INFORME DE LABORATORIO

MICROBIOLOGA

Regina Gutirrez Villegas ID 00027312

Luis Javier Rojas Garca ID 000297039
Juan Carlos Pino Vallecilla ID 000

Laura Marcela Trujillo Vargas

DOCENTE

PROGRAMA MAESTRA EN BIOTECNOLOGA

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA

MEDELLN COLOMBIA
2015

INTRODUCCIN

Los microorganismos en general tienen la posibilidad de crecer en los ms

diversos ambientes, dado el potencial metablico y la capacidad respiratoria.
En esta prctica de laboratorio se trabaj con la

levadura Sacchharomyces

cerevisiae, la cual es capaz de asimilar una gran variedad de monosacridos.

Tambin puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos mayores, como la
sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece de las enzimas
necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidn. Los carbohidratos
asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a travs del ciclo de
la Gluclisis (o va Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura aprovecha la energa
liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de ATP y la usa en la
etapa anablica. (Madigan, et al)
Para medir su actividad frente a los diferentes sustratos de la levadura se emplea
un

equipo para determinar la biodegradabilidad de sustancias nutritivas,

impurezas, contaminantes o residuos mediante la actividad microbiana, se realizan

a menudo las denominadas mediciones de la respiracin (= mediciones del
agotamiento). En estas pruebas se determina en condiciones definidas la
respiracin de los organismos, medida como absorcin de oxgeno o generacin
de dixido de carbono. Las mediciones se realizan mediante sistemas cerrados
con OxiTop-C y el Controlador OC 110.
Por otro lado se realiz la determinacin de protena en muestras de

tusa de

maz inoculadas con el hongo Pleurotus Pulmonaris correspondientes a 0 dias , 5

das, 10 das , 12 das , 15 das y a 20 das , de inoculacin, se realiz una curva
de calibracin.

Se llevaron a cabo dos practicas ms que fueron una tincin de gram y un

aislamiento microbiolgico en medios: agar nutritivo y agar PDA, solo como
practicas demostrativas para aprender el procedimiento.
METODOLOGIA
Practica N 1
Materiales y equipos

Levadura Saccharomyces cervisiae

Agua destilada
Azcar
Jugo de mango criollo
Jugo de uva
Equipo Oxitop
NaOH
Magnetos
Balanza electrnica
Beaker
Probeta

Fundamento
Como se dijo en la introduccin se va a realizar una prueba que consiste en
observar el crecimiento de la Sacaromyces cereviciae en varios tipos de sustrato,
empleando para esto el equipo del OXITOP, el cual permite determina en
condiciones definidas, la respiracin de los organismos medida como absorcin
de oxgeno o generacin de dixido de carbono, este ltima ser la que
emplearemos.
Se preparan 5 muestras as:
Levadura activada 22 ml + agua 200 ml + azcar 5 grs azucar
Levadura activada 22 ml + agua 200 ml
Levadura activada 22 ml + jugo de uva 200 ml
Levadura activada 22 ml+ jugo de mango 200 ml
Levadura activada 22 ml + jugo de mango 200 ml + azcar 5 grs

Las muestras preparadas son llevadas a los frascos correspondientes previamente

marcados.
Se introduce 200 ml de la cantidad de muestra problema ms 22 mililitros del
levadura activada ( se activa en 100 ml de agua , 5 grs de azcar y 1 grs de
levadura la cual se activa a una temperatura de 30 C), el inoculo en la solucin
debe tener una concentracin del 10% en porcentaje V/V y como se tienen 200mL
de cada medio de cultivo, por medio de un anlisis de conversin se realiza un
clculo obteniendo que se debe adicionar 22 mL de inoculo (Levadura activada)
en cada medio de cultivo a cada una de las muestras y se introducen en botellas
mbar. Dentro de la botella mbar se introduce

magneto para que realice

agitacin constante.
El orden en que se introducen es el siguiente:
1. Muestra problema
2. Inoculo de la levadura activada
3. El magneto en el fondo de la botella, verificar que est funcionando
perfectamente
4. Al chupn negro se le agregan 3 pastillas de NaOH
5. Cerrar con el cabezote
Una vez montadas las muestras en las botellas se procede a la programacin del
controlador. Una vez programadas se llevan a la Plataforma de agitacin a una
temperatura de 25 - 35C, asegurndose que est en continua agitacin. Para
que registre la actividad dentro de las botellas durante siete das.

