Universidad Internacional SEK

Facultad de Ciencias Ambientales

Trabajo de Biotecnología Ambiental

Comparación de varias especies de microorganismos degradadores de carbamatos

para determinar la mejor opción para el tratamiento biológico de suelos
contaminados con Carbaryl en plantaciones bananeras

Esteban Carpio Suárez

Introducción

Históricamente, muchos países de Latinoamérica han estado fuertemente ligados al desarrollo

de la industria bananera, en la cual ha sido común el uso intensivo de pesticidas para el
control de plagas que afectan a los cultivos de esta fruta (Araya, 2004).

El uso de carbamatos y organofosforados ha sido el medio mas asequible y eficiente para el

control de plagas en el banano, y se los utiliza hasta la actualidad a pesar de la toxicidad de
muchas de estas sustancias (Araya, 2004).

Adicional al impacto ambiental que suponen los residuos de pesticidas aplicados en estos
suelos, como es el caso del Carbaryl, se ha determinado que la pérdida de la calidad del
suelo que produce la aplicación de estas sustancias se relaciona directamente con una
disminución de la productividad (INIBAP et. al., 2004), constituyéndose así no solo en un
problema ambiental, sino que también tiene repercusiones económicas y sociales.

El carbaryl es uno de los carbamatos más utilizados para el control de una variedad de pestes
en varios tipos de cultivos de frutas, vegetales, algodón, etc. El mecanismo de acción del
carbaryl es inhibir la colinesterasa, una de las enzimas más importantes en el sistema nervios
de las personas, de vertebrados y de insectos. El carbaryl es relativamente seguro para los
mamíferos, tóxico para algunos microorganismos benéficos, altamente tóxico para peces y
parcialmente tóxico para las aves; particularmente este pesticida es extremadamente tóxico
para las abejas (Xu, 2000).

Paradójicamente al efecto que provoca la aplicación de estas sustancias de control, se ha

visto en muchos casos en las plantaciones de banano que algunas especies de
microorganismos se han adaptado a la presencia de los pesticidas en el suelo, e incluso en
ciertos casos han acelerado el proceso natural de biodegradación, provocando pérdida en la
efectividad de las aplicaciones, lo que se traduce en el uso de una mayor dosis para lograr el
efecto deseado y un costo de producción incrementado (Araya, 2004).

Para contrarrestar este efecto de biodegradación acelerada, los especialistas de la industria

bananera han propuesto el uso alternado de varios tipos de pesticidas, lo cual disminuye la
capacidad de adaptación de los microorganismos del suelo a la presencia de éstos y por ende
su capacidad de biodegradación (Araya, 2004). Esto provoca la acumulación en el suelo de
pesticidas que se vuelven persistentes debido a lo mencionado anteriormente.

Entre las especies más importantes que se han identificado en la aceleración de la

biodegradación de carbamatos se encuentran las siguientes: Achromobacter sp., Penicillium
sp., Arthrobacter, Pseudomonas sp., Nocardia y Bacillus sp (Araya, 2004).

También se ha establecido en investigaciones previas que entre los microorganismos que

tienen la capacidad de degradar un cierto tipo de carbamato, pueden ocurrir adaptaciones
cruzadas que le permiten degradar varios compuestos de la misma familia de pesticidas; por
ejemplo, se determinó que una especie del género Achromobacter que fue aislada de un
suelo contaminado con carbofurano podía hidrolizar algunos otros carbamatos (Araya, 2004).

La secuencia de adaptación cruzada propuesta por el mismo autor es la siguiente:

Carbofurano > Carbaryl > Propoxur > Aldicarb > O-nitofenildimetilcarbamato

En el Ecuador se ha evidenciado el uso del carbaryl en las plantaciones bananeras, pero no

existe un dato preciso de la cantidad utilizada por año, lo cual hace difícil establecer la
amplitud del uso de este carbamato en el país.

