres (mm) des zones
dinhibition de lchantillon non dilu avec les logarithmes des titres de lactivit
antibactrienne vis vis dune souche cible, permettant ainsi de quantifier rapidement
lactivit antibactrienne dune suspension.
La seconde mthode en milieu liquide consiste doser lactivit antibactrienne contre
une souche cible par mlange dune suspension de cette souche cible et de lchantillon
tester en cuves ou en microplaques. Le titre de lactivit antibactrienne est dfini comme la
quantit ncessaire donnant une inhibition de 50% du micro-organisme cible par rapport un
tmoin ensemenc dans les mmes conditions mais sans bactriocine (SEBTI, 2002).
La comparaison de ces deux mthodes, avec quatre bactriocines diffrentes, a permis
de montrer que bien que la mthode en milieu liquide soit plus reproductible, la possibilit
dtablir des droites talons partir des diamtres dinhibitions obtenus en milieu glos est
plus pratique pour doser de nombreux chantillons (DAWSON et al., 2002). De plus la
dtermination dactivit de type bactriocine en milieu glos par utilisation dune droite
dtalonnage, est plus prcise et plus rapide que le dosage en milieu glos en utilisant la
mthode des dilutions critiques (BURIANEK et YOUSEF, 2000).
1-3-2-2-Facteurs physico-chimiques influenant lactivit des bactriocines
Certains facteurs physico-chimiques peuvent modifier lactivit antibactrienne par
action sur la diffusion du peptide (en milieu solide) ou sur lactivit de la bactriocine. Les
spectres dinhibition sont, dans la plupart des cas, raliss sur milieu solide par la mthode
dite dantibiogramme. Cependant lactivit antibactrienne est limite par la diffusion des
bactriocines (MIRDAMANI et al., 2008). Certains auteurs ont mis en vidence plusieurs
facteurs influenant cette diffusion :
la concentration en agar dans les milieux de dtection est souvent diminue pour
permettre une meilleure diffusion, ainsi elle est passe de 15 g.l-1 (VIGNOLO et al, 1995) 7
g.L-1(ARIHANA et al., 1996) voire mme 6 g.l-1 (COVENTRY et al., 1996). La dure de
diffusion 4C peut galement jouer un rle important, elle peut tre dune heure, de 2h, de
6h, dune nuit, de 18h ou tre nulle (GAZORI et al., 2009). Le Tween 80 est aussi parfois
ajout au milieu glos (0,1%, v/v) pour permettre daccroitre la diffusion de lagent
antibactrien (SEBTI, 2002). Un des paramtres pouvant affecter l'efficacit des bactriocines
est l'activit de l'eau (Aw). Ainsi, une Aw leve favorise l'activit des enzymes
protolytiques mais aussi la croissance de pathognes tel que L. monocytogenes (AASEN et
al., 2003).
Lors dune application alimentaire, la composition du produit est un des premiers
facteurs pouvant rduire ou totalement dissiper lactivit de la bactriocine de par son
adsorption sur les composantes du produit, la limitation de sa solubilit et de sa diffusion, sa
dgradation par des protases, linteraction avec des additifs alimentaires ou des ingrdients
et/ou un pH inappropri. Les traitements appliqus aux produits constituent un deuxime
facteur pouvant limiter lactivit inhibitrice dans un produit alimentaire.
28
En effet, des traitements thermiques trop levs peuvent dgrader les bactriocines
prsentes. La temprature de stockage pourra galement rduire lactivit des bactriocines,
qui varie en fonction de la temprature (GALVEZ et al., 2007). Un autre facteur limitant
lactivit des bactriocines est la flore autochtone, principalement sa concentration, la
prsence de bactries rsistantes, la prsence de microorganismes produisant des protases
dgradant la bactriocine et ltat physiologique de cette flore. Un tat physiologique
stationnaire ou stress ainsi que la formation de spores peut conduire une rsistance accrue.
En outre, dans les produits solides, les bactries forment des micro colonies ou des biofilms
dont la rsistance aux bactriocines peut tre plus leve (SCHBITZ et al., 2003).
Dautre part, la combinaison des bactriocines avec dautres traitements de
conservation chimique ou physique donne des rsultats prometteurs pour la conservation des
aliments. Les molcules chimiques peuvent tre des acides organiques, le nitrite, le chlorure
de sodium, lthanol, des huiles essentielles (limpact sur les proprits organoleptiques doit
tre soigneusement valu) ou des agents chlatants tel que lEDTA, le phosphate trisodique,
le citrate. Ces agents chlatants permettent de squestrer les ions magnsium des
lipopolysaccharides de la membrane externe des bactries Gram- permettant aux bactriocines
datteindre la membrane interne, sige de leur activit (GALVEZ et al., 2007).
La conservation des aliments peut se faire par lapplication des traitements physiques :
la chaleur, le stockage sous atmosphre contrle, lapplication de champs lectriques ou
lapplication des hautes pressions (RODGERS, 2004 ; DEEGAN et al., 2006 ; GALVEZ et
al., 2007). Dautre part, la bio-conservation par lutilisation de bactriocines incorpores dans
lemballage associe lutilisation dinhibiteurs de protases ou de protines de soja a t
suggre. Car plusieurs facteurs sont considrer lors de lapplication de ces biomolcules
dans une matrice alimentaire : la texture du produit, sa composition, son pH ainsi que son
activit de leau Aw, influencent la stabilit de la molcule de bactriocine et donc son activit
antibactrienne, dautre part, ces facteurs sont considrer quant leur effet sur la croissance
et la prolifration des germes pathognes dans le produit conserver (KOUAKOU, 2008).
29
Lauto-immunit et la
rsistance aux bactriocines
Lauto-immunit et la rsistance aux bactriocines
1-Lauto-immunit
Lauto-immunit consiste en la protection de la cellule productrice de bactriocines
contre la bactriocine quelle produit.
1-1-
Lauto-immunit des lantibiotiques
Deux mcanismes peuvent tre responsables de lauto-immunit :

La production dune lipoprotine dimmunit code par le gne LanI : Cette protine
sattache la surface externe de la membrane et interagit avec le lantibiotique afin de
lempcher de former des pores dans la membrane de la cellule productrice. La structure de
ces protines est trs variable, ce qui permet de supposer une certaine spcificit dinteraction
avec le lantibiotique (TWOMEY et al., 2002 ; JOHNSEN et al., 2004). Pour la nisine, il
semblerait que lextrmit C-terminal de cette lipoprotine dimmunit soit implique dans
linteraction spcifique avec la bactriocine (TAKALA et al., 2006).
LABC transporteur cod par les gnes LanE, LanF et LanG : Ce systme permettrait
dexporter le lantibiotique lextrieur de la membrane cellulaire, permettant de garder la
concentration intracellulaire en dessous du seuil critique. Le mode daction est toujours sous
tude. Nanmoins, mme sil est vident que ce systme permet daugmenter lautoimmunit,
il semblerait quil ne soit pas suffisant pour confrer une immunit totale et doit tre complt
par le premier (STEIN et al., 2003; LI et al., 2006).
1-2-
Lauto-immunit des bactriocines de classe II

1-2-1- La classe IIa
Pour les bactriocines de classe IIa, lauto-immunit semblerait provenir de la

production dune protine dimmunit intracellulaire contenant entre 88 et 115 acides amins
(MARTIN-VISSCHER et al., 2008). Ces protines globulaires sont cationiques et
hydrophobes (MARTIN-VISSCHER et al., 2008). Le gne les codant est la plupart du temps
co-transcrit avec le gne de structure de la bactriocine, les deux gnes constituant un opron.
Cependant, des gnes dimmunit indpendants ont dj t dcrits comme orfY qui
donne une protection contre la leucocin A et lenterocin A (FIMLAND et al., 2002). Les
protines dimmunits des bactriocines de classe IIa sont classes en trois sous-groupes sur
la base de leur alignement de squence. Il y a une grande variation entre les squences des
diffrentes protines dimmunit, malgr le haut degr dhomologie des bactriocines
correspondantes (FIMLAND et al., 2002). Les protines dimmunit ont un haut degr de
spcificit. Nanmoins, elles peuvent donner une immunit aux bactriocines contenant des
squences C-terminales homologues. Une classification des bactriocines sur la base de ces
squences a donc t ralise.
Brivement, le sous-groupe1 contient lenterocin A, la pediocin PA-1, la sakacin P et
la piscicolin 126 ; le sous-groupe 2 contient la leucocin A et la mesentericin Y105 tandis que
le sous-groupe 3 contient la curvacin A, la carnobacteriocin Bm1 et lenterocin P (FIMLAND
et al., 2002).
30
De plus, il semble que la squence C-terminale des protines dimmunit permette

galement de dterminer la spcificit daction (JOHNSEN et al., 2004). La fonctionnalit de
la protine dimmunit est par ailleurs dpendante de la souche (DRIDER et al., 2006). Les
protines dimmunit ont une action intracellulaire. Diffrentes tudes ont pu montrer quelles
se trouvaient principalement dans le cytoplasme et quelles interagissent peu avec la
membrane cellulaire (JOHNSEN et al., 2004). Cependant, leur mode daction reste peu
compris (ENNAHAR et al., 2000 ; FIMLAND et al., 2002 ; DRIDER et al., 2006). DIEP et
al. (2007) ont montr rcemment que les protines dimmunit de la lactococcin A mais aussi
de bactriocines de classe IIa (lenterocin P, la sakacin A et la pediocin PA-1) agissaient en se
liant un complexe form par les sous units IIC et IID de la mannose transfrase et la
bactriocine en inhibant ainsi son action, probablement en lempchant de former les pores
qui mnent la mort de la cellule. En labsence de la bactriocine dans le milieu de culture, il
ny a pas ou trs peu dinteraction entre la protine dimmunit et les sous-units IIC et IID de
la mannose transfrase .
La bactriocine et la protine dimmunit interagiraient mais de faon indirecte, via la
EIIt Man (DIEP et al., 2007). Une fois la bactriocine fixe EIItMan, la protine dimmunit
viendrait interagir avec le complexe EIIt Man / bactriocine du ct intracellulaire (Figure 11B)
en empchant ainsi la fuite dions et dorganites intracellulaires (DIEP et al., 2007) (Figure
11C).
Figure 11: Modle dinteraction de la protine dimmunit avec la mannose permase

phosphotransfrase EIItMan pour les bactriocines de classe IIa et certaines bactriocines de
classe IId (Lactococcine A et B) (DIEP et al., 2007).
31
1-2-2- La classe IIb

Comme pour la classe IIa, la rsistance de la cellule la bactriocine quelle produit se
fait par lintermdiaire de la production dune protine dimmunit. Il ny a quun seul gne
dimmunit. Linformation gntique est localise sur le mme opron que celui des deux
gnes de structure (GARNEAU et al., 2002 ; OPPEGARD et al., 2007).
2-La rsistance aux bactriocines
A l'instar des antibiotiques conventionnels, certaines bactriocines sont sujettes aux
mcanismes de rsistance dvelopps par les cellules bactriennes et qui tendent rduire leur
spectre d'activit. Plusieurs tudes rapportent un phnomne de rsistance aux bactriocines
de type nisine et pdiocine (ENNAHAR et al., 2000 ; GRAVESEN et al., 2002).
Lapparition de phnotype de rsistance aux bactriocines chez des souches
initialement sensibles a particulirement attir lattention des chercheurs. Les phnomnes de
rsistance sont lis aux mcanismes daction de ces peptides biocides dont la cible primaire
est la membrane cellulaire (LIMONET et al., 2002).
Le terme de rsistance est dlicat dfinir. Il est en effet soumis de nombreux

paramtres ne dpendant ni de la bactriocine, ni de la souche cible, tels que la nature du
milieu de culture (liquide ou solide), sa composition, la temprature, et ltat physiologique de
la souche (GALVIN et al., 1999). Ainsi, les auteurs prcisent-ils leur dfinition de la
rsistance en dfinissant un seuil de sensibilit partir duquel la souche est considre comme
rsistante. Afin de comparer la sensibilit de diffrentes souches vis vis dune mme
bactriocine, la dtermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est la technique
la plus employe (ENNAHAR et al., 2000).
Dans le cas des bactriocines de classe IIa (type pdiocine), cette rsistance naturelle
affecte 1 8% des souches sauvages des bactries testes (Kim et al., 2007) et se dveloppe
des niveaux trs levs (DUFFES et al., 2000) comparativement au mcanisme de rsistance
la nisine qui volue graduellement (GRAVESEN et al., 2002).
En effet, une activit de nisinase a t observe chez plusieurs Bacillus spp.
(SABOURANGA, 2007). Bacillus cereus produit une nisinase bien caractrise qui possde
une activit dhydroalanine rductase qui dgrade la nisine (SABOURANGA, 2007). Dans
certains cas, la rsistance aux bactriocines peut tre spontane, elle rsulte de l'accoutumance
des bactries l'agent antimicrobien comme c'est le cas pour Lactococcus lactis IL 1403
envers la lacticine 3147 (GUINANE et al., 2006). Cependant, les souches rsistantes ces
diffrentes bactriocines se sont montres sensibles aux mutacines produites par
Streptococcus mutans (MORENCY et al., 2001).
Le dveloppement de la rsistance bactrienne aux bactriocines est un phnomne
complexe dont les mcanismes ne sont pas totalement caractriss mais qui semble incriminer
plusieurs lments. La rsistance bactrienne peut survenir la suite des altrations de la
composition de la membrane cytoplasmique, des modifications en phospholipides
membranaires, et des changements au niveau de la paroi cellulaire (RUSSEL et
MONTOVANI, 2001 ; FABRETTI et al., 2006 ;).
32
MC ENTIRE et al. (2004) ont montr que la rsistance de L. monocytogenes la