FOTOS DE MONTAJE DEL ENSAYO EN EL OXITOP

Botellas listas con la muestra problema y marcadas

Programacin del cabezote de cada botella

Incubacin de las muestras por 7 das

Practica N2
Determinacin de protena por el mtodo de Biuret
Fundamento
El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la
condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco. Reaccin
del Biuret

Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO4) se aade a una

solucin de protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces
peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un
mximo de absorcin a 540 nm.
Las caractersticas ms importantes de la reaccin son:

La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los

pptidos y protenas.
Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composicin de aminocidos. Algunos compuestos
(NH4 + , Tris, etc.) dan la reaccin

Violeta-prpura Complejo protena-Cu(II)

Consultado en (Bradford MM 1976)
MATERIALES Y EQUIPOS

Cultivos de PLeurotus pulmonarius de 0 dias , 5 dias, 10 dias , 12 dias , 15

dias y a 20 dias
Buffer FOSFATO NaCl pH=8.5mM. (Frio)
Balanza electrnica.
Erlenmeyer.
Agitador.
Filtro de papel.
Embudo de filtracin.
Soporte metlico para montaje de filtracin.
Beaker pequeo.
Reactivo de Biuret.
Micropipetas y puntas.
Pipetas y bomba de succin.
Albumina Suero bovino: solucin 10g/l.
Tubos de ensayo con tapas.
Espectrofotmetro (Shimadzu UV 1601PC.).
Computador.

PASOS
A. Extraccin de la protena
a. Para llevar a cabo la extraccin de la protena se procede a emplear
un Buffer ( fosfato NaCl, pH=8 ,50 mM, debe estar frio para
obtener mejores resultados)
b. Se pesa 1,5 grs de la muestra( cultivo del hongo Pleurotus
Pulmonaris en tusa de maz a (nosotros nos toc la muestra de 15
das de incubacin) Se le adicionan 20 ml de buffer frio y se deja
macerar agitando por 60 minutos a 150rpm ( en la plataforma de
agitacin), tambin se puede macerar la muestra con un mortero., y
luego se agita
c. Filtrar la muestra
d. Guardar el filtrado para hacer la lectura por el mtodo de Biuret

FOTOS DEL MONTAJE DE LA PRUEBA DE DETERMINACION DE

PROTEINAS ( METODO BIURET)

Muestras del cultivo

del hongo Pleurotus
Pulmonaris
en tusa
de maz

Frascos en los que

llevo
a
cabo
extraccin
de
protena
antes
Adicionar el buffer

se
la
la
de

Muestras en agitacin
para extraer la proteina

Filtracin de la muestra
para obtener el buffer
con la proteina

Filtrados obtenidos

B. Determinacin de la protena por mtodo colorimtrico

Esta prueba se realiza en dos partes:
1. Obtener la protena del cultivo del hongo ( ya se realiz en el
paso A)
2. Realizar una curva de calibracin
Para este mtodo se emple el reactivo de Biuret el cual se prepara
as:
a. Solucin estndar de Biuret (reactivo A) se prepara con
CuSO4 . 5 H2O ( Carlo Erba)
EDAT (MOL LABS)
KL ( Carlo Erba)
Na(OH) (2.5 N )( Merck)

1,5 grs
6,0grs
1,0grs
300 ml

b. Solucin de Albumina de suero bovino ( 10g/lit para la curva de

calibracin. (Reactivo B)
La curva de calibracin
Nmero del tubo
Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Reactivos
8 ml de A
2 ml de B
0 ml de H2O
8 ml de A
1.6 ml de B
0,4 ml de H2O
8 ml de A
1.2 ml de B
0,8 ml de H2O
8 ml de A
0,8 ml de B
1,2 ml de H2O
8 ml de A
0,4 ml de B
1,6 ml de H2O
8 ml de A
0.2 ml de B
1,8 ml de H2O
8 ml de A
0 ml de B
2 ml de H2O

FOTOS DE LA PREPARACION Y LECTURA DE LA CURVA DE CALIBRACION

PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Las muestras se preparan adicionando 8 ml del reactivo de Biuret y 2 mil de

muestra que contiene el extracto proteico se deja reposar media hora para leerlo
en el espectrofotometro
Luego de prepararlos se mezclan bien con el Vortex y se dejan reposar por 30
minutos en el Shaker.