A pesar de esto, en el Texto Unificado de Legislación Ambiental Secundaria (TULAS) tiene

bien identificado a estos compuestos y a los límites permisibles. En el Anexo 1 del Libro VI,
correspondiente a la las Normas de Calidad Ambiental y de Descargas de Efluentes: Recurso
Agua, en la Tabla 1: Límites máximos permisibles para aguas de consumo humano y uso
doméstico, que únicamente requieren tratamiento convencional, se establece la
concentración máxima permisible de carbamatos totales en 0,1 (mg/L); y particularmente
en la tabla 5: Criterios referenciales de calidad para aguas subterráneas, considerando un
suelo con contenido de arcilla entre (0-25,0) % y de materia orgánica entre (0 - 10,0 )%, se
establece la concentración máxima de carbaryl en 0,06 (µg/L)(Ministerio de Ambiente,
2004).

Si bien en el Anexo 2 del Libro VI, correspondiente a la Norma de Calidad Ambiental del
Recurso Suelo y Criterios de Remediación para Suelos Contaminados, no se incluyen al
carbaryl o al grupo de los carbamatos dentro de la Tabla 3: Criterios de Remediación o
Restauración, dentro del grupo pesticidas regulados para esta actividad (Ministerio de
Ambiente, 2004), es de gran importancia el tratamiento de suelos contaminados con
Carbaryl, para evitar la escorrentía de este pesticida a fuentes de agua, donde sí están
establecidas las concentraciones máximas de este carbamato, conforme a lo revisado
anteriormente; y para evitar la pérdida de calidad del suelo que pueda llevar a un bajo
rendimiento de producción de banano.

Objetivos

General

- Determinar cuál es la mejor opción a aplicar en la remediación biológica de suelos

contaminados con este pesticida en plantaciones bananeras.

Específicos

- Comparar varios ensayos realizados en laboratorio con diferentes especies de

microorganismos en los cuales se trataron directa o indirectamente su capacidad de
biodegradación del carbaryl.

- Comparar los resultados obtenidos para determinar cuál cepa es la más eficiente
biodegradando carbaryl.

- Comparar los medios de cultivo y los parámetros críticos necesarios para el

crecimiento de los microorganismos, para definir cuál es la opción que requiere de
una menor inversión económica y técnica para su escala.

- Analizar los resultados y recomendar diferentes aplicaciones a una escala mayor para
la biodegradación de carbaryl en suelos contaminados.
Marco Teórico

Aislamiento, cultivo e inoculación de cepas 50552 y 50581 de Pseudomonas sp.

según la investigación realizada por Chapalamadagu et. al. (1991)

Para la determinación de biodegradación en esta investigación se utilizó carbaryl de grado

analítico (>99,5% de pureza), y carbaryl comercial (98% de pureza) (Chapalamagu et.
al,1991).

Este estudio se basa en la premisa de que en ciertos casos los productos xenobiótico
pueden ser solamente parcialmente degradados, en este caso se identificó que la cepa
50552 degradaba carbaryl a un compuesto más tóxico, el 1-naftol; y se identificó que la
cepa 50581 degradaba el 1-naftol completamente a CO2 y H2O por lo que se propuso el
uso de un consorcio de las dos cepas para la degradación integral de carbaryl
(Chapalamagu et. al,1991).

Medio de Cultivo

Los microorganismos fueron incubados en un medio aerobio a 30 ºC, a pH 7, en medio

minimal que presente como única fuente de carbono el carbaryl (para la cepa 50581), y 1-
naftol (para la cepa 50582), el medio de cultivo contenía 10 g de NaCl, 10 g de triptona, y
5 g de almidón, añadiendo 1,8% en volumen de agar al medio (Chapalamagu et. al,1991).

Los experimentos de biodegradación fueron realizados utilizando tubos de ensayo

duplicados de 25 ml, cada uno contenía 2 ml de medio minimal y 1 mg de carbaryl
(analítico y comercial) o 1-naftol. Se inoculó a este medio con 15 ml de bacterias que se
encontraban ya en crecimiento exponencial.

Para la identificación de metabolitos producto de la degradación de carbaryl y 1-naftol se

analizan los sobrenadantes del tubo de ensayo utilizando cromatografía de gases y
cromatografía líquida de alto rendimiento (Chapalamagu et. al,1991).

