SELECCIN Y MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERS

INDUSTRIAL.
ESTERILIZACIN A MEDIOS DE CULTIVO
- POR DESTRUCCION TOTAL DE MICROORGANISMOS.
La esterilizacin es un mtodo de estabilizacin cuyo fundamento es provocar una
elevacin de la temperatura que provoca la destruccin de los agentes de
deterioro, enzimas y especialmente, microorganismos como bacterias, hongos y
levaduras. Tambin destruye virus que son agentes infecciosos, aunque no
deterioren el alimento.
QUMICOS: Mezcla de elementos que se funden a determinadas temperaturas o
tiras de papel que cambian de color (nos indican que la temperatura lleg a una
determinado valor pero no nos indican si se llego a la presin de vapor
sobresaturado y se cumpli el tiempo necesario para el ciclo ).
BIOLGICOS:
Suspensin
de
microorganismos
por
ej.
esporas
de
Bacillusstearothemopilus en tiras de papel impregnadas que se ponen sobre el
objeto a esterilizar o recipientes cerrados ( ampollas ) que tienen un indicador
como prpura de bromocresol que vira al amarillo si el microorganismos es capaz
de crecer. Se utilizan suspendiendo la ampolla en el centro del recipiente con el
lquido a esterilizar, se realiza el ciclo y luego se cultiva la ampolla a ver si crece.
- POR MUERTE O INACTIVACION.
La muerte o inactivacin significa la eliminacin de microorganismos sin que
exista necesariamente desintegracin de las clulas. Se puede efectuar por:
CALENTAMIENTO SECO O HMEDO:
Desnaturaliza las macromolculas. Es ms efectivo que el seco. Es ms rpido y
necesita menos intensidad.
El calor hmedo, generalmente en forma de vapor bajo presin, es muy til y de
gran valor en la esterilizacin en el laboratorio, que se efecta en autoclave, o en
la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de
fermentacin.
-POR RADIACIONES:
Se denominan tambin esterilizacin fra. Se usa con material sensible al calor, ya
que no produce calentamiento del material. Puede ser:
RADIACIONES IONIZANTES:
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos nucleicos.
gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolbiles
(termosensibles)
Rayos Gamma: Puede esterilizar antibiticos, vacunas, alimentos, etc.
Rayos X: Penetran bien, pero requieren mucha energa.
Rayos Ultravioletas: Afectan a las molculas de DNA de los
microorganismos
RADIACIONES ELECTROMAGNTICAS:
Luz UV, muta el DNA (dmeros de timina), la clula tiene un sistema de
reparacin en el cual con luz azul se activan las enzimas fotorreparadoras,
tambin existe una reactivacin en oscuridad. Tiene bajo poder de
penetracin, se usa en superficies o ambientes como quirfanos o plantas
de envasados.

- POR ELIMINACIN CON MTODOS FSICOS.

Mtodos fsicos: Calor hmedo o autoclave, calor seco u horno Pasteur,
irradiacin ionizante gamma.
CALOR HMEDO O AUTOCLAVE
El autoclave es el mtodo de eleccin en todo lo que pueda esterilizarse por ser
termo resistente.

CALOR SECO: PUPINEL

Elimina microorganismos por coagulacin de las protenas de stos.
Su efectividad depende de la difusin del calor, la cantidad de calor
disponible, y los niveles de prdida de calor.
La buena accin microbicida del calor seco depende de que los elementos a
esterilizar estn limpios, en presencia de materia orgnica, por ejemplo:
aceite o grasa, el microorganismo es protegido de la accin del calor.
Su uso se debe limitar a materiales no esterilizables en autoclave.
Penetra lentamente en los materiales por lo cual se requiere largos
perodos de exposicin.
Debido a las altas temperaturas para destruir microorganismos, es
inapropiado para algunos materiales como lquidos, gomas y gneros. Por
otra parte daa el material porque reduce el temple de acero.
Se utiliza para aceites, vaselina, petrleos y polvos.
DESARROLLO DE LA CINTICA DE CRECIMIENTOS DE LOS CULTIVOS
CONTINUOS
CRECIMIENTO MICROBIANO.
Es un incremento en el nmero de clulas o aumento de la masa microbiana. El
crecimiento es un componente esencial de la funcin microbiana, ya que una
clula individual tiene un periodo de vida determinado en la naturaleza y la
especie se mantiene solamente como resultado del crecimiento continuo de la
poblacin celular.
Una bacteria es capaz de duplicarse as misma.
El crecimiento microbiano ocurre por fisin binaria, es la divisin de
una bacteria en dos clulas hijas.
Previniendo que no se produzca ningn caso de mutacin las clulas hijas
resultantes sern genticamente idnticas a la clula original. De este modo
tiene lugar la "duplicacin local" de la poblacin bacteriana.

ADAPTACIN
FASES DEL
CRECIMIENTO
MICROBIANO

EXPONENCIAL
ESTACIONARIA
DECLIVE

FASE DE ADAPTACION.
Las bacterias se adaptan a las condiciones de
crecimiento. Es el perodo en el que las bacterias individuales estn madurando y
no tienen an la posibilidad de dividirse.
FASE EXPONENCIAL. Es un perodo caracterizado por la duplicacin celular. El
nmero de nuevas bacterias que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a
la poblacin actual. Si el crecimiento no se limita, la duplicacin continuar a un
ritmo constante, por lo tanto el nmero de clulas de la poblacin se duplica con
cada perodo de tiempo consecutivo.

