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TCNICAS DE DIAGNSTICO

Anlisis de protenas
mediante electroforesis
e inmunotransferencia
(Western blot)
Alexandre de la Fuente Gonzlez, Jess Rodrguez
Lozano y Eduardo Fonseca Capdevila
Servicio de Dermatologa. Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo.
A Corua. Espaa.

252

La qumica es una ciencia experimental y los qumicos

que estudian los seres vivos, o cualquier investigador
que intente estudiar los organismos desde un punto de
vista qumico, debe comenzar por estudiar los procesos
a escala celular y subcelular. Hay que tener en cuenta
que los resultados y las conclusiones correspondientes
a un trabajo sobre la materia viva deben relacionarse e
interpretarse a escala de rgano, tejido y, si es posible,
organismo, porque las clulas vivas estn en un estado
dinmico de actividad y sta puede influir no slo en los
procesos qumicos de las clulas ms prximas (interaccin celular), sino en la actividad de las ms distantes
(efectos hormonales, citocinas, etc.).
La bioqumica, ciencia que estudia los seres vivos mediante procedimientos y mtodos qumicos, tuvo inicialmente un desarrollo muy lento. Por una parte, a los qumicos del siglo XIX y principios del XX no les atraa
demasiado el aspecto coloidal y complejo que presentaba la materia viva a simple vista o mediante un microscopio ptico. Por otra parte, fue necesario esperar a que
diferentes ramas de la qumica alcanzaran un nivel tecnolgico adecuado. As, para conocer los metabolitos y
determinar las concentraciones tan sumamente pequeas en que estos compuestos se encuentran en las clulas, fue necesario esperar al desarrollo de la qumica
analtica. Hoy en da, para separar y purificar metabolitos necesitamos utilizar los mtodos de centrifugacin,
cromatografa y electroforesis; para determinar sus concentraciones, los de microanlisis; para caracterizarlos,
los espectrofotomtricos (ultravioleta e infrarrojos);
para determinar una estructura en el espacio, los de difraccin de rayos X, etc.
Correspondencia: Dr. A. de la Fuente Gonzlez.
Servicio de Dermatologa. CHU Juan Canalejo.
P.o Sir John Moore, s/n. 15006 A Corua. Espaa.
Correo electrnico: jlozano@mundo-r.com
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Con el objeto de seguir un orden lgico en el estudio

de los procesos que tienen lugar en un sistema y la interrelacin entre ellos, es conveniente comenzar por
estudiar las partes que componen dicho sistema. Esto requiere, generalmente, el aislamiento de los componentes
y un anlisis que permita deducir su funcin o funciones
en el contexto del sistema. Cuando se requiere estudiar
los procesos que tienen lugar en una partcula u orgnulo de la clula, hay que, necesariamente, comenzar por
aislar dicho orgnulo o partcula. Esto puede conseguirse por un proceso de fraccionamiento de los componentes que implica dos etapas: una de disgregacin o rotura
de las clulas y otra de centrifugacin de la suspensin
celular resultante. La separacin del componente celular que se desea estudiar del resto de los componentes
celulares requiere de la utilizacin de tcnicas cromatogrficas y electroforticas. El conocimiento de la funcin de dicho componente celular se basa, entre otras,
en la informacin obtenida por la aplicacin de tcnicas
espectroscpicas, potenciomtricas, polarogrficas, manomtricas y en la utilizacin de istopos radiactivos.
Anteriormente hemos mencionado que el estudio de
la actividad celular requiere el fraccionamiento de los
componentes celulares, pero debe tenerse en cuenta
que este proceso puede producir efectos diferentes de
los que tienen lugar en las clulas en condiciones normales. Con objeto de reducir al mnimo dichos efectos,
se debe tomar durante los experimentos todas las precauciones posibles, procurando mantener unas condiciones (soluciones reguladoras, pH, fuerza inica, etc.)
lo ms semejante posible a las que imperan en la clula.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta que es prcticamente imposible eliminar totalmente los cambios y efectos que se originan en los procesos de fraccionamiento
y aislamiento de las sustancias que componen la clula.
Por ello, los resultados obtenidos deben interpretarse
con sumo cuidado y teniendo en cuenta el contexto del
orgnulo, la clula, el rgano y el organismo.
La tcnica de Western blot surge en el contexto de los
mtodos de anlisis de cidos nucleicos, aunque no los
analiza directamente, sino que analiza el producto de
expresin de los genes, esto es, las protenas, y como
tantas otras tcnicas de laboratorio, como tal no ha
dado lugar a muchas publicaciones, incluida en los tratados de tcnicas de biologa molecular y transmitida de
forma verbal y personal entre investigadores de un mismo laboratorio o en reuniones y simposios. Entre los padres de la tcnica hay que destacar a Ulrich K. Laemmli
(y sus colaboradores), quien describi la electroforesis
discontinua en geles que contenan SDS (dodecilo sulfato sdico). Towbin et al describieron la transferencia de
protenas desde geles de poliacrilamida a hojas de nitrocelulosa, pero quien fue esencial para llegar hasta este
protocolo fue sir Edwin Southern, el inventor del Southern blot (la tcnica lleva su nombre y las descubiertas
a continuacin se denominaron Northern blot y Western
blot), una simple y elegante tcnica que usa gel, nitrocelulosa y varias hojas de blotting paper, y que revolucion la biologa molecular, a mediados de los aos seten-