nisine rsulte d'une intense activit ATPase. D'autres tudes associent la rsistance aux
bactriocines l'existence de plasmide.
Ainsi, TANG et al. (2001) ont identifi chez L. lactis subsp. lactis un gros plasmide
PTS50 de 47 kb qui encode la rsistance la nisine. CHEN et al. (2006) dans une tude
similaire effectue chez L. lactis, rvle que le gne dterminant la rsistance la nisine est
situ sur un plasmide. Cette mergence de bactries pathognes rsistantes la nisine sme le
doute quant l'utilisation des bactriocines comme bio prservatif alimentaire. A cela, on
pourrait ajouter trois facteurs limitant qui rduisent leur efficacit dans les aliments :
- Les bactriocines sont trs peu actives contre les bactries Gram ngatif, les levures et les
moisissures,
- elles ne sont pas efficaces contre toutes les bactries pathognes Gram positif (cellules
vgtatives et spores). Leur spectre d'activit varie avec la nature de la matrice alimentaire,
- il peut exister au sein des souches de bactries Gram positif sensibles, des mutants
insensibles pouvant crotre en prsence de bactriocines (SABOURANGA, 2007).
Cependant, l'intrt croissant du public pour les additifs de conservation d'origine
biologique, stimule les recherches sur d'autres bactriocines plus efficaces (ENNAHAR et al.,
2000). Ainsi, pour contourner le phnomne de rsistance aux bactriocines, on prconise
dans le domaine alimentaire, l'utilisation combine de plusieurs peptides antimicrobiens
d'origine diverse et adapts aux conditions de la matrice alimentaire. Cela cre un effet
synergique d'activit contre de nombreux pathognes alimentaires (LUDERS et al., 2003).
Afin d'liminer des bactries indsirables dans les aliments, O'SULLIVAN et al.
(2003) ont propos l'introduction de bactriocine par application de cultures de cellules
productrices de plusieurs bactriocines.
2-1-Les diffrents types de rsistants
Il existe pour les bactriocines trois types de rsistants :
- Les rsistants naturels, cest dire les souches qui sont insensibles une bactriocine
donne sans adaptation particulire, par exemple Leuconostoc citreum CIP 103405 est
insensible la mesentrocine 52A (LIMONET et al., 2004).
- Les rsistants induits, qui sont produits lorsquune souche naturellement sensible une
bactriocine prsente un phnotype de rsistance lie une adaptation, comme cest
probablement le cas pour Ln. Mesenteroides subsp Mesenteroides LMA 7 AR vis vis de la
Mesentrocine 52A (LIMONET et al., 2002) ou des mutations, comme chez Lactococcus
lactis (GUINANE et al., 2007). Le taux de croissance des rsistants induits cultivs en
prsence de bactriocine est identique celui de la souche parentale (JASNIEWSKI et al.,
2008). En revanche, cultivs en absence de bactriocine, les rsistants induits ont une phase
de latence plus longue et un taux de croissance plus faible que celui de la souche sauvage
(DUFFES et al., 2000).
- Les souches dites immunises, cest dire celles qui produisent une protine dimmunit
simultanment une bactriocine, cas de toutes les bactries productrices de peptides
antibactriens (JASNIEWSKI et al., 2008).
33
Pour obtenir des rsistants induits, des souches bactriennes naturellement sensibles
sont soumises un stress, laide essentiellement de bactriocines. Deux mthodes sont
gnralement utilises : la premire consiste en des expositions successives de la souche
sauvage des concentrations croissantes en bactriocine (cette technique est ralisable aussi
bien en milieu liquide que solide) (LIMONET et al., 2002). La deuxime mthode repose sur
une exposition unique mais une concentration leve en bactriocine (CRANDALL et al.,
1998).
Lobtention de mutants rsistants une bactriocine par mutagense dirige est
possible si la cible muter est le rcepteur de la bactriocine comme la mannose permase
(AROUS et al., 2004 ; CALVEZ et al., 2007 ; DIEP et al., 2007). Il est possible de
slectionner une souche rsistante une bactriocine partir dune banque de mutants
obtenus par mutagense insertionnelle alatoire. Des mutants de L. lactis IL1403 rsistantes
aux lantibiotiques ont t obtenus partir dune banque ralise par intgration du plasmide
pORI19 (GUIANE et al., 2007). Il en est de mme pour L. innocua rsistant la pdiocine
AcH. Une banque de mutants a t cre en utilisant le transposon Tn917 (XUE et al., 2005).
Lavantage de ces techniques est quelles peuvent permettre lidentification de lacteur
responsable du phnotype de rsistance, par consquent le facteur de sensibilit peut parfois
en tre dduit. Des repiquages successifs de rsistants induits, avec ou sans pression de
slection, ont permis de montrer que le phnotype de rsistance semble tre stable, ainsi la
rsistance de L. monocytogenes la divercine V41 est conserve aprs 20 repiquages
(DUFFES et al., 2000).
2-1-Les caractristiques des rsistants
Le support gntique de la rsistance na pas encore t lucid. Cependant chez L.
Monocytogenes, trois gnes, pbp 2229, hpk1021 et Imo2487, codant respectivement une
penicillin-binding protine, une histidine kinase et une protine de fonction inconnue ont t
mis en vidence (GRAVESEN et al., 2004).
Actuellement, la comprhension du mcanisme de rsistance porte sur les tudes de la
membrane cytoplasmique. Lapparition dun phnotype de rsistance est trs souvent lie
une modification des caractristiques de la membrane. Le seul modle concernant le
mcanisme de rsistance aux bactriocines a t propos par CRANDALL et MONTVILLE
en 1998 et concerne la nisino-rsistance de L. Monocytogenes ATCC 700302. Il implique
plusieurs facteurs :
- La modification du peptidoglycane et la prsence de cations divalents gnant la progression
de la bactriocine vers la membrane cytoplasmique.
- La modification de la charge lectrique de la bicouche lipidique diminuant ainsi les
interactions lectrostatiques entre les bactriocines et la membrane.
- La modification de la rigidit membranaire sopposant linsertion des bactriocines dans la
membrane.
Cependant, en 2011, MAKHLOUFI et al., ont rapport que la nisino-rsistance de L.
monocytogenes ne provenait pas de la non adsorption de la bactriocine sur les cellules.
Lhypothse de la modification des protines membranaires a galement t formule.
34
La diffrence de composition membranaire en acides gras, en phospholipides des

rsistants induits par rapport la souche parentale a t rapporte (VADYVALOO et al.,
2002 ; LIMONET et al., 2004; KOVACS et al., 2006 ; KRAMER et al., 2008). Plusieurs
auteurs ont tudi le rle des protines dans la rsistance aux bactriocines, soit par une tude
du protome, soit par une approche gntique, soit par une tude de lARNm (KRAMER et
al., 2006). Ainsi chez L. Monocytogenes limplication du gne rpoN a t observe dans le
phnomne de rsistance (DALET et al., 2001). Ce gne code pour une protine de 447
rsidus dacides amins semblable la sous unit 54 dune ARN polymrase bactrienne de
B. Subtilis. Quand le facteur de transcription rpoN nest pas exprim chez la souche sensible,
cette dernire devient rsistante la mesentricine Y105. De plus, lorsque le gne codant ce
facteur est interrompu chez E. Feacalis JH2-2, la souche devient rsistante plusieurs
bactriocines de la sous-classe IIa et reste sensible la nisine (DALET et al., 2000 ;
HECHARD et al., 2001). Chez un variant de L.Monocytogenes rsistant la leucocine A,
labsence dune protine prsentant 83% didentit avec une mannose phospho-transfrase
spcifique a t mentionne (SPRULES et al., 2004).
Des diffrences au niveau du protome entre L. Monocytogenes et de son variant
nisino-rsistant ont t observes par lectrophorse bidimensionnelle (DUFFES et al., 2000)
et qui consistent en la disparition de neuf protines et en lapparition de huit autres dont une
flagelline et une ferritine. Ces auteurs mettent comme hypothse quil ne semble pas y avoir
de relation entre ces protines et le phnotype de rsistance mais une drgulation du systme
dexpression du facteur sigma.
La mannose permase interviendrait dans la rsistance face plusieurs bactriocines
de la sous-classe IIa chez L. Monocytogenes (GRAVESEN et al., 2002 ; AROUS et al., 2004 ;
VADYVALOO et al., 2004) et chez L. Innocua (XUE et al., 2005). Ces auteurs suggrent que
la mannose permase est le rcepteur des bactriocines de la sous-classe IIa, mais cette
hypothse na pas t gnralise avec toutes les souches et toutes les bactriocines tudies.
Certains peptides antibactriens ciblent un compos intracellulaire (BROGDEN,
2005). Des rsistants peuvent alors apparaitre en modifiant cette cible cytoplasmique ; cest le
cas dE. Coli DH5 rsistant la microcine J25 qui est mute au niveau de lARN
polymrase, cible du peptide (YUZENKOVA et al., 2002).
2-3-Le mcanisme de rsistance des cellules cible aux bactriocines
Etant donn quune des utilisations principales des bactriocines est leur application
dans lindustrie alimentaire pour prvenir des contaminations par des bactries pathognes
telles que L. monocytogenes, le dveloppement de souches rsistantes peut tre un problme.
2-3-1- La rsistance aux lantibiotiques
Le mcanisme de rsistance des lantibiotiques le plus tudi est celui de la rsistance
la nisine. Les rsistances vis vis de la nisine dans des souches non rsistantes apparaissent
la frquence de 10-9 10-2 pour L. monocytogenes et 10-8 10-2 pour les autres
microorganismes aprs exposition des concentrations croissantes. Leur stabilit est variable
(GRAVESEN et al., 2002 ; GUINANE et al., 2006 ; KRAMER et al., 2006 ; GUINANE et
al., 2007). La frquence dapparition des rsistances varie en fonction de la souche cible et
des conditions environnementales (pH, concentration en chlorure de sodium et temprature).
35
Lapparition dune rsistance est souvent associe une diminution du taux de

croissance maximale de la cellule (GRAVESEN et al., 2002). Il a t montr que les mutants
rsistants navaient pas de modification au niveau du lipide II (KRAMER et al., 2004). La
rsistance la nisine a t attribue une diffrence de la composition en acide gras dans la
membrane et des modifications au niveau de la paroi cellulaire (KRAMER et al., 2006;
NAGHMOUCHI et al., 2007). Rcemment, KRAMER et al. (2006) ont montr que des
souches de Lactococcus lactis rsistantes la nisine exprimaient diffremment 93 gnes par
rapport la souche sauvage non rsistante, 62 tant plus exprims et 31 tant sous exprims.
Cette tude a permis de montrer que le mcanisme principal de rsistance semblait tre
dempcher la bactriocine datteindre le lipide II par diffrents modes (KRAMER et al.,
2006) :
- Changer la paroi cellulaire en lpaississant, la faisant plus dense ou en changeant sa charge,

- Elever le pH local lextrieur de la membrane cytoplasmique,
- Changer lexpression de lopron fab qui est impliqu dans llongation et la saturation des
phospholipides, ce qui augmente la fluidit de la membrane et empche la nisine de former
des pores,
- Changer les ABC transporteurs prsents. Ils peuvent tre impliqus dans lexcrtion de la
nisine hors de la membrane cytoplasmique, lempchant datteindre le lipide II.
Dautre part, il a t montr que ladsorption de la lacticin 3147 sur la membrane des
cellules cibles tait diminue chez les mutants rsistants (GUINANE et al., 2006).
Lapparition dune rsistance contre un lantibiotique peut induire une rsistance contre un
autre. Par exemple, lapparition dune rsistance contre la lacticin 3147 induit une rsistance
la nisine (GUINANE et al., 2007).
2-3-2- La rsistance aux bactriocines de classe IIa
Les rsistances aux bactriocines de classe IIa sont souvent trs leves avec une
augmentation de la CMI (concentration minimale inhibitrice) dun facteur 1000. 1 8 % des
souches sauvages de L. monocytogenes isoles sont rsistantes (GRAVESEN et al., 2002).
Les mutations spontanes apparaissent aprs exposition la bactriocine. L. Monocytogenes
dveloppe des rsistances aux bactriocines de classe IIa la frquence de 10-3 10-6
(GRAVESEN et al., 2004). Cette frquence dapparition des rsistances varie en fonction de
la souche, de la bactriocine et de facteurs environnementaux tels que le pH, la concentration
en chlorure de sodium et la temprature (GRAVESEN et al., 2002). La stabilit de ces
mutants est variable. Par exemple, des mutants spontans de L. monocytogenes 412rsistants
la pediocin PA-1 gardent cette rsistance aprs 100 gnrations (GRAVESEN et al., 2002).
Diffrents mcanismes sont lorigine de cette rsistance :
- Laugmentation du pourcentage dacides gras insaturs dans la membrane et du nombre de

