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2009
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ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………… 3
2. OBJETIVOS………………………………………………………………… 4
2.1 General……………………………………………………………… 4
2.2 Específicos………………………………………………………… 4
3. MARCO TEÓRICO………………………………………………………… 4
3.4.1 Oxígeno……………………………………………………………… 5
3.4.2 Temperatura……………………………………………………….. 5
3.4.3 pH…………………………………………………………………… 5
4. MARCO METODOLÓGICO…………………………………………………… 6
4.2 AISLAMIENTO………………………………………………………………… 7
4.9TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS………………………………………………… 12
5. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………… 13
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1. INTRODUCCIÓN
El uso de fertilizantes químicos constituye un daño biológico a los suelos deteriorando la calidad
de los mismos: inducen el aumento de acidez y salinidad eliminando el humus y suavizando los
tejidos de la planta provocando que ésta sea menos resistente y saludable, eliminan el ecosistema
natural de suelo desarrollando plantas más vulnerables.
La tierra se hace dependiente a los químicos incrementando los daños al suelo y los costos de
fertilización. Actualmente un fertilizante químico nitrogenado se comercializa en $380 por sacos de
19Kg, este costo es alto por la energía que se utiliza para su elaboración. a
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2. OBJETIVOS
2.1 General
2.2 Específico
• Preservar cepas de Azotobacter spp en caldo BHI por la técnica del criovial.
3. MARCO TEÓRICO
3.2 Biofertilizante
Los biofertilizantes se caracterizan por la presencia de microorganismos vivos que no causan daño
o enfermedad al hombre, a los animales ni a las plantas. Pueden emplearse bacterias u hongos
microscópicos, llamados micorrízicos, que se asocian en forma natural con las raíces de las
plantas, beneficiando su crecimiento y el rendimiento de los cultivos.
Los microorganismos contribuyen con el crecimiento de las plantas y el rendimiento de los cultivos,
pero para que éstos sean beneficiados es indispensable que las bacterias u hongos se encuentren
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vivos. El biofertilizante debe contener varios millones de bacterias por gramo de soporte sólido o
por mililitro, en caso de ser acuoso. Una vez que la semilla germina y las raíces empiezan a
desarrollarse, las bacterias se multiplicarán y colonizarán la superficie de las raíces y promoverán
el crecimiento de las plantas.
Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al
inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el
microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de
fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de
aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del medio de
cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente
como resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas de
crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte.
En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase
logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos
secundarios).
3.4.1 Oxígeno
3.4.2 Temperatura
Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima tienen retardado su
crecimiento y por lo tanto reducida la producción celular, es decir su productividad. Por otro lado, si
la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés al
choque térmico con la consiguiente producción de proteasas celulares que ocasionan una
disminución en el rendimiento de los productos proteicos.
3.4.3 pH
La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el
crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede
originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de
cultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por
supuesto que esta adición del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el
pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el fermentador.
Las bacterias fijadoras de nitrógeno son componentes muy importantes del suelo. Para desarrollar
la fertilidad del suelo, debe aumentar el contenido de nitrógeno. En las condiciones
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medioambientales adecuadas, las bacterias fijadoras de nitrógeno producen enzimas que toman el
nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera, y, con los azúcares que obtienen de la planta, fijan
el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana. Si las bacterias satisfacen sus necesidades de
nitrógeno, entonces, el nitrógeno pasa a la planta, y pueden observarse niveles elevados de
proteína en la planta. Este nitrógeno elevado no se libera al suelo hasta que muere parte de la
planta, o se exuda al suelo en la rizósfera.
Se dividen en dos grandes grupos: las simbióticas especificas de las leguminosas como el
Rhizobium y las libres que viven en el suelo y no necesitan la planta para su reproducción como el
Azotobacter y el Azospirillum, entre los más importantes en agricultura.
Otras ventajas comprobadas del uso de estas bacterias como biofertilizante son:
Hay pues un cúmulo de ventajas para el usuario, económicas, ecológicas, A corto, medio y largo
plazo en la progresiva sustitución de la fertilización química por las bacterias naturales, totalmente
inofensivas para el medio y el ser humano.
La N2 + 16 ATP + 8e-+ 8H+ nitrogenasa 2NH3 + 8H2 + 16 ADP+ 16 P
4. MARCO METODOLÓGICO
De cada cultivo de Stevia se toman cinco muestras de 500g a una profundidad de 10 a 15 cm, el
muestreo se realiza en forma de zig –zag a lo largo del cultivo.
