RESUMO: Podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com

outras tcnicas instrumentais de anlise, a cromatografia ocupa um

lugar de destaque entre os mtodos analticos modernos, devido a
facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao de
espcies

qumicas.

Trata-se

de

um

mtodo

fsico-qumico

fundamenta-se no deslocamento diferencial dos componentes de uma

mistura, devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis
(fase mvel e estacionria). Sendo um dos mais novos e mais
importantes membros das tcnicas de separao, a cromatografia
lquida de alta eficincia utiliza pequenas colunas, nas quais uma fase
mvel lquida que bombeada a alta presso e elui sobre a fase
estacionria que est em seu interior, esta formada de partculas
com dimetro de 3 a 10m, assim, os solutos com maior afinidade
com a fase mvel sero eludos primeiro e posteriormente os que tm
maior afinidade com a fase estacionria. Quanto menor o tamanho da
partcula, maior ser a eficincia da coluna e maior a resistncia
vazo. O mtodo dispe de diferentes mecanismos de separao
podendo ser de: partio, adsoro, troca inica ou excluso de
tamanho. Pode ser efetuada em fase normal, fase estacionria polar e
fase mvel apolar, ou em fase reversa, fase estacionria apolar e fase
mvel polar.

1. Introduo:
Desde o incio de sculo passado a cromatografia vem sendo
utilizada como tcnica analtica, para a separao, identificao e
quantificao de substncias qumicas. Essa tcnica pode ser
cromatografia

em

coluna,

ocorrendo

dentro

de

um

tubo,

ou

tipo

de

cromatografia planar ocorrendo em uma superfcie plana.

A

cromatografia

de

alta

eficincia

(CLAE)

um

cromatografia lquida que emprega pequenas colunas recheadas de

materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluida
sobre altas presses. Ela tem capacidade de realizar separaes e
1

analises quantitativas de uma grande quantidade de compostos

presentes em vrios tipos de amostras, em escala de tempo de
poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilidade.
O consumo de tabaco representa a segunda maior causa de
mortes no mundo. Nos casos de tabagismo, podem ser dosados os
componentes da fumaa proveniente do cigarro, entre eles a nicotina,
que o principal composto presente. Grande porcentagem de
nicotina absorvida biotranformada em cotinina, seu principal
metabolito.
A cotinina pode ser determinada por diversos mtodos, entre eles
espectrofotometria,

imunoensaios,

cromatografia

gasosa

(CG),

cromatogrfica liquida de alta eficincia (CLAE) e CG ou CLAE

acoplada

espectrometria

de

massas.

especificidade

sensibilidade da CLAE so adequadas para avaliar exposio ao

tabaco tornando este mtodo o mais empregado.

2. Objetivo:
Validar um mtodo por CLAE precendida por extrao lquidolquido para mensurar os nveis de cotinina na urina, com a
finalidade de monitorar a exposio ao tabaco, incluindo a
exposio ambiental.

3. Materiais e Mtodos:
Todos os reagentes utilizados neste estudo foram de grau analtico.
Foram utilizados os padres de cotinina, nicotina e 2-fenilimidazol.
Hidrxido de sdio, diclorometano, metanol, acetonitrila, acido ctrico,
trietilamina e acetato de sdio.
Para certificar a ausncia de cotinina nestas amostras, foram
realizadas analises cromatogrfica deste analito e foram empregadas
apenas as amostras nas quais no foi detectada cotinina.
3.1. Parmetros cromatogrficos
2