Muestras listas para la lectura

Aqu se evidencia el momento de la lectura

En este momento se ve en el computador como se genera la curva de calibracin.

RESULTADOS PRACTICA CRECIMIENTO MICROBIANO

El OXITOP hace alrededor de 199 determinaciones de CO 2, con cuyos datos se
construye la curva de crecimiento. Por lo que la tabla de datos no se anexa en el
caso de las curvas de crecimiento
CASO 1 GRAFICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CON AGUA
DESTILADA

Levadura sin Azcar

600
500
400
300
200
100
0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Se observa una grfica en la cual el crecimiento de la levadura se da de forma

inmediata sin pasar por la fase lag , pasa a la fase logartmica o cremiento
acelerado hasta las 53,48 horas ( 2 das aproximados) de fermentacin , con una
concentracin de CO2 de 400, luego la concentracin de CO2 tiene una cada leve
disminuyendo a 377 ppm a las 73,888 horas osea a los
3,07 das
aproximadamente, la concentracin de CO2 nuevamente se incrementa a 400
ppm, en ese mismo da osea a las 89,44 horas que corresponde a ( 3,78 das) de
fermentacin para ser ms precisos y continua aumentando sin presentar fase
estacionaria , continua entonces su proceso fermentativo hasta los 6,44 das en
que se detiene la fermentacin para realizar las lecturas correspondientes , con
una concentracin de CO2 final de 515 ppm

CASO 2 GRAFICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CON AGUA

DESTILADA MAS AZUCAR

Levadura + Azcar
600
500
400
300
200
100
0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Se observa una grfica en la cual el crecimiento de la levadura se evidencia en

forma inmediata ya que a los 46 minutos ya observa una concentracin de CO 2 de
5,6 ppm, sin embargo a las 9,33 horas aproximadamente hasta las 10,88 horas se
detiene su crecimiento, esto se evidencia en que la concentracin de CO 2 este
tiempo se mantiene en 59,1 ppm, el crecimiento continua en forma lenta y se
normaliza a las 18,66 horas con una concentracin de 78,8 ppm, a partir de este
momento crece en forma acelerada y a las 56,44 horas alcanza
una
concentracin de CO2 de 400ppm , sin embargo entre estos instantes y las 70,77
horas , la levadura sufre una leve esta de crecimiento que sin ser estacionaria , es
muy lento temiendo a veces lecturas en la concentracin de CO 2 , de disminucin
y aumento en forma muy leve, luego se normaliza y reinicia una fase de
crecimiento acelerado hasta obtener a los 6,44 das una concentracin final de
CO2 , de 537 ppm

CASO 3

GRAFICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CON JUGO DE MORA

Jugo de mora y levadura

350
300
250
200
150
100
50
0

20

40

60

80

100

120

140

160

En esta grafica se observa que la levadura inicia su crecimiento en forma

inmediata osea sin pasar por la fase lag llegando al mximo de produccin de CO 2
que fue de 301 ppm a los 5,08 das y a los 6,44 da inicia fase de decrecimiento o
muerte celular

RESULTADOS PRACTICA DETERMINACION DE PROTEINA

Datos iniciales
Concentracin inicial (C1)= 10 g/L
Volumen inicial (V1)= 2 ml =0.002 L
Volumen final (V2)= 10 ml = 0.01 L
Se debe hallar la concentracin final (C2) para cada una de ellas, y se hizo la
siguiente operacin:
C1.V1 = C2 X V2

Despejamos la concentracin final que es la que no conocemos y nos qued:

C2= C1 X V1/ V2f
Reemplazamos los valores y se obtiene el resultado para cada una de ellas.
Se ley en el espectrofotmetro (Shimadzu UV- 1601PC)(a una longitud de onda
de 540 nm). Se realiz la curva de absorbancia Vs concentracin.

