Guia de Laboratorio Microbiologia Ambiental

Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Gua de laboratorio Microbiologa Ambiental
GUIA PRACTICA DE LABORATORIO MICROBIOLOGA AMBIENTAL

358010
JORGE ALEJANDRO RODRIGUEZ PALACIOS

DIRECTOR DE CURSO
1-2015

Los estudiantes deben consultar por su cuenta propia y basados en las referencias y
bibliografa entregada en el curso la informacin necesaria para las siguientes
prcticas. El tutor prctico guiar y despejar las dudas a los estudiantes en el
laboratorio e igualmente al final de la sesin de laboratorios realizar una evaluacin
compuesta por 3 quices los cuales sern la calificacin correspondiente a la actividad
experimentacin 2 actividad 4 del curso.
PRACTICA 1- TEORA BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
TEORA PRACTICA No.1 BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO
Los laboratorios de microbiologa estn regidos por normas de seguridad e higiene
que deben cumplirse a cabalidad para garantizar la proteccin contra infecciones de
los estudiantes u otro personal que labora en estas instalaciones, as como
garantizar la calidad de las tcnicas y la confiabilidad de los resultados.
1.1. Las siguientes medidas son de obligado cumplimiento en cualquier rea
del laboratorio:
1.1.1. El acceso al laboratorio estar limitado al personal autorizado.
1.1.2. El personal del laboratorio debe implicarse en el cumplimiento de las normas
de seguridad.
1.1.3. Todas las reas estarn debidamente marcadas con la seal de riesgo
biolgico y su nivel de contencin.
1.1.4. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la
adecuada contencin biolgica.
1.1.5. Todas las superficies de trabajo se limpiarn y desinfectarn diariamente y
siempre que se produzca un derrame.
1.1.6. Los residuos y muestras peligrosas que van a ser incinerados fuera del
laboratorio deben ser transportados en contenedores cerrados, resistentes e
impermeables siguiendo las normas especficas para cada tipo de residuo.
1.1.7. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado y no es aconsejable utilizar
los pasillos como almacn. Siempre debe quedar un espacio libre no inferior a 120
cm para poder evacuar el laboratorio en caso de emergencia.
1.1.8. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizar de tal
manera que, en caso de cada, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es
hacerlo en cajas hermticas o neveras transportables. Estas cajas o neveras
debern ser rgidas y resistentes a los golpes, contar con materiales absorbentes en
su interior y de fcil desinfeccin. Se etiquetarn o identificarn de forma oportuna y
no podrn ser utilizadas para otros fines. Bajo ningn concepto se deben transportar
las muestras a mano.
1.1.9. La ropa protectora, fcilmente ajustable y confortable, as como guantes,
gafas, etc.; debe estar disponible en todo momento. La ropa protectora de las reas
con nivel de contencin 3 (batas) nunca debe ser usada fuera del rea de trabajo y si
se quita debe de ser desechada automticamente en una bolsa de material
contaminado. Jams debe volver a ser usada.
2

1.1.10. Todo el personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel
con materiales potencialmente infecciosos. Con este fin deben usarse guantes
cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patgenos. Los
guantes siempre sern desechados antes de salir del rea de trabajo. Jams se
saldr de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se coger el telfono, se
tocarn las hojas de examen, maniguetas de las puertas, etc.
1.1.11. Tras quitarse los guantes, se realizar un lavado de manos.
1.1.12. Se usarn gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de
salpicaduras y/o aerosoles.
1.1.13. Se pondr extremo cuidado en minimizar el riesgo de auto-inoculacin y de
generacin de aerosoles.
1.1.14. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al
Supervisor y al Jefe del Laboratorio y hacerse constar por escrito.
1.1.15. Est rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizar pipeteo