chanes courtes. Ces modifications augmentent la fluidit de la membrane en diminuant les
potentialits dinsertion de la bactriocine et la formation des pores (VADYVALOO et al.,
2002),
- Labsence de la mannose phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransfrase (PSTS), la
molcule transmembranaire rceptrice de la bactriocine (VADYVALOO et al., 2004). Il a
t montr que, chez L. monocytogenes, linactivation du gne rpoN et de lopron mpt codant
pour la mannose permase induit la rsistance de L. monocytogenes.
36
La mannose permase est une protine transmembranaire qui assure le transport du

sucre (mannose, glucose et 2-doxyglucose chez L. monocytogenes) et sa phosphorylation de
part et dautre de la membrane cellulaire. Chez L. monocytogenes, cette molcule contient
trois sous-units. Le gne rpoN code pour la sous-unit 54 de la RNA polymrase
bactrienne qui dirige lactivation de la transcription de lopron mpt.
Dans les mutants rsistants, une diminution de lexpression du gne codant pour la
mannose permase et une augmentation de lexpression du gne codant pour la
phosphotransfrase spcifique des - glucosides ont t remarques (GRAVESEN et al.,
2002a; GRAVESEN et al., 2002b; GRAVESEN et al., 2004; VADYVALOO et al., 2004).
Par ailleurs, il a t montr que des mutants rsistants avaient un taux de croissance
maximal rduit (GRAVESEN et al., 2002). Cette rduction peut tre attribue la diminution
de la capacit transporter des nutriments, comme le glucose, de part et dautres de la
membrane cellulaire (NAGHMOUCHI et al., 2007).
2-3-3- Les cross-rsistances
Les mcanismes de rsistances aux lantibiotiques et aux bactriocines de la classe IIa
ne sont pas les mmes. Cependant, la rsistance aux lantibiotiques peut parfois entraner une
rsistance aux bactriocines de classe IIa ou inversement. Par exemple, NAGHMOUCHI et
al. (2007), ont montr que la rsistance de L. monocytogenes acquise la nisine A ou Z
augmente la rsistance la pediocin PA-1 et la divergicin M35, deux bactriocines de classe
IIa. Dautre part, les mutants rsistant la divergicin M35 montrent une rsistance accrue la
nisine Z mais rduite la nisine A. Les mutants rsistant la pediocin PA-1, quand eux, ont
une rsistance plus leve la nisine Z et la divergicine mais diminue la nisine A.
37
Chapitre II :
Partie exprimentale
Matriel et mthodes
Matriel et mthodes
1-Matriel
1-1-Matriel biologique
- Bactries lactiques potentiellement bactriocinognes de la collection du laboratoire de
Microbiologie Applique (intgr lunit de recherche Laboratoire de Biochimie Analytique
et de biotechnologies LABAB) isoles du lait de chamelle, et appartenant aux deux genres
Lactococcus et Lactobacillus :
CH5: Lactococcus lactis ssp lactis.
CH7: Lactococcus lactis ssp raffinolactis.
CH8: Lactococcus lactis ssp lactis.
CH15: Lactobacillus brevis/buchneri.
- Bactrie cible: Listeria innocua. F Collecte et isole luniversit de Nantes.
1-2-Appareillage
- Cuve verticale d'lectrophorse, plaques en verre, spacers, peigne, gnrateur de courant
(HoeferminiVe, Germanie).
- Petite cuve verticale dlectrophorse BIO-RAD MINI 2-D CELL. France.
- Cuve horizontale dlectrophorse dADN (Bio-RAD MINI- SUB-CELL-GT). France.
- Agitateur lectrique et agitateur de tube essais.
- Agitateur magntique plaque chauffante (Ruhnromag, Germanie).
- Bain marie.
- Rfrigrateur domestique.
- Conglateur -20C.
- pH mtre lectronique.
- Plaque chauffante rglable 95C
- Balance lectronique de prcision 0,001g (KERN-EW, Germanie).
- Centrifugeuse 6461g.
- Centrifugeuse rfrigre 20 000 g (SIGMA 4-16 K, France).
- Centrifugeuse eppendorfs de 13 000 g (SANYO Mst Micro centaur, Germanie).
- Etuve de 37C (memmert). Et de 30C (BINDER, England).
- Etuve de strilisation rglable jusqu' 250c.
- Autoclave (Pb international, Germanie).
- Appareil de visualisation : chambre et dtecteur UV SERIAL N12200230. Germanie.
- Spectrophotomtre visible medine scientific limited WAVELENGTH. Germanie.
- Spectrophotomtre UV-Visible UV mini-1240 UV-Vis Spectrohotometer SHIMATZU.
Japon.
38
Matriel et mthodes
2-Mthodes
2-1-Revivification des germes
Les bactries lactiques ainsi que la souche cible Listeria innocua. F, ont t conserves
-20C dans le bouillon M17 contenant 30% de glycrol strile et sur milieu de conservation
en piqre centrale.
Afin de les revivifier, les bactries lactiques sont ensemences d'abord dans 1ml de
bouillon Elliker et incubes 37C pendant 24h. Quant Listeria innocua F, elle est
ensemence dans 5ml de bouillon BHIB puis incube 37C pendant 24h.
2-2-Test d'activit par la mthode de diffusion des puits
Dans cette technique, les deux souches bactriennes (souche test et souche indicatrice)
sont cultives dans leurs conditions optimales de croissance. Afin de s'assurer du pouvoir
producteur de nos souches en bactriocines aprs leur conglation long terme et galement
de confirmer la nature protique des bactriocines par l'tude de leur sensibilit vis--vis des
enzymes protolytiques. Nous nous sommes bass sur le protocole de GONZALEZ et al
(2007) que nous avons modifi selon les moyens dont nous disposons au laboratoire. Pour se
faire, les tapes ci-aprs ont t suivies :
2-2-1- Prparation du surnageant actif
- Ensemencer la souche lactique dans 1ml de bouillon nutritif enrichi ;
- Incuber 24h 37C ;
- Repiquer sur 10ml par le bouillon nutritif enrichi ;
- Ajouter 2 ml dhuile de vaseline strile pour assurer lanarobiose ;
- Incuber 18h 30C ;
- Aspirer lhuile de vaseline avec une micropipette ;
- Centrifuger 8000g / 30min + 4C ;
- Neutraliser le surnageant rcupr, pH 7 avec NaOH 1N.
2-2-2- Prparation de linoculum de la souche indicatrice
- Raliser une culture de Listeria innocua F sur 5ml de bouillon nutritif enrichi ;
- Incuber 30C pendant 18h ;
- Prendre 500l partir d'une culture Over Night de Listeria innocua F 37C;
- Ajuster 5ml par de l'eau physiologique (0,9% NaCl) strile et homogniser (Ralisation
dune dilution 1/10 au lieu de 1/100 (modifie en fonction des conditions pratiques).
- Inoculer 15ml de glose nutritive enrichie (et contenant 0,9% dagar), avec 15l de la
suspension de Listeria innocua F initialement prpare (DO = 0,08 correspondant
106UFT/ml 625nm) ;
- Homogniser la glose ;
- Couler sur boite de Ptri et laisser un moment sur la paillasse pour solidification;
- Raliser des puits de 6mm de diamtre dans la glose avec le bout circulaire ouvert dune
pipette pasteur ou dune cloche de Durham, strile.
Remarque : dans notre cas, la DO = 0,08 est obtenu par dilution de la suspension de la
souche cible 1/10 au lieu de 1/100 utilis dans le protocole de Nantes, cela est d, la faible
39
Matriel et mthodes
densit microbienne que nous avons obtenu justifie par le manque de milieu de culture
(substitution du milieu ELLIKER par le bouillon nutritif enrichi).
2-2-3- Ralisation du test
- Charger les puits avec 70l du surnageant neutralis ;
- Laisser diffuser sur la paillasse durant 1h ;
- Incuber 16h 30C ;
- Deux puits ont t raliss par boite, le premier contenant de l'eau distille strile (tmoin
ngatif), le deuxime renfermant le surnageant de la souche lactique.
La lecture se fait par la mesure du diamtre en mm avec pied coulisse, des zones
dinhibitions formes autour des puits (Zi).
Un rsultat est considr positif si le diamtre de la zone dinhibition est suprieur
2mm (YILDIRIM. Z et YILDIRIM. M, 2001). La dtermination du diamtre dinhibition se
fait par la formule suivante :
Zi = diamtre de la zone dinhibition obtenue diamtre du puits (6mm).
2-2-4-Confirmation de la nature protique des bactriocines
On utilise deux enzymes protolytiques concentration finale d'enzyme de 1mg/ml
respectivement de Trypsine et de Pepsine. Cette tape nous donnera une ide sur les
squences en AA des peptides bioactifs, car les deux enzymes protolytiques utilises ont des
sites de coupures diffrents. La trypsine coupe la droite des acides amins basiques et la
pepsine, gauche des acides amins neutres.
Prparation des enzymes (BENKERROUM et al., 2000 ; CHEN et HOOVER,
2003).
-Trypsine
- Prparer le tampon phosphate (0,1M, pH 6) ;
- peser 20mg denzyme avec une balance de prcision ;
- dissoudre lenzyme dans 10ml du tampon phosphate ;
- filtrer avec un filtre de 0,22m (strilisation);
- conserver + 4C.
-Pepsine
- Prparer une solution d'HCl (0,02M, pH 2) ;
- peser 20mg denzyme avec une balance de prcision ;
- dissoudre lenzyme dans 10ml de la solution dHCl pralablement prpare ;
- filtrer avec un filtre de 0,22m ;
- conserver +4C.
40
Matriel et mthodes
Technique
- Mlanger 1ml du surnageant neutralis pH 7 avec 1 ml de la solution enzymatique
(Rapport volumique 1:1) pour avoir une concentration finale en enzymes de 1mg/ml ;
- incuber 2h 37C dans un bain marie ; afin de permettre le contact avec l'enzyme et assurer
ainsi la raction bactriocine-enzyme ;
- charger les puits avec 70l des solutions suivantes : tampon avec enzyme, surnageant sans
enzyme et surnageant avec enzyme ;
- laisser diffuser 1h la paillasse ;
- incuber 16h 30C.
La lecture se fait par la recherche des zones dinhibitions et la mesure de leurs diamtres.
Le schma de la figure suivante rsume les tapes suivies dans ce protocole :
41
Matriel et mthodes
Figure 12 : schma rsumant le protocole du test de diffusion des puits.
42
Matriel et mthodes
Figure 13 : schma rsumant le protocole dinactivation aux protases.
43
Matriel et mthodes
2-3-Purification des bactriocines

Lobjectif de cette partie est dobtenir les PM des bactriocines produites par les
souches tudies. Nous avons procd leur sparation par une PAGE-SDS, puis vrifier
l'activit antibactrienne des bandes migres par leur expression par la technique du
zymogramme (SCHAGGER et VON JACOW, 1987).
2-3-1-Ensemencement des bactries lactiques productrices de bactriocines
Les souches lactiques revivifies sont repiques dans 10ml de bouillon Elliker. Au
bout de 24h d'incubation 37C, selon le protocole de NISSEN-MEYER et al (1992) et afin
davoir une grande productibilit en bactriocines, une grande culture a t effectue dans
100ml de bouillon Elliker raison de 10% de la culture prcdente. Cette culture est incube
37C pendant 18h.
Au total, 4 souches lactiques sont ensemences :
-Trois souches du genre lactococcus : Lactococcus lactis ssp lactis CH05, Lactococcus lactis
ssp raffinolactis CH07, Lactococcus lactis ssp lactis CH08.
-Une souche de lactobacillus : lactobacillus brevis/buchnerii CH15.
2-3-2-Sparation des bactriocines par Electrophorse PAGE-SDS
Aprs 16h d'incubation correspondant la phase exponentielle de la croissance
bactrienne (ACHEMCHEM et al., 2004), le bouillon Elliker troubl, de 100ml, est
neutralis, dans des conditions striles, pH 6,5 (pH optimal pour l'adsorption des molcules
de bactriocines sur les membranes des bactries productrices selon (YANG et al., 1992),
puis remis l'incubation sous 37C pendant 2h.
Aprs ces 2h dincubation, une centrifugation a t ralise 6461g pendant 30mn. Le
culot rcupr, est solubilis dans 4ml d'une solution d'eau distille ajuste pH 1,4 par du
HCl 32%. Cette acidit a pour rle de faire dsorber les bactriocines fixes sur les parois
bactriennes (YANG et al., 1992). En comparaison avec les techniques classiques de
purification des protines, cette mthode d'adsorption-dsorption semble tre plus
conomique, plus rapide et reproductible (PIARD et al., 1992).
Ensuite, aprs ajout de 500 l de Tween 80 qui est un surfactant influenant la
dsorption (BROWER et DAESCHEL, 1995), le mlange obtenu a subi une deuxime
centrifugation 6461g pendant 30 min, permettant de rcuprer le surnageant contenant les
bactriocines dsorbes. Enfin, les surnageant rcuprs des diffrentes cultures des souches
tudies, sont rpartis dans des tubes eppendorfs et mlangs avec la solution de
dnaturation. (Voire Annexe 5).
Les tubes eppendorfs sont mis sur une plaque chauffante pendant 5mn sous 95C pour
assurer la dnaturation des protines au contact avec la solution dnaturante, avant d'tre, en
dernier lieu, soumis une migration en cuve verticale par une lectrophorse PAGE-SDS
(LACHANCE, 2000).
La sparation se fait dans une plaque contenant trois gels, un stacking gel 6%, un gel
spacer de 10% et le separating gel de 15% en polyacrylamide, dposs l'un aprs l'autre
respectivement.
44
Matriel et mthodes
Chaque chantillon a t charg sur le gel en duplicata de faon pouvoir couper le

