Pontificia Universidad Catlica de Valparaso

Facultad de Ciencias Bsicas y Matemticas

Instituto de Biologa
LABORATORIO 1

MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO

El microscopio se invent, hacia 1610, por Galileo, segn los italianos, o por Jansen,
segn los holandeses. Las primeras publicaciones importantes en el campo de la
microscopia aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi observa al microscopio los
capilares sanguneos. A mediados del siglo XVII, Leenwenhoek, utilizando microscopios
simples de fabricacin propia, describi por primera vez protozoos, bacterias,
espermatozoides y glbulos rojos. Durante el siglo XVIII el microscopio sufri diversos
adelantos mecnicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no
se desarrollaron mejoras pticas. Las mejoras ms importantes de la ptica surgieron
en 1877 cuando Abbe publica su teora del microscopio y por encargo de Carl Zeiss
mejora la microscopa de inmersin sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que
permite obtener aumentos de 2000 A. A principios de los aos 30 se haba alcanzado
el lmite terico para los microscopios pticos, sin conseguir aumentos superiores a
500X o 1000X. Actualmente, el desarrollo de la ptica ha permitido mejorar la
definicin de los microscopios de luz, contando con una amplia gama de microscopios
de este tipo. Sin embargo, el lmite de resolucin de estos microscopios no permite
observar estructuras que estn a una distancia menor a 0,2 m, por lo que se han
desarrollado otros tipos de este instrumento tales como el microscopio electrnico.
Esta gua resume las partes y caractersticas del microscopio ptico compuesto, que
ser la principal herramienta utilizada durante todo el semestre para los laboratorios
de Biologa Celular.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO
El microscopio ptico ha sido por ms de dos siglos la principal herramienta de trabajo
de los bilogos.
Una clula animal tpica mide de 10 a 20 m de dimetro, lo que es unas 5 veces ms
pequeo que la partcula ms pequea visible al ojo humano desnudo. Las clulas
animales no-solo son pequeas, sino que tambin son incoloras y transparentes. La
descripcin de sus detalles internos se debe en gran parte, a que durante la ltima
parte del siglo XIX, se desarrollaron variadas tinciones que permitieron aumentar el
contraste lo suficiente como para hacer evidentes las diferentes estructuras
intracelulares.
Aunque existen diferentes tipos de microscopios, todos estn formados esencialmente
por los mismos componentes. A modo de repaso, recordaremos que sus componentes
se han agrupado en tres sistemas principales:
A. Sistema Mecnico:
Pie: Corresponde a la base de sustentacin del aparato.
Columna: sostiene el espejo o el sistema de iluminacin, el condensador, platina y el
tubo con el sistema ptico de amplificacin.
Platina: plataforma horizontal con un orificio central que permite el paso de los rayos
luminosos que atravesarn la preparacin. Consta de pinzas para sujetar la
preparacin, la que es desplazada por un carro mvil.

Tubo o Can: en su extremo superior lleva la lente ocular y en el inferior la lente