N U T R IE N T E S

FASE ESTACIONARIA. La tasa de crecimiento disminuye como consecuencia del

agotamiento de nutrientes y la acumulacin de productos txicos. Esta fase se
alcanza cuando las bacterias empiezan a agotar los recursos que estn disponibles
para ellas.
FASE DE DECLIVE O MUERTE. Las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren.

CARBONO
NITROGENO

HIDRGENO
OXGENO
AZUFRE
FOSFR
O
OTROS MINERALES

Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores fsicos y

qumicos. Entre los factores fsicos tenemos la temperatura y el pH. Los factores
qumicos necesarios para el crecimiento bacterial son diversos elementos
constitutivos de las clulas.
REQUISITOS FISICOS.
TEMPERATURA
El patrn de crecimiento bacterial se ve profundamente influenciado por la
temperatura. La temperatura a crecimiento ptimo permite el crecimiento ms
rpido de las bacterias durante un perodo de tiempo, usualmente entre 12 y 14
horas. La temperatura mnima de crecimiento es aquella temperatura menor a la
cual la especie puede crecer. La Temperatura de crecimiento mximo es la
temperatura mayor en la cual el crecimiento es posible.
- pH
Sicrfilos
TEMPERATURA

Mesfilos
Termfilos

En la mayora de las bacterias el crecimiento ptimo es entre 6.5 y 7.5. Muy pocas
bacterias crecen a un pH menor de 4.0. Sin embargo, las bacterias clasificadas
como acidfilos son tolerantes a la acidez, un ejemplo es Thiobacillus thiodans que
crece a un pH ptimo de entre 2.0 a 3.5.
ESTEQUIOMETRIA DE CRECIMIENTO.
El crecimiento de cualquier sistema biolgico se define como el incremento
ordenado de ese sistema, lo cual implica un aumento de masa celular que
eventualmente conduce a la multiplicacin celular.
El crecimiento se da de acuerdo a la los tipos de organismos.
Existen dos tipos de mtodos para cuantificar el crecimiento microbiano
METODOS DIRECTOS:
-HEMACITOMETRO.
Tambin conocido como placa de Petroff-Hausser o cmara de Neubauer. Se utiliza
para el conteo celular directo, en medios preferentemente claros y libres de
partculas colorantes (soluciones de azul de metileno) son utilizados para distinguir
clulas vivas de muertas. No se recomiendan para cultivos que forman agregados
celulares. Este mtodo se recomienda para organismos de dimetros menores a 3
Um.
-CONTADOR DE PARTICULAS:
Basado en la relativa alta resistencia elctrica de las clulas.
Los contadores comerciales usan dos electrodos y una solucin electroltica, un
electrodo se coloca en un tubo contenido un orificio; a continuacin se aplica vacio
al tubo anterior, provocando que la solucin del electrolito conteniente las clulas

sea absorbida a travs del orificio. Un potencial elctrico se aplica a travs del
orificio, la resistencia elctrica aumenta y causa pulsos en el voltaje elctrico. El
numero de pulsaciones es una medida del numero de partculas se calcula
considerando el volumen predeterminado de la muestra.
METODOS INDIRECTOS:
-CUENTA VIABLE EN PLACA:
El conteo de clulas viables se realiza en cajas petri con medio de cultivo adecuado
y gelificado con agar, que son inoculadas con la muestra e incubadas. La palabra
viable describe a un microorganismo capaz de reproducirse. Los resultados se
expresan en unidades formadoras de colonas (UFC). Mtodo til para bacterias y
levaduras, pero no en hongos.
-RECUENTO SOBRE FILTROS.
Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de
suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles (con un
dimetro de poro que retiene las bacterias pero permite el trnsito de
sustancias).Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de
cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas.
Dichas colonias se cuentan, deducindosela concentracin original de viables en
funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro
DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE MASA CELULAR.
METODOS DIRECTOS:
-PESO CELULAR. Es un mtodo que solamente se aplica a clulas de creciendo
en un medio libre de slidos. Las muestras con la biomasa son centrifugadas o
filtradas, lavadas con solucin buffer o agua y secadas a 80C por 24 horas.
-VOLUMEN DE EMPAQUE CELULAR. Permite la estimacin de la concentracin
celular en medios de fermentacin rpidamente; el medio es centrifugado en un
tubo graduado bajo condiciones estndar y el volumen de clulas puede ser
medido aproximadamente.
METODOS INDIRECTOS:
-DENSIDAD OPTICA. Se basa en la absorcin de luz de clulas suspendidas en un
medio de cultivo. Por lo que es necesario considerar los antecedentes de absorcin
por componentes en el medio de cultivo; el medio de cultivo debe ser
esencialmente libre de partculas. Una curva de calibracin es necesaria para
relacionar la densidad ptica contra el peso celular seco.
-MEDIDA DE CONSUMO DE NUTRIENTES O DE PRODUCCION DE ALGUN
METABOLITO POR UNIDAD DE TIEMPO.
Consumo de oxigeno y consumo carbnico determinados por el respiro-metro de
warbug
-NEFELOMETRIA. El nmero de partculas en solucin puede determinarse a
partir de mediciones de la intensidad de la luz dispersada con la ayuda de un
fototubo. La luz pasa a travs de una muestra del cultivo y n fototubo mide la luz
dispersada por las clulas en la muestra. La intensidad de luz dispersada es
proporcional a la concentracin celular.
CINETICA DE CRECIMIENTO DE CULTIVO CONTINUO Y DISCONTINUO.
CONTINUO.
El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por
un sistema abierto de flujo que se compone de:

