TOXICIDADE SUBCRNICA INALAO: 90 DIAS DE ESTUDOS

RESUMO
Este teste revista Guideline 413 (TG 413) foi projetado para caracterizar completamente
artigo toxicidade teste por inalao por um perodo subcrnica (90 dias), e para fornecer
dados robustos para avaliaes quantitativas de risco de inalao. Grupos de 10 do sexo
masculino e 10 do sexo feminino roedores so expostos 6 horas por dia durante um perodo
de 90 dias (13 semanas) para a) o artigo de teste em trs ou mais nveis de concentrao,
b) o ar filtrado (controlo negativo), e / ou c) o veculo (veculo de controlo). Os animais so
expostos geralmente 5 dias por semana, mas a exposio durante 7 dias por semana,
tambm permitido. Os machos e as fmeas so sempre testados, mas eles podem ser
expostos a diferentes nveis de concentrao que se saiba que um dos sexos mais
susceptvel a um determinado artigo de teste. Essa diretriz permite que o diretor de estudo a
flexibilidade para incluir grupos satlite (reversibilidade), sacrificar, lavado bronco-alveolar
(BAL), os testes neurolgicos e patologia clnica adicional e avaliaes histopatolgicas, a
fim de melhor caracterizar a toxicidade de um artigo de teste.

INTRODUO
1. Bem-estar animal 1. Diretrizes da OCDE so revistos periodicamente luz do
progresso

cientfico

consideraes

evoluo

das

necessidades

de

regulamentao. O Test Guideline inalao subcrnica originais 413 (TG 413) foi
aprovada em 1981 (1). TG 413 foi revisto para refletir o estado da cincia e atender
s necessidades regulatrias atuais e futuras.
2. Os estudos de toxicidade por inalao subcrnicos so usados principalmente
para obter concentraes de regulamentao para avaliar o risco do trabalhador em
ambientes de ocupao. Eles tambm so utilizados para avaliar residencial
humano, transporte, e risco ambiental. Esta orientao permite a caracterizao de
efeitos adversos sequncia de exposies repetidas inalao diria para um artigo
de teste durante 90 dias aproximadamente 10% do tempo de vida de um rato). Os
dados obtidos a partir de estudos de toxicidade por inalao subcrnicos pode ser
utilizado para avaliaes de risco quantitativas e para a seleo das concentraes
em estudos crnicos. Este teste Orientao no se destina especificamente para o
teste de nanomateriais. Definies utilizadas no contexto deste mtodo de ensaio
podem ser encontradas no Documento de Orientao 39 (2).

CONSIDERAES INICIAIS

3. Todas as informaes disponveis sobre o artigo de teste deve ser considerado

pelo laboratrio de ensaio antes da conduo do estudo, a fim de melhorar a
qualidade do trabalho e minimizar o uso de animais. A informao que ir auxiliar na
seleo das concentraes adequadas podem incluir o de identidade, a estrutura
qumica e propriedades fsico-qumicas do artigo de teste; resultados de qualquer in
vitro ou em testes de toxicidade in vivo; utilizao prevista (s) e potencial de
exposio humana; dados disponveis (Q) SAR e os dados toxicolgicos de
substncias estruturalmente relacionadas; e dados derivados a partir de outros
repetidos estudos de exposio. Se a neurotoxicidade esperado ou se observa no
decurso do estudo, o estudo diretor pode optar por incluir avaliaes adequadas,
como uma bateria funcional observacional (FOB) e medio da atividade motora.
Embora o calendrio de exposies em relao aos exames especficos podem ser
crticos, o desempenho dessas atividades adicionais no devem interferir com o
projeto bsico estudo.
4. As diluies de artigos de teste corrosivos ou irritantes podem ser testadas em
concentraes que produzam o grau desejado de toxicidade [veja-se GD 39 (2)]. Ao
expor os animais a esses materiais, a concentrao-alvo deve ser suficientemente
baixa para no causar dor e desconforto acentuado, no entanto suficiente para
estender a curva de concentrao-resposta para nveis que atingem o objetivo
regulamentar e cientfico do teste. Estas concentraes devem ser selecionados em
uma base caso-a-caso, de preferncia com base em um estudo para determinao
da gama projetado adequadamente que fornece informaes sobre o desfecho
crtico, qualquer limiar de irritao, e do tempo de incio (ver pontos 11-13). Deve ser
fornecida A justificativa para a concentrao.
5. Os animais moribundos ou animais, obviamente, com dor ou mostrando sinais de
sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor. Os animais
moribundos so considerados da mesma forma que os animais que morrem durante
o ensaio. Critrios para tomar a deciso de sacrificar animais moribundos ou em
sofrimento, e orientaes sobre o reconhecimento de morte previsvel ou iminente,
so objeto de um documento da OCDE Orientao sobre Humane Endpoints (3).
DESCRIO DO MTODO
Seleo das espcies animais

