Universidad Autnoma de San Luis

Potos

Facultad de ingeniera

Microbiologa
Dra. Yolanda Jasso Pineda
Tincin de clulas bacterianas
Gonzlez Prez Esa

Mircoles 12 de febrero del 2014

INTRODUCCIN
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles
de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el
contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir
entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados
constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por calor es lo ms
comn, aunque tambin pueden fijarse con sustancias qumicas como
formaldehidos, cidos y alcoholes. La fijacin produce habitualmente un
encogimiento de las clulas; la tincin por el contrario hace que parezcan
mayores. Despus de la fijacin viene la tincin. Los colorantes son
generalmente compuestos orgnicos que tienen afinidad especfica por los
materiales celulares, muchos estn cargados positivamente (catinicos; azul de
metileno, cristal violeta y safranina) y se combinan con intensidad a los
constituyentes
polisacridos).

celulares
Otros

cargados

colorantes

son

negativamente
molculas

(c.

cargadas

nucleicos

negativamente

(aniones; eosina, rojo Congo, etc.) que se combinan con los constituyentes
celulares cargados positivamente (protenas). La cantidad, funcionalidad y
especificidad de los colorantes es muy amplia. Si se desea aumentar el
contraste, son suficientes mtodos simples de tincin. El azul de metileno es un
buen ejemplo de tincin simple pues no oscurece los detalles celulares.
Las tinciones son de gran utilidad pero pueden conducir a errores por la
formacin de artefactos que asemejan estructuras celulares autnticas, pero
que son formaciones artificiales inducidas por el colorante.

OBJETIVOS

Aprender la tcnica de preparacin de un frotis, fijacin y coloracin

ms utilizada en microbiologa

Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas y Gram

negativas

MATERIALES Y MTODOS

Muestras de bacterias
Mechero Bunsen
Cerillos
Marcador indeleble
Portaobjeto

Juego

tincin de Gram
Puente para teir las laminillas
Aceite de inmersin
Papel especial para limpiar

de

colorantes

lentes de microscopio

para

1. Colocar en el centro de un portaobjetos limpio y sin grasa una gota

de agua destilada si la muestra es slida. Tomar una pequea
cantidad de cultivo con el asa o con un hisopo y ponerla sobre la
gota de agua. Dispersar el slido con movimientos circulares hasta
que se observe una suspensin homognea.
2. Extienda la muestra en el portaobjetos para facilitar el secado.
3. Para facilitar la fijacin de la muestra al vidrio, pase varias veces
ste por la llama azul del mechero.
4. Colocar las laminillas en un

puente,

cubrir

la

muestra

completamente con cristal violeta y dejar reposar por 1 min.

Enjuagar con agua.
5. Aadir solucin de lugol (yodo) y dejar reposar 1 minutos. Enjuagar.
6. Agregar alcohol-acetona por 2 segundos. Enjuagar.
7. Aadir solucin de safranina hasta cubrir la muestra y dejar reposar
por 30 segundos. Enjuagar.
8. Despus de secar observar al microscopio

Bacterias empleadas en la prctica:

Pseudomona sp
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Salmonella typhi
Citrobacter sp

RESULTADOS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Bacteria

Pseudomona sp

S. aureus

ra

E. coli
S. typhi
Citrobacter sp

La tcnica de tincin de Gram utilizada para clasificar las bacterias en

Gram positivas y Gram negativas en funcin del grosor y la composicin

de la pared celular bacteriana, tiene una utilidad indiscutible. La pared de
la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as
como para prevenir la lisis osmtica. La sustancia que forma la pared
celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la
clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas
de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%90% de la pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de
la clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms
delgada,

nicamente

membrana

exterior

de

peptidoglicano

compuesta

de

est

fosfolpidos,

rodeada

por

una

lipopolisacridos,

lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula Gram-negativa es

peptidoglicano.

Los resultados de la tabla anterior fueron extrados de la literatura puesto

que la preparacin de los frotis probablemente se llev a cabo de manera
incorrecta y no se observ microorganismos en los portaobjetos. En este
reporte utilizamos el mtodo descrito en el manual de prcticas sin
embargo en la literatura consultada se encontraron pequeas variaciones
en el procedimiento.

El Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua,
se cubre con solucin Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua,
decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con
Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. En el prrafo
anterior se indica un reposo de 20 segundos nicamente despus de
agregar la safranina, pudiendo esto afectar la tincin.

Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de cristal violeta y son lavadas despus para quitar el exceso de
colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las Gram-positivas
como las Gram-negativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre
entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo
es aqu el I; el KI simplemente hace soluble el I en agua. El I entra en las
clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De
nuevo tanto las clulas Gram-positivas como las Gram-negativas se
encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la
decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las
que es soluble el complejo I-cristal violeta. Algunos organismos (Grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (Gram-negativos) lo hacen.
La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su
resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al
hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla de
alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de
la pared de la clula . La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de
retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las
clulas Gram-positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido). Despus de la decoloracin
las clulas Gram-positivas son todava azules, pero las Gram-negativas
son incoloras. Habitualmente se usa un colorante de color rojo, como la
safranina para contraste; despus de la coloracin de contraste las clulas
Gram-negativas son rojas, mientras que las Gram-positivas permanecen
azules.

Muy probablemente la mala ejecucin de la tincin de Gram provoc que

no se observaran bacterias en el microscopio a 10X, 40X y 100X.Esta
mala ejecucin se refiere a inexactitud en los tiempos de reposo y
cantidad de agua para lavar el frotis. Una excesiva cantidad de agua
puede arrastras los reactivos. Aunado a esto, los objetivos del microscopio
se encontraban sin mantenimiento y sucios. Explicando as el porqu de
los resultados.

CONCLUSIN

La tincin de Gram es muy til en la microscopa siempre y cuando se

lleve a cabo respetando los tiempos de reposos, cantidad de agua con que
se enjuaga el frotis y el equipo de laboratorio se encuentre en buenas
condiciones.

BIBLIOGRAFA

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

http://en.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas

http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli

http://es.wikipedia.org/wiki/Fiebre_tifoidea

http://en.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus

http://en.wikipedia.org/wiki/Citrobacter