UNIVERSIDAD TECNLOGICA DE TECMAC

Divisin de Biotecnolgica
DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO
Grupo: 4QBT3
Elaborado por:
Castaeda Navarro Monserrat
Profesora:
Beni Camacho Prez

INTRODUCCIN
El diseo y la optimizacin de medios de cultivo es una tarea cotidiana en
microbiologa. Sin embargo, el concepto formal de optimizacin esta vagamente
definido entre los microbilogos y, la mayora de las veces, los mtodos para hacerlo
estn mal empleados. La aparente razn que explica esta situacin es que el diseo y
la optimizacin de medios de cultivo son procesos matemticos que requieren de un
conocimiento mnimo de los mtodos estadsticos. (Valderrama, 1997).
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa
fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza
qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los
requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar
energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.No obstante que
los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que pueden
necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn
representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg;
b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca,
Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por
litro;
c) Factores de crecimiento, que estn constituidos generalmente por componentes
orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni
metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin
metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no
saturados, etc..
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los
componentes, en: 1) medios sintticos o medios qumicamente definidos,
2) medios complejos en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o
vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.

que

aportan

las sustancias fundamentales ya

mencionadas, pero

que

son

qumicamente indefinidas y de composicin variable.

DISEO

El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los

componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos
correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos
aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser
empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos
especficos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones
sobre las materias primas. Otros aspectos que son tambin importantes se refieren a
todos los procesos y operaciones previas y posteriores a la etapa de fermentacin y al
conocimiento de los mecanismos bioqumicos que regulan la formacin de algunos
productos. (Ertola, 2012).
Los requerimientos nutricionales estn determinados por el tipo de metabolismo celular,
ya sea autotrfico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del
CO2 como las algas y algunas bacterias, y los heterotrficos que necesitan compuestos
orgnicos como fuente de carbono. Otro factor esencial est determinado por las
condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El O 2 es uno de los oxidantes ms
comunes en el metabolismo energtico. En la ausencia del O 2, el NO3 o SO4 son
utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias
metanognicas son auxtrofos anaerobios que utilizan H 2 para reducir el CO2 a CH4
para obtener energa. Otros protistas obtienen su energa, en condiciones anaerobias
por reaccin de xido-reduccin realizadas sobre compuestos orgnicos.
Otro requerimiento nutricional est constituido por las fuentes de nitrgeno que pueden
ser de naturaleza inorgnica u orgnica. El nitrgeno es utilizado para la biosntesis de
protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular.
Para la sntesis de protena se requieren en general L-aminocidos, aunque tambin
son necesarios algunos aminocidos de la serie D como D-alanina y D-asprtico para

su incorporacin a la pared de las clulas. En algunos casos se requieren tambin

pptidos de histidina.

Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en

forma de PO4 H y SO4 (o aminocidos azufrados). El fsforo se incorpora en cidos
nucleicos, y polmeros celulares. El S es asimilado para la sntesis de aminocidos
azufrados, y adems se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros
componentes.
Los requerimientos de K y Mg son tambin esenciales. Una parte importante del
primero est unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con los
factores que influyen en el aumento del RNA de las clulas, como la velocidad de
crecimiento. El in K acta como coenzima y probablemente acta como catin en la
estructura aninica de varios componentes celulares. El in Mg es esencial para la
estabilidad de los ribosomas y acta como cofactor en numerosas reacciones del
metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales
como fosfato y sulfato. (Garca, 2004)
Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categoras:
a) Los que son frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co,
Cu y Zn.
b) los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, e
I.
En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidos cualitativamente.
A veces es difcil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente
est presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales.
Los requerimientos de stos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el
cultivo ha estado sujeto a "strees", como por ejemplo por aumento de temperatura por
encima de un valor ptimo. Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden
ciertos aminocidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, cido
pantottico, niacina, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores
esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor

parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento

son las purinas, poliaminas, putrescinas, etc. En algunos procesos existe la necesidad
de efectuar otros agregados, a parte de los nutrientes requeridos por los
microorganismos y que representan los requerimientos especficos del proceso
considerado. (Mateos, 2014)

Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar disponibles

para

ser usados

por

la

clula.

Es importante

mencionar la

disponibilidad

correspondiente a iones metlicos cuya concentracin es modificada por quelacin, ya

que muchos constituyentes del medio y productos del metabolismo actan como
agentes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminocidos, hidroxicidos,
hidrxidos, y los aniones PO4 y CO3-2.
Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentracin y prevenir la precipitacin de
los iones metlicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algn agente
quelante agregado, como el EDTA (Acido Etilendiaminotetraactico).En medios
complejos de uso industrial la situacin es an ms complicada ya que existe una gran
variedad de sustancias orgnicas, las cuales pueden quelar, secuestrar o absorber
iones metlicos reduciendo la concentracin inica disponible. Entre dichos compuestos
podemos citar: aminocidos, protenas, cidos orgnicos, polifenoles, polifosfatos y
materiales coloidales.
En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio de cultivo
va a tener una determinada capacidad de unin a elementos metlicos disminuyendo
su concentracin efectiva, como ocurre tambin con los aminocidos y protenas que
tienen los grupos reactivos R-COO - , RHN- , RS- , RO , que son los ms importantes.
Los componentes empleados en las industrias de fermentacin son generalmente
complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los
mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composicin qumica. Si tenemos en
cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de
mucho productos obtenidos por fermentacin, se hace prioritario disminuir el costo de
los medios. Las materias primas ms importantes corresponden a fuentes de carbono y
de nitrgeno.