6. Saudveis roedores adultos jovens de estirpes laboratoriais comumente utilizados

devem ser empregadas. A espcie preferida o rato. Justificao deve ser
fornecida, se forem utilizadas outras espcies.
Preparao dos Animais
7. As fmeas devem ser nulparas e no grvidas. No dia da randomizao, os
animais devem ser jovens adultos de 7 a 9 semanas de idade. Os pesos corporais
deve ser dentro de 20% do peso mdio de cada sexo. Os animais so escolhidos
ao acaso, marcados para identificao individual, e mantidos nas suas gaiolas
durante pelo menos 5 dias antes do incio do teste para permitir a aclimatao s
condies do laboratrio.
Criao de animais domsticos
8. Os animais devem ser identificados individualmente, de preferncia com
transponders subcutneas, para facilitar as observaes e evitar confuses. A
temperatura da sala dos animais experimentais manuteno deve ser de 22 3 C.
A humidade relativa deve idealmente ser mantida na gama de 30 a 70%, embora isto
possa no ser possvel, quando utilizando a gua como veculo. Antes e depois da
exposio, os animais geralmente devem ser enjaulados em grupos por sexo e
concentrao, mas o nmero de animais em cada gaiola no deve interferir com a
observao clara de cada animal e deve minimizar as perdas devido ao canibalismo
e de luta. Quando os animais esto a ser expostos nariz-s, pode ser necessrio
para que eles ser aclimatados aos tubos de reteno. Os tubos de conteno no
devem impor fsica indevida, trmica, ou stress imobilizao dos animais. Conteno
podem afeta os resultados fisiolgicos, tais como a temperatura do corpo
(hipertermia) e / ou do volume respiratrio minuto. Se os dados genricos esto
disponveis para mostrar que no h tais mudanas ocorrem em qualquer medida
aprecivel, em seguida, pr-adaptao aos tubos de conteno no necessrio.
Os animais expostos em todo o corpo a um aerossol devem ser alojados
individualmente durante a exposio para evitar que a filtragem do teste de aerossol
atravs da pele dos seus companheiros de gaiola. Dietas convencionais de
laboratrio e certificados podem ser utilizadas, exceto durante a exposio,
acompanhada de um suprimento ilimitado de gua potvel municipal. A iluminao
deve ser artificial, com sequncias de 12 horas de luz / 12 horas de escurido.

Inalao Chambers
9. A natureza do artigo de teste e o objeto do teste deve ser considerado na escolha
de uma cmara de inalao. O modo preferido de exposio de nariz-only (termo
que inclui a cabea-only, nariz-only, ou focinho-only). Exposio apenas do nariz-se
geralmente preferido para estudos de aerossis lquidos ou slidos e para os
vapores que podem condensar para formar aerossis. Objetivos especiais do estudo
pode ser melhor alcanado atravs de um modo de corpo inteiro de exposio, mas
isso deve ser justificada no relatrio do estudo. Para assegurar a estabilidade
atmosfera quando se utiliza uma cmara de todo o corpo, o volume total dos animais
de ensaio no deve exceder 5% do volume da cmara. Princpios do nariz apenas e
integrais tcnicas de exposio do corpo e suas vantagens e desvantagens
especficas so abordadas no GD 39 (2).
OS ESTUDOS DE TOXICIDADE
Limitar as concentraes
10. Ao contrrio dos estudos de toxicidade aguda, no h concentraes-limite
definidos em estudos de toxicidade por inalao subcrnicos. A concentrao
mxima testada deve considerar: 1) a concentrao mxima alcanvel, 2) o "pior
caso" nvel de exposio humana, 3) a necessidade de manter um suprimento
adequado de oxignio e / ou 4) as consideraes de bem-estar animal. Na ausncia
de limites base de dados, podem ser utilizados os limites agudas do sistema global
harmonizado de classificao e rotulagem de produtos qumicos das Naes Unidas
(isto , at uma concentrao mxima de 5 mg / L para aerossis, 20 mg / L para os
vapores e 20.000 ppm para gases); referem-se a GD 39 (2). Dever ser
devidamente justificada se for necessrio para ultrapassar esses limites ao testar
gases ou artigos de teste altamente volteis (por exemplo, refrigerantes). A
concentrao limite deve provocar toxicidade inequvoca, sem causar estresse
indevido aos animais ou que afetem a sua longevidade (3).
Range-Finding Estudo
11. Antes de comear com o estudo principal, geralmente necessria a realizao
de um estudo para determinao da gama. Um estudo para determinao da gama
mais abrangente do que um estudo de observao, pois no se limita a seleo

concentrao. Conhecimento aprendido a partir de um estudo para determinao da

gama pode levar a um estudo principal de sucesso. Um estudo para determinao
da gama pode, por exemplo, fornecer informaes tcnicas sobre mtodos de
anlise, dimensionamento de partculas, a descoberta de mecanismos txicos,
patologia clnica e dados histopatolgicos, e estimativas do que pode ser
concentraes NOAEL e MTC em um estudo principal. O director do estudo pode
optar por usar o estudo para determinao da gama de identificar o limiar de
irritao das vias respiratrias (por exemplo, com histopatologia do trato respiratrio,
teste de funo pulmonar, ou lavagem ronchoalveolar), a concentrao superior, que
tolerada sem esforo imprprio para os animais, e os parmetros que melhor
caracterizam a toxicidade de um artigo de teste. 12. Um estudo de determinao de
gama pode ser constituda por um ou vrios nveis de concentrao. Dependendo
dos pontos de extremidade escolhidas, 05:57 machos e de trs a seis do sexo
feminino deve ser exposta a cada nvel de concentrao. Um estudo para
determinao da gama deve durar um mnimo de 5 dias e geralmente no mais de
28 dias. A justificativa para a escolha das concentraes para o estudo principal
devem ser fornecidas no relatrio do estudo. O objetivo principal do estudo
demonstrar uma relao concentrao-resposta com base no que est previsto para
ser o ponto de extremidade mais sensvel. A baixa concentrao deve ser
idealmente uma concentrao efeito noobserved-adverso, enquanto a alta
concentrao deve provocar toxicidade inequvoca, sem causar estresse indevido
aos animais ou que afetem a sua longevidade (3).
13. Ao selecionar nveis de concentrao para o estudo de determinao de gama,
todas as informaes disponveis devem ser consideradas inclusive as relaes
estrutura-atividade e os dados relativos a produtos qumicos semelhantes (ver ponto
3). Um estudo gama-descoberta pode verificar / refutar o que so considerados os
pontos de extremidade baseados mecanicamente mais sensveis, por exemplo,
inibio da colinesterase por organofosforados, formao de metahemoglobina por
agentes erythrocytotoxic, hormnios tireoidianos (T3, T4) para hyrotoxicants,
protenas, HDL, ou neutrfilos no lavado bronco-alveolar de partculas pouco
solveis incuos ou aerossis irritantes pulmonares.
Estudo Principal

