PROTENAS

Las protenas son macromolculas formadas por cadenas

lineales de aminocidos
Qu es un aminocido?
Cmo se llama el enlace que une dos aminocidos?

El DNA tiene 2 funciones

REPLICARSE

TRADUCIRSE

TRANSCRIPCIN

TRADUCCIN

Figura tomada de LehningerPrinciples of Biochemistry

D.L. Nelson & M.M. Cox. Third Edition Worth Publishers.

TRANSCRIPCIN

Transferencia de la informacin
contenida en el DNA hacia una
secuencia de protenas

ARNm
ARN Polimerasa

TRADUCCIN
Se traduce el mensaje gentico del DNA
-RNAm
-RNAt
Quin aporta los aminocidos?
-Aminocidos
-Enzimas
La informacin del RNAm se organiza en
tripletes
CODN
GUC AAU UCG CUG
codn 1 codn 2

aa1

codn 3

codn 4

aa3

aa4

aa2

aa1 aa2 aa3 aa4

CODIGO GENTICO

Universal
Especfico
Continuo
Redundante

AUG Codn de inicio

Frecuencia de substituciones

Anemia Falciforme

Evolucin y diversidad de secuencias

Diversidad actual
10 millones de especies x 5,000 genes/especie
5 x1010 secuencias de protena diferentes.
Conocemos una pequea fraccin(6.7 x 107 secuencias)

Las protenas son cadenas lineales de aminocidos

Estructura secundaria
Es el plegamiento entre residuos de aminocidos cercanos
en la cadena polipeptdica.
Puentes de hidrgeno entre los grupos carbonilo (-CO) y
los amino (-NH-)
Hlices Alfa

Beta Plegada

Estructura Terciaria
Se denomina estructura terciaria de una protena a la distribucin tridimensional de todos
los tomos que constituyen la protena.
Hlices, hebras y estructuras no repetitivas como asas y giros forman dominios compactos y
globulares

Dominios
Regin compacta con mayores contactos consigo misma que con el
resto de la protena.
Unidad de plegamiento autnomo.
Unidad funcional.
Tamao promedio 200 aa.
El 49% de los dominios identificados tienen entre 51 y 150 aa.
Domino mas grande 907 aa
Hasta 13 dominios diferentes por protena

Dominios helicoidales
Manojos de cuatro hlices

Citocromo b652

Mioglobina

Hormona de crecimiento humano

Dominios beta
Compuestas principalmente por hojas antiparalelas
Conexin entre hebras adyacentes sube y baja

Barriles

Protena que une retinol

(sube y baja)

Sandwiches

Protena A Bacterioclorofila
(Sube y baja)

Dominios alfa/beta
Barriles

Hojas abiertas

Estructura Cuaternaria

STRUCTURE OF BETA-GLYCOSIDASE FROM SULFOLOBUS SOLFATARICUS

Hipertermfila

CPO
S

S
H2O2

H2O
O
4,6 Dimetil dibenzotiofeno (DMDBT)
Sulfoxido (DMDBT)

CPO
N
H

Carbazol

Cloroperoxidasa (CPO)

Cl

H2O2

H2O

Sulfona(DMDBT)

Cl

Cl

H2O2 KCl

N
H

3- Cloro carbazol

N
H

3,6 Dicloro carbazol

Capside Viral

BASES DE DATOS DE SECUENCIAS DE PROTENAS

BASES DE DATOS DE ESTRUCTURA DE PROTENAS

Protein Data Bank
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

Existen programas que nos permiten analizar las estructuras de

protenas

LAS PROTENAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO

CELULAR

FUNCIN
Catlisis
Defensa
Transporte
Soporte
Movimiento
Regulacin
Sealizacin

EJEMPLOS

LAS PROTENAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO

CELULAR

FUNCIN

EJEMPLOS

Catlisis

Enzimas : proteasas, polimerasas, cinasas

Defensa

Inmunoglobulinas, anticuerpos, toxinas

Transporte

Hemoglobina, mioglobina, canales

membranales
Colgeno, queratina
Actina, miosina
Factores de transcripcin (protenas de
unin al DNA)

Soporte
Movimiento
Regulacin
Sealizacin

Hormonas (insulina)

Propiedades de las protenas

MASA

TAMAO

Carga
Existe un pH para el cual la carga elctrica media de las
molculas es cero. Este pH se llama punto isoelctrico
(pI). El pI es el pH en el que la molcula se disocia por
igual en ambos sentidos, y como

pKa1+pKa2
PI =
2

Reconocimiento molecular

 PARA QU NECESITAMOS PURIFICAR PROTENAS?

