"EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.

PLANEACION,
ORGANIZACION Y NORMAS DE TRABAJO" Y "PREPARACION DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO"

Presentado a:
ALINA K. SIGARROA RIECHE

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS Y AGRARIAS DEL AMBIENTE
INGENIERIA BIOTECNOLOGICA
COLOMBIA
2015

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"EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES. PLANEACION,
ORGANIZACION Y NORMAS DE TRABAJO" Y "PREPARACION DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO"

Presentado por:

PAOLA ALEJANDRA ANGARITA 1610591

JOSE EDELBERTO DIAZ MARIN 1610705
LEIDY XIMENA CAMARGO URIBE 1610740
MARIA ALEJANDRA DUGARTE BOHORQUEZ 1610753

Presentado a:
ALINA K. SIGARROA RIECHE

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS Y AGRARIAS DEL AMBIENTE
INGENIERIA BIOTECNOLOGICA
COLOMBIA
2015

Contenido
Introduccin .................................................................................................................................................. 4
Objetivos ....................................................................................................................................................... 4
Materiales ...................................................................................................................................................... 5
Metodologa .................................................................................................................................................. 5
Diseo, organizacin y normas de trabajo ................................................................................................ 5
Preparacin de soluciones madres o soluciones stock. para el medio basal de murashige y skoog (1962).
................................................................................................................................................................... 6
Preparacin del medio de cultivo .............................................................................................................. 6
Conclusiones ................................................................................................................................................. 7
Cuestionario .................................................................................................................................................. 8
Cuestionario 1. .......................................................................................................................................... 8
Cuestionario 2. ........................................................................................................................................ 10
Bibliografa.................................................................................................................................................. 12
Anexos......................................................................................................................................................... 13

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Introduccin
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en
condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos, estos medios son
esenciales en el laboratorio por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y
uso, asegurar la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
Un medio de cultivo es una solucin acuosa en donde se encuentran disueltas sales minerales
que aportan los elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes
(Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono,
generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad fotosinttica de los tejido in vitro. Adems,
el medio puede ser enriquecido con Aminocidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento. Los
medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o 100 veces (Soluciones
Madre o Stock). En la solucin madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre que no
se produzcan problemas de precipitacin. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de
quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo. Los medios de cultivo se pueden
utilizar de forma lquida o con un agente gelificante como el agar.
La elaboracin de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre
previamente realizadas. Adems, se aade la fuente de carbono y el agente gelificante, que
normalmente es agar. Se pueden hacer distintos medios de cultivo manteniendo la misma
concentracin de algunas sustancias, por ejemplo sales minerales y vitaminas, y modificando o
eliminando otras como los reguladores de crecimiento. Tomando como base las sales minerales,
vitaminas y fuente de carbono de Murashige y Skoog se pueden realizar mltiples medios de
cultivo variando los reguladores de crecimiento o su concentracin (Murashige y Skoog, 1962)

Objetivos
Dominar todo lo referente a la planeacin, organizacin, equipos necesarios y las normas de
trabajo a seguir en un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.
Conocer y preparar las soluciones Stock ms usadas para medios de cultivo bsicos para la
ejecucin de los trabajos de cultivo de tejidos vegetales.
Conocer todo el proceso de preparacin del medio de cultivo para la ejecucin de los trabajos
de cultivo de tejidos vegetales

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Materiales
Bata de Laboratorio
Cuaderno de laboratorio
1 rollo de papel aluminio (Todo el grupo)
Cinta tirro (de enmascarar) o marcador permanente para vidrio
Metodologa
Diseo, organizacin y normas de trabajo

Durante la prctica se discuti sobre los materiales que debemos usar. Las Cuales se dividen en 2:
1. Personales : Uniforme completo, jabn antibacterial
2. Grupal: Alcohol 96%, Hipoclorito 13%, Algodn, Papel aluminio, Envoplasr, Toalla,
Jeringas, etc.
Adems tambin se habl sobre las reas en las que se divide el laboratorio de biotecnologa
vegetal.
1. rea NO estril.

Cuarto zona de lavado

Cuarto Zona preparacin de medios
Cocinas
Dispensador de medios de cultivos
Agitador magntico
Zona de autoclave
Autoclave
Horno
Control de calidad

ZONA TRAMPA

2. rea Estril

Cuartos de siembra
Cuartos de crecimiento
Cabinas de flujo laminar

ZONA TRAMPA
3. rea Vivero

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Preparacin de soluciones madres o soluciones stock. para el medio basal de murashige y
skoog (1962).