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De la Fuente Gonzlez A et al. Anlisis de protenas mediante electroforesis e inmunotransferencia (Western blot)

ta. Primero en la Universidad de Edimburgo y ms tarde

en la de Oxford, sigui dedicndose a la genmica y desarrollara y patentara los arrays. Fund la Oxford
Gene Technology (OGT) en 1988, empresa que desarrolla microarrays en la actualidad, entre otras herramientas al servicio de la genmica.
TCNICA DE ELECTROFORESIS E
INMUNOTRANSFERENCIA (WESTERN BLOT)
En qu consiste la electroforesis?
La electroforesis incluye las tcnicas de separacin
que implican la separacin en un campo elctrico de
partculas cargadas. En el caso de la electroforesis de
protenas, el proceso se diferencia en funcin de los
electrodos, el tampn de electroforesis y el soporte que
utiliza.
Qu materiales se emplean?
Electrodos. Habitualmente se utilizan los de platino de
alta calidad.
Tampn de electroforesis. El tampn de electroforesis (electrolito) debe cumplir los siguientes requisitos:
Mantener el pH constante: ha de tener una alta capacidad de tamponacin, ya que las partculas que se separan (en nuestro caso, las protenas) ven afectadas sus
cargas en funcin del pH y las reacciones en los electrodos ocasionan cambios en el pH.
Mantener la corriente elctrica.
No debe haber interacciones con las partculas que
se desea separar.
El rango de pH debe estar entre 4 y 9.
La fuerza inica del tampn de electroforesis (electrolito) debe estar controlada; si la fuerza es muy alta, el
proceso es lento, la movilidad disminuye, puede aumentar la temperatura y puede producirse la desnaturalizacin de las macromolculas.
Soportes. Los primeros soportes empleados en los procesos de electroforesis fueron el papel (acetato de celulosa, Whatman 3MM, etc.), ms tarde se desarrollaron
estructuras en tres dimensiones en forma de geles. Los
primeros geles utilizados fueron los de almidn, que mejoraron la resolucin con respecto al papel, pero no permitan controlar las dimensiones del poro. As pues, se
desarrollaron los dos tipos de geles ms utilizados en
las electroforesis, que son los geles de acrilamida para
las electroforesis de protenas y los geles de agarosa
para las electroforesis de cidos nucleicos.
Geles de archilamida. Ofrecen las siguientes ventajas:
Se puede controlar los tamaos de poro.
Se pueden polimerizar con la forma que convenga:
de tubo, de lmina para intercalar entre dos placas, de
diferentes espesores, etc.
Soportan una amplia gama de tampones.
Permiten separaciones rpidas.

Pocillo

Movilidad
electrofortica

Muestra

Figura 1. Fundamentos de la electroforesis discontinua (1).

Permiten una amplia gama de tinciones.