-una cmara de cultivo de volumen

constante, a la que llega un suministro de
nutrientes, y de la que se eliminan o separan
los productos txicos de desecho (por un
dispositivo de rebosadero).
Una vez que el sistema alcanza el equilibrio,
el nmero de clulas y la concentracin de
nutrientes en la cmara permanecen
constantes, y entonces se dice que el sistema est en estado estacionario, con las
clulas creciendo exponencialmente.
DISCONTINUO.
Los cultivos discontinuos pueden considerarse como
un sistema cerrado, excepto para la aireacin, que
contiene un cantidad limitada de medio, en el que el
inoculado pasa a travs de un nmero de fases; un
sistema cerrado es como una serie de procesos que
no interacta con un medioambiente especifico.
En el cultivo discontinuo, el inoculo se agrega al inicio
del proceso de la fermentacin as como
continuamente
en
un
periodo
de
tiempo
determinado.
El uso de este tipo de medios de cultivos elimina los efectos de represin por las
fuentes de carbono usados rpidamente, as como tambin reduce la viscosidad en
el medio y los efectos txicos de los constituyentes.
METABOLISMO PRIMARIO Y SECUNDARIO.
El metabolismo es el conjunto de procesos y reacciones qumicas anablicas
(requieren energa) y catablicas (liberan energa); por los cuales un
microorganismo obtiene la energa y los nutrientes que necesita para vivir y
reproducirse.
METABOLITOS PRIMARIOS. Se producen en el curso de las reacciones
metablicas anablicas o catablicas que tiene lugar durante las fases
decrecimiento y que contribuyen a la produccin de biomasa o energa por las
clulas. Se producen principalmente en la trofofase o fase de crecimiento.
METABOLITOS SECUNDARIOS. Se producen por rutas anablicas especializadas
cuando no hay crecimiento.

El cultivo

CULTIVO.
de

microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y

nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En
general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las

caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la

disponibilidad de nutrientes en el medio.
En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las
caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la
disponibilidad de nutrientes en el medio.
SUSTRATO PARA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL.
LOS SUSTRATOS:
En laboratorio estn perfectamente definidos en cuanto a composicin, pureza,
etc.; mientras que a escala industrial esto no es posible por no ser
econmicamente viable, por lo que se utilizan generalmente residuos de otras
industrias. Estos residuos han de cumplir los siguientes requisitos para poder
ser usados como sustrato:
Contener una fuente de carbono y nitrgeno suficientemente rica.
Han de presentarse en formas asequibles por las clulas (no son
vlidas todas las formas).
Cierto contenido en oligoelementos y sales minerales, bsicas para
que los microorganismos efecten sus funciones.
Tamponadores de pH. Debido a la actividad microbiana, el pH del
medio puede sufrir grandes variaciones, lo que puede llegar a inhibir
el crecimiento microbiano. Para minimizar estos efectos, se aaden
tampones.
Su composicin ha de ser lo suficientemente:

EQUILIBRADA

SIN EXCESO DE NINGUN NUTRIENTE NECESARIO

SUSTRATOS USADOS COMO FUENTES DE NITROGENO.
En ocasiones, lo que se hace es enriquecer los sustratos con especies qumicas
ricas en nitrgeno, como urea o nitrato amnico

DESARROLLO DE INOCULOS A ESCALA INDUSTRIAL.

SIEMBRA
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo)
en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su
desarrollo y multiplicacin. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
- Que se efecten aspticamente
- Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn esterilizados
- Que se realicen solo los manipuleos indispensables

- Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un

mechero o bien Flujo laminar.
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los
requerimientos del microorganismo a estudiar.
Siembra por inmersin: se coloca el inoculo en una placa o caja de Petri y sobre
el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este mtodo se utiliza
para microorganismos aerobios.
Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersin.
Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para
cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este mtodo se utiliza para
microorganismos anaerobios facultativos y microaeroflicos.
Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo
fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inoculo. Con ayuda de
una esptula de Drigalsky se extiende el inoculo hasta su absorcin total por el
medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos
aerobios estrictos.
Siembra en estra: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido
y se deja solidificar.
PROPAGACIN DEL CULTIVO.
Las fermentaciones industrialesSe llevan a cabo en fermentadores o biorreactores.
En estos fermentadores el sustrato es convertido a un compuesto o metabolito con
la ayuda de un microorganismo.
PROPAGACIN EL CULTIVO
El microorganismo a ser utilizado en la fermentacin debe ser cultivado y
transferido a envases con mayor cantidad de medios para as obtener un gran
nmero de microorganismos que ser inoculada en los tanques de fermentacin. El
gran nmero de microorganismos se obtiene mediante sucesivas inoculaciones.
CLULAS INMOVILIZADORAS.
Dentro de la industria alimentaria, la inmovilizacin de microorganismos en
soportes naturales o sintticos proporciona estabilidad a las funciones celulares.
Esta tcnica permite alcanzar:
Altas concentraciones celulares en volmenes reducidos
La reutilizacin como biocatalizador
Implantacin de sistemas de continuos de produccin