1. Estudie detenidamente la composicin del medio MS.

2. Se lavan los frascos, y se llevan al horno
3. Se preparan, por separado, 500 ml de cada una de las soluciones madres que a
continuacin se sealan:
Solvente comn: Agua destilada

Solucin A. Macronutrientes:
Nitrato de Amonio

66.0 g/l

Nitrato de Potasio

76.0 g/l

Solucin C. Calcio:

Sulfato de Magnesio x7 H2O

14.8 g/l

Cloruro de Calcio x 2 H2O

Hidrgeno fosfato de Potasio

6.8 g/l

150 g/l

Solucin D. Yoduro de Potasio:

Yoduro de Potasio

Solucin B. Micronutrientes:
cido Brico
6.2 g/l
Sulfato de Manganeso x 5 H2O

Sulfato de Manganeso x 1 H2O

Sulfato de Cinc x 5 H2O

Sulfato de Cinc x 6 H2O

Molibdato de Sodio x 2 H2O
Sulfato de Cobre x 5 H2O
Cloruro de Cobalto x 6 H2O

22.3g/l
16.0 g/l
8.6 g/l
10.5 g/l
0.25 g/l
0.025 g/l
0.025 g/l

0.83 g/l

Solucin E. Hierro en forma de

quelato:
EDTA Na

3.73 g/l

Sulfato de Hierro x 7 H2O 2.78 g/l

Preparacin del medio de cultivo

1.

La los frascos del

cultivo

Se esteriliza en horno (155 a 2h)

2.

Preparar El medio de cultivo

Macronutrientes
Micronutrientes
CaCl2
IK
EDTA-Fe

25 ml/l
1 ml/l
3.0 ml/l
1 ml/l
5 ml/l

Sales al
100%

Se disuelve con H2O

destilada
Suplementacin

El agar se debe aadir una vez

que se ajuste el pH

Vitaminas MS
Azcar
AJUSTAR pH
Agar
2,4 D

2 ml/l
30 gr/l
6.0
6 gr/l
0.5 mg/l

Esterilizar en el autoclave
(120 a 20min)

Distribuir el medio en los

frascos, Tapar y Rotular

Guardar en el rea trampa a T

ambiente o refrigerada si se
deja por mas de 4 Dias.

Conclusiones
Es importante aprender sobre las diferentes reas en las que se divide el laboratorio de
Biotecnologa Vegetal, Ya que con esta informacin se puede obtener un mejor manejo y orden
en el momento de la prctica.
De acuerdo con lo realizado en la presente prctica se concluye que es de gran importancia
preparar adecuadamente los medios de cultivo, aadir la cantidad de solucin exacta y disolverla
correctamente para obtener los resultados esperados

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El pH deba de estar en un rango de 5.7 a 6.0, empleando el potencimetro. En este caso se le
agrego NaOH hidrxido sdico y HCL cido clorhdrico 0.1 N. para nivelar el pH esperado, pues
ya que si el pH era bajo se le agregaba HCL para subirlo
Durante la prctica se logr de forma positiva la elaboracin del medio de cultivo para
tejidos vegetales, se obtuvo de igual forma el conocimiento para realizar los clculos necesarios
para aplicar a este las cantidades que se requiere para dicha elaboracin; clculos los en los
cuales se necesita de la tabla de valores asignada para cada componente.
Cuestionario
Cuestionario 1.
1. Elabore, mediante un esquema, un diseo propio para un laboratorio de cultivo de
tejidos vegetales. Tenga en cuenta y seale, con lneas de puntos, el flujo de trabajo.

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2. Seale dentro del medio de cultivo basal preparado los elementos esenciales estudiados.
a. Estn presentes todos ellos? Por qu ocurre esto?
Si estn presentes todos los elementos esenciales para el medio de cultivo; componentes
inorgnicos (macro y micronutrientes), componentes orgnicos (fuente de carbono,
vitaminas, agente solidificante.), hormonas y las sustancias reguladoras de crecimiento y
desarrollo junto tambin con el solvente comn; agua des ionizada y bidestilada. Esto se
debe a que estas sustancias y elementos qumicos son los esenciales para el desarrollo y
crecimiento de las clulas del explante y adems muchas no son capaces de sintetizarlos.
b. Qu consecuencias podra traer algn error en las cantidades pesadas de los
elementos qumicos? Justifique su respuesta.
El error en la adicin de la cantidad necesaria de un elemento nos podra causar simplemente
el no desarrollo normal del explante o bien la muerte ms concisa de este, puesto que al pasar la
concentracin del elemento o componente este causara la intoxicacin del explante matndolo o
no dejndolo llegar al desarrollo de la formacin foliar o radicular.
3. Qu son las soluciones madres o stock? Con qu fin se preparan en el laboratorio?
Cuales son los factores que debern tenerse en cuenta para su preparacin y conservacin
en laboratorio?
Podemos decir que un mtodo de hacer menos tedioso el trabajo para la elaboracin de medios
de cultivo para tejidos vegetales y de otras prcticas consiste en preparar lo que se conoce como
"soluciones madre" de algunos de estos componentes (sales minerales, Vitaminas, hormonas,
etc). Estas soluciones tienen una concentracin que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces
superior a la concentracin final del medio. Su ventaja no estriba slo en el hecho de que hay que
pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino tambin la exactitud de la pesada ya
que algunos compuestos estn tan diluidos en la solucin final, que la pesada que habra que
hacer estara por debajo de los lmites de exactitud de las balanzas de precisin.
Las soluciones madre se conservan en frigorfico (una nevera con buena refrigeracin.) y en
bote topacio (envase de vidrio color mbar) el cual con unas buenas condiciones y manejo puede
conservarnos las soluciones madre durante algunos meses, desechndose ante cualquier seal de
precipitacin.
Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminocidos, hormonas,
vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez
que se va a hacer la preparacin del medio ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no
se conservan bien en solucin.
4. Investigue sobre los pasos que continan en la preparacin del medio de cultivo final.