Los cuatro componentes fundamentales para la polimerizacin de un gel de acrilamida con estructura tridimensional porosa son:
Acrilamida.
Bisacrilamida.
TEMED (tetraetilenmetilendiamina).
APS (persulfato amnico).
La molcula de APS es la iniciadora de la reaccin y
en disolucin se encuentra en forma de radical libre, es
muy activa y acta sobre una molcula de acrilamida.
As transmite su capacidad de radical libre a esta molcula, que a su vez acta sobre otras molculas de acrilamida y da lugar a un polmero lineal. Estas reacciones
de polimerizacin las cataliza el TEMED. La bisacrilamida acta como agente enlazante.
El poro tiene un tamao medio que se controla por el
porcentaje de acrilamida que utilizamos al preparar el
gel. Este porcentaje ira desde el 4 hasta el 30%. Por encima o por debajo de este rango los geles no son utilizables, puesto que se vuelven demasiado consistentes y
frgiles o demasiado lquidos, respectivamente. Cuanto
mayor es el porcentaje de acrilamida menor es el tamao del poro.
Electroforesis discontinuas
Puesto que el resultado que se obtenga de una separacin por electroforesis se determina por la movilidad
electrofortica de las partculas y sta se tiene lugar segn el tamao y la carga, es necesario que las condiciones iniciales de todas las partculas de la muestra sean
las mismas. Los geles y minigeles que se utilizan en la
actualidad permiten la formacin en la parte superior de
pocillos en los que cargar la muestra o mezcla de protenas que deseamos separar por electroforesis. El volumen de muestra que se puede cargar en un minigel es de
alrededor de 50 l. En este volumen se podra dar la situacin que se describe en la figura 1.
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De la Fuente Gonzlez A et al. Anlisis de protenas mediante electroforesis e inmunotransferencia (Western blot)

Electrolito

pH 8,8

GlyGel concentrador

Gel concentrador
pH 6,8

Gly0

pH 8,8

Gly-

Gel separador

Electrolito

Gel separador

Figura 2. Fundamentos de la electroforesis discontinua (2).

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En este caso, una partcula que tiene una menor movilidad electrofortica y, por tanto, migrara ms despacio
en el gel habr quedado por debajo de la partcula con
mayor movilidad y que en teora debera migrar ms deprisa. Esto se debe a que las condiciones de partida de
ambas partculas no son las mismas. En cualquier proceso de separacin es necesario e imprescindible que
todas las partculas comiencen dicho proceso a la vez y
en el mismo punto.
Por esta razn se dise el proceso de electroforesis
discontinua. Este tipo de electroforesis se caracteriza
por la utilizacin de dos tipos de geles: un gel de separacin, en el que el porcentaje de acrilamida se elige en
funcin de la protena o protenas que se desea separar
y con un tampn compuesto por Tris/HCL y con pH 8,8,
y un gel de concentracin o stacking, en el que se polimerizan los pocillos. En este caso el porcentaje de acrilamida es considerablemente inferior (alrededor del
4%), el tampn tambin estar compuesto por Tris/HCL,
pero el pH se ajusta a 6,8.
El electrolito o tampn de electroforesis que se
usa est formado por Tris/Glicina y tiene un pH de
8,8. Este tampn se pone en contacto con el gel en la
parte superior, y en la parte inferior, con su electrodo
correspondiente. El resultado se esquematiza en la figura 2.
La corriente que se genera es continua y la transportan los iones Gly del electrolito. Cuando el in Gly penetra en el gel concentrador, el pH cambia, se transforma en el in Gly0 y no puede transportar la corriente.
Para suplir este fenmeno en esta zona se forma un gradiente de voltaje, de modo que cuanto mayor es la distancia de una partcula a la interfase entre los dos geles,
mayor ser el voltaje. Las molculas que se encuentran
ms lejos se movern ms rpido que las que estn ms
cerca y, como consecuencia, una aplicacin de muestra
en un pocillo del orden de 1 cm se comprime y llega a la
interfase con una dimensin de 1 mm.
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ELECTROFORESIS EN CONDICIONES
DESNATURALIZANTES
Puesto que se trabaja con tampones que tienen diferentes pH y las protenas ven afectada su carga en funcin de este parmetro, en principio el efecto que tendra el pH en la carga de las protenas de una mezcla
compleja de macromolculas sera desconocido. Por
esta razn, la mayora de las electroforesis actuales se
realizan en condiciones desnaturalizantes (SDSPAGE).
Este tipo de electroforesis se basa en la desnaturalizacin de las protenas. Para ello se utiliza el denominado
tampn de muestra o sample buffer (SB). La composicin de este tampn es la siguiente: SDS, betamercaptoetanol, glicerol, Tris/HCl (pH 6,8) y azul de bromofenol.
El SDS es una sal sdica, un detergente de carga negativa. Este compuesto es capaz de unirse a las protenas
y conferirles carga negativa debido a que enmascara
la propia carga de las protenas. La unin del SDS con
las protenas se produce en una proporcin constante,
es decir, cada gramo de protena es capaz de unirse a 1,4
g de SDS. La relacin carga/masa de la protena, por lo
tanto, va a ser constante para todas las protenas de una
mezcla compleja.
El betamercaptoetanol reduce cualquier puente disulfuro de la protena. El glicerol aumenta la densidad y
asegura que la muestra tenga en el pocillo una densidad
superior que la del electrolito y la muestra permanezca
estable. El azul de bromofenol tiene una movilidad electrofortica superior a la de las protenas que se tienen
en la muestra. Se utiliza como marcador del frente de
electroforesis (fig. 3) que, en principio, garantiza que
por detrs se encuentren las protenas e indica cundo
se debe interrumpir la electroforesis.
Antes de preparar las muestras con los diferentes
componentes, realizamos una preparacin de las protenas consistente en hacer dos procesos de ebullicin en
el bloque trmico a 100 C durante 5 min, desechando