Las muestras se empacan en bolsas de papel que se colocan dentro de bolsas de plásticos
herméticas y posteriormente se transportan en coolers.
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4.1.1 Procesamiento de muestras
Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo se tamizan en un tamiz estándar de 4.75 mm, con
el fin de obtener gránulos uniformes, para realizar el aislamiento primario.
La medición del pH se realizan siguiendo el protocolo descrito por Van Lierop, 1981; se coloca en
un frasco de vidrio limpio suelo tamizado y agua destilada en proporción 1:1 p/v. Posteriormente, la
suspensión se deja precipitar durante 5 min y se toma el valor de pH del sobrenadante con un
potenciómetro. Los valores de pH del sobrenadante a partir de cuatro mediciones en cada cultivo.
4.2 AISLAMIENTO
A partir de cada muestra de suelo obtenida en los diferentes cultivos, se realiza el aislamiento
primario por triplicado, empleando la técnica de gránulos de suelo; que consiste en colocar 20
gránulos en cajas de Agar Ashby – Sacarosa (medio especifico para Azotobacter spp) a una
distancia aproximada de 1 cm. Las cajas se incuban a 28°C por 7 días hasta observar alrededor de
los gránulos colonias translucidas y mucilaginosas. Se realiza el recuento de gránulos con colonias,
con el fin de obtener el porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbioticas
para cada cultivo (% de recuperación = No. de gránulos con colonias mucilaginosas/total de
gránulos sembrados x100) y se realiza coloración de gram.
El aislamiento secundario se realiza mediante siembra por agotamiento en cajas con Agar Ashby –
Sacarosa a partir de las colonias obtenidas en el aislamiento primario. Las cajas son incubadas por
7 días a 28°C, posteriormente se observa el crecimiento en el medio selectivo Ashby – Sacarosa,
la morfología de la colonia y de las células por medio de la coloración de Gram. Las cepas aisladas
que presenten crecimiento en el segundo aislamiento se codifican de acuerdo al cultivo de donde
fueron aisladas.
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Con el fin de observar la producción de pigmentos en medio solido, de cada aislamiento se realiza
una siembra en agar diferencial Ashby con 5 g/l de benzoato, remplazando la fuente de carbono
(sacarosa) en cajas petri para observar la pigmentación en las colonias. La siembra se realiza
tomando una colonia de cada aislamiento y realizando una estría en toda la caja, se incuba a 28°C
por 7 días y se observa pigmentación.
A partir de las cepas aisladas y evaluadas se realizan cultivos en erlenmeyer de 100 ml con 50 ml
de caldo nutritivo, el cual se incuba a 28°C por 24 Horas con agitación de 150 rpm. El cultivo se
deposita en 10 viales de 1.5 ml de 50 % V/V de glicerol puro estéril. Luego se mantiene en
congelación a -80°C.
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4.5 SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
Para reactivar a las bacterias se utiliza el caldo Pikosvskaya modificado liquido, ideal para el
crecimiento de Azotobacter spp. El caldo correctamente preparado se vierte en tubos de ensayo (5
ml/tubo) y se esteriliza. Luego se inocula cada tubo con la cepa madre bajo condiciones de
esterilidad y se incuba a 30°C por 24 horas.
Para la preparación del pre inoculó se toman en cuenta los siguientes requisitos:
1.- El cultivo debe estar metabólicamente activo y libre de contaminantes. Para ello se trabaja bajo
normas estrictas de esterilidad y se realiza un control permanente de cultivo mediante la
observación directa al microscopio de las características del microorganismo utilizando técnicas
microbiológicas.
2.- El inoculo debe estar en su fase exponencial (grado máximo de desarrollo). Para ello se evalúa
el crecimiento bacteriano durante 30 horas que es el tiempo estimado que tarda en alcanzar la fase
exponencial. Se procura obtener preinóculos con una concentración de biomasa del orden de 108-
109 células/ml.
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3.- Se debe disponer de una cantidad de cultivo suficiente para inocular el volumen de medio
liquido a utilizar en la fermentación, el cual debe estar entre el 3 – 10 % del volumen total a
fermentar. En este caso se trabaja con un volumen equivalente al 10% del volumen total a
fermentar.
Procedimiento
Con las cepas reactivadas anteriormente se realiza un pool bacteriano. 10 ml de pool se inoculan
en 90 ml de caldo Pikovskaya modificado (10% de volumen total a fermentar) y otros 10 ml en 90
ml de caldo alternativo, obteniéndose un volumen final de 100 ml de cultivo por cada caldo de
fermentación. Posteriormente se incuban a 30°C por 24 horas y 150 rpm en matraces de 250 ml.