1.1 D) Operacin del proceso de fermentacin alcohlica en la industria.

Brandy
El brandy es un aguardiente que se obtiene de la destilacin del vino de uva sin
incluir pulpa, piel o semillas de la fruta. Es llamado tambin como vino de quema.
Historia
El origen del brandy se lo adjudican diversos pases, entre ellos Alemania, Italia y
Espaa, alrededor del siglo XVIII y XIX, marcando a Holanda como el principal
mercado del brandy. La palabra brandy significa vino quemado, elaborados a partir
de la destilacin del vino con elevada acidez y moderado grado alcohlico.
La intencin era agregar de nuevo el agua separada al brandy en la destilacin
poco antes de su consumo. Luego se descubri que si se almacenaba en barriles
de madera, el producto resultante se mejoraba considerablemente comparado con
el vino original.
Elaboracin del brandy
1. Las uvas se cosechan y se despalillan.
2. Posteriormente, las uvas se trituran y pasan por las prensas horizontales para

obtener el jugo de ellas.

3. Los mostos fermentan a una temperatura de 16 C - 17 C. Finalizada la

fermentacin, los vinos esperan los primeros fros invernales para ser destilados.
Tiempo que permanecen en contacto con levaduras y sedimentos, enriquecindose
en frutal intensidad aromtica y aterciopelando su materia corprea
4. En depsitos de acero el zumo se transforma en vino por medio de la
fermentacin.
5. El vino reposa un tiempo corto y pasa a la destilacin en alambiques de cobre.
6. PRIMERA DESTILACIN
Se introduce el vino en la caldera para su ebullicin. El alcohol se evapora y se
dirige hacia el serpentn que se halla sumergido en un depsito de agua fra, dando
origen al brouillis, cuya graduacin alcohlica varia entre 28 y 30 grados. Los
vapores se enfran y condensan, en un proceso que dura 8 o 9 horas, y en funcin
del grado alcohlico se separan en tres fracciones:
Las cabezas: Primeros vapores condensados, con impurezas, no utilizados en
nuestros brandies.
Las flemas: Recogidas aparte, de aspecto lechoso y con unos 30 grados.
Las colas: ltimos vapores condensados o ltima fraccin que slo alcanza 2
grados de alcohol.
7. SEGUNDA DESTILACION
El brouillis o las flemas se someten a una destilacin ms lenta, de unas 12 horas
para obtener un aguardiente de muy alta graduacin alcohlica. La separacin en
esta ocasin es la siguiente:
Las cabezas.
Holanda: lquido incoloro que se recoge hasta el momento que el alcoholmetro
alcanza 60 - 62 grados de alcohol
Segundas: Que alcanzan 28 - 30 grados
Las colas.
8. Despus de la destilacin el aguardiente de vino pasa al aejamiento en barriles
de roble, lo que da como resultado el brandy
9. Cuando el brandy esta bien aejado se procede al embotellado
Saccharomyces Bayanus
Colonia: Agar malta: Blanco cremoso a las colonias lisas de color hueso WL:
Blanco cremoso a las colonias lisas de color hueso
Reproduccin:
Spore: esferoidal y suave
Zygote: clula vegetativa diploide
Ascus: tpicamente cuatro esporas por asco, asco persistente.
De crecimiento lquido: dispersa o clumpy, dependiendo de la cepa,
fermentador inferior.
Caractersticas deseables
Sabor

BRANDY DE UVA: ste se produce por la destilacin del jugo de uva

fermentado. Luego de la cosecha, se exprimen las uvas y el mosto es puesto
a fermentar inmediatamente. Despus de tres semanas, se obtiene un vino
con poco alcohol, cido y turbio, que deber ser destilado y aejado para

convertirse en brandy. Entre este tipo de brandy se encuentran: ARMAGNAC,

BRANDY DE JEREZ, BRANDY ITALIANO y COGNAC

BRANDY DE FRUTA: Este brandy se destila de frutas diferentes de la mora.

Las frutas ms comunes en la elaboracin de estos brandis son la manzana,
la ciruela, el durazno, la frambuesa y el albaricoque. El mosto de Las
manzanas se convierte en sidra, la cual se deja en reposo unos meses antes
de ser destilada dos veces.

BRANDY DE PULPA: Este brandy proviene de la pulpa de la uva, las

semillas y los vstagos fermentados que quedan Luego de que se extrae el
jugo. Son los menos comunes. La grappa es un ejemplo de este tipo de
brandy.