gel en deux la fin de la migration et ainsi obtenir deux gels identiques (voir annexe 6). La
plaque contenant l'ensemble gel et chantillons est ensuite plonges dans le tampon
d'lectrophorse 1X, puis la migration est lance sous les paramtres 250V et 20mA.
Un marqueur de taille PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas LIFE
SCIENCE) est utilis, couvrant la gamme de PM suivante : 250 KDa, 130 KDa, 95 KDa,
72 KDa, 55 KDa, 36 KDa, 28 KDa, 17 KDa et 10 KDa.
A la fin de la migration, le gel est dcoup en deux parties, la premire destine la
coloration des bandes protiques est traite comme suit :
- 1h de fixation ;
- 1h de coloration au bleu de Coomassie G250 ;
-1 h de dcoloration ;
L'autre est destine la technique du zymogramme.
2-3-3-Expression de l'activit antimicrobienne par la technique du
zymogramme
La partie du gel destine au zymogramme est mise :
- 1h avec agitation douce dans une solution 20 % disopropanol et 10% dacide actique ;
- 1h avec agitation douce dans une solution dH2O distille 0.5% de tween 20 (v/v) ;
- 1 nuit avec agitation douce dans de leau distille ;
Viennent, ensuite, les tapes suivantes :
- Rincer le gel avec de leau distille filtre (0.2 m) puis le dposer bien plat dans une boite
de ptri sous hotte ;
- inonder le gel avec 20 ml de milieu de culture soft agar (0.8% agarose) contenant la bactrie
indicatrice raison de 106 cellules/ml, en vitant la formation de bulle laide de la pointe
dun cne en verre strile ;
- laisser prendre en masse sous la hotte ;
- incuber selon les conditions optimales de croissance de la bactrie indicatrice.
Aprs incubation, la lecture se fera en localisant une zone dinhibition de la souche
cible tale sur ce gel, puis la superposer sur le gel color afin de situer la bande protique qui
lui correspond et trouver ainsi le PM de la bactriocine.
45
Matriel et mthodes
Figure 14 : schma rsumant le protocole de purification des bactriocines.
46
Matriel et mthodes
2-4-Caractrisation gntique des bactriocines par la mthode de la cure plasmidique

Les bactriocines sont codes par des clusters gntiques ports soit par le
chromosome bactrien, soit par les plasmides, afin de localiser cet emplacement gntique, il
convient disoler, partir des souches tudies, des mutants Bac non producteurs de
bactriocines. La cure des plasmides est lune des techniques utilises pour lidentification
gntique de ces molcules (BELKADI, 2010).
Aprs ensemencement des souches bactriocinognes en prsence de lagent curant,
(Rifampicine ou Novobiocine), les mutants Bac sont isols, leurs profils plasmidiques sont
dtermins par lextraction et la migration lectrophortique de lADN plasmidique, puis
leurs activits inhibitrices vis vis de la souche cible Listeria innocua F sont testes par les
deux mthodes ralises dans les tapes prcdentes, savoir, le test dinhibition par la
mthode de diffusion des puits, et la technique du zymogramme.
Dans cette tape, seules les deux souches potentiellement bactriocinognes : CH05 et
CH07 ont t utilises.
2-4-1-Cure des plasmides
Principes
Cette exprience a pour but de :
-Provoquer la perte dun plasmide codant aux bactriocines par culture de la souche
productrice en prsence dun agent curant utilis une concentration sub-inhibitrice (proche
de la CMI). Les agents curant empchent par diffrents mcanismes la rplication de lADN
(bromure dthidium, acridine orange, U.V., antibiotiques...).Les agents curant choisis sont :
la Rifampicine et la Novobiocine.
La rifampicine est un antibiotique bactricide de la famille des rifamycines, il inhibe
lARN polymrase bactrienne, arrtant ainsi la synthse du brin avanc de la rplication de
lADN et celle de lARNm dans la synthse des protines (GRISEMINE, 2002).
La novobiocine est un antibiotique bactricide de la famille des quinolones qui agit sur
lADN gyrase, une enzyme de la classe des topo-isomrases de type II dont le rle est de
contrler la structure topologique de lADN en gnrant des coupures transitoires dans celuici
et en catalysant le passage des segments dADN travers ces coupures avant de les refermer,
ces mcanismes ont pour but, la stabilisation de la double hlice dADN par sa condensation
ainsi que son droulement (relchement) pour faciliter le processus de la rplication
(GRIFFITHS et al, 2002). Ces enzymes permettent notamment d'ajouter et d'enlever des super
tours dans les molcules d'ADN. Elles jouent un rle essentiel lors de nombreuses tapes de la
vie cellulaire (rplication, transcription, sparation des chromosomes, etc.).LADN-gyrase
produit une srie de coupures et de ligations des brins dADN ce qui permet le relchement de
la molcule puis son enroulement. Au moment de la coupure, lADN et la gyrase sont
transitoirement lis de manire covalente.
La novobiocine agit sur ce complexe transitoire en formant un complexe irrversible
ADN-gyrase-novobiocine. La soudure des brins est spcifiquement inhibe par lantibiotique
et lADN bactrien se trouve sous forme de fragments (EUZEBY, 2010).
47
Matriel et mthodes
La novobiocine cible lADN gyrase bactrienne, ce qui inhibe cette dernire tout en
empchant la rplication de lADN chromosomique et donc la multiplication bactrienne
(KARP, 2004). A des concentrations sub-inhibitrices, ces antibiotiques exercent leurs actions
sur lADN plasmidique sans affecter le chromosome bactrien (GRISEMINE, 2002).
Protocoles
Cure des plasmides par la rifampicine
(Protocole modifi de luniversit de TOURS (France) (microbiologie.univtours.
fr/tp_m1_UE7_5a). Unit denseignement de chimiothrapies anti-infectieuses UE-S7- 5a,
2006 : application la caractrisation gntique des bactriocines).
Les souches lactiques sont cultives en prsence de lagent curant afin de dterminer
la CMI la rifampicine en milieu liquide. Ceci permettra de choisir le tube renfermant la
concentration sub-inhibitrice la plus proche.
Gamme de demi-dilution de la rifampicine 10x dans leau (600 18.75 g/ml) :

- A partir dune solution mre de rifampicine 1g/L, prparer :
- 1 ml de rifampicine 600 g/ml
- 1 ml de rifampicine 400 g/ml
Mettre 0,5 ml deau distille strile, dans 9 tubes essais striles, numrots 300, 200, 150,
100, 75, 50, 37.5, 25 et 18.75.
Diluer, avec des sries de demi-dilutions, les tubes 600 g/ml et 400 g/ml, sans changer de
cne de pipette:
Tube 600 ==> 300 ==> 150 ==> 75 ==> 37.5 ==> 18.75.
(Ex. 0,5 ml deau + 0,5 ml rifampicine 600 = 1 ml rifampicine 300.....)
Tube 400 ==> 200 ==> 100 ==> 50 ==> 25.
48
Matriel et mthodes
Le schma suivant reprsente les tapes ralises :

500l
600 g/ml
500l
300 g/ml
500l
150 g/ml
500l
75 g/ml
500l
37,5 g/ml
18,75 g/ml
500l deau distille strile

Solution mre
de Rifampicine
1g/L
500l
400 g/ml
500l
200 g/ml
500l
100 g/ml
500l
50 g/ml
25 g/ml
500l deau distille strile
Figure 15: schma dtaill des tapes de prparation de la gamme de dilution de la

rifampicine 10X.
Gamme de dilution de la rifampicine 1x dans du bouillon Elliker (60 1.875 g/ml)
- Mettre 0.8 ml de bouillon Elliker dans 11 tubes numrots 60, 40, 30, 20, 15, 10, 7.5, 5.0,
3.75, 2.5 et 1.875.
- Ajouter 0.1 ml des solutions de rifampicine 10x correspondantes.
- Prparer 1 douzime tube = tube tmoin avec 0.9 ml de bouillon Elliker strile.
Dilution de la culture bactrienne 10-2 (quivalent 106 UFT/ml)
Mettre 0.1 ml de la culture bactrienne (Over night) dans 10 ml deau physiologique strile.
Ensemencement
- Ajouter aux 12 tubes 0.1 ml de la dilution 10-2 de la culture bactrienne en commenant par
le tube Tmoin. Incuber 24h 37C.
49
Matriel et mthodes
Le schma suivant illustre les tapes entrepris pour la prparation de la gamme de dilutions de
la rifampicine 1X :
Tube tmoin
600 g/ml 400 g/ml
300 g/ml
900 l de bouillon Elliker

strile + 100 l de la
suspension bactrienne
10 6 UFT/ml
60 g/ml
Tube tmoin
200 g/ml 150 g/ml 100 g/ml 75 g/ml 50 g/ml 37,5 g/ml
25 g/ml
18,75g/ml
100 l de chaque dilution de

rifampicine 10X + 800 l de
bouillon Elliker strile +
100 l de la suspension
bactrienne 10 6 UFT/ml
40 g/ml
30g/ml
20 g/ml
15 g/ml
10g/ml
7,5 g/ml 5 g/ml 3,75 g/ml
2,5 g/ml
1,875g/ml
Gamme de dilution de la
rifampicine 1X
Figure 16 : schma dtaill des tapes de prparation de la gamme de dilution de la

rifampicine 1X.
50
Matriel et mthodes
Cure des plasmides par la Novobiocine

Dans cette tape, les donnes sont puises partir du protocole de GRISEMINE pour
la dtermination de la CMI et donc de la concentration sub-inhibitrice, dune part, et des
rsultats obtenus par lquipe de (KALCHAYANAND, 2000), savoir la formation de
mutants de Lactobacillus brevis, dont les plasmides sont curs, en utilisant des concentrations
de novobiocine allant de 0,25 g/ml 5 g/ml pour la caractrisation gntique de la
brvicine 9296.
La dmarche exprimentale a pour but de localiser la CMI de la novobiocine en milieu
liquide, suivant les mmes tapes que celles ralises pour la rifampicine, la diffrence est au
niveau des valeurs de la gamme de dilution.
Gamme de dilution de la Novobiocine 10x dans leau (50 2,5g/ml)

- A partir dune solution mre de novobiocine 400 mg/L, prparer une srie de dilution selon
lordre dcroissant : 50 g/ml, 25 g/ml, 12,5 g/ml, 6,25 g/ml, 3,125 g/ml et 2,5 g/ml.
Gamme de dilution de la novobiocine 1x dans du bouillon Elliker (5 0,25g/ml)

- Mettre 0.8 ml de bouillon Elliker dans 6 tubes numrots : 5 ; 2,5 ; 1,25 ; 0,625 ; 0,3125 ;
0,25.
- Ajouter 0.1mL des solutions de novobiocine 10x correspondantes.
- Prparer 1 septime tube = tube tmoin avec 0.9 ml de bouillon Elliker strile.
Dilution de la culture bactrienne 10-3

Mettre 10L de la culture bactrienne (Over night) dans 10 ml deau physiologique strile.
Ensemencement
- Ajouter aux 7 tubes 0.1 ml de la dilution 10-3 de la culture bactrienne en commenant par le
tube Tmoin. Incuber 24h 37C.
2-4-2-Contrle de la cure
Aprs la ralisation de la cure plasmidique pour les deux souches lactiques
slectionnes (CH05, CH07), plusieurs repiquages en bouillon Nutritif enrichi suivi
densemencements en glose nutritive enrichie, ont t raliss, en parallle avec des
observations microscopiques et des colorations de Gram, ayant pour but, la vrification de la
puret des bactries chaque tape et labsence de contaminants.
De plus, lensemencement en glose, des bactries dont les plasmides sont curs,
permet de rcuprer des colonies pures et isoles, et de raliser des suspensions exemptes de
rsidus dantibiotiques se trouvant dans le premier tube, concentration sub-inhibitrice
(obtenu lors de la gamme de dilution dans le protocole de cure plasmidique), pouvant ainsi,
donner des zones dinhibition, due laction de la rifampicine, ou de la novobiocine sur les
bactries de la souche cible (BERTHE et al., 2008) par la mthode de diffusion des puits, ce
qui donnera des faux positifs.
Cette tape de contrle de la cure des plasmides a pour intrt, de mettre en vidence
des mutants sans plasmides forms par laction des agents curant utiliss. Elle est ralise par
lextraction de lADN bactrien, suivie de sa migration dans un gel dagarose.
51
Matriel et mthodes
La comparaison entre les profils plasmidiques de la souche sauvage et de son variant