automtico con material adecuado y cada trabajador ser instruido para manejarlo
debidamente.
1.1.16. En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que
el papel contaminado es de muy difcil esterilizacin.
1.1.17. No debern usarse lentes de contacto.
1.1.18. El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
1.1.19. Comer, beber, fumar y aplicarse cosmticos esta formalmente prohibido en el
rea de trabajo del laboratorio, as como el almacenamiento de comida o bebida.
1.1.20. El personal debe lavarse las manos frecuentemente durante las actividades
rutinarias, tras acabar la jornada laboral y siempre antes de abandonar el laboratorio
(almorzar). Se usar un jabn antisptico y el secado se realizar con papel.
1.1.21. Las heridas y cortes en las manos, si se han producido en el Laboratorio,
sern comunicados al responsable de la Seccin correspondiente, as como al
Supervisor de Bioseguridad que lo registrar haciendo constar todas las
circunstancias. Las heridas y cortes deben ser convenientemente vendados y
despus es imprescindible ponerse guantes.
1.2. Clasificacin de los microorganismos infecciosos por grupo de riesgo
1.2.1. Grupo de riesgo 1 (riego individual o poblacional escaso o nulo)
1.2.2. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades
en el ser humano o los animales
1.2.3. Grupo de riesgo 2 (riego individual moderado, riesgo poblacional bajo)
1.2.4. Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales
pero que tienen pocas probabilidades de entraar un riesgo grave para el personal
de laboratorio, la poblacin, el ganado o el medio ambiente. La exposicin en el
laboratorio puede provocar una infeccin grave, pero existen medidas preventivas y
teraputicas eficaces y el riesgo de propagacin es limitado.
1.2.5. Grupo de riesgo 3 (riego individual elevado, riesgo poblacional bajo)
1.2.6. Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales
graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen
medidas preventivas y teraputicas
3

eficaces.
1.2.7. Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)
Agentes patgenos que suele provocar enfermedades graves en el ser humano o los
animales y que se transmiten fcilmente de un individuo a otro, dicta o
indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y teraputicas
eficaces.
Tipos de laboratorios:
Nivel de bioseguridad 1 Laboratorio bsico
Nivel de bioseguridad 2 Laboratorio bsico
Nivel de bioseguridad 3 Laboratorio de contencin
Nivel de bioseguridad 4 Laboratorio de contencin
mxima
1.3. Cdigo de prcticas en laboratorios bsicos
1.3.1. Acceso: el smbolo y signo internacional de peligro biolgico (Figura 1) debe
colocarse en las puertas de loa locales donde se manipulen microorganismos del
grupo de riesgo 2 o superior.
1.3.2. Proteccin personal: se debe usar todo el tiempo batas o uniformes
especiales para el trabajo en el laboratorio. Usar guantes protectores apropiados con
materiales potencialmente infecciosos.
1.3.3. Procedimientos: es estrictamente prohibido pipetear con la boca. Colocarse
material y/o etiquetas en la boca. Se mantendr un registro de accidente e incidentes
que ocurren en el laboratorio. Se elaborar y seguir un procedimiento escrito para la
limpieza de todos los derrames. Los lquidos contaminados debern
descontaminarse antes de ser descartados.
1.3.4. Zona de trabajo del laboratorio: se mantendr ordenado, limpio y libre de
materiales no relacionados con el trabajo. Las superficies de trabajo deben
permanecer descontaminadas.
Las ventanas que puedan abrirse deben estar equipadas de rejillas para evitar el
ingreso de artrpodos.
1.3.5. Diseo e instalaciones del laboratorio: inicialmente se debe prestar especial
atencin a los problemas que puedan causar problemas en la bioseguridad, Entre
ellos estn: la formacin de aerosoles, el trabajo con grandes cantidades o altas
concentraciones de microorganismos, el exceso de personal o material, la infestacin
por roedores o artrpodos, la entrada de personas no autorizadas y el circuito de
trabajo.
1.4. Normas de trabajo en el laboratorio de microbiologa
1.4.1. Desinfectar el rea de trabajo
1.4.2. Prender el mechero antes de comenzar a trabajar
1.4.3. Al utilizar el asa bacteriolgica, debe calentarse en toda su extensin el
alambre a la llama del mechero hasta que se ponga roja. Este proceso debe hacerse
antes y despus del uso.
1.4.4. Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el
tapn en la mano derecha sostenido entre el dedo meique y la palma de la mano,
cerca de la llama del mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el
4