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Figura 3. El frente de electroforesis dibuja los pocillos.

Figura 5. Cubeta de electroforesis conectada a la fuente de alimentacin.

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Figura 4. En el tercer carril van hacindose visibles los marcadores

de peso molecular.

Figura 6. Esquema de la transferencia semiseca.

en cada uno de ellos el pellet (granulado) y recogiendo

el sobrenadante, para as eliminar algn tipo de material
insoluble e impurezas.
Posteriormente cada muestra la haremos pasar unas
50 veces por una aguja de 21 G, de manera que reduciremos su densidad, haciendo que el proceso de desplazamiento por el gel sea ptimo.
Las mezclas complejas de protenas (lisados totales)
se incuban con el tampn de muestra durante 5 min a
100 C. Esto garantiza dos cosas: la desnaturalizacin de
las protenas y la unin del SDS a las protenas desnaturalizadas, lo cual les confiere una carga negativa en una
proporcin constante.
Hay que tener en cuenta que lo que tendremos a partir
de ahora en la muestra son protenas desnaturalizadas,
pero tambin que las protenas que estaban formadas
por subunidades vern rotas las uniones entre ellas.
Al ser constante la relacin entre la carga y la masa de
las protenas, stas se van a mover a travs del gel por
su tamao y por la mayor o menor posibilidad de atravesar los poros. Al representar el logaritmo del peso molecular de las molculas con respecto a la movilidad electrofortica, hay linealidad. Por esta razn, y como

referencia para poder obtener el peso molecular de una

protena o para identificar una protena en concreto en
el gel, se hace pasar por el gel una muestra de marcadores de peso molecular (fig. 4). Estos marcadores son
molculas purificadas conocidas con distintos valores
de peso molecular.
INMUNOTRANSFERENCIA (WESTERN BLOT)
La tcnica de inmunotransferencia (immunoblotting
o Western blot) es un sistema rpido y muy sensible
para la deteccin y caracterizacin de protenas que se
basa en la especificidad de reconocimiento entre antgeno y anticuerpo. Implica la separacin por electroforesis
por el sistema SDS-PAGE y una transferencia cuantitativa e irreversible a una membrana de PVDF de las protenas de una mezcla compleja (lisado total celular). Los
antgenos que se han transferido a la membrana son reconocidos por anticuerpos monoclonales o policlonales
especficos de ellos.
Sistemas empleados
Nosotros usamos el mtodo conocido como transferencia semiseca (figs. 5-7), en el cual dicha transferencia
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Figura 7. Montando los sandwichs en el aparato de transferencia.