cur est ainsi possible (protocole de KALCHAYANAND, 2000).
2-4-2-1-Extraction de lADN bactrien
L'extraction de l'ADN et la dtermination des profils plasmidiques sont ralises
suivant la mthode d'ANDERSON et McKAY(1983), avec des modifications concernant les
conditions de culture des souches (milieu et temprature diffrents) et les volumes des ractifs
utiliss pour lextraction (en fonction du volume de la culture bactrienne initiale : 10ml au
lieu de 40 ml).
Les souches bactriennes sont cultives dans un bouillon BHIB 37C pendant 18 h.
La culture est alors centrifuge 2700 g pendant 10 min et le culot bactrien utilis
immdiatement pour l'extraction de l'ADN en fonction des tapes suivantes (avec
modification des volumes des ractifs utiliss):
- resuspension du culot cellulaire dans 200l de saccharose 6,7% - Tris 50mM EDTA 1mM,
pH8,0.
- chauffage 37C pendant 1h.
- ajout de 100l de Lysozyme 25mg/ml (au lieu de 10mg/ml pour les Gram ngatives) dans
Tris 25 mM, pH8,0.
- incuber pendant 20 minutes 37C.
- ajout de 40l dEDTA 0,25M Tris 50mM, pH8,0.
- ajout de 20l SDS : 20% (pds/vol) dans Tris 50mM EDTA 20mM, pH8,0.
- mlanger immdiatement.
- incuber pendant 20min 37C pour complter la lyse.
- agiter au vortex vitesse maximal pendant 30 secs dans un ppendorfs.
- ajout de 20l dune solution neuve de NaOH 3M.
- mlanger doucement par des inversions pendant 10min.
- ajout de 41l de Tris 2,0 M HCl, pH7,0.
- continuer mlanger pendant 3min.
- ajout de 60l de NaCl 5,0 M.
- ajout de 650l du phnol satur avec une solution de NaCl 3%. Mlanger.
- centrifuger 2700g pendant 5min.
- enlever la phase suprieure et extraire avec 650ldun mlange de Chloroforme/Alcool
isoamylique (24 : 1 v/v).
- centrifuger 2700 g pendant 5min.
- enlever la phase suprieure et prcipiter avec le mme volume disopropanol.
- placer -20C pendant une nuit pour acclrer la prcipitation.
- centrifuger 11000 g pendant 5min.
- enlever lexcs disopropanol et scher le culot sous vide.
- resuspendre dans 100l de Tris 10mM EDTA 1mM, pH7,5.
- examiner la solution dADN par lectrophorse sur gel dagarose.
52
Matriel et mthodes
2-4-2-2-Electrophorse de lADN bactrien

La solution dADN (20 l) est mlange une solution de dpt dans un rapport de
10/1 (Bleu de Bromophnol 0,5% ; EDTA 10 mM ; glycrol 50%, dans leau) avant dtre
dpose dans les puits du gel (0,6 % dagarose) (voire annexe 7). La solution de dpt, en
augmentant la densit de lchantillon, permet un meilleur dpt de lADN au fond des puits.
La migration de lADN se fait 100 Volt (au lieu de 70 Volt pendant 14h et 14C,
en utilisant une circulation permanente deau froide dans laquelle est plonge la cuve
dlectrophorse, selon le protocole original). LADN est rvl par raction avec le Bromure
dthidium (2g/ml pendant 20min) puis visualis dans notre unit de recherche sous
fluorescence UV dans un appareil contenant une chambre UV et quip dun dtecteur (UV
SERIAL N12200230).
2-4-3-confirmation de la localisation gntique des bactriocines par le test

dactivit par la mthode de diffusion des puits
Dans cette tape, le protocole du test dactivit par la mthode de diffusion des puits
(2-2) est suivi pour chacune des populations bactriennes suivantes (Tableau I):
Tableau I : Distribution des groupes de souches lactiques utilises pour le test dactivit par
la mthode de diffusion des puits aprs le curage des plasmides.
Groupes 1
Groupes 2
CH05
CH05 non cure
CH05 avec curage de plasmides
CH07
CH07 non cure
CH07 avec curage de plasmide
Les souches
Le test dactivit par la mthode de diffusion des puits est ralis pour les bactries
cures par la rifampicine ainsi que pour celles cures par la novobiocine. Dans chaque boite
de ptri, trois puits sont raliss, le premier contiendra 70l deau distille strile (tmoin
ngatif), le deuxime, 70l du surnageant brute actif neutralis rcupr partir de la culture
de la souche sauvage (tmoin positif) et le troisime, 70l du surnageant brute actif neutralis
rcupr partir de la culture de la souche ayant subie la cure plasmidique. (par la rifampicine
ou par la novobiocine).
2-4-4-Confirmation de la localisation gntique des bactriocines par la
technique du zymogramme
Afin de vrifier la localisation des clusters de gnes codant lactivit bactriocinique,
le test dinhibition par la mthode des puits, pour les surnageant bactriociniques rcuprs
partir des souches sauvages et des mutants curs, est complt par lapplication du mme
principe pour la mthode du zymogramme pour toutes les souches tudies.
53
Matriel et mthodes
Chaque souche est traite suivant les tapes densemencement, dlectrophorse

PAGE-SDS des extraits bactriociniques et du test dactivit par le zymogramme, avec une
distribution des chantillons de faon mettre dans les puits du gel dlectrophorse, chaque
deux groupes dune mme souche (non cure et cure respectivement), dans deux puits
voisins. (Voire Annexe 6).
2-5-Caractrisation gntique des protines dimmunit aux bactriocines
La majorit des bactries productrices de bactriocines sont capable de produire des
protines dimmunit qui leur confrent une protection contre leur propre toxine (JOHNSEN
et al., 2004). Les protines dimmunit sont en gnral spcifiques chaque souche
productrice, mais peuvent aussi dans quelques cas protger la souche productrice contre des
bactriocines phyllogntiquement proches vis--vis de sa propre bactriocine (FIMLAND et
al., 2002, JOHNSEN et al., 2004). Vingt protines dimmunit de vingt bactriocines de
classe IIa ont t caractrises ce jour (FIMLAND et al., 2005).
Les protines dimmunit des bactriocines de classe IIa sont hydrophobes et sont
formes de 88 115 acides amins. Nous avons test dans cette tape, la sensibilit de la
souche lactique sa propre bactriocine avant et aprs la cure plasmidique, dans le but de
localiser les dterminants gntiques de limmunit la bactriocine. Selon le protocole de
KALCHAYANAND (2000), les souches lactiques ainsi que leurs variants curs sont soumis
laction de la bactriocine parentale produite par la mme souche. Le test est ralis par la
mthode de diffusion des puits. Chaque surnageant brute actif est utilis sur deux boites, lune
inocule par la souche sauvage et lautre par son variant cure.
2-6-Dtermination de la concentration minimale inhibitrice des bactriocines en
unit arbitraire (U.A/ml) :
Nous avons utilis la mthode des dilutions critiques pour la dtermination de
lactivit sur milieu glos, par la mthode de diffusion des puits (principe expliqu dans la
partie bibliographique : III-3-2-1-Dtermination du titre en bactriocines).
Selon le protocole de SEBTI et al (2002), A partir dune srie de dilution de demi en
demi effectue la solution mre de bactriocines, obtenue par la mthode
dadsorption/dsorption de YANG (1992), 70 l de chaque dilution sont dposs dans un
puits. Les botes de Ptri sont alors incubes 37 C pendant 24 h. La concentration en
bactriocines en unit arbitraire ramene au ml, correspond linverse de la dilution ultime,
pour laquelle une zone dinhibition est encore visible.
La srie de dilution ralise pour chaque extrait bactriocinique est la suivante :
1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,125 ; 0,0625 ; 0,0312 ; 0,016.
54

1ml
1ml
0,5
Matriel et mthodes
1ml
0,25
1ml
0,125
1ml
0,0625
1ml
0,0312
0,016
+ 1ml deau distille

strile pour chaque
dilution
Test dactivit par la mthode de
diffusion des puits
Figure 17 : Schma illustrant les tapes de dtermination des CMI des bactriocine.
55
Rsultats et discussions
Rsultats et discussion
1-Test dinhibition par la mthode de diffusion par puits et sensibilit aux protases
La culture bactrienne des souches productrices de bactriocines est ralise en
anarobiose, ce qui vite la formation du peroxyde dhydrogne (H2O2). La neutralisation des
pH des surnageant brutes actifs liminent, quant elle, leffet de lacidit due lacide
lactique. Par consquent, lapparition de zones dinhibitions autour des puits contenant les
surnageant actifs, et la disparition dune telle activit par addition des enzymes protolytiques
(Trypsine et pepsine) confirme dune part la nature protique des bactriocines produites et
dautre part laction anti-listeria.
Le tableau qui suit rsume les diamtres des zones dinhibition obtenues :
Tableau II : Valeurs des diamtres des zones dinhibition dues lactivit bactriocinogne
Souches lactiques
Surnageant actifs
Surnageant actifs
+ trypsine
+ pepsine
(diamtre des zones

en mm)
(diamtre des zones

en mm)
Surnageant actifs
(diamtre des zones
en mm)
Lactococcus lactis ssp
lactis CH05
14

raffinolactis CH07
13

lactis CH 08
08
Lactobacillus
brevis/buchneri CH15
16
13
16
Les quatre souches de bactries lactiques ont exprim des activits inhibitrices vis
vis de Listeria innocua, par la production de bactriocines et ont donn des zones dinhibition
dont les diamtres respectifs sont : 14 mm, 13 mm, 08 mm et 16 mm pour les souches :
Lactococcus lactis ssp lactis CH05, Lactococcus lactis ssp raffinolactis CH07, Lactococcus
lactis ssp lactis CH08 et Lactobacillus brevis/buchneri CH15, respectivement.
Par la mme technique, des bactriocines inhibant Listeria innocua et produites par le
genre lactococcus ont t caractrises dans un atelier de salaison de produits laitiers, par
YAKOUBI et al en 2006.
OGUNBANWO et al (2003) et SIMOVA et al (2008) ont identifi de bactriocines
produites par les deux genres lactococcus et lactobacillus, et capables dinhiber des souches
Gram positif dont Listeria innocua F.
Lactivit anti-listeria dune bactriocine de classe IIa, la mesentericine 52A a t
tudie par le test de diffusion des puits par JASNIEWSKI et al en 2008.
56
Cependant, plusieurs auteurs, ont pu caractriser, dans la mme niche, et en utilisant la

mme mthode dactivit antibactrienne, des bactriocines produites par les deux genres,
Lactococcus et Lactobacillus, et actives contre les bactries du genre Listria. La
Lactococcine BZ produite par Lactococcus lactis ssp lactis BA (SAHINGIL et al., 2009), la
Bozacine 14 produite par Lactococcus lactis ssp lactis B14 (KABADJOVA et al., 2000), la
ST69BZ produite par Lactobacillus plantarum ST69BZ (TODOROV, 2010).
De leurs cts, MAKHLOUFI et al., en 2011, ont identifi une bactriocine produite
par une souche de Leuconostoc pseudomesenteroides, isole partir du Boza (une boisson
bulgare) et active contre Listeria monocytogenes, par lutilisation du test dactivit par la
mthode de diffusion des puits.
La mme anne, une bactriocine produite par lactobacillus plantarum LMG P-26358
isole dun fromage traditionnel franais, a t identifie par la mthode de diffusion sur agar.
Il sagit dune molcule stable une temprature de 100C et des pH compris entre 1 et 10,
prsentant un degrs dhomologie de 100% avec la plantaricine 423 et ayant une activit
inhibitrice lgard de plusieurs bactries parmi lesquelles, listeria innocua et listeria
monocytogenes (MILLS et al., 2011). Les figures suivantes montrent les rsultats obtenus par
la mthode de diffusion sur puits :
Figure 18 : Activit des bactriocines produites par la souche CH05.

E : 70 l deau distille strile, 5 : 70 l de surnageant brut actif neutralis de la souche CH05.
57
S7
E
E : 70 l deau distille strile, S7 : 70 l de surnageant brut actif neutralis de la souche CH05.
S
Dilution
10-1 de la
souche
cible

E : 70 l deau distille strile, S : 70 l de surnageant brut actif neutralis de la souche CH08.
Nous avons essay de raliser une tape de dsorption base sur le principe de YANG
(1992), afin davoir un maximum de bactriocines dans le surnageant. Pour cela, aprs la
premire centrifugation, nous avons rcupr le premier surnageant actif S, puis partir de l,
le culot est solubilis de nouveau dans 1ml de solution de dsorption et centrifug 8000g
pendant 30 min. Cela permet de dcrocher dventuelles molcules fixes sur les parois
bactriennes. Aprs la centrifugation, le surnageant (S) est rcupr.
58
Nous avons suivi ce test pour les deux souches CH05 et CH07, o les surnageant S5,
S5 et S7, S7 sont obtenus respectivement, leur pH sont neutraliss, puis ils sont soumis au
test dactivit par la mthode de diffusion par puits en contact avec une culture over-night de
la souche cible.
Dans chaque boite, trois puits sont raliss, le premier contient 70l deau distille
strile (tmoin ngatif), le deuxime contient 70l du surnageant S (tmoin positif) et le
troisime contient 70l du surnageant S. Les images ci-aprs illustrent les rsultats obtenus
lors de cette tape :
S5
E
S5
Figure 21 : Activit des bactriocines produites par la souche CH5.(avec essai de dsorption).
E : 70 l deau distille strile, S5 :70 l de surnageant brut actif neutralis de la souche CH05, S5 :70 l de
surnageant brut actif neutralis de la souche CH05, et aprs dsorption acide.
59
S7
S7
E
Figure 22 : Activit des bactriocines produites par la souche CH07 (avec essai de
dsorption). E : 70 l deau distille strile, S7 :70 l de surnageant brut actif neutralis de la souche CH07,
S7 :70 l de surnageant brut actif neutralis de la souche CH07, et aprs dsorption acide.
Comme on le voit sur les images, pour les deux souches, des zones dinhibition
apparaissent autours des puits o on a dpos les surnageant S exprimant lactivit antilisteria
des bactriocines excrtes et rcupres dans le premier surnageant de culture, tandis
quaucune activit nest observe au niveau des surnageant S. Ce qui laisse supposer que nos
souches produisent des bactriocines libres dans le milieu de culture. Et que la totalit de ces
molcules sont rcupres dans le premier surnageant, tant donn qu pH acide de la
culture, ces bactriocines ne sont pas lies sur les cellules bactriennes.
Cette hypothse est appuye par un dosage des protines au niveau des deux types de
surnageant S et S pour la souche CH07, potentiellement bactriocinogne, en utilisant la
mthode dabsorption aux UV, et une gamme talon avec lalbumine bovine (BSA). Le
rsultat montre une diffrence de concentration en protines avec 3,52mg/ml pour S CH07 et
1,32mg/ml pour SCH07.
Pour linactivation aux protases, les zones dinhibition sont affectes par les enzymes
protolytiques pour les trois souches : CH05, CH07 et CH08. (Voir les valeurs des zones
dinhibition sur le tableau II ci-dessus). Ces rsultats confirment la nature protique de la
partie biologiquement active des bactriocines produites par ces souches, dune part, et
indiquent la sensibilit de ces molcules la trypsine et la pepsine. Pour le mme intrt,
des enzymes telles que : la trypsine, l-chymotrypsine et la pepsine sont couramment
employes (CHEN et HOOVER, 2003).
60
La confirmation de la nature peptidique dune bactriocine produite par une souche de