objetiva. Se denomina tubo binocular si posee dos lentes oculares.
Revlver o Tambor: Corresponde a una pieza giratoria en el extremo inferior del tubo.
Moviliza por rotacin los diferentes objetivos de que dispone el microscopio.
Tornillos de Focalizacin: los microscopios tienen dos tornillos: macromtrico el que se
utiliza para un enfoque grueso, y el micromtrico que completa el enfoque de precisin.
El tornillo micromtrico trae una escala graduada y cada marca indica un avance de
dos micrmetros (m).
B. Sistema de Iluminacin:
Fuente luminosa: Puede ser natural o artificial (luz blanca, ultravioleta, monocromtica,
etc.).
Espejo: tiene por funcin recibir la luz de la fuente luminosa y reflejarla sobre el
condensador. Cuando se usa la luz natural (difusa) se emplea la cara plana del espejo
y si la luz proviene de una fuente cercana (concentrada) se usa la cara cncava. Los
microscopios modernos no usan espejos pues su fuente de luz se ubica bajo el
condensador.
Condensador: Est formado por un sistema de lentes que enfoca la luz en el plano
superior de la preparacin. Existen condensadores de Abbe compuestos de dos lentes
(A.N.=1,20), condensadores de tres lentes (A.N.=1,40) y condensadores acromticos
corregidos de sus aberraciones esfricas y cromticas.
Diafragma Iris: Por debajo del condensador se dispone un diafragma regulable que
grada la cantidad de luz que llega a la preparacin.
Anillo porta filtro: Corresponde a un anillo de metal situado bajo el condensador en el
cual puede colocarse un filtro de color. Al usar luz artificial rica en radiaciones rojas y
amarillas de mayor longitud de onda, es recomendable el uso de filtros azules o verdes
que absorban las radiaciones de mayor longitud de onda aumentando as el poder de
resolucin del aparato.
C. Sistema de Amplificacin:
Lentes oculares. Son sistemas pticos ubicados en la parte superior del tubo del
microscopio. Consistentes en un cilindro hueco que lleva dos lentes (simples o
compuestos). La lente superior se denomina ocular y la inferior, de campo o colectora.
A veces se usan tambin los oculares de compensacin, que en combinacin con los
objetivos apocromticos corrigen la aberracin cromtica restante de los objetivos. As
el objetivo apocromtico corregido concentra ms los rayos azules, en tanto que los
oculares compensadores concentran ms los rojos. Como resultado de la interaccin la
imagen aparece incolora. Los oculares se designan por su aumento (6X, 8X, 10X, 15X,
20X). Esto es importante por cuanto el aumento del microscopio es igual al producto
del aumento del ocular por el del objetivo. En resumen, la funcin de los oculares es
aumentar la imagen real e invertida dada por el objetivo y corregir algunos defectos de
la misma, de manera que el ocular acta como una lupa formando una imagen virtual,
aumentada y derecha de la imagen real dada por el objetivo.

Lentes Objetivas: Corresponden a sistemas de lentes ubicados inmediatamente encima

del objeto o preparacin. Estas lentes dan una imagen aumentada, real e invertida.
Existen diversos tipos de objetivos, los que se clasifican segn el medio interpuesto
entre la lente y el objeto:
- Objetivos a seco: En estas lentes el medio interpuesto entre la lente y el objeto
(preparacin) es aire. Pueden ser apocromticos o corrientemente acromticos.
- Objetivos de inmersin: El medio interpuesto es un lquido viscoso transparente con
un ndice de refraccin mayor que el del aire. Existen lentes de inmersin en agua o
aceite (comnmente aceite de cedro; n = 1,515). En general este aceite tiene un n
semejante al del vidrio que cubre la preparacin (cubreobjetos) (n = 1,52). Su funcin
es concentrar los rayos que se habran perdido por refraccin en el portaobjetos.
Adems, el microscopio tal como lo conocemos hoy tiene tres caractersticas
fundamentales:
Poder de aumento: capacidad del microscopio de entregar imgenes aumentadas.
Poder de definicin: capacidad del microscopio de dar imgenes ntidas de contornos
precisos.
Poder de resolucin: capacidad del microscopio de mostrar separados dos puntos, que
a ojo desnudo parecen como juntos.
Poder de penetracin: capacidad del microscopio de mostrar a foco dos puntos que
estn en distintos planos.
Poder de aumento: el aumento de un microscopio ptico est dado por el producto
entre el aumento de la lente objetiva que se est usando y el aumento de la (o las)
lente(s) ocular(es):
Aumento Total = aumento lente objetiva X aumento lente ocular
Poder de resolucin: Al definir esta capacidad del microscopio, obligadamente debe
mencionarse el concepto de Lmite de resolucin (LR), el que se define como la mnima
distancia que debe haber entre dos puntos para que stos sean vistos como entidades separados.
Poder resolucin = 1 / LR
El LR de un microscopio puede calcularse usando la frmula de Abbe:

Esta ecuacin es vlida incluso para el ojo. El smbolo es la longitud de onda de la luz
usada para iluminar el objeto (0,5 m para luz blanca), K es una constante que
depende del ndice de refraccin del medio que hay entre el objeto y la lente objetiva
(0,61 para microscopio ptico), y AN es la apertura numrica.
Apertura Numrica (AN): Los objetos dispersan la luz. De esta manera, los rayos de luz
que chocan con un punto son dispersados, formando un cono de luz.