dedo ndice y el pulgar. El correcto manejo de los tubos evitara contaminaciones
cruzadas en los cultivos.
1.4.5. Flamear la boca de los tubos despus de quitarles el tapn y antes de volverlo
a colocar para evitar la formacin de aerosoles o la contaminacin del contenido del
tubo.
1.4.6. Destapar las cajas de petri manteniendo la base y la tapa simultneamente en
la mano izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero.
1.4.7. Los escobillones o baja lenguas deben quemarse en la llama del mechero, se
deja enfriar y se descarta.
1.4.8. Todo el material que se use en microbiologa de estar estril.
1.4.9. El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la
incubadora. Las cajas de Petri se marcan en el borde de la base para evitar que
tapen las superficies de los
cultivos.
FIGURA 1. Seal de advertencia de peligro biolgico para las puertas del laboratorio.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
BENSON, HAROLD J. Microbiological applications: Laboratory Manual in General
Microbiology. McGraw Hill. U.S.A. 1998.
COLLINS, C. H. and M LYNE, PATRICIA. Traduccin del ingles por Jos Mara
Tarazona
Vilas. Mtodos microbiolgicos. Editorial ACRIBIA, S. A. ZARAGOZA (Espaa).
1989.
OMS Organizacin Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en el laboratorio.
Ginebra. 2005.

IMPORTANTE: LOS ESTUDIANTES DEBEN LEER Y CUMPLIR LAS NORMAS DE
LABORATORIO, EL INCUMPLIMIENTO DE LAS MISMAS ACARREAR LA
SANCIN DE LA NOTA PRCTICA.
PRACTICA 1.1
Los estudiantes debern leer las siguientes preguntas y tener claro los conocimientos
tericos de las msmas, en la sesin de laboratorio el tutor prctico realizar una
evaluacin sobre el tema, dichas preguntas y sus respuestas deben ser entregadas
al tutor de la prctica junto con el informe final de laboratorio.
PRCTICA No. 1
DE RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO Y MATERIALES DE
MICROBIOLOGIA
1. Qu caractersticas debe reunir el vidrio utilizado para la fabricacin del material
de cristalera para los laboratorios y por qu?
2. Explique brevemente las ventajas y desventajas del uso de materiales de vidrio y
de plstico, respectivamente, en los laboratorios de microbiologa.
3. Describa, ilustre y clasifique los siguientes materiales, indicando el uso que se les
da en el laboratorio de microbiologa (Sea breve, se le sugiere elaborar un cuadro):
a) Portaobjetos
b) Cubreobjetos
c) Cajas de Petri
d) Pipetas graduadas (terminales y no terminales)
e) Pipetas Pasteur
f) Tubos de ensayo (tipos)
g) Matraces (tipos)
h) Probetas (tipos)
i) Tubos de Durham
j) Asas de inoculacin (tipos)
k) Mecheros (tipos)
l) Estufas bacteriolgicas (tipos)
m) Bao bacteriolgico
n) Horno Pasteur
o) Autoclave
p) Jarra de anaerobiosis
q) Centrfuga
r) Nefelmetro de Mac Farland
s) Membranas Millipore
t) Cuenta colonias
4. Ilustre un Microscopio ptico de campo claro con los nombres de todas sus partes.
5. Enliste detalladamente todas las medidas que se requiere tomar en cuenta para el
manejo correcto y cuidados del microscopio compuesto.
6. Enliste detalladamente todos los pasos que se requiere seguir para enfocar
imgenes en un microscopio compuesto.