0.7
f(x) = 0x + 0.17
R = 0.95

0.6
0.5
0.4
Abs

0.3
0.2
0.1
0
0

50

100

150

200

Concentracin (ppm)

En el eje X se anotan los datos de la concentracin de protena

En el eje Y se anota la absorbancia (ppm).
DATOS CURVA DE CALIBRACION

CONCENTRA
CION (PPM)
ABS
Volumenes C2
200 0,616
2
200
160
0,52
1,6
160
120 0,503
1,280 0,342
120
0,840 0,29380
0,420 0,23940
0 0,113

250

0,2

20

Contenido proteina Pleurotus P + Tusa Maiz

60
50
40
Cantidad de Proteina 30
20
10
0
0

10

15
Dias

DATOS LECTURA DE LAS MUESTRAS CON Peorotus. ps.

C1
V2

1000 ppm
10 ml

20

25

DIAS

CONCENTRACION
0

21,8695652

19,6956522

10

28,826087

12

41,8695652

15

52,7391304

20

56,6521739

ANALISIS DE RESULTADOS
PRACTICA 1 CRECIMIENTO MICROBIANO EVALUADO CON EL OXITOP
Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varan desde los carbohidratos
hasta los aminocidos. Adems, la capacidad de utilizar ciertos tipos de azcares
ha sido tradicionalmente empleada para la caracterizacin de las distintas razas
que esta especie presenta. Entre los azcares que puede utilizar estn
monosacaridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre otros.
Tambin son capaces de utilizar disacridos como la maltosa y la sacarosa y
trisacridos como la rafinosa. Uno de los azcares que no puede metabolizar es
la lactosa, utilizndose este azcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces
lactis. Tambin es capaz de utilizar otras fuentes de carbono distintas a
carbohidratos y aminocidos. Entre las ms destacadas se encuentra la capacidad
de utilizar tanto etanol como glicerol. Por norma general, las levaduras mantienen
dos tipos de metabolismo muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones
en las que existen altas concentraciones de glucosa, fructosa o maltosa, la
tendencia es a realizar una fermentacin alcohlica de estos, es decir, se realiza
la gluclisis y posteriormente se forma etanol. Una vez que estos azcares
escasean, se produce la respiracin del etanol, va ciclo de Krebs. Evolutivamente
esto es un proceso que, a priori, no es ventajoso por ser energticamente
desfavorable para la reproduccin del organismo, dado que se obtiene mucha
menos energa en el primer proceso que en el segundo. No obstante, la gran

mayora de los organismos son muy sensibles al etanol, por lo que se ha

entendido como un proceso de competencia por sustrato. Las levaduras, adems
de necesitar una fuente de carbono, necesitan tanto fuentes de nitrgeno como
podran ser el amonio, la urea o distintos tipos de aminocidos como fuentes de
fsforo.

Adems,

son

necesarias

vitaminas

como

la Biotina,

tambin

llamada Vitamina H, y distintos elementos traza (Feldmann G.J., 2005 )

CASO 1
En la grfica que representa el crecimiento de la S. cereviciae en agua destilada ,
se observa un crecimiento que no es coherente con el medio de cultivo en el que
se encuentra la levadura, obviamente el inoculo de levadura viene con azcar
blanca osea sacarosa, con esta azcar se activa la levadura , pero ingresa a un
medio sin ningn nutriente ni minerales ( agua destilada) , no debera presentar un