Figura 8. Se transfiere la protena del gel a la membrana.

se realiza en horizontal y entre papeles de filtro saturados en tampn de transferencia (usamos el Extra Thick
Blot Paper de Bio-Rad, ref. 170-3968).
Este sistema reduce la cantidad de tampn necesario
y adems permite transferencias ms rpidas, debido a
que los electrodos se encuentran ms prximos.
Para la electroforesis usamos el Mini Protean 3 Electrophoresis System y para la transferencia, el Trans Blot
SD semi-dry cell, y como fuente de alimentacin, la Power Pac HC, todos ellos de Bio-Rad. La transferencia se
realiza en 40 min a un voltaje constante de 20 V (fig. 8).
Existen otros tipos de sistemas de transferencias,
como la hmeda o en tanque, donde el sistema es vertical y completamente sumergido entre dos paneles conectados a electrodos. Es especialmente recomendable
para protenas difciles de transferir (> 100 kDa o hidrfugas), aunque como es necesario que las transferencias
se realicen durante ms tiempo, se requiere un sistema
que mantenga la temperatura constante. Suelen llevar
entre 30 min y 1 h si se realizan a 100 V, o se pueden realizar durante toda la noche en cmara fra a 14 V.

de los carriles transferidos; se puede marcar sobre la

membrana con lpiz antes de proceder al desteido total de la membrana con agua, lo cual es necesario para
continuar con el proceso de la membrana.
Nosotros utilizamos marcadores de peso molecular
preteidos de Bio-Rad (Prestained SDS_PAGE Standard,
broad range, ref. 161-0318), con lo que no se requiere la
tincin con rojo Ponceau para visualizarlos.

Membranas
Las membranas ms utilizadas actualmente son las de
PVDF (fluoruro de polivideno) que son hidrfugas, por
lo que es muy importante sumergirlas en metanol, despus en agua y otra vez en metanol, 5 min cada una de
las inmersiones y por ese orden, para posteriormente tenerlas 15 min sumergidas en tampn de transferencia a
una temperatura de 4 C. Estas membranas tienen la
ventaja frente a otras (nitrocelulosa o nailon) de una
alta capacidad para unir biomolculas, adems de que
son ms manejables y permiten una amplia gama de tinciones reversibles y mtodos de deteccin.
Tincin reversible
La solucin rojo Ponceau (0,5% Ponceau-S red, 1% cido actico) permite una tincin reversible, fcilmente
eliminable, que provee bastante informacin. La membrana se mantiene unos minutos en la solucin y, a continuacin, se destie en agua destilada, lo que permite
visualizar los marcadores de peso molecular y cada uno
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Inmunotransferencia
Bloqueo. Las membranas con el material transferido se
bloquean para impedir uniones inespecficas del anticuerpo que se utiliza en la tcnica. Este proceso se realiza mediante la incubacin de la membrana en una solucin de
bloque, compuesta, por lo general, por protenas que no reaccionan despus con el anticuerpo. Para las membranas
de PVDF se suele utilizar como disolvente para la solucin
de bloqueo tampn de lavado TTBS (Tween 20 en TBS).
Para el bloqueo se puede usar BSA, que en teora sera la
ms adecuada para el bloqueo de protenas fosforiladas,
pero la membrana no sale muy limpia, por lo que nosotros
usamos leche desnatada deshidratada al 5%, que tambin
nos ha servido para el bloqueo de dichas protenas.
Anticuerpos. Las protenas inmovilizadas en la membrana se incuban con anticuerpos primarios especficos
que permiten identificar y cuantificar protenas concretas de una mezcla compleja de protenas.
En la actualidad se usan fundamentalmente dos tipos
de preparaciones de anticuerpos para Western blot (fig. 9):
anticuerpos policlonales, cuyas preparaciones incluyen
mltiples molculas de anticuerpo que se unen a un antgeno concreto, y anticuerpos monoclonales, que poseen
la ventaja de que son especficos en sus interacciones
porque nicamente se unen a un eptopo en particular,
es decir a una nica regin del antgeno.
El principal problema que plantea su utilizacin es
precisamente el hecho de que reconozcan pequeas regiones de la secuencia polipeptdica. Esto puede suponer en algunos casos que se produzcan reacciones cruzadas con otros polipptidos.