7. Defina los siguientes trminos en microscopa: Lmite de resolucin, poder de
resolucin y poder de amplificacin, indicando la frmula mediante la que se calculan
cada uno.
8. Mencione los tipos de microscopio electrnico que existen actualmente y cules
son las diferencias y ventajas que usted considera ms importantes entre estos y el
microscopio ptico cuando se trabaja en un laboratorio de microbiologa.
9. Cul es la utilidad del asa recta y redonda?
10. Qu se entiende por resiembra o pase bacteriano?
PRACTICA 2
MTODOS DE SIEMBRA
PARTE A
La inoculacin de medios de cultivo para la recuperacin, mantenimiento y/o
aislamiento de microorganismos, es un procedimiento fundamental e importante.
Debe tenerse cuidado con las tcnicas de siembra microbiana para evitar en lo
posible la contaminacin por otros microorganismos diferentes al deseado.
MATERIALES
1. Muestra contaminada con microorganismos (Pueden utilizar las muestras de la
practica 3 experimentacin 1 en caso que el laboratorio CEAD, UDR, CERES, no
cuente con microorganismos para la prctica.)
2. Agua peptonada al 0,1% estril
3. Agar nutritivo en caja de Petri
4. Asa redonda
5. Gradilla
6. Mechero
7. Incubadora
8. Vinipel
9. Marcador de vidrio
PROCEDIMIENTO
1. Desinfectar el rea de trabajo, prender el mechero y preparar el material de
trabajo.
2. Coger parte de la muestra y colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua
peptonada.
Homogenizar.
3. Dejar 20 30 minutos en incubacin los tubos.
4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un circulo de papel (8 cm)
para ponerlo debajo de la caja de Petri (Figura 1)
5. Finalizado el tiempo de incubacin tomar el asa redonda y esterilizarla por calor
hasta que est est roja, dejar enfriar cerca al mechero.
6. Abrir el tubo con la muestra y tomar una asada.
7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque
nada y de no pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este
8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento.
9. Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y
envolverla en papel vinipel.
8

10. Colocar el tubo y la caja a incubar a 37C. La caja debe estar boca abajo
siempre.
11. Desinfectar el rea de trabajo, apagar el mechero y entregar el material
Figura 1. Tcnica de aislamiento de colonias
Este procedimiento se denomina aislamiento de bacterias, debido a que las bacterias

presentes en una muestra se distribuyen sobre la superficie de un agar, y cada clula
se reproduce independientemente hasta formar un conglomerado de bacterias
observables a simple vista (colonia bacteriana). De esta manera es posible observar
sobre la superficie del medio, colonias de diferentes caractersticas en cuanto a
forma, superficie, borde, forma, color, aspecto y elevacin, lo que indica
microscpicamente presencia de diferentes tipos microbianos en la muestra. As se
puede estudiar e identificar independientemente cada especie.
METODOS DE SIEMBRA PARTE B

Los microorganismos tambin pueden ser cultivados en distintos titpos de medios de
cultivo tanto lquidos como slidos, en esta parte los estudiantes debern hacer una
siemra del microorganismo en medio lquido.
Materiales
1. Muestra contaminada con microorganismos (Pueden utilizar las muestras de la
practica 3 experimentacin 1 en caso que el laboratorio CEAD, UDR, CERES, no
cuente con microorganismos para la prctica.)
2. Agua peptonada al 0,1% estril(frascos con 90 ml)
9

3. caldo nutritivo en tubo de ensayo (9ml)
4.Agar nutritivo semislido o tioglicolato en tubo de ensayo
5. Agar nutritivo slido en tubo de ensayo
6. pipeta de vidrio de 1ml
7. Asa redonda
8. Gradilla
9. Mechero
10. Incubadora
11. Vinipel
Procedimiento
1. Desinfectar el rea de trabajo, prender el mechero y preparar el material de
trabajo.
2. Coger parte de la muestra y colocarla en el frasco que contiene el agua
peptonada.
Homogenizar.
3. Dejar 20 30 minutos en incubacin .
4. tomar 1 ml de la suspensin y transferirla en el tubo que contiene el medio de
cultivo.
5. incubar a 37 por 24 horas, observar el tipo de crecimiento, a continuacin un
ejemplo.
6. anotar los resultados obtenidos.

Siembra en medio semislido.
De la misma suspensin inicial tomar con un asa recta e introducirla en dicha
suspensin, posteriormente siembre por puncin en el medio semislido como indica
a continuacin la figura.
10

Siembra en medio slido con superficie inclinada

Tomar con asa recta de la misma suspensin inicial (muestra) y proceder a realizar la
misma accin anterior, incubar y observar el crecimiento, a continuacin se ilustra un
ejemplo.
Patrones de crecimiento en medios slidos
Anotar el crecimiento que obtuvo con su microorganismo.