Color
El Color de un brandy en su mayora es claro, o transparente al salir del destilado,
pero esto depende tambin de la uva, fruta utilizada ya que esto afecta mucho, al
igual que el. El color depende del aejamiento del destilado. Hay algunos que
tienen 10 o 20 aos en reposo.
Grado de alcohol
Como ya se ha mencionado el Brandy se recolecta al llegar a cierto grado de
alcohol, que es de 60 a 62, pero este puede ser recolectado mucho antes o mucho
despus, esto va dependiendo de los gustos, del proceso de la industria, y de la
calidad de la materia prima utilizada.
Fuentes de obtencin
Como ya se ha mencionado antes, el Brandy es un derivado del Vino, por lo cual el
microorganismo que se utiliza en el vino es al mismo que en el brandy, en este
caso es Saccharomyces bayanus.
Es una levadura del gnero Saccharomyces, y que se emplea fundamentalmente
en la elaboracin del vino as como de la sidra, en concreto de los procesos de
fermentacin alcohlica.
- Naturalmente: En el campo, la uva es pobre en levaduras (indgenas); de forma
natural contiene cantidades de entre 1,000 y 100,000 clulas por baya (uva),
siendo as, levaduras poco o nada fermentativas que no llevan a una fermentacin
alcohlica normal del vino. La levadura de especie Saccharomyces, a pesar de ser
escasa sobre la uva, es prcticamente la nica especie fermentativa.
- Coleccin: En la actualidad, muchas regiones en diferentes pases (Francia,
Australia, Suiza etc.), han logrado reproducir y conservar una gran cantidad de
cepas de levaduras Saccharomyces Cereviseae y Saccharomyces Bayanus
mediante un proceso de deshidratacin por congelacin llamado Liofilizacin. De
esta manera, la levadura puede ser transportada para su aprovechamiento en
distintas regiones del mundo y efectuar fermentaciones alcohlicas con cepas de
levaduras seleccionadas ms aromticas, permitiendo as, producir vino de mayor
calidad.

Preparacin de medios de cultivo

Disolver los componentes del medio en agua destilada. Si el medio contiene un

agente solidifcante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullicin
del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolucin del
agar (medios slidos y semislidos.
Esterilizar la disolucin
Medios slidos en placa

YPD: Composicin: 1% extracto de levadura, 2%peptona, 2% glucosa. Para medio

solido se aadi agar al 2%.
YPG: Composicin: 1% extracto de levadura, 2% peptona, 3% (v/v) glicerol, 2%
agar.
AMM (agar mosto Macabeo): Composicin: 800 ml (variedad Macabeo), 20 g de
agar, 180 ml de agua destilada.
Saccharomyces bayanus. Se caracteriza por tener al microscopio una forma ms
alargada que otras levaduras, De 3-6 414 micras de tamao.
Desarrolla una fermentacin ms lenta y requiere de
una mayor cantidad de nutrientes para realizar la
fermentacin.
Mtodos y Tcnicas de produccin de cepas.
A partir de varias diluciones de cada muestra, se sembraron alcuotas de 0.1 ml
sobre placas de Petri con medio YPD-agar y se incubaron de 3 a 7 das a 28C.
En todas las pruebas, salvo en las que se indica otra cosa, se compara el
crecimiento con medios testigos sin inocular. La lectura se llevo a cabo despus de
7 y 15 das de incubacin a 28C.
Pruebas
Morfologa celular: El tamao de la colonia.
Pruebas bioqumicas: La fermentacin se observo por la aparicin de gas en la
campana
Pruebas fisiolgicas: Crecimiento a diferentes temperaturas
Ron
El ron es un licor alcohlico destilado, obtenido de la melaza de la caa de azcar.
Usualmente es un sub-producto de la fabricacin del azcar.
Elaboracin del ron
- Molienda. En molinos, las caas son lavadas para quitar restos de tierra y luego
cortadas en pedazos pequeos para facilitar la extraccin del jugo. Los pedazos
pasan por una serie de molinos que extraen el jugo de los tallos.
Luego de la primera molienda, se agrega una pequea cantidad de agua para
facilitar las extracciones siguientes del jugo. El residuo slido, llamado bagazo, es
frecuentemente reciclado como combustible. Luego es filtrado y hervido.
- Tipos de Melaza.