El ngulo de apertura, se forma entre el rayo que pasa exactamente por el centro de la
lente y el ltimo rayo que entra por la periferia de la lente objetiva. Este ngulo
permite medir la cantidad de luz que puede ingresar en el objetivo.
Si se observan los valores de AN de las diferentes lentes objetivas de un microscopio
dado, podr apreciarse que la AN aumenta con el aumento de cada lente, es as que en
la tabla siguiente se muestran los aumentos de las diferentes lentes objetivas y sus
respectivas AN.
La frmula de Abbe muestra que para aumentar la resolucin, es decir disminuir el
lmite de resolucin, se pueden manipular slo un pequeo nmero de variables: la
longitud de onda de la luz que se usa y la apertura numrica (AN) del objetivo con que
se est realizando la observacin Y es principalmente respecto a la manipulacin de la
longitud de onda donde se han hecho la mayora de las mejoras, crendose diferentes
tipos de microscopa que sern analizados ms adelante en los laboratorios.

OTROS TIPOS DE MICROSCOPA

La potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada por la longitud de
onda de la luz visible. Es por esto que surgieron nuevos instrumentos de microscopa
que modificaron tanto la forma de iluminar la muestra como la longitud de onda con la
cual se observa. Cuando las modificaciones de estos parmetros no fueron suficientes,
se idearon nuevamente otras tecnologas.
Esta gua resume algunos tipos de microscopa que existen en la actualidad, definiendo
sus fundamentos, modo de operacin y resultados visibles que cada uno de ellos
entrega.
Microscopa de fluorescencia. Las molculas fluorescentes absorben luz de una
determinada longitud de onda y emiten luz de una longitud mayor. El microscopio de
fluorescencia es capaz de detectar la emisin de estas sustancias debido a que posee 2
filtros. Uno que filtra la luz incidente, dejando pasar solo la luz de longitudes de onda
ms baja y el segundo filtra la luz transmitida dejando pasar solo la luz de longitudes
de onda mayor, as, los objetos se ven brillantes sobre un fondo oscuro. Los objetos
pueden poseer fluorescencia natural (autofluorescencia como la vitamina A) o
fluorescencia artificial mediante la adicin de colorantes como la fluorescena o la
rodamina. Este microscopio es usado en la deteccin de protenas intracelulares como
la tubulina, a travs de microinyecciones en un proceso llamado citoqumica anloga
fluorescente.
Microscopa de barrido confocal. Al observar una muestra con microscopio ptico comn
se presentan dos problemas. El primero es que el preparado debe ser extremadamente
fino y el segundo es que solo ciertas partes se observan con nitidez mientras que las
otras se perciben borrosas y poco claras. El microscopio confocal ha permitido
solucionar este problema eliminando estas reas borrosas y creando una imagen
tridimensional computarizada de alta precisin. Se basa en un sistema de barrido por
planos de la muestra en el que son eliminados todos los puntos desenfocados de la
preparacin mediante un filtro ubicado con alta precisin para que coincida con el
punto iluminado. Presenta la gran ventaja de producir imgenes tridimensionales.
Generalmente usa fluorescencia y es iluminado mediante lser.