14. O principal estudo de toxicidade subcrnica geralmente consiste de trs nveis

de concentrao, e tambm negativo concorrente (ar) e / ou comandos do veculo,
conforme necessrio (ver pargrafo 18). Todos os dados disponveis devem ser
utilizados para ajudar a seleo dos nveis de exposio adequadas, incluindo os
resultados de estudos de toxicidade sistmica, metabolismo e cintica (nfase
especial deve ser dada para evitar a alta os nveis de concentrao que saturam
processos cinticos). Cada grupo de teste contm 10 do sexo masculino e 10 do
sexo feminino roedores que so expostos ao artigo de teste para 6 horas por dia em
a 5 dias por cada semana por um perodo de 13 semanas (durao total de pelo
menos 90 dias). Os animais tambm podem ser expostos 7 dias por semana (v.g. ao
testar medicamentos inalatrios). Se um dos sexos conhecido por ser mais
susceptveis a um determinado artigo de teste, os sexos podem ser expostos a
diferentes nveis de concentrao, a fim de optimizar a concentrao-resposta, como
descrito no ponto 15. Se as espcies de roedores que no sejam os ratos so
expostos nariz-only, duraes mximos de exposio pode ser ajustado para
minimizar o sofrimento especfica da espcie. A lgica deve ser fornecida ao utilizar
um perodo de exposio inferior a 6 horas / dia, ou quando necessrio proceder a
uma longa durao (por exemplo, 22 horas / dia) de estudo exposio de todo o
organismo (referem-se a GD 39)
(2). Alimentao deve ser suspenso durante o perodo de exposio, a menos que a
exposio superior a 6 horas. A gua pode ser fornecida ao longo de uma exposio
de todo o organismo.
15. As concentraes alvo selecionados devem identificar o rgo alvo (s) e
demonstrar uma concentrao-resposta clara:
O elevado nvel de concentrao deve resultar em efeitos txicos, mas no causar
sinais persistentes ou letalidade que impeam uma avaliao pertinente.
O nvel de concentrao intermediria (s) deve ser suficientemente espaadas para
produzir uma gradao dos efeitos txicos que entre a concentrao de baixa e alta.
O nvel de concentrao mais baixa deve produzir pouca ou nenhuma evidncia de
toxicidade.
Sacrifcios provisrias

16. Se planear sacrificar, o nmero de animais em cada nvel de exposio deve ser
aumentado pelo nmero de ser sacrificado antes da concluso do estudo. Deve ser
apresentado o justificativa para o uso de sacrifcios intermdios, e as anlises
estatsticas devem corretamente responsveis por eles.
Satellite (reversibilidade) Estudo
17.

Um

estudo

satlite

(reversibilidade)

pode

ser

usado

para

observar

reversibilidade, persistncia ou aparecimento tardio de toxicidade por um perodo de

ps-tratamento de um comprimento adequado, mas no inferior a 14 dias. Grupos
(reversibilidade) Satlite composto por 10 machos e 10 fmeas expostas
simultaneamente com
os animais experimentais no estudo principal. Satellite (reversibilidade) grupos de
estudo devem ser expostos ao produto em estudo ao nvel de concentrao mais
alta e deve haver controles de ar e / ou veculos simultneos conforme necessrio
(ver pargrafo 18).
Animais de controle
18. Simultneas animais (ar) de controlo negativo devem ser manuseados de forma
idntica para os animais do grupo de teste, exceto que eles esto expostos ao ar
filtrado em vez de artigo de teste. Quando a gua ou uma outra substncia
utilizada para ajudar a gerar a atmosfera de ensaio, um grupo de controlo de veculo,
em vez de um negativo (ar) grupo de controlo, devem ser includos no estudo. A
gua deve ser utilizada como o veculo sempre que possvel. Quando a gua
utilizada como o veculo, os animais de controlo devem ser expostos ao ar com a
mesma humildade relativa que os grupos expostos. A escolha de um veculo
adequado deve basear-se numa pr-estudo conduzido apropriadamente ou dados
histricos. Se a toxicidade de um veculo no bem conhecida, o diretor de estudo
pode optar por usar tanto uma (ar) controle negativo e um controle do veculo, mas
este fortemente desencorajada. Se os dados histricos revelam que um veculo
no txico, ento no h necessidade de um (Ar) do grupo de controlo negativo e
um controlo de veculo s deve ser usado. Se um pr-estudo de um teste artigo
formulados em um veculo no revela qualquer toxicidade, segue-se que o veculo
no txico na concentrao testada e este controla com o veculo deve ser usado.

CONDIES DE EXPOSIO
A administrao de concentraes
19. Os animais so expostos para o artigo de teste como um gs, vapor, aerossol,
ou uma mistura dos mesmos. O estado fsico para ser testado depende das
propriedades fsico-qumicas do produto em estudo, as concentraes selecionadas,
e / ou a forma fsica provavelmente presente durante o manuseamento e utilizao
do teste artigo. Artigos de teste higroscpico e quimicamente reativos devem ser
testados em condies de ar seco. Cuidados devem ser tomados para evitar a
gerao de concentraes explosivas. Materiais em partculas podem ser
submetidas a processos mecnicos para reduzir a dimenso das partculas. Outras
orientaes so fornecidas no GD 39 (2).
Distribuio do Tamanho das Partculas
20. dimensionamento de partculas deve ser realizada em todos os aerossis e para
os vapores que podem se condensam para formar aerossis. Para permitir a
exposio de todas as regies relevantes do tracto respiratrio, os aerossis com
dimetros aerodinmicos mdios de massa (DAMM) que variam de 1 a 3 um com
um desvio padro geomtrico (g) na gama de 1,5 a 3,0 so recomendadas (4).
Apesar de um esforo razovel deve ser feito para cumprir esta norma, o julgamento
de peritos deve ser fornecido, se no puder ser alcanado. Por exemplo, partculas
de fumos metlicos ser menor do que esse padro, e de partculas carregadas e
fibras podem ultrapass-lo.
Artigo em teste num veculo Preparao
21. Idealmente, o artigo de teste devem ser testados sem um veculo. Se for
necessrio utilizar um veculo para gerar uma concentrao de artigo de teste e o
tamanho da partcula, deve ser dada preferncia gua apropriado. Sempre que um
produto de teste dissolvida num veculo, a sua estabilidade deve ser demonstrada.
MONITORAMENTO DAS CONDIES DE EXPOSIO
Cmara Airflow