Melaza Ligera, de primera ebullicin o Miel de Primera

Miel de Segunda, de segunda ebullicin, es ms oscura y ms espesa, tambin
conocida como Black Treacle en ingls.
Blackstrap Molasse en ingls, y que es la materia de donde se hace el ron
industrial, resulta de la tercera ebullicin.
- La fermentacin. Se efecta en tanques de cerca de 80,000 litros de capacidad,
ubicados en un ambiente lo mas fresco posible. El tiempo de duracin de todo este
proceso depende de los tipos de Ron que desee obtener. Hay veces que 24 horas
resultan suficientes, aunque suele pasar 36 horas antes de que el azcar de la
melaza se convierta en alcohol. Para algunos rones oscuros el proceso puede
demorar hasta 12 das.
- Destilacin. Proceso por el cual el mosto fermentado se calienta, el alcohol se
evapora a una temperatura inferior que la del agua (78 y 100 respectivamente),
estos vapores son recogidos y condensados dando origen al aguardiente. Se
pueden utilizar Alambiques y Columnas de destilacin.
- Envejecimiento. El aguardiente resultante se deja envejecer en barricas de
roble blanco, algunos usados anteriormente. Los aos de envejecimiento o
aejamiento dependern del tipo de Ron que se desea obtener. Las barricas, deben
reposar en lugares hmedos, con poca luz, el propsito del envejecimiento es el
refinamiento del aguardiente.
- Filtracin. Proceso que elimina las partculas indeseables resultantes del
proceso de envejecimiento al tiempo que mejora la pureza de su color. Para los
rones que se van a vender como blancos, el filtrado por carbn activado elimina los
tintes aportados por la madera de las barricas.
- Mezclado. La mayora de los rones comerciales consisten en una mezcla de
rones de diferentes tipos y edades, incluso de diferentes pases de origen, como es
el caso de las marcas internacionales de grandes volmenes. Si se desea, durante
la mezcla se puede aadir caramelo, especies y sabores. Una vez se han
seleccionado los diversos constituyentes y mezclados, se dejan fusionar por un
tiempo, antes de reducirlos con agua pura para luego ser embotellados.
Qu es la melaza? La melaza es la materia de donde se hace el ron industrial,
resulta de la tercera ebullicin y es muy espesa, pegajosa, oscura y algo amarga.
Se necesita aproximadamente 1.5 galones de melaza para hacer un galn de ron.
Ventajas
Es la levadura ms conocida y de importancia industrial ya que es la especie de
levadura utilizada por excelencia para la obtencin de etanol a nivel industrial
debido a que es un organismo de fcil manipulacin y de recuperacin, no es
exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto costo, tolera altas
concentraciones de etanol, en la fermentacin produce bajas concentraciones de
subproductos.
Historia y utilizacin comercial

Desde que los antiguos egipcios descubrieron que una sustancia granosa haca que
el sabor del agua fuera excepcionalmente extrao, la levadura se ha usado para la
coccin y la creacin de bebidas.
Sin embargo, la levadura no fue identificada como un organismo viviente hasta
despus de la invencin del microscopio a finales del ao 1860. Fue all cuando el
organismo fue aislado y creci en culturas para desarrollar la cepa ms eficaz para
uso comercial.
Los fabricantes de vino, cerveza y cocineros han usado varias especies de
Saccharomyces, y trabajaron para desarrollar cepas puras a fin de alcanzar sus
necesidades especficas.
Saccharomyces Cerevisiae
El gnero de Saccharomyces son hongos unicelulares, ms comnmente llamados
levadura. Aunque algunas levaduras y hongos pueden causar problemas a las
plantas y las personas, Los Saccharomyces juegan una funcin importante en
las industrias de la cocina y elaboracin de cerveza
Clasificacin
Reino:
Hongos
Filo: Ascomycota,
Clase:
Hemiascomycetes,
Orden: Saccharomycetales,
Familia: Saccharomycetaceae,
Gnero: Saccharomyces.
La especie ms comn es la Saccharomyces cerevisiae, que es la levadura del
horneado o cerveza.
Descripcin. Los hongos son organismos parecidos a las plantas, que no
contienen clorofila. Para sobrevivir, deben obtener su alimento viviendo en fuentes
orgnicas. Las Saccharomyces tienen una pared celular hecha de quitina y sus
lpidos son vinculados por steres. Usan una plantilla de ADN para la sntesis de
protenas, lo que hace que el Saccharomyces. Los Saccharomyces se reproducen
en ciernes, una forma de reproduccin asexual.
Funcin. Saccharomyces significa "hongos de azcar", que ofrece una clave a la
funcin de su levadura. Los Saccharomyces tienen la capacidad de fermentar los
azcares, queriendo decir que pueden convertir el azcar en dixido de carbono y
alcohol. La Saccharomyces cerevisiae hace esta funcin de forma tan eficiente que
puede fermentar su propio peso en glucosa en no ms de una hora.
Ciclo de vida. El ciclo de vida de este organismo simple ha ofrecido informacin
til a la biologa molecular, incluyendo la especializacin celular y la expresin
gentica en eucariotas. Los Saccharomyces crecen mediante ciernes. Esto quiere
decir que la clula "madre" da lugar a una clula hija elipsoidal con una nueva
superficie celular. Sin embargo, los Saccharomyces pueden sobrevivir y crecer en
un estado haploide y diploide. Los haploides pueden aparearse y formar una clula
diploide
Rasgos. Los Saccharomyces, cuando crecen en ambientes controlados, maduran
en tres das. Forman colonias hmedas, planas y suaves que varan de color crema
a bronceado. Las saccharomyces no pueden utilizar nitrato, deben tener
pseudohifas; sin embargo, las hifas encontradas en muchos hongos no estn

presentes. Los Saccharomyces formarn ascosporas cuando crecen en algunos

medios. stas son esporas contenidas en un asca
Caractersticas deseables
- Color. El color del Ron puede ser neutro (incoloro) o presentarse en tonalidades
varias que van desde el mbar al caoba. El nico colorante que est permitido
adicionar es el caramelo, que no modifica en nada su gusto.
- Olor. Su particularidad radica en que suelen ser suaves y con un fuerte aroma
que dura bastante en boca. En algunas partes, ste se distingue por su aroma a
pltano.
- Sabor. Al elaborarse en barricas de madera de roble notaremos este sabor algo
fuerte parecido al vino. Sabe a frutas maduras, a tostados, a miel, a dulce de caa
de azcar recin cortada que ofrece un sabor algo ms dulzn que otras bebidas
de similares pretensiones.
- Grado de alcohol. Esta bebida, debido a su contenido de alcohol, debe tomarse
con moderacin. Los grados de alcohol del ron estn en torno a los 33,40.