Microscopa electrnica.
La construccin del microscopio electrnico representa un verdadero logro en cuanto a
incrementos del aumento y poder de resolucin. En principio se debe a que reemplaza
la luz visible por un haz de electrones. Lo que en teora permite obtener un poder de
resolucin muy elevado. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho
menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. La longitud
de onda ms corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 angstroms (1 angstrom es
1 x 10-10 metros). La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los
microscopios electrnicos es de alrededor de 0,5 angstroms.
Una limitacin de este tipo de microscopia es el requerimiento de utilizar alto vaco, lo
cual descarta investigaciones en clulas vivas. Existen diferentes tipos de microscopia
electrnica desarrolladas hasta este momento.
- Microscopa electrnica de Transmisin (MET). Los MET utilizan electrones acelerados
con voltajes de 30 a 100 kV y su longitud de onda es aproximadamente 100.000 veces
menor que la longitud de la luz visible. Este tipo de microscopios permiten obtener
aumentos mnimos de 1000X y aumentos mximos que pueden oscilar entre 200.000X
y 2.000.000X con una resolucin de 10 A y 1 A respectivamente. Las muestras a ser
estudiadas deben ser fijadas (ej glutaraldehido seguido de tetrxido de osmio),
deshidratadas y luego incluidas en una resina monomrica (ej epon) para poder ser
cortadas y obtener secciones ultrafinas (50-100 nm de espesor). Los cortes deben ser
ultrafinos debido a que los electrones tienen un poder de penetracin muy limitado. As
mismo, las muestras deben ser teidas con sales de metales pesados (osmio, uranio o
plomo), ya que el contraste depende del nmero de electrones dispersados y este a su
vez depende del nmero atmico de los tomos de la muestra. De esta forma se logra
que los diferentes componentes celulares aparezcan con distintos grados de contraste.
Su gran poder de aumento asociado a su excelente resolucin hacen que este
microscopio sea particularmente til para el examen de organelos celulares. Tambin
se puede visualizar el interior de las membranas celulares realizando tcnicas de
criofractura y grabado por congelacin.
- Microscopa electrnica de Alto Voltaje (MAV). El MET est limitado por escaso poder
de penetracin del haz de electrones. Esto implica la necesidad de utilizar cortes de
tejidos muy delgados. Esta limitacin se puede superar mediante el MAV cuyo haz de
electrones de 10 veces ms rico en energa que el MET.
- Microscopa estereoelectrnica. Este tipo de microscopa permite observar cortes de
tejido ms gruesos ya que el mismo preparado es fotografiado desde dos ngulos
diferentes. Si despus se analizan las fotografas mediante un estereoscopio se obtiene
un notable efecto tridimensional, en el cual la profundidad es mayor cuanto mas
grueso es el corte de tejido.
- Microscopa electrnica de barrido (MEB). Este microscopio es muy semejante al MET
pero presenta dos diferencias fundamentales: posee un haz de electrones mvil que
recorre la muestra en reas determinadas y utiliza la emisin secundaria de electrones
para la formacin de la imagen. Aqu la muestra es fijada, se seca y se cubre con una
fina pelcula de un metal pesado. A continuacin la muestra es recorrida por un haz
focalizado de electrones. Al chocar los electrones contra cada punto de la superficie
metlica los electrones se dispersan y se emplean para controlar la intensidad de un
segundo haz que se mueve sincrnicamente con el haz primario y forma una imagen
sobre una pantalla de televisin. De esta forma se produce una imagen completa y
muy aumentada de la muestra. Este microscopio proporciona una gran profundidad de

foco, lo que permite obtener excelentes imgenes tridimensionales. Sin embargo, la

resolucin alcanzada por el MEB es menor que la obtenida por el MET (10nm con un
aumento efectivo de 20.000 veces). La gran profundidad de foco y la baja resolucin
lograda por este microscopio hacen que sea particularmente til en el estudio de los
detalles superficiales de clulas o tejidos, pero no de organelos celulares

ACTIVIDAD PRCTICA
A. Cada alumno, observar una muestra de papel milimetrado con una letra impresa.
Enfocar la letra con la lupa (4,5x u otro segn el caso). Realice las siguientes
actividades.
Describa como se ve la letra (derecha, invertida, difusa, etc.)
Desplace la platina a la derecha y a la izquierda en qu direccin se mueve la letra?
Usando las lneas del papel milimetrado determine el dimetro del campo observado,
luego el radio y a partir de ste calcule el rea del campo. Repita el procedimiento a
40x
B. Se entregar a cada alumno una preparacin de hilos de colores para evaluar la
correcta colocacin en la platina y el correcto enfoque 10x.
Describa como varia la profundidad en la observacin de hilos de colores cuando se
cambia de objetivo 10x al de 40x.
Determinar con cul de los dos aumentos se obtiene:
Mayor amplitud de campo
Menor distancia de trabajo
Mayor poder de resolucin