A separao cromatogrfica foi realizada em cromatgrafo de

alta eficincia, equipado com um detector ultravioleta. Como fase
mvel foi utilizada gua Milli-Q: metanol:acetato de sdio 0,1M:
acetonitrila contendo 1 mL de acido ctrico 0,034M e 5,0 mL de
trietilamina para cada litro de soluo. O pH foi ajustado a 4,4 com
acido actico. A fase mvel, o comprimento de onda do detector, o
tipo de coluna e o volume de extrato injetado foram selecionados
atravs da realizao de testes com parmetros citados por vrios
autores.
3.2. Procedimento de Extrao
Foram pipetados 2,0 mL de urina centrifugada. Posteriormente
adicionado 25L de hidrxido de sdio 10M, 100L de padro interno
e 4,0 mL de diclorometano. Posteriormente esta soluo sofreu
agitao por 40 minutos em um homogeneizador e centrifugada por
10 minutos a 3000rpm (revolues por minuto). Dois mililitros de fase
orgnica foram transferidos para um frasco evaporador e colocados
em termobloco, sob corrente de nitrognio e temperatura ambiente,
at secura. A seguir o resduo foi reconstitudo com 00L de fase
mvel e injetado na CLAE.
3.3. Validao analtica
A linearidade foi determinada pela analise dos calibradores (em
triplicata), utilizando urina de indivduos no expostos ao tabaco, com
os quais se criou uma curva de calibrao com as concentraes de
10,0; 25,0; 50,0;100,0; 250,0; 500,0 e 1000,0 ng/mL. A linearidade foi
determinada atravs do calculo de regresso linear pelo mtodo dos
mnimos quadrados, e expressa pelo coeficiente de correlao ( r2).
Para determinar

a preciso inter-ensaio, foram utilizadas

amostras adicionadas com trs nveis de concentrao de cotinina, as

quais foram analisadas seis vezes cada. A preciso foi expressa com
desvio padro relativo.
3

A exatido foi calculada a partir da diferena entre o valor real

presente em amostras de urina branco adicionadas com trs nveis de
concentrao de cotinina e o valor obtido na anlise.
Para a verificao da estabilidade, dez alquotas de trs
amostras com concentraes baixas, medias e altas de cotinina
urinria foram mantidas a 4C, em frascos de polietileno, durante trs
dias.Aps este perodo as amostras foram submetidas nova
determinao de cotinina e os resultados foram comparados queles
obtidos com as amostras frescas.
A aplicabilidade do mtodo foi avaliada por meio da anlise de
cerca de 20 amostras reais de fumantes e de indivduos no expostos
ou com exposio ambiental.

4. Resultados e discusses:
No cromatograma de uma amostra branco adicionada de
padro de cotinina, o tempo de reteno foi em torno de 6 minutos e
o do padro interno de 5 minutos.
Foram apresentados os resultados para os pontos 50, 500 e
1000ng/mL

respectivamente,

de

preciso(11,2%;12,3%;

8,1%),

exatido(107%; 101,7%; 97%), e estabilidade(-8,1%; -6,0%;-2,7%). O

limite de deteco do mtodo foi 5 ng/mL e o quantificao foi 10
ng/mL.
O coeficiente de correlao linear encontrado foi r2=0,9979 no
intervalo de 10 a 1000ng/mL, confirmando a linearidade.
A partir da anlise da amostra de urina de individuo sem
exposio ao tabaco, o cromatograma resultante no apresentou pico
de cotinina, j na amostra de individuo fumante o cromatograma
detectou o pico da cotinina.
Existem diversos marcadores sugeridos para avaliar a exposio
ao

tabaco

entre

eles

tiocianato,

monxido

de
4

carbono,carboxiemoglobina, hidroxiprolina e animas aromticas. No

entanto nenhum desses biomarcadores um bom indicador da
exposio ao tabaco, devido a sua falta de especificidade ou
sensibilidade (MAN ET AL.2006). Como a nicotina biotransformada a
diversos metabolitos, por isso no indicada como indicador de
exposio ao tabaco. analisando a meia vida, a estabilidade e o fato
de ser o metabolito mais importante,

a cotinina foi o biomarcador

mais adequado para determinar a exposio ao tabaco.

Antigamente, a determinao de nicotina e seus metabolitos
eram realizadas por analises espectrofotomtricas. Este um mtodo
rpido e de baixo custo. Os mtodos espectrofotomtricos foram
empregados no monitoramento do consumo de tabaco por serem
simples e fornecerem uma estimativa da quantidade total de
metabolitos da nicotina inalada durante a exposio ao tabaco.
Entretanto, substancias contendo ncleo piridnico podem interferir
nos

resultados,

que

tornam

mtodo

menos

especifico.

Consequentemente, a concentrao urinaria resultante maior do

que aquela obtida por cromatografia gasosa ou liquida e, por este
motivo, os mtodos colorimtricos deixaram de ser considerados
seguros

para

monitoramento

da

exposio

ao

tabaco.