22. O fluxo de ar atravs da cmara de exposio deve ser cuidadosamente

controlados, monitorizados continuamente, e gravada pelo menos de hora em hora
durante cada exposio. A monitorizao em tempo real da concentrao atmosfera
de ensaio (ou estabilidade temporal) uma medio integral de todos os parmetros
dinmicos e fornece um meio indirecto para controlar todos os parmetros
relevantes para inalao dinmicas. Se a concentrao monitorado em tempo real,
a frequncia de medio de fluxos de ar pode ser reduzido a uma nica medio por
exposio por dia. Uma ateno especial deve ser dada a evitar reinalao em
cmaras s de nariz. A concentrao de oxignio deve ser pelo menos 19% e a
concentrao de dixido de carbono no deve exceder 1%. Se houver razes para
crer que esta norma no pode ser cumprido, as concentraes de oxignio e dixido
de carbono devem ser medidos. Se as medies no primeiro dia de exposio
mostram que estes gases esto em nveis apropriados, no h outras medies
devem ser necessrias.
Cmara de Temperatura e Umidade Relativa
Temperatura 23. Cmara deve ser mantida a 22 3 C. Umidade relativa do ar na
zona de respirao dos animais, tanto para o nariz apenas e de corpo inteiro
exposies, deve ser continuamente monitorado e gravado por hora durante cada
exposio, sempre que possvel. A humidade relativa deve ser preferencialmente
mantida na gama de 30 a 70%, mas esta pode tanto ser inatingvel (por exemplo, ao
testar as formulaes base de gua) ou no mensurvel devido interferncia de
artigo de teste com o mtodo de ensaio.
Artigo de Teste: Concentrao nominal
24. Sempre que possvel, a concentrao nominal cmara de exposio devem ser
calculados e registrados. A concentrao nominal a massa do artigo de teste
gerado dividido pelo volume total de ar que passa atravs do sistema de cmara de
inalao. A concentrao nominal no utilizado para caracterizar a exposio dos
animais, mas a comparao da concentrao nominal e a concentrao real d uma
indicao da eficincia da gerao do sistema de teste, e, portanto, pode ser
utilizado para descobrir problemas de gerao.
Teste do artigo: Concentrao Efetiva

25. A concentrao atual a concentrao artigo de teste como amostrado a zona

de respirao dos animais em uma cmara de inalao. Concentraes reais podem
ser obtidas atravs de mtodos especficos (por exemplo, a amostragem direta,
adsoro ou mtodos reativos qumicos e caracterizao analtica posterior) ou por
mtodos no-especficas, tais como anlise de filtro gravimtrico. O uso da anlise
gravimtrica aceitvel apenas para aerossis de p nico componente ou
aerossis de lquidos de baixa volatilidade e deve ser apoiada por caracterizaes
adequadas especficas de artigo de teste de pr-estudo. Concentrao de aerossol
de p multi-componente pode tambm ser determinada por anlise gravimtrica. No
entanto, este requer dados analticos que demonstram que a composio do
material transportado pelo ar semelhante ao material de partida. Se esta
informao no estiver disponvel, uma re-anlise do material de teste (de
preferncia, no seu estado no ar), a intervalos regulares durante o curso do estudo,
pode ser necessrio. Para os agentes de aerossol que pode evaporar ou sublimar,
deve ser demonstrado que todas as fases foram recolhidas atravs do mtodo
escolhido.
26. Um lote de artigo de teste deve ser usado durante todo o perodo de durao do
estudo, se possvel, e a amostra de teste deve ser armazenado sob condies que
mantm a sua pureza, homogeneidade e estabilidade. Antes do incio do estudo,
deve haver uma caracterizao do artigo de teste, incluindo a sua pureza e, se
tecnicamente possvel, a identidade, e as quantidades de contaminantes
identificados e impurezas. Esta pode ser demonstrada por, mas no est limitado a,
os seguintes dados: tempo de reteno e rea do pico relativo, o peso molecular a
partir de espectroscopia de massa ou por cromatografia de gs analisa, ou outras
estimativas.
Embora no seja o de identificar amostra de teste de responsabilidade do laboratrio
de teste, pode ser prudente para o laboratrio de teste para confirmar a
caracterizao da patrocinadora, pelo menos, de uma forma limitada (por exemplo,
cor, natureza fsica, etc.).
27. A atmosfera de exposio deve ser realizada o mais constantes possvel. Um
dispositivo de monitorizao em tempo real, tal como um fotmetro de aerossol para
aerossis ou um analisador de hidrocarbonetos total de vapores, podem ser
utilizados

para

demonstrar

estabilidade

das

condies

de

exposio.