Leuconostoc pseudomesenteroides, isole du Boza, une boisson traditionnelle fermente
base de crales consomme en Turquie, est ralise en utilisant la trypsine, la pepsine et la
protinase K (MAKHLOUFI et al, 2011).
La trypsine a lgrement affect lactivit de la souche lactobacillus brevis/buchneri
en diminuant le diamtre de la zone dinhibition de 16 mm 13 mm, ce qui est d,
probablement, la diminution de la concentration en bactriocines dans le puits par leffet de
dilution au demi, aprs ajout du mme volume, de solution enzymatique.
Lactivit de la mme souche nest, cependant pas affecte, par laction de la pepsine,
en gardant le diamtre de la zone dinhibition 16 mm, en prsence et en absence de
lenzyme. Ces rsultats suggrent la rsistance des bactriocines produites par la souche
CH15, la trypsine et la pepsine respectivement. Les figures suivantes illustrent les rsultats
des inactivations aux protases :
5
5T
E
Sensibilit des
bactriocines
produites par
CH05, aux
protases
5P
Figure 23: Inactivation aux protases, des bactriocines produites par la souche CH05.
E : 70 l deau distille strile, 5 : 70 l de surnageant brut actif neutralis de la souche CH05, 5T :70 l du
mlange surnageant brut actif neutralis de la souche CH05 et de la solution enzymatique de trypsine (1/1 : v/v),
5P : 70 l du mlange surnageant brut actif neutralis de la souche CH05 et de la solution enzymatique de
pepsine (1/1 : v/v).
61
E
7
7P
7T
Figure 24 : Inactivation aux protases des bactriocines produites par la souche CH07.
E : 70 l deau distille strile, 7 :70 l de surnageant brut actif neutralis de la souche CH07, 7 T : 70 l du
mlange surnageant brut actif neutralis de la souche CH07 et de la solution enzymatique de trypsine (1/1 : v/v),
7P : 70 l du mlange surnageant brut actif neutralis de la souche CH07 et de la solution enzymatique de
Pepsine (1/1 : v/v).
2-Purification des bactriocines et test dactivit par la technique du zymogramme

A cette tape, nous tenons signaler loriginalit du travail quant la mthode
dactivit par le zymogramme et la source disolement des bactries. Le lait de chamelle est
peu exploit cette effet, do la difficult interprter nos rsultats, cependant, la mme
technique du zymogramme a t applique pour la recherche dactivit bactriocinogne par
dautres auteurs et sur dautres niches.
Nous avons, donc, adopt la mthode dextraction acide ayant pour principe
ladsorption et la dsorption des molcules sur les cellules productrices de bactriocines,
prconise par YANG et al., en 1992. La mme technique a t suivie par ALLOUCHE et al
en 2010, lINA dEl Harrach, pour la purification de bactriocines produites par des souches
de lactobacilles thermophiles, utilises dans lindustrie laitire.
En 2001, MAO et al, ont purifi une bactriocine produite par lactococcus lactis FS92
isole partir de porc et ont dtermin son PM laide dune migration par PAGE SDS
suivie dune rvlation biologique par la technique du zymogramme.
Toujours par la mme mthode, lactivit antibactrienne dune autre bactriocine
produite par une souche de lactococcus sp GM 005 isole partir dune pte japonaise base
dharicot, de soja et de riz, a t tudie par ONDA et al en 2002.
62
Dans notre tude, laspect des zones dinhibition sur le gel dagarose a t discut. Ces
dernires apparaissent opaques, sur fond noir, par rapport au reste du gel o il ya un parfait
dveloppement du tapis bactrien de la souche cible Listeria innocua F. Afin de justifier cela,
un test tmoin a t ralis : dans une boite de Ptri compartimente en trois, nous avons
coul de lagarose strile dans deux compartiments, tandis que nous avons remplit lautre, par
de lagarose pralablement inocul par le mme inoculum dune culture Over-Night de la
souche cible, quon utilise pour le test du zymogramme. Aprs incubation, dans les mme
conditions de temps et de temprature que le test du zymogramme, Les compartiments striles
sont rest opaques, quant celui ensemenc par la souche cible, il est devenu transparent. La
photo de la figure 22 montre le rsultat de ce test.
Figure 25 : Diffrence daspect entre un gel dagarose ensemenc A par la souche cible et un
gel dagarose strile B, et qui justifie lapparition des zones dinhibition sur le zymogramme.
Le virage de couleur du milieu de culture serait d une interaction molculaire entre
les constituants de l'agarose et les mtabolites microbiens des bactries Listeria innocua F qui
sont dveloppes.
Les bactriocines spares par lectrophorse ont exprim des activits inhibitrices
lgard de la souche cible. En superposant les deux moitis (colore et non colore) de chaque
gel, les zones dinhibition pour toutes les molcules actives, sont situes des PM au-dessous
de 10 Kda.
Les photos des figures suivantes illustrent les rsultats des zymogrammes des
diffrentes souches tudies :
63

respectivement, ainsi que leurs zones dinhibition par la technique du zymogramme (
droite).

respectivement, ainsi que leurs zones dinhibition par la technique du zymogramme (
droite).
Lestimation des PM a donn des valeurs de 8,4 KDa ; 9,2 KDa ; 8,4 KDa et 9,6 KDa.
Par la mme mthode, PHUONG et al en 2009, ont dtect la prsence, dans un extrait
hydrosoluble dAsiago dallevo (un fromage italien), de composs de poids molculaire
compris entre 3KDa et 10 kDa et inhibant la croissance de Listeria innocua LRGIA 01.
64
Au dbut, ces composs sont assimils soit des bactriocines ou des petits
fragments de casines activit antimicrobienne, alors que HAYES et al (2006) ont dmontr
que les PM de ces derniers nexcdent pas 1000Da, ce qui oriente lidentification des
bactriocines.
3-Caractrisation gntique des bactriocines
La comprhension des mcanismes dinhibition des flores protectrices vis--vis de
flores cibles a fait lobjet de nombreux travaux pour les bactries lactiques productrices de
bactriocines. Dans certains cas, elle est tudie en utilisant des mutants ou des variant non
producteurs de bactriocines qui montrent une activit moindre ou absente (RICHARD et al.,
2003 ; NILSSON et al., 2004). Dans dautres tudes, lactivit est compare lutilisation de
souches proches ne montrant pas dinhibition (YAMAZAKI et al., 2003 ; YAMAZAKI et al.,
2005 ; TAHIRI et al., 2009).
Dans notre travail, nous avons compar lactivit bactriocinogne des souches leurs
variants dont les plasmides sont curs par lutilisation de la rifampicine et de la novobiocine
comme agents curant.
Le tableau ci-aprs montre les rsultats en CMI de la cure plasmidique pour les deux
souches CH05 et CH07, par lutilisation des deux antibiotiques :
Tableau III : rsultats de la cure plasmidique en Concentrations minimales inhibitrices :
Souches cures
Agents
Lactococcus lactis ssp lactis Lactococcus

lactis
CH05
raffinolactis CH07.
ssp
Curant
Rifampicine
3,75 g/ml
3,75 g/ml
Novobiocine
1,25 g/ml
1,25 g/ml
La CMI est la plus faible concentration dantibiotique qui inhibe toute croissance
visible dun micro-organisme aprs 24h dincubation dans un milieu de croissance spcifique.
La concentration sub-inhibitrice est la concentration de lantibiotique la plus proche de la
CMI (JARLIER, 2004).
Selon les dilutions utilises, et partir des rsultats des CMI, les valeurs des
concentrations sub-inhibitrices ayant permis la cure des plasmides sont pour les deux souches
: 2,5 g/ml et 0,625 g/ml pour la rifampicine et la novobiocine, respectivement.
65
3-1-Vrification de la cure plasmidique

La migration sur gel dagarose 0,6%, de lextrait dADN bactrien total, et sa
visualisation sous UV aprs raction avec du BET ont rvl la formation de mutants curs, le
rsultat est montr dans la figure suivante :
ADN chromosomique
ADN plasmidique
A
Figure 28 : Rsultat de llectrophorse de lADN bactrien total et illustrant les profils

plasmidiques pour les variants CH05 (A), CH05 cure (A), CH07 (B) et CH07 cure (B).
Voire schma de lannexe 7 pour la rpartition des chantillons sur le gel de migration.
La photo montre la disparition, chez le mutant cur, dune bande correspondant

lADN plasmidique.
Il est noter que la puret de lextrait dADN est confirm par le dosage en UV, aux
deux longueurs donde 260nm et 280nm suivi du calcul du rapport entre les deux
absorbances:
A260nm/A280nm. Selon MIKKELSEN et al (2004) : un chantillon dADN pur donne une valeur
gale 1,8 du rapport entre ces deux longueurs donde, et que selon les cas suivants :
A260nm/A280nm< 1,8 : prsence de protines (chantillon contamin par des protines).
A260nm/A280nm> 1,8 : prsence dARN.
66
Dans notre cas, le rapport a donn une valeur de 1,97, ce qui indique la prsence
dARN justifie par la suppression obligatoire de ltape de traitement de lchantillon par
lARNase lors de lextraction, par manque de ce ractif. Cependant, la prsence dARN nest
pas prononce puisquelle na pas interfr avec le rsultat recherch.
3-2-Caractrisation gntique des bactriocines par le test dactivit par la
diffusion des puits
La ralisation du test dactivit par la mthode de diffusion des puits, des surnageant
brutes actifs neutraliss pour les deux souches CH05 et CHO7 ainsi que de leurs variants
curs a montr la disparition des zones dinhibition aprs la cure plasmidique. Les figures
suivantes illustrent ces rsultats :
Zymo
E
7
Rif
7cur
Figure 29: Disparition de lactivit bactriocinique de la souche CH07 aprs la

cure plasmidique.
Sur la mme photo, la grande zone dinhibition correspond la sensibilit de la souche
cible Listeria innocua F la rifampicine avec une concentration de 3,75 g/ml, qui est la
valeur de la CMI du mme antibiotique, obtenue lors de la cure plasmidique.
67
CH05
CH05
cur
E
Figure 30 : Disparition de lactivit bactriocinique de la souche CH05 aprs la cure

plasmidique. E : Eau distille strile (tmoin ngatif).
Les rsultats obtenus confirment donc que les gnes codants pour les bactriocines
produites par les deux souches CH05 et CH07 sont ports par des plasmides.
BENOIT et al (1996) ont mis en vidence la localisation des gnes codant pour la
brevicine SB27, ainsi que ceux codant limmunit cette bactriocine, sur un plasmide, aprs
cure plasmidique la novobiocine aboutissant lobtention dun variant non producteur de
bactriocine et sensible la bactriocine parentale. Lanalyse des profils plasmidiques
montrent la disparition dune bande de 3Mda pour ce variant.
Par la mme mthode, lquipe de KALCHAYANAND (2000) ont tudi
lemplacement gntique dune bactriocine anti-listeria, la brvicine 9296 produite par une
souche de Lactobacillus brevis 9296 isole partir du fromage de munster. Des variants Bacont t obtenus par la cure plasmidique la novobiocine des concentrations allant de 0,25
g/ml 5 g/ml. La disparition de lactivit anti-listeria aprs la cure des plasmides confirme
la localisation plasmidique du locus codant cette bactriocine.
Dautres part, MERZOUG et al (2010) ont caractris les gnes codant la lactococcine
GHB15 produite par Lactococcus lactis ssp diactylactis GHB15, par des expriences de
transformation bactrienne suivie dun curage de lADN plasmidique par le SDS diffrentes
concentrations et une incubation une temprature de 39C. Lapparition du caractre Bac+
chez la bactrie receveuse du plasmide pGHB15 de 5,3Kpb, et la disparition du mme
caractre chez le variant cur de la souche donatrice, confirme la localisation plasmidique de
la bactriocine.
68
3-3-Caractrisation gntique des bactriocines par la technique du zymogramme