Siembra de Hongos
11

Los hongos son microorganismos eucariticos con condiciones de crecimiento
especiales e inters ambiental, pueden ser utilizados a nivel de industria.
Materiales
1. Cajas de Petri con agar PDA
2. Agujas de diseccin, jeringas de insulina o asa recta.
3. Hongos de cualquier gnero con crecimiento no mayor a 15 das antes de la
prctica ( en caja de Petri)
Procedimiento
1. Tome con la aguja de diseccin o asa un cuadro de la colonia fngica de no
ms de 5 mm de dimetro, intente tomar de los extremos de la colonia,
cuidadosamente coloque el cuadro en la caja de Petri con agar PDA en el
centro de la misma, incubar a 25.
NOTA: PARA LA SEGUNDA FASE DEL LABORATORIO EL MICROORGANISMO
SER UTILIZADO PARA LA REALIZACIN DE LMINAS Y OBSERVACIN DE
ESTRUCTURAS BAJO EL MICROSCPIO.
PRACTICA 3
TECNICAS DE TINCIN
MATERIALES
1. Lminas
2. Laminillas
3. Agua destilada estril
4. Asas bacteriolgicas redonda y asa recta
5. Mechero
6. Azul de metileno
7. Cristal violeta
8. Lugol
9. Alcohol cetona
10. Fucsina bsica o safranina
11. Tinta china
12. Microscopio ptico
13. Colonias aisladas de bacterias para observacin de bacterias
14. Guantes de ltex
PROCEDIMIENTO
1. Coloracin simple
a. En una lmina portaobjetos limpia, colocar una gota del agua destilada estril
(trabajo con
12

muestra slida) o una gota del cultivo bacteriano (trabajo con muestra liquida) sobre
la misma y con ayuda del asa redonda estril extender la gota de suspensin a un
rea no superior a dos
centmetros cuadrados.
b. Dejar que la preparacin se seque al aire. Fijar con calor, pasando tres veces
seguidas a travs de la llama del mechero.
c. Dejar enfriar la lmina. Lo anterior se conoce como la realizacin de un frotis y se
hace para coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las
coloraciones respectivas.
d. Colocar la preparacin sobre una rejilla encima del vertedero.
e. Cubrir la suspensin con algn colorante dado por el profesor, as:
i. Cristal violeta: 1 minuto
ii. Azul de metileno: 5 minutos
iii. Fucsina: 1 minuto
f. Terminado el tiempo de coloracin segn el colorante empleado, eliminar el
colorante lavando con agua suavemente.
g. Dejar secar y colocar la preparacin en la platina del microscopio y observar con el
objetivo de menor aumento inicialmente hasta llegar al objetivo de 100X
13

2. Coloracin compuesta
a. Realizar un frotis de la muestra seleccionada
b. Colocar en la rejilla para coloracin y cubrir el frotis con cristal violeta esperando
que transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante.
c. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis
14

d. Realizar la decoloracin con la mezcla alcohol-acetona, por 25 segundos. Lavar
inmediatamente con agua.
e. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30
segundos. Lavar con agua.
f. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las
observaciones respectivas.
Figura 2. Tincin de Gram
Distintas morfologas observadas al microscopio
15

NOTA: ANOTAR LAS MORFOLOGAS OBSERVADAS POSTERIORES A LA

COLORACIN, SI ES POSIBLE TOMAR FOTOS.
PRACTICA 4
OBSERVACIN MICROSCPICA DE HONGOS
La clula fngica es similar a cualquier organismo eucarionte, aunque existen
diferencias subcelulares entre la clula de un hongo inferior a la de uno superior.
Cuando se estudian los hongos se pueden observan dos grandes grupos: los
algodonosos, que se conocen con el nombre de mohos y otros que forman colonias
hmedas y se conocen como levaduras.
MATERIALES
1. Cultivo de hongos
2. Lminas portaobjetos
3. Laminillas
4. Azul de lactofenol
16