Concentrao real cmara deve ser medido pelo menos 3 vezes durante cada dia de

exposio para cada nvel de exposio. Se no for possvel devido a taxas de fluxo
de ar limitadas ou baixas concentraes, uma amostra por perodo de exposio
aceitvel. Idealmente, esta amostra deve, ento, ser recolhidos ao longo de todo o
perodo de exposio. Amostras de concentrao de cmara individuais devem
desviar-se da cmara de concentrao mdia de no mais do que 10% para os
gases e vapores, e por no mais do que 20% para aerossis lquidos ou slidos.
Tempo para atingir o equilbrio cmara (t95) devem ser calculados e comunicados. A
durao da exposio estende o tempo em que o artigo de teste gerada. Isso leva
em conta os tempos necessrios para atingir o equilbrio cmara (t95) e decadncia.
Orientao para estimar t95 pode ser encontrado em GD 39 (2).
28. Para misturas muito complexas consistindo de gases/vapores e aerossis (por
exemplo, atmosferas de combusto e artigos de teste propulsionadas de produtos
de uso final com propsitos/dispositivos), cada fase pode se comportar de maneira
diferente em uma cmara de inalao. Por conseguinte, pelo menos uma substncia
indicadora (analito), normalmente o princpio ativo na formulao do produto testado,
de cada uma das fases (gs / vapor e aerossol) deve ser selecionado. Quando o
artigo de teste uma mistura (por exemplo, uma formulao), a concentrao
analtica deve ser reportada para a formulao total, e no apenas para o
ingrediente ativo ou do componente (analito). Informaes adicionais sobre as
concentraes reais podem ser encontrados em GD 39 (2).
Artigo de Teste: Distribuio de Tamanho de Partculas
29. A distribuio do tamanho das partculas dos aerossis deve ser determinada
pelo menos semanalmente para cada nvel de concentrao usando um impacto em
cascata ou um instrumento alternativo, tal como um dimensionador de partcula
aerodinmico (APS). Se equivalncia dos resultados obtidos por um impacto em
cascata e a alternativa
instrumento pode ser mostrado, em seguida, o instrumento alternativo pode ser
usado durante todo o estudo.
30. Um segundo dispositivo tal como um filtro gravimtrico ou um borbulhador
impinger / gs, deve ser usado em paralelo com o instrumento principal para

confirmar a eficincia de recolha do instrumento primrio. A concentrao de massa

obtida por anlise de tamanho de partcula deve estar dentro dos limites razoveis
da concentrao em massa obtida por anlise de filtro [ver GD 39 (2)]. Se
equivalncia pode ser demonstrada em todas as concentraes testadas na fase
inicial do estudo, em seguida, ainda mais medies de confirmao podem ser
omitidas. Por uma questo de bem-estar animal, devem ser tomadas medidas para
minimizar os dados conclusivos que possam levar a uma necessidade de repetir um
estudo.
31. Partcula de dimensionamento deve ser realizada para os vapores se h
qualquer possibilidade de que a condensao do vapor pode resultar na formao
de um aerossol, ou se as partculas forem detectadas em uma atmosfera de vapor
com potencial de fases mistas.
OBSERVAES
32. Os animais devem ser clinicamente observados antes, durante e aps o perodo
de exposio. Mais observaes frequentes podem ser indicadas, dependendo da
resposta dos animais durante a exposio. Quando a observao de animais
dificultada pelo uso de tubos de conteno do animal, cmaras de corpo inteiro com
pouca iluminao, ou atmosferas opacas, os animais devem ser cuidadosamente
observados aps a exposio. Observaes antes da exposio do dia seguinte
podem avaliar qualquer reversibilidade ou exacerbao de efeitos txicos.
33. Todas as observaes so registradas com registros individuais sendo mantido
para cada animal. Quando os animais so mortos por razes humanitrias ou
encontrados morto, no momento da morte deve ser registrado com a maior preciso
possvel.
34. Observaes do lado da gaiola devem incluir alteraes na pele e da pele, olhos
e mucosas; mudanas nos sistemas respiratrio e circulatrio; alteraes do sistema
nervoso; e mudanas na atividade somatomotor e padres de comportamento. A
ateno deve ser dirigida observao de tremores, convulses, salivao, diarreia,
letargia, sono e coma. A medio da temperatura retal pode fornecer evidncia de
suporte da bradipneia reflexo ou hipo / hipertermia relacionados com o tratamento ou
confinamento. Avaliaes adicionais podem ser includas no protocolo de estudo,

tais como cintica, biocontrolo, a funo pulmonar, a reteno de materiais

fracamente solveis que se acumulam no tecido pulmonar e alteraes
comportamentais.
OS PESOS CORPORAIS
35. pesos a cada animal devem ser registrados pouco antes da primeira exposio
(dia 0), duas vezes por semana depois (por exemplo: s sextas-feiras e segundasfeiras para demonstrar a recuperao ao longo de um fim de semana livre de
exposio, ou em um intervalo de tempo para permitir a avaliao da toxicidade
sistmica), e no momento da morte ou eutansia. Se no h nenhum efeito nas
primeiras 4 semanas, os pesos corporais podem ser medidos semanalmente
durante o perodo restante do estudo. Satlite (reversibilidade) animais (se utilizado)
dever continuar a ser pesados semanalmente durante o perodo de recuperao.
No final do estudo, todos os animais devem ser pesados, pouco antes de serem
sacrificados para permitir a um rgo de imparcial calculada para propores de
peso corporal.
ALIMENTOS E GUA CONSUMO
36. O consumo de alimentos deve ser medido semanalmente. O consumo de gua
pode tambm ser medido.
PATOLOGIA CLNICA
37. Avaliaes de patologia clnica deve ser feita para todos os animais, incluindo
controles e (reversibilidade) animais de satlite, quando eles so sacrificados. O
intervalo de tempo entre o final da exposio e de recolha de sangue deve ser
gravado, particularmente quando a reconstituio do ponto final abordado rpida.
Amostragem aps o final da exposio indicado para esses parmetros com uma
meia-hora plasma curto (por exemplo, COHb, CHE, e MetHb)
38. A Tabela 1 apresenta os parmetros de patologia clnica que geralmente so
necessrias para que os estudos de toxicologia. O exame de urina no necessrio
numa base de rotina, mas pode ser realizada quando considerada til com base na
toxicidade esperada ou observada. Os diretores do estudo podem optar por avaliar