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Deteccin. Existen mtodos de deteccin, como el

marcado radiactivo, que se basan en unin del anticuerpo secundario con 125I, cuya radiactividad impresiona
una pelcula autorradiogrfica.
Nosotros utilizamos un mtodo ms prctico y menos
sucio para detectar las uniones antgeno-anticuerpo
en una inmunotransferencia, consistente en la utilizacin de anticuerpos secundarios con una actividad enzimtica. Estos anticuerpos se unen especficamente a las
regiones de los anticuerpos primarios que no se unen a
los antgenos (figs. 10 y 11).
Cuando utilizamos un anticuerpo primario que se obtuvo de un animal (p. ej., de ratn), tenemos que usar

como anticuerpo secundario uno que se haya producido

en otro animal (p. ej., conejo o cabra) y que sea capaz
de reconocer el anticuerpo primario en las regiones que
no se unen al antgeno.
Las actividades enzimticas que se suelen utilizar conjugadas con anticuerpos secundarios son la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa horseadish (HRPO), ya que
permiten la deteccin de la unin antgeno-anticuerpo
mediante sustratos luminiscentes. Tambin se pueden
usar sustratos cromognicos, pero la deteccin de los
sustratos luminiscentes es mucho ms rpida y ms sensible. Nosotros usamos un kit comercial llamado ECL
Western Blotting, Amersham, que se basa en la accin

Anticuerpos policlonales

Anticuerpos monoclonales

Figura 9. Tipos de anticuerpos empleados para Western blot.

257

Anticuerpo
primario:
anti-

Anticuerpo
secundario:
con actividad
enzimtica
asociada

(p. ej., monoclonal

de ratn)

(p. ej.,
anti-IgG de ratn)

Figura 10. Esquema de la inmunodeteccin de protenas en membrana.

Sustrato
Reaccin colorimtrica
Reaccin luminiscente

Revelado

Autorradiografa

Figura 11. Esquema del revelado.

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betamercaptoetanol, SDS y tampn Tris/HCl pH 6,8 a

una temperatura de 50-65 C. Antes y despus se realizan abundantes lavados, que facilitan la eliminacin de
los anticuerpos y de la propia solucin de stripping. A
continuacin se procede al bloqueo tal y como hemos
indicado anteriormente.

Figura 12. Western blot. A la izquierda se observan los marcadores

de peso molecular de referencia, para identificar la protena.

258

de la actividad enzimtica HRPO o AP sobre compuestos (como el luminol), generndose compuestos que dan
lugar a luz y cuyos efectos suelen durar unos 15 min.
Esta reaccin luminosa ser la que impresione una pelcula autorradiogrfica.
Este mtodo es muy til, porque permite conseguir
una mayor sensibilidad variando el tiempo de exposicin de la pelcula autorradiogrfica y porque el resultado obtenido puede ser fcilmente fotografiado o digitalizado, lo cual permite cuantificacin por densitometra.
En la figura 12 puede observarse el resultado de un Western blot con los marcadores de peso molecular de referencia.
Reutilizacin de la membrana (stripping). En la actualidad es frecuente la reutilizacin de una misma
membrana para detectar otras protenas con otros anticuerpos especficos, lo cual da una mayor fiabilidad a la
hora de comparar resultados de diferentes protenas a
partir de una misma mezcla compleja de protenas.
La reutilizacin de las membranas de PVDF reveladas
con sistemas luminiscentes es la ms sencilla, puesto
que este tipo de membrana es mucho ms manejable y
menos deteriorable y los productos luminiscentes son
solubles y no se depositan sobre la membrana.
Para la reutilizacin es necesario eliminar completamente las uniones de los anticuerpos primario y secundario con el antgeno y entre s, respectivamente. A este
proceso se lo denomina stripping y consiste en la incubacin de la membrana con una solucin compuesta por

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APLICACIONES DEL WESTERN BLOT

Sus aplicaciones son muy numerosas. Dentro del campo de la biomedicina, para englobarlas por grupos, diremos que tiene aplicaciones diagnsticas en enfermedades infecciosas, enfermedades hereditarias y congnitas,
enfermedades autoinmunitarias, y un extenso y cada vez
ms amplio papel en el cncer, tanto para el diagnstico
precoz y el tratamiento como en investigacin bsica y
aplicada. Otros campos en los que se utiliza esta tcnica
son la inmunologa y reas relacionadas con sta, como
la inflamacin y el envejecimiento celular, y por supuesto en el mbito de las enfermedades infecciosas y la microbiologa, la gentica y es una herramienta ms de la
genmica.
AGRADECIMIENTOS
A Alicia Subtil Rodrguez, por su amable colaboracin en la redaccin de la metodologa y en la confeccin de los esquemas.

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