Afin de complter les rsultats obtenus, les extraits de bactriocines rcuprs partir
des cultures des deux souches CH05 et CH07 ainsi que de leurs variants curs respectifs, sont
soumis la migration sur PAGE-SDS et au test dactivit par la technique du zymogramme,
afin de pouvoir comparer les profils protiques ainsi que les zones dinhibitions. La
rpartition des chantillons sur le gel dlectrophorse est illustre dans le schma de lannexe
6.
Les photos suivantes montrent les rsultats obtenus :

par la mthode du zymogramme.
69
B
par la mthode du zymogramme.
A : migration incomplte des bandes au temps t1, B : migration complte des bandes un temps t2.
Les photos montrent des activits anti-listeria situes un PM de 10Kda pour les deux
souches CH05 et CH07, et la disparition dune telle activit chez les variants curs des mmes
souches respectivement. Autrement dit, lexclusion du plasmide de la souche Bac +, rend
cette dernire, une souche Bac -.
La disparition du phnotype bactriocinogne, aprs la cure des plasmides prouve que
les gnes codant ces bactriocines sont ports par des plasmides.
70
Par la mme dmarche, les gnes de structure ainsi que ceux dimmunit de la
plantaricine 423, une bactriocine de classe IIa produite par lactobacillus plantarum isole
partir de la viande de boeuf sont caractriss. Les squences gntiques sont localises sur le
plasmide PLA4 (VAN REENEN et al., 2006).
Une anne plutard, par le mme protocole, il a t montr que la salivaricine B (SalB),
une bactriocine produite par Streptococcus salivairus et ayant un PM de 2,74 Kda, est code
par un locus gntique port sur un mgaplasmide (HYINK et al., 2007).
Au niveau des profils lectrophortiques obtenus, nous avons remarqu la disparition
de la zone dinhibition de la souche cible PM infrieur 10 Kda, mais au niveau de la moiti
du gel, colore au bleu de coomassie, la bande protique apparait toujours. Lide de
lexistence dune autre protine bactrienne de PM proche de celui de la bactriocine tudie,
nous a pouss raliser une sparation lectrophortique sur un gel plus rticul de 20%. Le
rsultat est montr dans la figure ci-dessous :
CH07
CH07 cure
Autres
protines
bactriennes
10 KDa
Bactriocine
Figure 33 : Disparition, par effet de la cure plasmidique, de la bande protique correspondant

la bactriocine produite par la souche CH07.
4-Caractrisation gntique de limmunit aux bactriocines
Les rsultats ont montr une apparition dimportantes zones dinhibition des variant
curs par les bactriocines parentales, pour les deux souches : Lactococcus lactis ssp lactis
CH05 et Lactococcus lactis ssp raffinolactis CH07.
Ces rsultats indiquent que, chez ces souches, la perte des plasmides portant les gnes
de production des bactriocines, saccompagne de la perte de leur immunit face leur
propres bactriocines. Nous pouvons, donc, conclure que les gnes de production et ceux
dimmunit des bactriocines produites par les deux souches CH05 et CH07 sont
plasmidiques et co-transcrits.
71
Car, selon ENNAHAR et al (2000), le schma commun dorganisation des systmes

gntiques impliqus dans la biosynthse, le transport et la rgulation de la biosynthse des
bactriocines de classe IIa est constitu de trois groupes de gnes. Un groupe impliqu dans la
biosynthse et limmunit la bactriocine, renferme les gnes codant le prcurseur de la
bactriocine (B) et la protine dimmunit (I). Un groupe impliqu dans lexport de la
bactriocine renferme les gnes codant un transporteur ABC (D), une protine accessoire (E)
et parfois une protine de fonction inconnue (C).
Les figures qui suivent illustrent les rsultats obtenus :
E
E
5
5
Souche cible :
CH05
Souche cible :
CH05 cure
Figure 34 : Immunit de la souche CH05 sa propre bactriocine (A) et la sensibilit de son

variant cur la bactriocine parentale (B), par la mthode de diffusion sur puits.
E : 70 l deau distille strile. 5 : 70 l de lextrait bactriocinique de la souche CH05.
7
E
Souche cible :
CH07 cure
E
Souche cible :
CH07
Figure 35 : Immunit de la souche CH07 sa propres bactriocine (A) et la sensibilit de son

variant cur la bactriocine parentale (B), par la mthode de diffusion sur puits.
E : 70 l deau distille strile. 7 : 70 l de lextrait bactriocinique de la souche CH07.
72
Par la mme mthode, lquipe de KALCHAYANAND (2000), ont montr que les
gnes de production de la brvicine 9296 et d'immunit de Lactobacillus brevis DSM 9296
sont ports par un plasmide, de 11 kpb.
5-Dtermination des concentrations minimales inhibitrices des bactriocines
Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont variables selon les espces
bactriennes et les souches (ENNAHAR et al., 2000). Les spectres dinhibition des
bactriocines stablissent partir des surnageant de culture ou de prparations semi-purifies
(extraits bactriociniques). Le rsultat sera, donc, reprsentatif de lactivit antibactrienne
globale dune souche et non de lactivit dune seule bactriocine. Pour cette raison,
lorsquune souche produit plusieurs bactriocines, linterprtation du spectre dinhibition est
seulement possible si celui-ci est ralis partir de bactriocines purifies (SEBTI et al.,
2002).
Dans notre cas, lactivit anti-listeria a disparu en diluant lextrait au demi, pour la
souche CH05, et en le diluant pour la souche CH07. Selon le principe des dilutions
critiques, les valeurs des CMI des bactriocines produites par ces souches sont de 14,28
U.A/ml et de 7,14 U.A/ml pour les deux souches, CH05 et CH07 respectivement.
Les figures suivantes illustrent les rsultats obtenus :
0,016
0,5
1
0,0312
0,25
0,0625
0,125

par la mthode du titrage sur milieu glos. Valeurs des dilutions critiques : 1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,125 ;
0,0625 ; 0,0312 ; 0,016.
73
0,06
25
0,12
5
0,03
12
1
0,2
5
0,01
6
0,5

par la mthode du titrage sur milieu glos. Valeurs des dilutions critiques : 1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,125 ;
0,0625 ; 0,0312 ; 0,016.
On remarque que lactivit antibactrienne de la souche CH07 est plus prononce que
celle de la souche CH05, puisqu la mme dilution (1/2), alors que lactivit de la souche
CH05 a disparu, celle de la CH07 persiste. De plus, le pouvoir inhibiteur dune molcule
antimicrobienne est inversement proportionnel sa CMI (SEBTI et al., 2002 ; IZQUIERDO,
2009).
74
Conclusion
Conclusion
Notre travail a port sur la caractrisation de bactriocines anti-listeria produites par
des souches lactiques des genres Lactococcus et Lactobacillus isoles partir du lait de
chamelle de la rgion de BISKRA.
Nous avons commenc par lidentification du pouvoir bactriocinogne par la
mthode de diffusion des puits, o les quatre souches utilises, savoir : Lactococcus lactis
ssp lactis CH05, Lactococcus lactis ssp raffinolactis CH07, Lactococcus lactis ssp lactis
CH08 et Lactobacillus brevis/buchnerii CH15 ont inhib la croissance de Listeria innocua F,
une souche cible de rfrence collecte luniversit de Nantes, avec des zones dinhibition
de 14mm, 13mm, 08mm et 16mm pour les quatre souches respectivement. Les bactriocines
produites par les trois souches de Lactococcus sont sensibles leffet de la trypsine et de la
pepsine, deux enzymes protolytiques les plus utilises pour la confirmation de la nature
protique des bactriocines.
Par la suite, nous avons ralis une extraction de ces molcules selon le protocole
dadsorption/dsorption de YANG (1992), suivie de leur migration par une SDS-PAGE et
dune rvlation biologique par la mthode du zymogramme. Les quatre souches ont donn
des profils protiques et des zones dinhibition de PM : 8,40KDa, 9,26KDa, 8,47KDa et
9,62KDa pour les quatre souches respectivement. Ces valeurs de PM situes entre 5KDa et
10KDa classent les bactriocines tudies dans la sous-classe IIa.
Nos rsultats sont complts par une tude gntique ayant pour but de localiser
lemplacement des clusters de production et dimmunit aux bactriocines. A cet effet, nous
avons produit des mutants Bac- (non producteurs de bactriocines) et Bac S (sensibles
laction de la bactriocine parentale) dont les plasmides sont curs, partir des deux souches
CH05 et CH07 et en utilisant deux antibiotiques inhibant la synthse des acides nucliques,
comme agents curant, des concentrations sub-inhibitrices. Il sagit de la rifampicine et de la
novobiocine. La cure plasmidique est vrifie par llectrophorse de lADN bactrien, qui a
rvl la disparition dune bande correspondant au plasmide.
La disparition de lactivit anti-listeria et lapparition de la sensibilit de la souche
lactique sa propre bactriocine, aprs la cure plasmidique, pour les souches de Lactococcus
prouve que les gnes codant leurs bactriocines et ceux de limmunit ces dernires, sont
ports par les mmes plasmides.
Enfin, nous avons utilis la mthode des dilutions critiques et le test dactivit par la
diffusion sur puits afin de dterminer les CMI des extraits bactriociniques pour les deux
souches CH05 et CH07. Les valeurs taient respectivement de 14,28 U.A/ml et de 7,14
U.A/ml.
En guise de perspectives, il serait intressent de complter ce travail par :
-la ralisation dexprience de conjugaison bactrienne pour estimer le caractre conjugatif
des plasmides codant aux bactriocines ainsi que de leur immunit, do lintrt
dapplication en gnie gntique pour produire des molcules antibactrienne lchelle
industrielle ;
-la purification des bactriocines par les techniques danalyses fines : chromatographie
dexclusion molculaire, chromatographie dchange dions, chromatographie dinteractions
hydrophobes, HPLC et dtude structurale par la spectroscopie de masse et la RMN ;
75
Conclusion
-squenage des peptides et dtermination des fractions bioactives ;
-largir le spectre dactivit antibactrienne, voir mme antifongique, vis vis dautres
pathognes, notamment alimentaires ;
-tude de la stabilit des molcules dans les conditions industrielles : pH, temprature.....etc.
Ainsi que loptimisation du rendement de productivit des souches ;
-squenage des clusters gntiques codant la production et limmunit de ces biomolcules.
76
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ANNEXES
Annexe 1 : listes du Matriel et ractifs utiliss.

1-Verrerie
-Fiole gradue 1 litre.
-Fioles striles gradues 250ml.
-Flacons de 250ml.
-Bchers, Erlen-meyer.
-Pipettes gradues 1ml, 2ml, 5ml et 10ml.
-Eprouvettes de 10ml et de 30ml.
-Entonnoir strile.
-Tubes essais striles.
-Boites en verre
2-Ractifs et colorants
-Eau distille strile.
-Huile de vaseline strile.
-Enzymes protolytiques sous forme lyophilise: Trypsine et Pepsine.
-Polyacrylamide 30%.
-Bleu de Coomassie G250.
-Glycrol 80%.
-Solution de srum albumine bovine (BSA) 0,1mg/ml.
-SDS.
-Gel Buffer pH 8,45.
-Tween 20.
-Tween 80.
-Solution de fixation.
-Solution de coloration et solution de dcoloration.
-Tampon d'lectrophorse 1X.
-Solution de dnaturation (Tampon de charge non rducteur).
-Tampon PBS 0,1M pH 6.
-Solution mre de Rifampicine 1g/l.
-Solution mre de Novobiocine SIGMA 400 g/ml.
-Solution de dsorption pH 1,4.
-Solution de bromure dthidium SIGMA 0,2 g/ml.
-Gel dagarose 0,6 %.
-Saccharose 6,7% - Tris 50mM EDTA 1mM, pH8,0.
-Lysozyme 25mg/ml dans Tris 25mM, pH8,0.
-EDTA 0,25M Tris 50mM, pH8,0.
-SDS 20% dans Tris 50mM EDTA 20mM, pH8,0.
-NaOH 3M.
-Tris 2,0M HCl, pH7,0.
-NaCl 5,0M.
-Phnol satur (90%) avec une solution de NaCl 3%.
-Chloroforme Alcool iso amylique (24/1 v/v).
-Tris 10 mM EDTA 1mM, pH7,5.
-Solution de dpt : Bleu de Beomophnol 0,5% ; EDTA 10mM ; SDS 3% ; Glycrol 50%, dans
leau.
-Solution de visualisation : Bromure dthidium 2g/ml.
-Tampon dlectrophorse de lADN : Tris-actate 40 mM de Tris ; 20mM dactate de Na et
2mM dEDTA, pH8,1.
-Isopropanol.
3-Milieux de culture
-Bouillon MRS (HI-MEDI Laboratoires, Mumbai, India).
-Bouillon Elliker.
-Bouillon BHIB.
-Bouillon Nutritif enrichi.
-Glose Elliker 0,9% dagar.
-Glose Nutritive enrichie 0,9% dagar.
-Glose Nutritive enrichie 1,5% dagar.
4-Autres matriels
-Bec bunsen, boite ptri.
-Pipettes Pasteur.
-Anse Pasteur boucle et file droit.
-Pince, spatule, scalpel.
-Tube ppendorf.
-Filtres de membrane CA-MEMBRANE 0,20 m.
Annexe 2: Composition des ractifs et des colorants
Solution de bleu de bromophnol
- Bleu de Bromophnol......................................2 mg.
- Glycrol 50%............................................................................................10 g.
- Tris HCl 0.5M pH 6.8...................................1.25 ml.
- H2O...............................qsp 10 ml.
Tampon dlectrophorse des protines 5X + SDS
- Tris .................................15 g.
- Glycine....................................72 g.
- H2O..............................qsp 1L.
PBS 10X
- NaCl.......................................76.5 g.
- Na2HPO4....7.25 g.
- KH2PO4................................2.1 g.
- H2O...............................qsp 1 L.
Solution d'HCl (0,02M, pH 2)