Fuentes de obtencin
Naturales. La levadura es elaborada especialmente para fines alimentarios y
nutritivos, en forma natural, a partir de la "fermentacin" aerbica de la
MELAZA de CAA DE AZUCAR, utilizando la ms moderna metodologa de
control para su produccin y realizando controles estrictos de calidad al
producto terminado. No contiene agregado de azcar, almidn, colorantes,
conservantes, lactosa ni gluten
Coleccin. En la actualidad, muchas regiones en diferentes pases han
logrado reproducir y conservar una gran cantidad de cepas de levaduras
Saccharomyces Cereviseae mediante un proceso de deshidratacin por. De
esta manera, la levadura puede ser transportada para su aprovechamiento
en distintas regiones del mundo y efectuar fermentaciones alcohlicas con
cepas de levaduras seleccionadas ms aromticas.
Preparacin de medios de cultivo
Para la preparacin de medio slido se aade agar (20g/L). Esterilizar en
autoclave a 121C durante 15 min. Las cepas de S. Cerevisiae se incubaron a
28C durante 48 h en medio YPD. Para mejor rendimiento el periodo de
incubacin es de 48 a 72 horas a temperatura de 22-25, para as producir
una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales.

Obtencin de cepa de Saccharomyces cerevisiae

La industria ronera actual, utiliza cepas de levaduras seleccionadas y mejoradas y
mantenidas en sus laboratorios, a fines de preservar la consistencia en el proceso
de fermentacin a travs del tiempo. Una reconocida Maestra Ronera jamaiquina
dice "La levadura utilizada, va a determinar el sabor final y el perfil del aroma del
producto terminado.

Generacin de Mutantes
Se determina la dosis letal 50 para la levadura Saccharomyces cerevisiae M522
Se realiza una nueva irradiacin con este tiempo de exposicin a un cultivo fresco
de la levadura
A partir del tubo irradiado se realizaran diluciones seriadas y se plaquean por
triplicado en placas de YPD agar a los efectos de obtener colonias aisladas
10 colonias que se transfieren a tubos con 2 ml de YPD para generar cultivos puros
de las nuevas cepas de Saccharomyces
De las placas que contenan colonias aisladas se seleccionan por morfologa y
aspecto
Se siembra en paralelo la cepa M522 como control
Las cepas fueron mantenidos en placa de YPD en heladera y se congelaron a -20C
en leche.

Estudio de Condiciones Metablicas de los Mutantes

A partir de una placa de mantenimiento en YPD de cada cepa y de la levadura
M522 mantenidas en heladera, se ajustaron tubos con 3 ml de suero fisiolgico
(NaCl 0,9%) utilizando la escala de Mac Farland.
Se transfirieron 150 L a tubos con 9 ml de YPD, YPD 40 g/L de glucosa, YPD
complementado con 10% de alcohol e YPD para incubar a 50C.
Los tubos fueron incubados durante 24 horas en condiciones aerobias, sin
agitacin a 37C y a 50C
Los cultivos se evaluaron por medidas de absorbancia a 660 nm utilizando como
blanco en cada caso el medio sin inocular.

1. D) Descripcin de los sistemas de cultivo de la fermentacin

alcohlica
Sistemas de cultivo
CONTINUO: Es un cultivo balanceado mantenido por un tiempo indefinido por un
sistema abierto de flujo, que se compone de:

Cmara de cultivo de volumen constante, a la que

llega un suministro de nutrientes de la que se
eliminan o separan los productos txicos de desecho
(por un rebosadero). Una vez que el sistema alcanza
el equilibrio, el nmero de clulas y la concentracin
de nutrientes en la cmara permanecen constantes,
entonces se dice que el sistema esta en estado
estacionario,
con
las
clulas
creciendo
exponencialmente.
Los parmetros a tener en cuenta son:
*Flujo
*Volumen de la cmara de cultivo
*Densidad celular en la cmara
*Prdida de clulas por el rebosadero
Se puede lograr un cultivo continuo en un quimiostato:
*Los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de tasas de
crecimiento exponencial.
*Permite crecimientos balanceados debido a que existe un sustrato o nutriente
presente en una concentracin establecida para limitar la densidad de
poblacin.
* Permite elegir la densidad de las clulas a la que se quiere trabajar
BATCH ALIMENTADO (FED BATCH/CULTIVO DISCONTINUO):
En este sistema, se alimenta continuamente el medio nutritivo o
alguno de sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el
limitante del crecimiento, sta tcnica permite controlar la
velocidad de crecimiento del microorganismo.
BATCH: Cuando se siembran microorganismos en un medio de
cultivo apropiado, estos comienzan a multiplicarse, hasta que
finalmente se detiene por agotamiento de nutrientes; un cultivo de esta
naturaleza, en el cual una cierta cantidad de microorganismos es sembrado en un
volumen dado, se conoce como cultivo "Batch". La evolucin del cultivo en el
tiempo, sigue una curva llamada "curva de crecimiento en Batch". Los sucesos se
separan en 4 fases
BIORREACTOR: Los biorreactores son recipientes
de reaccin, en los que se crean tcnicamente las
condiciones
ptimas
para
el
cultivo
y
multiplicacin de microorganismos, para la
formacin de productos ptimos.
REQUISITOS PARA EL INICIO DEL PROCESO
DE FERMENTACIN INDUSTRIAL
CEPA DE MICROORGANISMOS
* No todos los microorganismos (MOs) tienen uso industrial