crecimiento como el que muestra, este fenmeno se podra explicar desde el

punto de vista de que como tantos participamos en la preparacin de la prueba
pudo incurrirse en un error y se le adiciono azcar en ms poca cantidad o la
levadura con el azcar del inoculo tuvo suficiente para crecer y dar la grfica que
se presenta en este momento.
CASO 2
En la grfica del crecimiento de la levadura con agua destilada y azcar se
observa un crecimiento coherente con los nutrientes del medio , tambin se
observa que la levadura no pasa por la fase lag , esto quizs se deba a que ya
viene acondicionada al sustrato ya que se activ en un sustrato similar y continua
su crecimiento hasta agotar los nutrientes que trae al ser inoculada en el medio ,
una vez los finaliza continua con la sacarosa del medio para lo cual debe iniciar
con desdoblar esta molcula para poder reiniciar su proceso de crecimiento, de
ah esa pequea parte de la curva que semeja una fase lag , este mismo
fenmeno parece ocurrir en la grfica del caso 1 ( levadura con agua) , pero no tan
pronunciada .
CASO 3
En la grfica del crecimiento con jugo de mora se observa un crecimiento normal
de la levadura en el jugo de mora, es importante recordar que la mora posee
varios azucares como se pueden (ver en la tabla) con un crecimiento acelerado sin
pasar por la fase lag ya que vena al igual que en los otros dos casos analizados,
activada, los azucares de la mora son fcilmente metabolizados por levadura de
all su crecimiento tan acelerado , entra en fase estacionaria y de muerte a una
concentracin de 300ppm , debido quizs a :

Disminucin de los nutrientes

Metabolitos txicos de su proceso metablico concentrados en el medio de

cultivo
Cambio de ph del medio por la fermentacin

La siguiente tabla muestra una lista de la cantidad de hidratos de carbono

simples de la mora:
Nutriente
Cantidad
Nutriente
Azcar
6,24 g.
Lactosa
Fructosa
3,11 g.
Maltosa
Galactosa
0 g.
Oligosacaridos
Glucosa
2,96 g.
Sacarosa
Fuente: On line http://alimentos.org.es/calorias-mora

Cantidad
0 g.
0 g.
0 g.
0,17 g.

ANALISIS GRAFICA RECUENTO DE PROTEINA METODO BIURET

TABLA DE CALIBRACION
El

error presentado por la curva de calibracin, se debi a que muchos

colaboramos en elaborar la muestras problema de all que el factor de error

humano fuese tan alto.
Al analizar los resultados de las muestras con Pleorotus p, desde los cero das
hasta los 10 observamos que, el Pleorotus p, encuentra en una fase lag , de ah
en adelante sigue con su proceso de crecimiento presentado la fase logartmica no
se evidencia que hubiese llegado ya a la fase estacionaria o de muerte celular, con
las muestras analizadas
CONCLUSIONES

Sera interesante evaluar como es el crecimiento de la levadura en

ausencia de nutrientes

De los tres medios evaluados se evidencia mejor crecimiento de la levadura

en presencia de agua con azcar.

Para el trabajo con curvas de calibracin es importante minimizar al mximo
el nmero de personas que realizan el montaje de las muestras y la lectura

de los resultados, de esta forma se maneja un margen de error menor.

La tusa de maz , parece ser un sustrato bueno para el crecimiento de
Pleorotus p, aun que es necesario hacer ms evaluaciones.

BIBLIOGRAFIA

Ugarte M. V., Tesis para maestra obtencin y caracterizacin de cepas de

Saccharomyces cerevisiae superproductoras de glutatin

Willey, J.M., Sherwood, L.M., Woolverton C. J. (2008) Microbiologia 7ma
edicion, la curva de crecimiento pag 123

Paul Held, Monitoring growth of Beer brewing strain of Saccharomyces

cerevisiae. on-line
2015
.http://www.biotek.com/assets/tech_resources/SynergyH1_Yeast_Growth_A
pp_Note.pdf 2)

Kevin A. Morano, The response to heat shock and oxidative stress in

Saccharomyces cerevisiae. On line 2015 :
http://www.genetics.org/content/190/4/1157.full 3)

Mike A Singer & Susan Lindquist, Thermo tolerance in Saccharomyces

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http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/S0167-7799(98)01251-7 .

Arroyo-Lpez, Effects of temperature, pH and sugar concentration on the

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interspecific hybrid. On line
2015 :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19246112 5)

Arjun Singh. Genetic analysis of mutations affecting growth of

Saccharomyces cerevisiae at los temperature. Citado el 21 de Septiembre
del 2013. Disponible on-line en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1213157

Madigan T., Michael, Martinko M., Jhon, Parker, Jack. Brock Biologa de los
microorganismos. Pearson Prentice Hall. Dcima edicin. p: 957-985

Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem. 72: 248-254.

Feldmann G.J., 2005. Levaduras y biotecnologa pag 26-44