ESTUDIAR SU FUNCIN y regulacin enzimtica
REALIZAR ANLISIS ESTRUCTURALES:
cristalografa de rayos X, espectroscopa NMR.
Estudiar sus interacciones con otras protenas o con cidos nuclecos
Para la produccin de anticuerpos

Si no se conoce el gen que codifica a la protena aislada:

La protena purificada se puede usar para determinar la secuencia de
aminocidos y por tanto la secuencia del gen que la codifica!!!!

Algo que debemos saber.

1. Seleccionar la muestra biolgica (fuente)
2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA

Muy alta > 99%

Usos terapeticos , estudios in vivo

Alta > 95-99%

Estudios estructurales, cristalografa de

rayos X, Caracterizacin fisicoqumica

Moderada > 95%

Obtencin de antigeno(s) para la

produccin de anticuerpos
Secuenciacin
Espectrometra de masas

Y cmo comienzo la purificacin?

Contar con un mtodo adecuado para la deteccin de la protena de

inters.
Monitorear el progreso de la purificacin
Cuantificacin de protena total
Detectar especficamente la protena de inters

ROTURA CELULAR

MTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR

Algunos ejemplos son:
1. Lisis celular

vlido para clulas sin pared celular como las clulas de

tejidos animales, pero no es suficiente para clulas vegetales o bacterias.

2. Destruccin mecnica

3. Lisis con detergentes

Congelacin-descongelacin, prensa de
French, sonicacin, macerado con N2
lquido

Una vez que la protena se ha extrado de su entorno natural est expuesta a

muchos agentes que pueden daarla!!!!!!.

Cmo protegemos a la protena de inters?

UTILIZAR:
Soluciones amortiguadoras
Inhibidores de proteasas
Bajas temperaturas (4C)
EVITAR
Altas temperaturas
Manipular demasiado la muestra
PROCURAR
que el proceso sea lo ms corto posible.

Algunos agentes estabilizadores son:

Mtodos de purificacin de protenas

BAJA
RESOLUCIN

ALTA
RESOLUCIN

Precipitacin con sales,

precipitacin con temperatura y pH

Mtodos cromatogrficos:
filtracin en gel, intercambio inico,
afinidad
Mtodos electroforticos:
electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante, isoelectroenfoque

Precipitacin con sales

Sal ms usada: Sulfato de Amonio

EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE

AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA LLEGAR A UN % DE
SATURACIN ESPECFICO

ALTA RESOLUCIN

Cromatografa
Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los
distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes
Muestra
aplicada Eluyente

Volumen
de columna

Matriz
Tapn
poroso

Eluyente

Protenas separadas

Cromatografa de intercambio inico

Intercambio catinico
Fase estacionaria cargada negativamente
Intercambio aninico
Fase estacionaria cargada positivamente

GRADIENTE DE CONCENTRACIN

Factores)que)afectan)a)la)retencin)
1.

Fuerza)Inica)

2.)pH)
3.)Modicadores)Orgnicos)

PRINCIPIO:(
!
Tamao(de(partcula(y(masa(molecular.(
!
Mayor(masa(molecular(eluye(primero(
!
El(gel(retiene(particuas(de(menor(masa(
molecular(
(

!
APLICACIONES!
!
!
! Desalado!de!protenas!
! Puricacin!de!protenas!
! !Determinacin!del!peso!
molecular!de!las!
protenas!

TIPOS!DE!MATRIZ!
GRANULOS!DE!UN!MATERIAL!
ESPONJOSO!E!HIDRATADO!
!

!
!

Dextranos!con!
enlaces!cruzados!
Agarosa!
Poliacridamida!

Cromatografa de Afinidad

Utiliza la alta especificidad entre las molculas biolgicas

para separar componentes especficos de mezclas
complejas.

VENTAJAS:
No hay restriccin por volumen.
Especificidad
Pureza del producto final
DESVENTAJAS:
Precio (alto)
Condiciones de elucin drsticas
Ligando especfico no disponible o inadecuado

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN
DE PROTENA
Absorcin en el ultravioleta.

Es un mtodo no destructivo.
El intervalo de concentracin que se puede determinar depende del contenido de los
aminocidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml.
La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.

Reaccin del Biuret.

Las caractersticas ms importantes de la reaccin son:

La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y protenas.
Su intervalo de determinacin es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composicin de aminocidos.
Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reaccin.
Mtodo de Lowry.

REACCIN DE BIURET + REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU

Esta coloracin se atribuye a la reduccin del cido fosfomolbdico/fosfotngstico a azul de
heteropolimolibdeno de composicin no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado,
cisteinilos e histidilos de las protenas que forman el complejo con el Cu2+.

Mtodo de BRADFORD
El intervalo de determinacin de protena es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5
-1,4 mg/ml (ensayo estndar).
La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y
aromticos.