-pipeter 110l d'HCl 32% ;
-ajuster 50ml par de l'eau distille
Le pH est de 2.
Solution de PBS (0,1M ; pH6)
-KCl....................................0,7g.
-KH2PO4 .......................................0,9g.
-NaCl....................................26,7 g.
-Na2HPO4....................................14,2 g.
Solution de fixation :
-TCA......................................................................................................................12g.
-Eau distille......................................................................................................100ml.
Solution de coloration :
-Bleu de Coomassie R250......................................................................................0,5g.
-TCA.........................................................................................................................4g.
-Mthanol............................................................................................................100ml.
-Eau distille........................................................................................................100ml.
Solution de dcoloration :
-Acide actique...................................................................................................37,5ml.
-Eau distille.....................................................................................................312,5ml.
-Mthanol.............................................................................................................150ml.
Annexe 3 : Composition des ractifs utiliss pour lextraction de lADN bactrien :
-Saccharose 6,7% - Tris 50mM EDTA 1mM, pH8,0 :
-Saccharose ........................................................................................................1,34g.
-Tris-base ...........................................................................................................0,12g.
-EDTA .............................................................................................................0,006g.
-Eau distille ................................................................................................qsp 20ml.
-pH8,0.
-Lysozyme 25mg/ml dans Tris 25mM, pH8,0 :
-Tris-base ..........................................................................................................0,06g.
-Eau distille qsp ................................................................................................20ml.
-Lysozyme ...........................................................................................................0,5g.
pH8,0.
-EDTA 0,25M Tris 50mM, pH8,0 :

-EDTA ..............................................................................................................1,46g.
-Tris ..................................................................................................................0,12g.
-Eau distille ...............................................................................................qsp 20ml.
pH8,0.
-SDS 20% dans Tris 50mM EDTA 20mM, pH8,0 :
-Tris ...................................................................................................................0,12g.
-EDTA .............................................................................................................0,006g.
-Eau distille qsp ................................................................................................20ml.
-SDS .......................................................................................................................4g.
pH8,0.
-NaOH 3,0 M :
-NaOH ................................................................................................................2,4g.
-Eau distille qsp ...............................................................................................20ml.
-Tris 2,0 M HCl, pH7,0 :
-Tris .................................................................................................................4,84g.
-Eau distille ..............................................................................................qsp 20ml.
pH7,0.
-NaCl 5,0M :
-NaCl ................................................................................................................5,84g.
-Eau distille ...............................................................................................qsp 20ml.
-Phnol satur avec une solution de NaCl 3% :
-Prparation dune solution NaCl 30% :
-NaCl ........................................................................................................6g.
-Eau distill ....................................................................................qsp 20ml.
-Dilution 1/10 me par du phnol satur (90%) :
-NaCl 30% ..............................................................................................2ml.
-Phnol satur .......................................................................................18ml.
-Chloroforme Alcool iso amylique (24/1 v/v) :
-Chloroforme ...................................................................................................12ml.
-Alcool iso amylique .......................................................................................500l.
-Tris 10mM EDTA 1mM, pH 7,5 :

-Tris ..............................................................................................................0,024g.
-EDTA ..........................................................................................................0,006g.
-Eau distille .............................................................................................qsp 20ml.
-Solution de dpt : Bleu de Bromophnol 0,5% ; EDTA 10mM ; SDS 3% ; Glycrol 50%,
dans leau :
-Bleu de Bromophnol .....................................................................................0,1g.
-EDTA ............................................................................................................0,06g.
-SDS .................................................................................................................0,6g.
-Glycrol 100% ................................................................................................10ml.
-Eau distille ..............................................................................................qsp 20ml.
-Gel dagarose 0,6% :
-Agarose .........................................................................................................0,12g.
-Eau distille .............................................................................................qsp 20ml.
-Solution de visualisation :
-Bromure dthidium (BET) .........................................................................0,2mg.
-Eau distille ...........................................................................................qsp 100ml.
-Tampon dlectrode : Tris actate 40 mM de Tris ; 20mM dactate de Na et 2,0mM
dEDTA, pH8,1 :
-Actate de sodium.......................................................................................1,36g.
-Tris-base.........................................................................................................2,4g.
-EDTA...........................................................................................................0,29g.
-Eau distill qsp............................................................................................500ml.
Annexe 4: Composition des milieux de culture utiliss:
Bouillon cur-cervelle (BHIB) : (GUIRAUD, 2003)
Composition en g/l
Protose-peptone ........................................................................................................ 10
Infusion de cervelle de veau .................................................................................... 12.5
Infusion de cur de buf..............................................................................................5
Chlorure de sodium....................................................................................................... 5
Phosphate disodique................................................................................................... 2.5
Glucose ......................................................................................................................... 2
Eau distille qsp ................................................................................................ 1000 mlpH : 7.4
Strilisation : 15 minutes 120 C
Bouillon Elliker : (LEVEAU et al, 1991)

Composition en g /l
Tryptone ..................................................................................................................... 20
Extrait de levure............................................................................................................ 5
Glatine...................................................................................................................... 2.5
Lactose.......................................................................................................................... 5
Saccharose......................................................................................................................5
Glucose...........................................................................................................................5
Actate de sodium ..................................................................................................... 1.5
Acide ascorbique ....................................................................................................... 0.5
Eau distille qsp................................................................................................. 1000 ml
pH final : 6.8
Strilisation: 15 minutes 120 C
Bouillon MRS (DE MAN, ROGOZA, SHARPE, 1960) : (LEVEAU et al, 1991)
(HIMEDI Laboratoires, Mumbai, INDIA).
Composition en g /l
Peptone........................................................................................................................ 10
Extrait de viande............................................................................................................8
Actate de sodium......................................................................................................... 5
Phosphate bi potassique..................................................................................................2
Citrate dammonium .................................................................................................... .2
Sulfate de magnsium, 7 H2O ................................................................................... 0.2
Sulfate de manganse, 4 H2O .................................................................................. 0.05
Glucose ....................................................................................................................... 20
Tween 80.................................................................................................................. 1 ml
Agar ............................................................................................................................ 15
Eau distille qsp...................................................................................................1000 ml
pH : 4,3 0,2.
Strilisation : 15 minutes 120 C
Bouillon Nutritif enrichi : (GUIRAUD, 2003)

Composition en g/l
Peptone........................................................................................................................10
Extrait de viande..........................................................................................................05
Glucose........................................................................................................................10
Chlorure de Sodium.....................................................................................................05
Eau distille...........................................................................................................qsp 1L
pH 7,2.
Strilisation : 15 minutes 120C.
Glose Elliker: (LEVEAU et al, 1991)

Composition en g /l
Tryptone ..................................................................................................................... 20
Glatine...................................................................................................................... 2.5
Lactose.......................................................................................................................... 5
Saccharose..................................................................................................................... 5
Glucose...........................................................................................................................5
Actate de sodium ..................................................................................................... 1.5
Acide ascorbique ....................................................................................................... 0.5
Agarose...9
Eau distille qsp...................................................................................................1000 ml
pH final : 6.8
Strilisation: 15 minutes 120 C.
Glose Nutritive enrichie 0,9 % dagar : (GUIRAUD, 2003)
Composition en g/l
Peptone........................................................................................................................10
Extrait de viande..........................................................................................................05
Glucose........................................................................................................................10
Chlorure de Sodium.....................................................................................................05
Agar.............................................................................................................................09
Eau distille...........................................................................................................qsp 1L
pH 7,2.
Glose Nutritive enrichie 1,5 % dagar : (GUIRAUD, 2003).

Composition en g/l
Peptone.........................................................................................................................10
Extrait de viande...........................................................................................................05
Glucose..........................................................................................................................10
Chlorure de Sodium......................................................................................................05
Agar...............................................................................................................................15
Eau distille............................................................................................................qsp 1L
pH 7,2.
Annexe 5: Prparation du gel tricine SDS-PAGE :

Separating
Spacer
Staking
Protogel Acryl (30%) 2,75 ml
0,67 ml
0,80 ml
Eau Q
0,66 ml
2,17 ml
0,67 ml
0,99 ml
Gel buffer 3X
1,67 ml
Glycrol 80%
0,83 ml
TEMED
2,5 l
1,0 l
3,0 l
APS
25 l
10 l
32 l
Remarque : Gel buffer (3X) : Tris-base 3M, Ph 8.45, SDS 0.3%

- Aprs vrification de la propret de la plaque de verre et du joint, montage de lappareil et
fixation de lensemble grce aux pinces.
- Tracer deux lignes partir du haut de la petite plaque (environ 1.5 cm et 2.5 cm).
- Couler le gel Separating et Spacer conscutivement jusquau trait le plus bas puis le plus haut
puis addition dEtOH 50%.
- Aprs polymrisation (>30 min) lavage et schage de la limite suprieure du gel Separating.
- Couler le gel stacking et placer et placer dlicatement le peigne (attention aux bulles).
- Laisser >15 min pour une polymrisation totale.
Prparation des chantillons :

20 l dchantillon + 20 l de tampon de charge non rducteur (Loading buffer non rducteur)
- Migration pendant 15 min 10 mA par gel
- Migration pendant 80 min 20 mA par gel
Tampon de charge non rducteur (2X):
- 5 ml Tris-HCl 0.5M, pH 6.8
- 4 ml SDS 20%
- 4 ml Glycrol
- 5 ml Bleu de bromophnol (0.04%)
-2 ml dH2O.
Annexe 6 : Rpartition des chantillons sur le gel dlectrophorse des bactriocines :
CH7
MT
Sens de la
migration
CH7
Cure
CH5
CH5
Cure
CH7
CH7
Cure
CH5
CH5
Cure
Annexe 7 : Rpartition des chantillons sur le gel dagarose pour llectrophorse de lADN
bactrien :
20l solution de dpt (T)
20l ADN CH05 + 2l solution de dpt
20l ADN CH05 cure + 2l solution de dpt
20l ADN CH07 + 2l solution de dpt
20l ADN CH07 cure + 2l solution de dpt
Sens de la migration
Annexe 8 : Composition du gel 20% utilis en PAGE-SDS pour la sparation des bactriocines,
des autres protines bactriennes :
Separating
Spacer
Staking
Protogel Acryl (30%) 3,66 ml
0,67 ml
0,80 ml
Eau Q
0,66 ml
2,17 ml
0,67 ml
0,99 ml
Gel buffer 3X
2,23 ml
Glycrol 80%
1,11 ml
TEMED
3,4 l
1,0 l
3,0 l
APS
34 l
10 l
32 l
Annexe 9: Tableau didentification des acides amins et leur reprsentation abrge.

Valine
Leucine
Isoleucine
Phnylalanine
Val
Leu
Ile
Phe
Mthionine
Tyrosine
Tryptophane
Acide Aspartique
Met
Tyr
Trp
Asp
Acide Glutamique
Asparagine
Glutamine
Lysine
Glu
Asn
Gln
Lys
Arginine
Histidine
Glycine
Alanine
Arg
His
Gly
Ala
Cystine
Srine
Thronine
Proline
Cys
Ser
Thr
Pro

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

Caractrisation de bactriocines anti-listeria produites par

Anne universitaire : 2013 / 2014

Liste des abrviations

Liste des tableaux

Liste des figures

Liste des annexes

Table des matires

Chapitre II : Partie exprimentale

Les lments gntiques

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

Figure 1 : Organisation gntique des clusters de gnes impliqus dans la biosynthse et la

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

Figure 2 : Schma de biosynthse, de sa rgulation et dimmunit de la souche productrice

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

Figure 3 : Schma de la biosynthse, la rgulation de la biosynthse et limmunit des

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

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2-1-3-Proprits des plasmides des bactriocines

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PHILIP et al (2010) ont obtenu des rsultats intressants quant la localisation

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La transposition est un mcanisme dvolution rapide consistant dans laddition pure

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Figure 4 : Schma montrant linsertion du transposon accompagne de la duplication dune

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

Figure 5 : Principe du mcanisme de transposition pour les transposons ADN.

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

Figure 6 : Principe du mcanisme de transposition pour les rtrotransposons (RAISONNIER,

Les squences dinsertion

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

Les transposons composites

Chapitre I : Synthse bibliographique

Les lments gntiques codant les bactriocines

2-2-5-Les principaux modes de transposition

Mode daction des

Mode daction des bactriocines

Chapitre I : Synthse bibliographique

Mode daction des bactriocines

Chapitre I : Synthse bibliographique

Deux fonctions ont t proposes pour le feuillet :

Mode daction des bactriocines

Chapitre I : Synthse bibliographique

Lhlice serait capable, du fait de son orientation, de sinsrer dans linterface