parmetros adicionais, a fim de melhor caracterizar a toxicidade de um artigo de

teste (por exemplo, de colinesterase, lpidos, hormonas, equilbrio cido / base,
rgos de meta-hemoglobina ou Heinz, creatina quinase, relao mielide / eritride,
troponina, gasometria arterial, lactato desidrogenase, sorbital desidrogenase,
glutamato desidrogenase, e gama glutamil transferase).
Tabela 1. Parmetros padro de Patologia Clnica
Contagem de eritrcito
Hematcrito
Concentrao de hemoglobina
Hemoglobina corpuscular mdia
Volume corpuscular mdia
Hemoglobina corpuscular mdia
Concentrao
Reticulcitos
glicose *
O colesterol total)
Triglicerdeos
Uria
bilirrubina total
Creatinina
A protena total
Albumina
Globulina

Hematologia
A contagem total de leuccitos
Contagem diferencial de leuccitos
A contagem de plaquetas
Potencial de coagulao (escolher um):
O tempo de protrombina
O tempo de coagulao
Tempo de tromboplastina parcial
Qumica Clnica
alanina aminotransferase
aspartato aminotransferase
fosfatase alcalina
potssio
Sdio
Clcio
Fsforo
Cloreto

O exame de urina (opcional)

Aspecto (cor e turbidez)
A protena total
Volume
Glicose
Gravidade ou da presso osmtica As clulas do sangue / sangue
especifica
pH

* Porque um perodo de jejum prolongado pode introduzir vis em medies de

glicose para o tratado versus animais controle, o diretor do estudo deve determinar
se apropriado para jejuar os animais. Se um perodo de jejum usado, ele deve
ser apropriado para as espcies utilizadas; para o rato pode ser de 16 h (de jejum
durante a noite). Determinao da glicemia de jejum pode ser levada a cabo, aps
um jejum durante a ltima semana de exposio, ou aps um jejum durante a noite
antes da necropsia (neste ltimo caso, em conjunto com todos os outros parmetros
de patologia clnica).
39. Quando h evidncias de que o trato respiratrio inferior (isto , os alvolos) o
principal local de deposio e reteno, em seguida, a lavagem bronco alveolar
(LBA) pode ser a tcnica escolhida para analisar quantitativamente parmetros

dose-efeito baseada em hipteses focando alveolite, inflamao pulmonar e

fosfolipidose. Isto permite uma dose-resposta e mudanas de curso de tempo de
leso alveolar ser adequadamente sondadas. O LBA podem ser analisados para
contagem de leuccitos total e diferencial, protena total, e lactado desidrogenase.
Outros parmetros que podem ser considerados so os que indicativa de leso
lisossomal, fosfolipidose, fibrose, e inflamao alrgica ou irritante, que pode incluir
a

determinao

de

citoquinas

pr-inflamatrias/quimiocinas.

Medies

LBA

geralmente complementar os resultados dos exames histopatolgicos, mas no

podem substitu-los. Orientaes sobre como realizar a lavagem pulmonar pode ser
encontrada em GD 39. (2)
EXAME OFTALMOLGICO
40. Usando um oftalmoscpio ou um dispositivo equivalente, exames oftalmolgicos
do fundo de olho, meios de refrao, ris e conjuntivas deve ser realizada para todos
os animais antes da administrao do artigo de teste, e para todos de alta
concentrao e grupos de controle na resciso. Se forem detectadas alteraes nos
olhos, todos os animais dos outros grupos devem ser examinados, incluindo o
(reversibilidade) grupo satlite.
PATOLOGIA E RGO BRUTA PESOS
41. Todos os animais de teste, incluindo os que morreram durante o ensaio ou que
foram retirados do estudo por razes de bem-estar animal, devem ser submetidos a
completar exsanguination (se possvel) e autpsia. O tempo entre o fim da ltima
exposio de cada animal e o seu sacrifcio deve ser gravado. Se a necropsia no
pode ser realizada imediatamente aps um animal morto descoberto, o animal
deve ser refrigerado (no congelada), a uma temperatura suficientemente baixa para
minimizar a autlise. Necropsias devem ser realizadas o mais rapidamente possvel,
normalmente dentro de um dia ou dois. As alteraes patolgicas devem ser
registradas para cada animal, com especial ateno para as alteraes nas vias
respiratrias.
42. A Tabela 2 lista os rgos e tecidos que devem ser conservados em meio
adequado durante a autpsia para exame histopatolgico. A preservao dos [entre
colchetes] rgos e tecidos e de quaisquer outros rgos e tecidos a critrio do

diretor do estudo. Os rgos em negrito devem ser aparadas e pesava molhar o

mais rapidamente possvel aps a dissecao para evitar a secagem. A tireoide e
epiddimos s deve ser pesado, se necessrio, porque o corte artefatos podem
dificultar a avaliao histopatolgica. Tecidos e rgos devem ser fixados em
formalina a 10% tamponada ou outro fixador adequado logo que necropsia
realizada, e no menos do que 24-48 horas antes do corte de acordo com o fixador
para ser utilizado.
Tabela 2. rgos e tecidos conservados durante a necropsia Gross
Adrenais
Aorta
A medula ssea (e / ou aspirado fresco)
Crebro (incluindo seces de crebro, cerebelo, e medula / pons)
Ceco
Clon
Duodeno
[Epiddimos]
[Olhos (retina, nervo ptico) e plpebras]
Fmur e sufocar conjunta
Vescula biliar (quando presente)
[Harderian glndulas]
Corao
leo
Jejuno
Rins
[Glndulas lacrimais (extraorbital)]
Laringe (3 nveis, incluindo a base da epiglote)
Fgado
Pulmo (todos os lobos em um nvel, incluindo brnquios principais)
Gnglios linfticos da regio hilar do pulmo,especialmente para o ensaio de
partculas pouco solvel materiais. Para mais nos exames de profundidade e / ou
estudos com foco imunolgica, linfa adicional nodos podem ser considerados, por
exemplo, aqueles do mediastino, cervical / submandibular e / ou auricular regies.
Linfonodos (distais a partir da entrada portal-de-)
Glndula mamria (feminino)
Msculo (coxa)
Tecidos nasofarngeas (pelo menos 4 nveis; um nvel para incluem o duto da
nasofaringe e a nasal Associated Lymphoid Tissue (NALT))
Esfago
[Bulbo olfatrio]
Ovrios
Pncreas
Paratireides
Nervos perifricos (citico ou tibial,
de preferncia perto do msculo)
Pituitrio

