Practica 10

Inmunofluorescencia indirecta
1) Objetivo
Entender el concepto de inmunofluorescencia indirecta
Aplicar la tcnica de inmunofluorescencia indirecta para determinacin
de anticuerpos contra el agente infeccioso de la sfilis causado por la
treponema pallidum.
2) Fundamento
Las tcnicas que utilizan anticuerpos fluorescentes estn basadas en la
capacidad de los anticuerpos de unirse a ciertos colorantes fluorescentes
sin alterar sus propiedades inmunolgicas. Esto permiti desarrollar
mtodos de ensayo de amplia aplicacin en el diagnostico serolgico de
diversas enfermedades.
El procedimiento se basa en dos reacciones. En el primer paso el suero
del paciente se pone en contacto con el sustrato antignico. Si los
anticuerpos estn presentes en el suero, estos se unen al antgeno,
formando un complejo antgeno-anticuerpo. Si el suero testeado no
contiene anticuerpos dirigidos contra ese antgeno en particular, no se
formar complejo antgeno-anticuerpo y todos los componentes del
suero sern eliminados en la etapa de lavado. En el segundo paso s
agrega una anti gammaglobulina humana marcada con isotiocianato de
fluorescena. Si el complejo antgeno-anticuerpo se form en el primer
paso, la anti gamma marcada con fluorescena se adherir a ste. Una
reaccin positiva, fluorescencia verde manzana brillante, podr verse
con ayuda de un microscopio de fluorescencia.
3) Procedimientos
-

Llevar el equipo a temperatura ambiente 30 minutos antes de

realizar el ensayo
Reconstruir el bfer fosfato salino (BFS) y lleva a un litro con agua
destilada, conservar el buffer reconstituido entre 2-8C
Preparar una dilucin 1/5 de los sueros controles y de las muestras
con el absorbente, por ejemplo 10 microlitos de muestra + 40
microlitos del absorbente
Sacar las improntas necesarias de sus respectivos envases evitando
tocar las reas reactivas
Cubrir las reas reactivas con las disoluciones del control reactivo, no
reactivo y muestras.
Incubar en cmara hmeda 30 min. A temperatura ambiente
Realizar un rpido lavado con BFS usando peseta o similar

Primera la hilera de arriba y luego la de abajo inclinando levemente el

portaobjeto y en cada direccin (no dirigir el chorro directamente
sobre el rea reactiva)
De esta manera se evita cualquier contaminacin entre reas, luego
realizar dos lavados de 5 minutos cada uno colocando los
portaobjetos en la jarra de Coplin conteniendo BFS, agitando
suavemente
Diluir la anti gamma (G, A, M) humana FITC en BFS, segn el titulo
sugerido en el frasco (ej. Titulo sugerido:1/100 colocar 0.01 ml de
anti gamma en 1 mililitro de BFS)
Sacar las improntas del BFS, sacudir todo el exceso de papel
absorbente manteniendo hmedas las reas reactivas.
Cubrir rpidamente cada rea reactiva con la dilucin de anti gamma
e incubar en cada humera 30 minutos a temperatura ambiente
Repetir los pasos 1 y 9
Colocar rpidamente el medio de montaje sobre el cubreobjetos y
cubrir las reas reactivas sin presionar fuerte, evitando la formacin
de burbujas

4) Resultados
Los treponemas se observan teidos, en forma homognea con una
tpica fluorescencia verde manzana
5) Conclusin
Logramos entender el concepto de inmunofluorescencia indirecta
aplicando la tcnica para la determinacin de anticuerpos contra
agentes infecciosos