Las fuentes de carbono pueden ser:

1) Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidn, dextrina;
2) Alcoholes como el glicerol y manitol;
3) Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.
Son muy importantes tambin por su disponibilidad y costo reducido otras materias
primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de
queso, etc. Tambin se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias
que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos
como las vinazas de destilera, alpechn y residuos sulfiticos, que son sin embargo
solamente tiles para procesos de produccin de biomasa destinados al consumo
animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono
asimilables por los microorganismos, tambin contienen muchas impurezas que
impiden su utilizacin en otros procesos por las dificultades y costo elevado que
presentan las operaciones de separacin y purificacin de los productos. Las fuentes de
nitrgeno de naturaleza inorgnica ms comunes son el amonaco o las sales de
amonio. Las orgnicas estn representadas por varios productos, como ser:
1) Hidrolizados de protenas (Peptonas) que son obtenidas por

hidrlisis cida o

enzimtica de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes rganos y animales,

pescado, casena, gelatina, harina de soja, algodn, girasol, etc.. Mediante ajuste de la
relacin enzima-sustrato y variando tiempo de hidrlisis es posible variar el tamao de
la cadena de polipptidos. Aparte de su funcin como fuente nitrogenada, las peptonas
aportan algunas vitaminas y sales inorgnicas como fosfatos y suministran tambin
algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu.
2) Extracto de carne, que se obtiene por extraccin acuosa y concentracin posterior
variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extraccin y temperatura
de la misma.
3) Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser
obtenida mediante autlisis o plasmlisis de la levadura, es bsicamente una mezcla de
aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos.
4) Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada

5) "Cornsteep", el agua de maceracin de la industria del maz tiene mucha importancia

por su utilizacin como componente esencial de los medios para la produccin de
varios antibiticos y enzimas.
Es muy importante tambin la correcta eleccin de una determinada fuente cuando se
presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos,
la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompaar a las distintas
materias primas utilizadas.
La formulacin tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir
debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. Una primera
aproximacin con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el
conocimiento de la composicin de biomasa del microorganismo a ser empleado. Una
composicin elemental y tpica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48;
Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%. Es decir, que si queremos
formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos
proveer las distintas fuentes que aseguren como mnimo las cantidades de elementos
que deben ser suministrados. Por el conocimiento de la estequiometra de crecimiento y
de formacin del producto, es posible formular adecuadamente un medio. En general
podemos escribir para cualquier proceso de fermentacin:
Fuente de C + fuente de N + O 2 + minerales + nutrientes especficos biomasa +
productos + CO2 + H2O.
Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimizacin de los medios
de cultivo. Entre ellas podemos mencionar las siguientes:
1) No existencia de informacin respecto a coeficientes de rendimiento de macro y
micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado.
2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y
factores de crecimiento.
3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los
requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestin, que pueden causar
inhibicin del crecimiento.

4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y

formacin del producto.
5) Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.
La metodologa ms elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales se vara
la

concentracin

del

componente

ensayar

mantenindose

constante

las

concentraciones de los dems ingredientes. Para organismos aerobios generalmente

se utiliza como sistema de cultivo Erlenmeyer agitados. En este caso, se analiza el
efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentracin de
biomasa obtenida. Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace
falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el operador no conoce de
antemano que nutriente es el limitante del crecimiento. Cuando son varios los posibles
nutrientes limitantes el mtodo resulta poco prctico. Por otra parte puede ocurrir que la
respuesta obtenida al variar la concentracin de un componente dependa de los niveles
de los otros, o sea, se produzca interaccin entre componentes. Se puede mejorar
mucho la optimizacin en batch empleando tcnicas estadsticas o utilizando sistemas
continuos con pulsos de componentes. Utilizando cultivos continuos es posible obtener
un cultivo limitado por un slo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento,
pudindose conocer por lo tanto el efecto que su variacin ejerce sobre el cultivo al
mantenerse los dems componentes constantes.
Los mtodos de esterilizacin pueden ser de 3 tipos:
a) por destruccin total de microorganismos;
b) Por muerte o inactivacin;
c) Por eliminacin con medio fsicos.
Por destruccin total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica
calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicacin de una llama, que
es lo que hacemos en el laboratorio cuando flameamos un ansa de platino o las bocas
de tubo de ensayo o Erlenmeyer. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso
de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto sta metodologa, aunque es efectiva,
est muy restringida en su empleo.

La muerte o inactivacin significa la eliminacin de microorganismos sin que exista

necesariamente desintegracin de las clulas. Se puede efectuar por calentamiento,
seco o hmedo, por radiaciones o por agentes qumicos. El calor hmedo,
generalmente en forma de vapor bajo presin, es muy til y de gran valor en la
esterilizacin en el laboratorio, que se efecta en autoclave, o en la industria cuando se
esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentacin. En el caso de las
autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmsferas. En escala grande el
equipo de produccin es esterilizado con vapor saturado bajo presin, y la presin
requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y el aire debe ser purgado
totalmente del sistema (como ocurre tambin en el caso de los autoclaves) porque la
transferencia de calor disminuye mucho en ese caso. Despus de la esterilizacin se
mantienen las condiciones aspticas, haciendo pasar vapor por las vlvulas y sellos. La
eliminacin fsica est restringida a la esterilizacin de gases y lquidos.

REFERENCIAS
Valderrama O. Jos; (1997) Informacin Tecnolgica, Centro de Informacin
Tecnolgica, Chile.
Rodolfo Ertola, Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone; (2012) Programa Regional
de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico de la OEA

 Garca Garibay Mariano; (2004) Biotecnologa alimentaria; Editorial Limusa,

Mxico.
Dr. Pedro F. Mateos; (2014) Departamento de Microbiologa y Gentica. Facultad
de Farmacia.