Prstata
Reto
Glndulas salivares
Vesculas seminais
Pele
Medula espinhal (cervical, mdio-torcico, e lombar)
Bao
Esterno
Estmago
Teeth
Testes
Thymus
Tireides
[Lngua]
Traquia (pelo menos 2 nveis, incluindo uma seco longitudinal atravs do carina e
uma seo transversal)
[Ureter]
[Uretra]
Bexiga urinria
tero
Os rgos-alvo
Todas as leses macroscpicas e massas
43. Os pulmes devem ser removidos intactos, pesados, e instilado com um fixador
adequado, a uma presso de 20-30 cm de gua para assegurar que mantida a
estrutura do pulmo (5). Sees devem ser recolhidos para todos os lobos em um
nvel, incluindo brnquios principais, mas se a lavagem pulmonar realizada, o lobo
unlavaged deveria ser seccionada em trs nveis (no cortes seriados).
44. Pelo menos quatro nveis de os tecidos da nasofaringe deve ser examinado,
uma das quais dever incluir a conduta da nasofaringe (5) (6) (7) (8) (9) para permitir
o exame adequado do escamoso, de transio (no-ciliado respiratrio),
respiratrias (respiratria ciliadas) e epitlio olfativo, eo tecido drenagem linftica
(NALT) (10) (11). Trs nveis da laringe devem ser examinados, e um destes nveis
deve incluir a base da epiglote (12). Pelo menos dois nveis de traqueia deve ser
examinado, incluindo uma seco longitudinal atravs da carina da bifurcao da
seco transversal e uma brnquios extrapulmonares.
HISTOPATOLOGIA

45. A avaliao histopatolgica de todos os rgos e tecidos listados na Tabela 2

deve ser realizada para os grupos de controle e de alta concentrao, e para todos
os animais que morrem ou so sacrificados durante o estudo. Particular ateno
deve ser dada para o trato respiratrio, os rgos-alvo, e as leses graves. Os
rgos e tecidos que apresentam leses no grupo de alta concentrao devem ser
examinados em todos os grupos. O diretor do estudo podem optar por realizar
avaliaes histopatolgicas para grupos adicionais para demonstrar uma resposta
clara concentrao. Quando um (reversibilidade) grupo satlite usado, avaliao
histopatolgica deve ser realizada em todos os tecidos e rgos que apresentaram
efeitos identificados nos grupos tratados. Se houver mortes precoces excessivas ou
outros problemas do grupo de alta exposio que comprometem o significado dos
dados,

seguinte

concentrao

mais

baixa

deve

ser

examinada

histopatologicamente. Deve ser feita uma tentativa de correlacionar observaes

brutas com achados microscpicos.
Relatrio
Dados
Devem ser fornecidos
46. Dados individuais dos animais em pesos corporais, o consumo de alimentos,
patologia clnica, patologia grave, peso dos rgos, e histopatolgica. Dados de
observao clnicos devem ser resumidos num quadro que indique, para cada
experincia, o nmero de animais utilizados, o nmero de animais que apresentam
sinais especficos de toxicidade, o nmero de animais encontrados mortos durante o
ensaio ou abatidos por interveno humana, data da morte do indivduo animais,
uma descrio e tempo de percurso de efeitos e reversibilidade txicos, e os
resultados da autpsia. Todos os resultados quantitativos e, ao fundo, devem ser
avaliados por um mtodo estatstico apropriado. Qualquer mtodo estatstico
geralmente aceite pode ser usado e os mtodos estatsticos devem ser selecionados
durante a concepo do estudo.
Relatrio Do Teste
47. O relatrio de ensaio deve incluir as seguintes informaes, conforme o caso:
Animais de ensaio e pecuria - Descrio das condies de encarceramento,
incluindo: nmero (ou mudana no nmero) de animais por gaiola, material de cama,

temperatura ambiente e umidade relativa do ar, o foto perodo, e identificao de

dieta.
- Espcies / cepa utilizada e justificativa para o uso de outros que o rato
espcie. Fonte e dados histricos podem ser fornecidos, se forem para animais
expostos em condies de exposio, habitao e jejum semelhantes.
- Nmero, idade e sexo dos animais.
- Mtodo de randomizao.
- Descrio de qualquer pr-teste condicionado incluindo dieta, quarentena e
tratamento para a doena.
Artigo de teste
- Natureza fsica, pureza e, onde as propriedades relevantes, fsico-qumicas
(incluindo isomerizao).
- Dados de Identificao e Chemical Abstract Services (CAS) Nmero de registro, se
conhecido.
Veculo
- Justificao para a utilizao do veculo e justificao para a escolha do veculo (se
diferente de gua).
- Dados histricos ou concorrentes que demonstrem que o veculo no interferir com
o resultado do estudo.
Cmara de inalao
- Descrio pormenorizada da cmara de inalao, incluindo o volume e um
diagrama.
- Fonte e descrio do equipamento utilizado para a exposio de animais, bem
como a gerao de atmosfera.
- Equipamento para medio de temperatura, umidade, de tamanho de partculas, e
concentrao real.
- Fonte de sistema de ar condicionado e usado para.
- Os mtodos utilizados para a calibrao de equipamentos para garantir uma
atmosfera de ensaio homognea.
- Diferena de presso (positiva ou negativa).