5. Microscpio
PROCEDIMIENTO
Colocar en el centro de la lmina portaobjeto una gota de azul de lactofenol, luego
tomar con el asa micolgica previamente esteril parte del hongo y resuspenderlo en
la gota del colorante.
Colocar luego una laminilla encima de esta preparacin y esperar 3 minutos.
Finalizado este tiempo montar al microscpio y observar en 10X y 40X.
Dibujar las siguientes caractersticas en el cuadro que corresponda.
Hifa septada
Artrocionidios
Hifa Cenoctica
Conidios
PRACTICA 5
CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
Los factores fsicos y qumicos tienen un efecto notable sobre la vida de los
microorganismos en su medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en
tanto que otros lo retardan o lo impiden. El conocimiento del efecto de esos
parmetros medio ambientales no solo permiti estudiar los microorganismos bajo
condiciones controladas de laboratorio para favorecer su crecimiento sino que
posibilit aprender la forma de controlarlos.
MATERIALES
Cultivo de un microorganismo Gram - positivo
Cultivo de un microorganismo Gram - negativo.
Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes pHs.
Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri con diferentes concentraciones de NaCl.
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Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri
Caldo nutritivo
Pipetas estriles de 1 y 2 mL
Estufa
Vaso de precipitado de 500 mL
Incubadora
PROCEDIMIENTO
1. ACCIN DE LA TEMPERATURA
Suspender una colonia del microorganismo seleccionado en el caldo nutritivo y
dejarlo por media hora para un desarrollo de los microorganismos en el medio de
cultivo. Luego tomar 0.1 mL del medio y sembrarlo sobre el medio slido del agar
nutritivo. Llevar el caldo nutritivo donde se inoculo el microorganismo a la estufa y
ponerlo a ebullicin por el tiempo dado por el profesor y sembrar como al inicio.
Llevar las dos cajas de Petri e incubarlas a 37oC.
2. ACCION DEL pH
Dividir la base de las cajas en dos cuadrantes con el marcador de vidrio y con el asa
redonda sembrar por estras en un cuadrante el microorganismo Gram-negativo y en
el otro el Grampositivo.
Realizar este procedimiento con todas los medios de diferentes pH.
3. ACCIN DE LA PRESIN OSMTICA
4. ACCIN DE LA LUZ ULTRAVIOLETA
Seguidamente tapar la mitad de la caja con papel de aluminio y colocar sobre la otra
parte de la caja la luz ultravioleta por 5 y/o 10 minutos, tapar la caja y llevar a
incubar.
PRACTICA 6
RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE
COLONIAS-UFC.
Microorganismo aerobio mesfilo son todas las bacterias, levaduras y hongos
capaces de desarrollarse en condiciones de aerobiosis a 30C. Es un parmetro que
sirve para estimar la flora total, pero sin especificar tipos de microorganismos. Es uno
de los indicadores ms tiles del estado microbiolgico de un alimento, agua, suelo
entre otros. Tiene un valor limitado como indicador de la presencia de patgenos o
sus toxinas. Altos recuentos microbianos se consideran poco aconsejables para la
mayor parte de los alimentos.
MATERIALES
1. 2 cajas de Petri estriles
2. 4 tubos de ensayo con agua peptonada al 0.1% estriles
3. 4 Pipetas de 1 mL o una pipeta automtica (100 1000 L)
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4. 1 frasco de dilucin con 90 mL de agua peptonada al 0.1%
5. 50 mL de agar nutritivo previamente preparado y atemperado a 45 - 48C
7. Incubadora a 35C
8. Contador de colonias
9. Balanza
PROCEDIMIENTO
1. Hacer diluciones de la muestra lquida de acuerdo al tipo de
producto.
Si es una muestra contaminada deben realizarse
diluciones altas
En muestras procesadas se hacen diluciones bajas
2. Sembrar en profundidad por duplicado 1 mL de cada una de las diluciones
seleccionadas
3. Adicionar de 15 20 mL del agar nutritivo a la temperatura adecuada
4. Mezclar inmediatamente el inculo con el medio, con movimientos circulares de la
placa a favor y en contra de las manecillas del reloj, como en ngulo recto. Debe
evitarse que el medio impregne la tapa.
5. Dejar solidificar, adicionar una capa sellante de 5 mL sobre la caja y dejar
solidificar nuevamente.
6. Una vez solidificado el agar, se vierten las placas e introducen en la incubadora
(35C
durante 72 horas) .7. Sacar de la incubadora y realizar el recuento
8. Lectura: se deben contar las cajas cuyo nmero de colonias est comprendido
entre 30 y 300 UFC. Es conveniente ir marcando las colonias para evitar volver a
contarlas. Hallar la media.
El nmero contado se multiplica por el factor de dilucin y los resultados se
expresarn en unidades formadoras de colonia (UFC) por mL o g, dependiendo del
tipo de alimento de partida.
9. Siempre se informan dos nmeros enteros y el resto en exponente.
PRACTICA 7
APLICACIONES DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL.
La microbiologa enfocada en la parte ambiental ha permitido diagnosticar e
implementar nuevas alternativas para el desarrollo agrcola, en el mbito de la
ingeniera ambiental y la industria.
Con los conocimientos adquiridos en el curso y teniendo un conocimiento bsico de
la microbiologa, los estudiantes realizaran las siguientes pruebas que actualmente
se utilizan a nivel mundial y especficamente en el pas.
CONTROL DE CALIDAD EN ABONOS ORGNICOS Y SUELOS POR NMERO
MS PROBABLE (NMP)
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Materiales
1. Fracsos con solucin salina 0.85% o agua peptonada al 0.1% (90 ml)
2. Tubos tapa rosca con 9 ml de solucin salina o agua peptonada al 0.1%
3. 15 tubos tapa rosca con 9 ml de caldo de cultivo LBT (Lauryl Tryptose
Broth)
4. 15 campanas durham para observar produccin de gas (dentro de los
tubos de LBT)
5. 15 tubos trapa rosca con 9 ml de caldo de cultivo LMX (FLUOROCULT)
para cultivo de E. coli
6. Reactivo de kovacs
7. Lampara U.V
8. Pipetas de vidrio de 1 ml
9. Muestra de abono orgnico (los estudiantes debern llevar la muestra,
puede ser abono orgnico comercial, lombricompost, humus etc)
Procedimiento
1. Pesar 10 gramos de la muestra, mezclarla con los 90 ml de solucin salina o
agua peptonada.
2. Realizar diluciones seriadas hasta 10-3.
3. Marcar los tubos de LBT y LMX en 3 series de 5, es decir 5 tubos marcados
como 10-1, 5 tubos marcados como 10-2, 5 tubos marcados como 10-3.
4. A partir de las diluciones sembrar 1 ml de cada dilucin en los tubos con los
dos medios.recuerden que por cada dilucin deben inocular 5 tubos de medio.
5. Incubar a 37 por 24 horas
6. Realizar la lectura, la cual se realiza contando el nmero de tubos positivos,
para el caso de coliformes fecales (LBT) se presenta turbidez y presencia de
gas en las campanas durham, sino se presentan los dos fenmenos se
tomarn como negativos)
7. Por ejemplo en la dilucin 10-1 se presentaron 3 tubos positivos, en la dilucin
10-2 1 tubo positivo, en la dilucin 10-3 0 tubos positivos, obtenindose una
combinacin de 310, con ese nmero se dirigen a la tabla de Numero mas
probable segn la EPA-1680 2006.
Deteccin de Pseudomonas en suelos
Numerosos Microorganismos son utilizados como indicadores de
contaminacin en suelos o como posibles agentes en la mitigacin de
derrames de petrleo u otros compuestos derivados del petrleo, tal es el
caso de derrames petroleros, accidentes etc.
20