*Los microorganismos ms utilizados son las levaduras, como los gneros

Saccharomyces, Candida y Kluyveromyces.
*Se seleccionan los que producen uno o ms productos de inters
* Se modifican genticamente por mutacin o recombinacin para aumentar el o
los metabolitos de inters, con el fin de mejorar su produccin y aumentar las
ganancias de la industria.
*Las vas metablicas menores se reprimen o eliminan.
* Todos los microorganismos utilizados pertenecen a cepas industriales que son
conservadas en los laboratorios de microbiologa de las industrias y en distintas
colecciones nacionales.
Requisitos de un microorganismo industrial
El microorganismo debe:
1- Producir la sustancia de inters
2- Obtenerse en cultivo puro
3- Ser genticamente estable, pero ser susceptible de manipulacin gentica.
4- Poder desarrollarse en cultivos a gran escala.
5- Poder mantener el cultivo del MO durante perodos largos en el
laboratorio y en la planta industrial.
6-Tener un tiempo de duplicacin bajo y fabricar el producto deseado en un
perodo corto.
Crecimiento rpido
ocupar menos tiempo los equipos industriales
disminuir los riesgos de contaminacin.
mejor control de los factores ambientales
7-Crecer en medio de cultivo lquido relativamente barato y que se obtenga en
grandes cantidades.
Condiciones que no debe tener un microorganismo industrial
Los microorganismos industriales no deben:
1- Ser peligrosos para el hombre, animales y plantas de inters econmico.
2- Liberar toxinas, o si lo hacen deben poder ser eliminadas fcilmente.
PROCESO A NIVEL PILOTO
Tiene como finalidad principal el desarrollo a escala semi-industrial de productos
obtenidos a partir del cultivo de clulas y microorganismos, ya sean bacterias,
hongos o levaduras, modificados o no genticamente.
Su objetivo es se la obtencin del producto y el obtener la informacin necesaria
para estudio del desarrollo del proceso que permita su posterior produccin a
escala industrial.
1- El fermentador de laboratorio, un fermentador
generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad.

escala

pequea,

2- La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a

3000 litros. Aqu las condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el
costo no es aun un factor de importancia. En el fermentador de una planta
piloto es deseable una cuidadosa instrumentacin y un control con
computadora, de modo que las condiciones que se obtengan sean lo ms
similares a las del fermentador industrial.

3- El fermentador industrial mismo, generalmente de 10.000 a 400.000 litros

PRUEBAS BIOQUIMICAS DEL MICROORGANISMO
Prueba de la Fenol-Oxidasa
C. neoformans produce fenol-oxidasa, Esto se evidencia por la produccin de un
pigmento marrn oscuro o negro alrededor de la colonia de C. neoformans en el
medio TOC.
Medios de Cultivo
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una
etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
a) Macronutrientes
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales
c) Factores de crecimiento.

PARAMETROS DE CONTROL Y DE PRODUCCION

Concentracin del sustrato: es un valor que se debe considerar ya que
afecta la velocidad de la fermentacin, el comportamiento y el desarrollo de
las clulas de la levadura.
Suele ser satisfactoria una concentracin de azcar del 10 al 18%, el valor
ms corriente es del 12%.
Concentracin de Alcohol: Una de las principales limitaciones del
proceso, es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol
(alcohol) que se llegan a producir durante la fermentacin, algunos
microorganismos como el saccharomyces cerevisiae pueden llegar a
soportar hasta el 20% de concentracin en volumen.
Temperatura: En el caso de la saccharomyces cerevisae se tiene un
desarrollo ptimo entre 28-35 C, recomendable 30 C.
pH: Este es un factor importante en la fermentacin, debido a su
importancia en el control de la contaminacin bacterial como tambin al
efecto en el crecimiento de las levaduras, en la velocidad de fermentacin y
en la formacin de alcohol. el pH ms favorable para el crecimiento de la
saccharomyces cerevisiae se encuentra entre 4.4 - 5.0, con un pH de 4.5
para su crecimiento ptimo.

Concentracin de nutrientes: Como ya se dijo, la presencia de

sustancias nutritivas adecuadas es una condicin necesaria para el
crecimiento y desarrollo de la levadura, siendo su concentracin un factor
primordial en la actividad vital de la levadura
Aireacin: El aire es un factor decisivo en toda fermentacin, ya que su
presencia hace ms vigoroso el crecimiento de la levadura.

EFICIENCIA MEJORA DEL MICROORGANISMO

Exposicin de cesar antunez