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La elaboracin de los medios de cultivo se realiza diluyendo las soluciones madre previamente
realizadas. Adems, se aade la fuente de carbono y el agente gelificante, que normalmente es
agar, Se pueden hacer distintos medios de cultivo manteniendo la misma concentracin de
algunas sustancias, por ejemplo sales minerales y vitaminas, y modificando o eliminando otras
como los reguladores de crecimiento.
Para preparar 1L de estos medios se realiza el siguiente proceso: Colocar en un agitador
magntico una jarra de 1 L de capacidad con unos 400 ml de agua destilada y aadir los
elementos minerales y las vitaminas: - 100 ml del stock de macronutrientes. - 100 ml del stock de
Ca, - 1 ml del stock de micronutrientes, - 10 ml de la solucin hierro EDTA ( 0.2g/L de
secuestrene) - 10 ml del stock de vitaminas. - Adicionar la cantidad estimada de las soluciones de
fitohormonas. - 30 g sacarosa y esperar a que se disuelva. - Aadir agua destilada hasta un
volumen de 1L - Colocar la mezcla en una jarra y ajustar, en un pHmetro, el pH del medio (con
KOH, NaOH HCl) hasta 5.8. - Aadir 7,5 g de agar y disolverlo en el autoclave o en
microondas. - Agitar el medio, dosificarlo en los recipientes de cultivo y colocar las tapas. Esterilizar el medio en el autoclave durante 20 min a 120o C y 1 Kg/cm2 de presin. - Dejar
enfriar el medio antes de su utilizacin.
Si algn componente fuera termolbil habra que esterilizarlo por filtracin con una jeringuilla
y un filtro de un tamao de poro menor de 0.22 m. Este proceso habra que realizarlo en una
cmara de flujo laminar y emplear material estril.
Cuestionario 2.
1. Por qu se le aade al medio el 2,4 D? A qu grupo hormonal pertenece y que funcin
realizar en el medio de cultivo? Este medio de cultivo ser para obtener plantas
completas? Justifique su respuesta.
El cido 2,4 diclorofenoxiacetico ( 2,4D) es uno de los reguladores de crecimiento y desarrollo
que se le aade a los medios de cultivo para plantas in vitro; es una auxina de caracterstica
artificial, es utilizada ms comnmente en los medios para la induccin a la formacin de callos;
es una sustancia sinttica reguladora de crecimiento que no posee estructura indolica pero que
presenta actividad auxinica, esto va a llevar a la formacin rpida y alargamiento de los tejidos,
formacin de races, en fin al desarrollo progresivo de la planta en condiciones de desarrollo
asexual (organognesis indirecta) a partir de explantes constituidos por clulas ya diferenciadas.
No habr formacin de planta completa como tal, primero deber seguir una serie de secuencias
de medios para lograr la planta completa, es decir; medios que favorezcan la caulogenesis,
formacin foliar del explante; y rizogenesis, la etapa de formacin radicular del explante.
2. Qu tipo de formacin deber esperar a partir de este medio de cultivo? Justifique su
respuesta.
Principalmente en la parte gentica el medio esta predispuesto a la variacin de este material
gentico ya que el 2,4 D es una auxina artificial que va a generar variacin gentica en el

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explante sea mutaciones, esto nos indica que las plantas no tendrn caractersticas de clones por
el contrario luego de que del callo se pase a la vitroplanta se vern diferencias tanto genotpicas
como fenotpicas en algunas especies. Habr que tener en cuenta q por ser una organognesis
indirecta deber pasar por la secuencia de medios para la formacin de la planta completa a partir
del callo formado por el explante con clulas diferenciadas.

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Bibliografa

http://ocw.uniovi.es/pluginfile.php/2621/mod_resource/content/1/practicas/Cuaderno_Pract_Biot
ec_11_OCW.pdf
http://annymojica.blogspot.com/2012/03/practica-no2-preparacion-de-soluciones.html
http://ocw.uniovi.es/pluginfile.php/2621/mod_resource/content/1/practicas/Cuaderno_Pract_Biot
ec_11_OCW.pdf
http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=35
http://www.tomate.org.mx/DemoChiles/Lecturas/Documentos/CHILES6.pdf
http://www.exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/Reguladores%20general.pdf
http://148.206.53.84/tesiuami/UAM4339.pdf

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Anexos

Figura 1 Peso de Reactivos

Figura 2 Soluciones para la preparacin de medio MS

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Figura 3 Se Afora con Agua Destilada y se agrega el azucar

Figura 4 Mezcla del Medio

Figura 5 Ajustar pH

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Figura 6 Agregar el agar, Mezclar y calentar

Figura 7 Dejar Enfriar el medio, y agregarle las vitaminas y la hormona

Figura 8 Distribuir el medio, Tapar y Rotular