- Portas da exposio por cmara (nariz-only); localizao dos animais na cmara

(de corpo inteiro).
- Estabilidade da atmosfera de ensaio.
- Localizao dos sensores de temperatura e umidade e amostragem de ambiente
de teste no cmara.
- Tratamento de ar fornecido / extrada.
- As taxas de fluxo de ar, taxa de fluxo de ar / porto exposio (nariz-only), ou da
carga animal / cmara (Wholebody).
- Hora de equilbrio cmara de inalao (t95).
- Nmero de mudanas de volume por hora.
- Dispositivos de medio (se aplicvel).
Dados relativos exposio
- Justificao para a seleo concentrao alvo no estudo principal.
- Concentraes nominais (massa total de produto de teste gerados na cmara de
inalao dividido pelo volume de ar que passa atravs da cmara).
- Concentraes artigo de testes reais recolhidos por zona de respirao dos
animais; para misturas de teste que produzem formas fsicas heterogneas (gases,
vapores, aerossis), cada um deles pode ser analisado separadamente.
- Todas as concentraes de ar devem ser comunicados em unidades de massa (mg
/ L, mg / m3, etc.), e no em unidades de volume (ppm, ppb, etc.).
- Distribuio do tamanho das partculas, o dimetro aerodinmico mdio de massa
(DAMM) e o desvio padro geomtrico (g), incluindo os seus mtodos de clculo.
As anlises granulomtricas individuais devem ser notificadas.
As condies de teste
- Detalhes da preparao do artigo de teste, incluindo os pormenores de quaisquer
procedimentos utilizados para reduzir o tamanho das partculas de materiais slidos,
ou para preparar solues do produto em estudo.
- Uma descrio (incluindo de preferncia um diagrama) do equipamento utilizado
para produzir a atmosfera de ensaio e para expor os animais ao ambiente de teste.
- Detalhes do equipamento usado para monitorar a temperatura da cmara, umidade
e fluxo de ar cmara (ou seja, o desenvolvimento de uma curva de calibrao).

- Detalhes do equipamento utilizado para coletar amostras para determinao da

cmara
Concentrao e distribuio de tamanho de partcula.
- Os detalhes do mtodo analtico qumico usado e validao do mtodo (incluindo a
eficincia de recuperao de produto de teste a partir do meio de amostragem).
- Mtodo de randomizao na atribuio de animais para testar e grupos de controle.
- Detalhes de alimentos e de qualidade da gua (incluindo o tipo de dieta / fonte,
fonte de gua).
- A justificativa para a escolha das concentraes.
Resultados
- Tabulao de temperatura da cmara, umidade e fluxo de ar.
- Tabulao de nominal de cmara e os dados reais de concentrao.
- Tabulao de dados de tamanho de partculas, incluindo dados de amostra
analtica de coleta, distribuio de tamanho de partculas, e clculos do DAMM e g.
- Tabulao dos dados de resposta e nvel de concentrao para cada animal (ou
seja, animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo mortalidade,
natureza, gravidade, tempo de incio e durao dos efeitos).
- Tabulao de peso individual dos animais.
- Apuramento do consumo de alimentos
- Tabulao dos dados de patologia clnica
- Os achados de necropsia e resultados histopatolgicos para cada animal, se
disponveis.
Discusso e interpretao dos resultados
- nfase especial deve ser feita para a descrio dos mtodos utilizados para
cumprir os critrios do presente mtodo de ensaio, por exemplo, a concentrao
limite ou o tamanho das partculas.
- A respirabilidade de partculas em funo dos resultados globais devem ser
abordados, especialmente se os critrios de tamanho de partcula no puderam ser
cumpridos.
- A consistncia dos mtodos utilizados para determinar as concentraes nominais
e reais, e a relao da concentrao real de concentrao nominal deve ser includa
na avaliao global do estudo.

- A causa provvel da morte e do modo predominante de ao (contra sistmica

local) deve ser abordada.
- Uma explicao deve ser fornecida, se havia uma necessidade de sacrificar
humanamente animais em dor ou mostrando sinais de sofrimento intenso e
duradouro, com base nos critrios do Documento de Orientao da OCDE sobre
Humane Endpoints (3).
- O rgo (s) alvo deve ser identificado.
- O NOAEL e LOAEL devem ser determinadas.
REFERENCES
1) OECD (1981), Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No
413, Environment Directorate, OECD, Paris.
2) OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No.
39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
3) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of
Clinical Signsas Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety
Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and
Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
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Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs,
United States Environmental Protection Agency.
5) Dungworth, D.L., Tyler, W.S., and Plopper, C.E. (1985). Morphological Methods for
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material ,
Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
6) Young J.T. (1981) Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam.
Appl. Toxicol. 1, 309-312.
7) Harkema J.R. (1990) Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory
animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85, 231-238.
8) Woutersen R.A., Garderen-Hoetmer A. van, Slootweg P.J. and Feron V.J. (1994)
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In:
Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series,
Raven Press, New York, 215-263.
9) Mery S., Gross E.A., Joyner D.R., Godo M. and Morgan K.T. (1994) Nasal
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice.
Toxicol. Pathol. 22, 353-372.

10) Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., Duijvestijn
A.M., Breda Vriesman van P.J.C. and Sminia T. (1992) The role of nasopharyngeal
lymphoid tissue. Immunol. Today 13, 219-224.
11) Kuper C.F., Arts J.H.E. and Feron V.J. (2003) Toxicity to nasal-associated
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141, 281-285.
12) Lewis D.J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy
132(3). 419-428.