Un microorganismo utilizado en biorremediacin de suelos pertenece al
gnero Pseudomonas.
Materiales
1. Frascos con 90 ml de solucin salina al 0.85% o agua peptonada al 0.1%
2. Tubos tapa rosca para diluciones con 9 ml de solucin salina al 0.85% o
agua peptonada al 0.1%
3. Cajas de Petri con agar King b o cetrimide
4. Rastrillos de vidrio
5. Pipetas de vidrio de 1 ml
6. Suelo procedente del algn sitio de derrame de petrleo o que estp
impactado por derivados del petrleo (suelos de cultivos donde se ha
fumigado) o cualquier suelo.
7. Lampara de luz UV
Procedimiento
1. Pesar 10 g de la muestra y mezclarlos con los 90 ml de solucin diluyente,
agitar bien y realizar diluciones seriadas hasta 10-6.
2. Sembrar 0.1 ml de las diluciones 102, 10-4, 106 en superficie por duplicado,
proceder a hacer siembra masiva con los rastrillos cuidando que no se
rompa el agar, incubar a 30 grados por 4 das.
3. Posterior a la incubacin con ayuda de la lmpara observar las colonias
con fluorescencia o pigmentacin azul verdosa, realizar el recuento de la
dilucin que contenga entre 30 y 300 colonias.
4. Realizar los clculos de la siguiente manera, por ejemplo, en la dilucin 106
se contaron 48 colonias, ese valor se multiplica por el factor de dilucin,
por el factor de correccin as:
48(numero de colonias contadas x106(factor de dilucin) x10(factor de correccin,
es un nmero constante)=48x108UFC/g (UFC hace referencia a unidades
formadoras de colonia)
INDICADORES DE CONTAMINACION DE AGUAS POTABLES
Los indicadores de contaminacin son utilizados para medir el grado de
contaminacin o afectacin de cuerpos de agua, agua de consumo etc, en
Colombia para el caso de aguas potables la normatividad exige un valor de
0 unidades formadoras de colonia en 100 ml de agua muestreada para el
caso de coliformes totales como indicador.
Para esta prueba si el laboratorio de su CEAD, UDR, CERES no tiene los
elementos necesarios para realizarla, debern consultar cual es la
21