Treponema pallidum

Microscopio de fluorescencia

6) Cuestionario

1. Explique la diferencia entre tcnicas de inmuno fluorescencia

directa e indirecta
Primaria o IFD
La inmunofluorescencia primaria, o directa, tambin conocida por sus
siglas IFD (inmunofluorescencia directa), hace uso de un nico
anticuerpo que se encuentra qumicamente unido a un fluorforo. El
anticuerpo reconoce la molcula diana y se une a ella directamente.
En el caso de utilizarse como tcnica de tincin inmuno histoqumica
la regin donde se deposita la molcula diana puede ser identificada
al microscopio de fluorescencia como una zona brillante.
Esta tcnica presenta algunas ventajas con respecto a la IFI
(indirecta). Reduce el nmero de etapas necesarias, por lo tanto es
ms rpida y por otro lado es menos sensible a interferencias debidas
a reactividad cruzada de los anticuerpos o a reacciones no
especficas, las cuales tienden a aumentar el ruido de fondo de la
tcnica.
Secundaria o IFI
La inmunofluorescencia secundaria, o indirecta (tambin conocida
por sus siglas IFI) hace uso de dos anticuerpos; el anticuerpo primario
es el que reconoce y se une a la molcula diana, mientras que el
secundario que es el que se encuentra marcado con el fluorforo,
reconoce al primario y se une a l. Esta tcnica es un poco ms
compleja que la IFD, requiere ms pasos y es ms posible que sufra
interferencias, pero en contrapartida es mucho ms flexible que una
tcnica directa y debido a que es posible que un anticuerpo primario
una a ms de anticuerpo secundario, implica un efecto de
amplificacin que tambin aumenta la sensibilidad de la tcnica.
Esta tcnica es posible, debido a que los anticuerpos constan de dos
partes, una regin variable (que es la que reconoce al antgeno) y
una regin constante (que forma el esqueleto y estructura bsica de
la molcula de anticuerpo). Es importante notar sin embargo, que
esta divisin es artificial y que en realidad la molcula de anticuerpo
se encuentra formada por cuatro cadenas poli peptdicas: dos
cadenas pesadas y dos livianas, estas ltimas son las que contienen
la regin variable.
Es posible que existan varios anticuerpos que reconozcan diferentes
antgenos (es decir que tengan diferentes regiones variables) pero
que compartan la misma regin constante. Todos estos anticuerpos
con diferentes especificidades pueden ser reconocidos a su vez por
un nico anticuerpo secundario que reconozca la regin constante.
Esto ahorra el esfuerzo tcnico y el costo de modificar cada uno de
los anticuerpos primarios para acarrear el fluorforo.
Tpicamente se hace uso de diferentes anticuerpos primarios con
diferentes regiones constantes generados por la estimulacin en la
produccin de anticuerpos en diferentes especies. Por ejemplo, un
investigador puede estimular la produccin de un determinado
anticuerpo primario en una cabra, y luego emplear un anticuerpo de

conejo que reconozca la regin constante de los anticuerpos de cabra

(anticuerpos de "conejo anti-cabra"). Y luego puede crear un segundo
juego de anticuerpos en ratn que sean reconocidos por un tipo
diferente de anticuerpos "burro anti-ratn". Esto permite reutilizar los
anticuerpos marcados, que son muy difciles de obtener, en mltiples
experimentos.
Limitaciones
2. Qu caractersticas debe tener los conjugados utilizados
para inmunofluorescencia?
Se emplea conjugado con suero anti globulina fluorescente, a travs
de una tcnica en dos tiempos, contiene azida sdica 0.1% como
conservante
Se debe diluir segn el titulo sugerido
0.20 ml para 70 determinaciones
0.30 ml para 140 determinaciones
3. Qu cuidados bsicos se debe tener al manipular el
microscopio de inmunofluorescencia?
1. Para transportar el microscopio deben utilizarse siempre las dos
manos, sujetndolo por el brazo con una mano y por el pie con la
palma de la otra.
2. Una vez colocado el microscopio en su sitio, no debe moverse
hasta que finalice la prctica. Cuando se vaya a cambiar de
observador se debe mover l y no el microscopio.
3. Mover siempre suave y lentamente cualquier elemento del
microscopio.
4. Nunca poner los dedos en las lentes del ocular ni del objetivo. Si se
ensucian dichas lentes se limpiarn con un pao suave de algodn,
sin utilizar ningn disolvente.
5. No sacar de su sitio el ocular ni los objetivos, a no ser que vayan a
ser sustituidos, en cuyo caso la operacin debe realizarse lo ms
rpidamente posible, para evitar la entrada de polvo.
6. Asegurarse de que el portaobjetos est bien seco cuando va a ser
colocado sobre la platina.
7. Al enfocar, sobre todo con los objetivos de mayor aumento, hay
que evitar que el extremo del objetivo choque con la preparacin.
Para ello acercaremos el objetivo a la preparacin mirando
lateralmente y luego, mirando ya a travs del ocular, enfocamos
alejando el objetivo.
7) Bibliografa
http://html.rincondelvago.com/inmunofluorescencia.html
http://exa.unne.edu.ar/bioquimica/inmunoclinica/documentos/Laboratori
o_TPN8.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Inmunofluorescencia
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fluorescence_microscop.jpg