Radioimunoensaio e imunoensaio de absoro ligado enzima,

tambm podem ser usados para a estimativa dos nveis de cotinina,
mas esses mtodos tm custo elevado e esto relacionados a
ocorrncia de reaes cruzadas durante o processo.
Devido principalmente interferncia de muitos componentes
presentes

na

colorimtricas,

urina,
e

os

quais

podem

possibilidade

dos

influenciar
mtodos

nas

reaes

imunolgicos

apresentarem reaes cruzadas, a cromatografia liquida de alta

eficincia o mtodo mais apropriado para a quantificao de
cotinina nos fluidos biolgicos. O mtodo validado no presente
trabalho apresenta maior especificidade e sensibilidade do que os
mtodos espectrofotomtricos e imunoensaios, e melhor relao
5

custo e beneficio quando comparado a mtodos cromatogrficos

acoplados a espectrmetros de massa.
A CLAE exige um pr-tratamento das amostras por extrao
liquido-liquido ou extrao em fase solida. Devido ao menor e a boa
qualidade dos resultados obtidos com extrao liquido-liquido, foi
empregado diclorometano como solvente de extrao.
Quando aplicado a amostras a amostras reais foi possvel
diferenciar as amostras de indivduos no expostos de indivduos
expostos ao tabaco, seja por exposio ambiental ou habito tabgico.

5. Concluso:
A cromatografia lquida de alta eficincia um dos mais modernos
mtodos cromatogrficos, que se destaca entre os demais devido ao
fato de ser capaz de quantificar uma ampla variedade de compostos
que, por exemplo,

no poderiam

ser analisados

utilizando

cromatografia gasosa, devido ao fato de que estes necessitam

apenas ser solveis na fase mvel, o que o torna de fato
extremamente vantajoso na anlise de alimentos. Ela vem sendo
aprimorada com o passar dos anos a fim de se tornar um mtodo
cada vez mais eficaz na separao e quantificao de compostos.
Seus equipamentos so de alto custo, mas se for levado em
considerao quantidade de anlises que se pode efetuar, um
investimento que trs retorno, sendo assim seu emprego em vrios
laboratrios vem se tornando indispensvel.

6. REFERECIAS BIBLIOGRAFICAS: ( so a do artigo)

ARAJO, Julio M. A. Qumica de Alimentos: teoria e prtica. 3 ed.
Viosa: Editora UFV, 2004, 416p.
BONATO, Pierina Sueli. Cromatografia gasosa. In: Introduo a
mtodos cromatogrficos. 7 ed. Campinas: Editora da UNICAMP,
1997. p.141-181.
6

COLLINS, C. H. & GUIMARES, L. F. L., Cromatografia lquida de alta

eficincia. In: Collins, C. H. & Braga, G. L.; Introduo a Mtodos
Cromatogrficos, 3. ed., Ed. UNICAMP, So Paulo, 1988, p 179 - 243
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve
ensaio. Atualidades em Qumica, n.7, p.21-25, mai.1998.
GONALVEZ,

Maria

de

Lurdes

Sadler

Simes.

Mtodos

instrumentais para anlise de solues: Anlise Quantitativa.

Lisboa: Fundao Calouste Gulbenkian, 2001.1050p.
LANAS, Fermando M. Cromatografia em fase gasosa. So Carlos:
Acta, 1993. 254p.
NETO, Francisco R. de A.; NUNES, Denise, da S. S. Cromatografia:
Princpios bsicos e tcnicas afins. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003.
187p.
PRESOTO, A. E. F.; ALMEIDA-MURADIAN, L. B. de. Validao de
mtodos cromatogrficos por clae para anlise das vitaminas B 1, B2,
B6 e niacina naturalmente presentes em farinha de cereais. Qumica
Nova. v.31, n.3, p. 498-502. 2008.
SKOOG, Douglas A.; HOLLER, James; NIEMAN, Timothy. Princpios de
Anlise Instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. 836p.
VOGEL, Arthur. Anlise Qumica Quantitativa. 6 ed. Rio de
Janeiro: LTC-Livros Tcnicos e Cientficos Editora S.A, 2002. 462p.