normativa vigente y qu otros indicadores (microorganismos) se utilizan en
el mbito de contaminacin de aguas.
Materiales
1.
2.
3.
4.
Equipo de filtracin por membrana (equipo millipore de plstico)

Membrana de nitrocelulosa de 0.45 micrometros para filtacion.
Jeringa (para hacer vaco)
Cajas de Petri con agar Cromocult para coliformes.
Procedimiento
1. Tomar 100 ml de agua de la llave, la cual se inocular con una asada
de cultivo de E. coli, agitar muy bien.
2. Colocar la muestra en la parte superior de la campana de filtracin y
con la ayuda de la jeringa realizar el vaco para permitir el paso del
agua de un lado al otro.
3. Con unas pinzas estriles retirar la membrana y colocarla sobre el agar
cromocult, la parte de la cuadrcula debe ir mirando hacia arriba.
4. Incubar por 24 horas a 37 c y observar el nmero de colonias con las
caractersticas tpicas de E. coli y coliformes totales (consultar la
coloracin en este medio, se encuentra por internet)
NOTA: SI NO CUENTAN CON LOS MATERIALES DEBEN CONSULTAR LA
NORMATIVIDAD Y CMO SE INFORMAN LOS RESULTADOS, DEBEN
REALIZAR LOS DIBUJOS CORRESPONDIENTES A LA ACTIVIDAD.
EL INFORME DE LABORATORIO SER ENTREGADO AL TUTOR PRCTICO, EL
TUTOR PRCTICO REALIZAR LA EVALUACIN CORRESPONDIENTE A LA
PRCTICA, L SER EL ENCARGADO DE EVALUAR Y ENTREGAR LOS
PUNTOS CORRESPONDIENTES A LA ACTIVIDAD AL DIRECTOR DEL CURSO.
Muchos xtitos!!!!
22

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Distintas morfologas observadas al microscopio

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NOTA: ANOTAR LAS MORFOLOGAS OBSERVADAS POSTERIORES A LA

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