Una vez obtenidos los preinóculos, estos se inoculan en 900 ml de CPM y 900 de CA. Luego son
incubados a una temperatura promedio de 28°C por 72 horas. El oxigeno se suministra utilizando
un aireador para pecera con un flujo de aire aproximado de 1 m3 /h en matraces de 2000 ml.
Inóculo
Preinóculo
O2 CO2
10ml 100ml
1000ml de
biofertilizante
Se ha realizan una serie de corridas cinéticas en las que se evalúa la variación de pH, la
temperatura del caldo de cultivo y la concentración de biomasa. Además se evalúa el consumo de
sustrato en CPM con lo que se puede obtener las variaciones cinéticas de crecimiento. Las
muestras se toman casa tres horas durante las 72 horas que dura la fermentación. Este
procedimiento se realiza tres veces.
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Se utiliza la técnica de determinación de biomasa por densidad óptica para el CPM y la
determinación del Peso seco para el CA, debido a que por el color de la melaza es imposible de
medir la absorbancia. Además se realizan conteos de colonias en caja para determinar las
unidades formadores de colonias por litro.
Se mide la absorbancia de cada muestra a 540 nm y luego se obtiene la concentración de biomasa
en gramos por litro utilizando la curva de calibración de absorbancia en función de peso seco para
Azotobacter. Se utiliza medio estéril como blanco.
Para el conteo de bacterias en caja se realizan diluciones de 10-1 a 10-9 y se siembran en CPM
sólido. Cada dilución se realiza por duplicado.
Para determinar el uso de glucosa se utilizo la técnica de DNS que se basa en el uso de 3,5 –
dinitrosalicilico para provocar la oxidación de los azucares y, al mismo tiempo, se propia reducción,
desarrollándose la siguiente reacción:
Según lo anterior, una mole de azúcar reacciona con una mol de acido dinitrosalicilico, dando lugar
a una relación estequiométrica que permite conocer cantidad de azucares reductores presentes en
la muestra. Esta reacción además puede ser leída fácilmente al espectrofotómetro ya que da lugar
a una reacción colometricas el acido 3,5 – dinitrosalicilico de color amarillo cambia al acido 3 –
amino, 5 – nitro salicílico de un color pardo oscuro – marrón, cuya intensidad es proporcional a la
cantidad de azucares reductores
Procedimiento
De cada muestra tomada se mide el pH para determinar la variación del mismo durante la
fermentación, para ello se utilizo un potenciómetro previamente calibrado.
La temperatura del caldo de cultivo se mide durante todo el proceso de producción del
biofertilizante utilizando para ello un termómetro acoplado al equipo de fermentación.
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4.8 VIABILIDAD DEL PRODUCTO EN CONDICIONES DE LABORATORIO
Para determinar la viabilidad del producto se almaceno el producto terminado en envases plásticos
cerrados y se los coloca en refrigeración (4ºC) bajo condiciones higiénicas para evitar la
contaminación
Cada semana se evalúa el estado del producto mediante observación directa al microscopio. Se
evalúa la población microbiana, la actividad y la contaminación por un periodo establecido de
tiempo. Además se deben realizar conteos de colonias en caja con el medio Ashby como medio de
cultivo selectivo
5. BIBLIOGRAFÍA
[1]http://www.javeriana.edu.co/universitas_scientiarum/articulos/produccion_biofertilizante.p
df
[2] http://www.nobelonline.net/UserFiles/File/7kdas.pdf
[3] http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema12MI.html
[4]http://www.google.com.ec/search?
hl=es&rlz=1R2ADBF_es&q=bacterias+fijadoras+de+nitrogeno&meta=&aq=0&oq=bacterias
+fijadoras
[5] http://jb.asm.org/cgi/reprint/77/1/86.pdf
12
¨Interacción rhizobium/Azosoirllumrhizobium/azotobacter” en línea http
//www.edumicro.usual.es/sefin/rodelas.html
Espin,gbiología de azotobacter vinelandi Instituto de biotecnología UNAM en línea
http: //www.microbiología.org.mx/microbiosenlínea/capitulo_09/capitulo09.pdf
Guiar2001”biofertilzantes” en línea:
http//coli.usual.es/web/educativo/biotec_microb/temas/29RubenIGlesiasGarcia.pdf
IAB Centro de investigaciones y aplicaciones biotecnologías2001”biofertilizantes” Valencia
España en línea: http//www.iabiotec.com/respuestas.htm.
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