Para la determinación de la generación de CO2 se cubren los tubos de ensayo con papel
filtro empapados con una solución 1M de NaOH para retenerlo y realizar las mediciones
respectivas (Chapalamagu et. al,1991).

Resultados y Discusión

Todas los inóculos realizados con la cepa 50581 hidrolizaron el carbaryl a 1-naftol
utilizando el terminal metilcarbamato como fuente única de carbón, pero ninguno lo
degradó por completo, por lo que se inocularon estas muestras de 1-naftol con la cepa
50582 en la cual se detectó emisión de CO2 del sistema (Chapalamagu et. al,1991).
Cuadro 1. Hidrólisis de carbaryl por la cepa 50581 de Cuadro 2. Hidrólisis completa de carbaryl utilizando el
Pseudomonas sp., en negro la concentración de consorcio microbiano de las cepas 50581 y 50552 de
carbaryl, en rayas la concentración de 1-naftol, Pseudomonas sp. (Chapalamagu et. al,1991).
ambas concentraciones determinadas mediante
Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC)
(Chapalamagu et. al,1991).

Los análisis de cultivos de la cepa 50552 mediante Cromatografía de Gases y

Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC), que fueron inoculados en medio
minimal en el cual la única fuente de carbón era el 1-naftol, arrojaron que la
concentración del sustrato disminuyó con un incremento en la turbidez del medio
(crecimiento microbiano). Todo el sustrato fue degradado en un rango de menos de 36
horas luego de realizado el inóculo. Además se determinó la generación de CO2 en el
medio inoculado, al contrario del testigo donde no se generó CO2, lo cual prueba la
degradación completa del 1-fenol (Chapalamagu et. al,1991).

Luego de que estos resultados fueron completamente analizados, se propuso la

construcción de un consorcio microbiano de estas dos cepas de Pseudomonas sp. para
degradar completamente el carbaryl, los resultados arrojaron que luego de 36 horas de
incubación, luego de haber inoculado en medio minimal en el cual el carbaryl era la única
fuente de carbón, con las dos cepas mediante Cromatografía de Gases y Cromatografía
Líquida de Alto Rendimiento , se encontró que no hubo rastros de carbaryl residual ni de
otros metabolitos.

Cuadro 3. Generación de CO2 a partir de carbaryl en

diferentes situaciones: La serie de cuadros corresponde
a la degradación por parte del consorcio microbiano de
las cepas 50581 y 50552; la serie en círculos blancos
corresponde a la degradación por parte de la cepa
50581, en círculos negros luego la generación de CO2
cuando la cepa 50552 ha sido añadida posteriormente, y
en triángulos la cepa 50552 sola. (Chapalamagu et.
al,1991).
En el caso de la cepa 50581, se observó que además de la producción de 1-naftol a partir
de carbaryl, se generó un metabolito que no pudo ser identificado, esto puede ser debido
a que el 1-naftol es tóxico para esta cepa en particular, y por eso evade la ruta metabólica
y sintetiza este metabolito desconocido (Chapalamagu et. al,1991).

En otros estudios realizados se aislaron otras cepas de Pseudomonas sp., Rodococcus y

Bacillus sp. con la capacidad de degradar carbaryl, en los cuales se identificaron que los
principales metabolitos generados eran 1-naftol y 1,4-naftoquinona. La cepa 50581
utilizada no produjo 1,4-naftoquinona (Chapalamagu et. al,1991).

La bibliografía también cita a cepas de Pseudomonas sp. y de Achromobacter sp. que

habían sido aisladas de suelos contaminados con carbofurano y que también presentaron
capacidad para biodegradar carbaryl, sin embargo la cepa 50581 no presentó crecimiento
en un medio minimal con carbofurano como la única fuente de carbono, esto puede
indicar que existe una especificidad en esta cepa para la degradación de carbaryl,
contrario al comportamiento de adaptación cruzada para la degradación de otros
carbamatos (Chapalamagu et. al,1991).

En cuanto a la cepa 50552 se estableció la capacidad para degradar completamente el 1-

naftol sin la generación de metabolitos de por medio, pero no es capaz de metabolizar
carbaryl directamente. Sin embargo se comprobó la capacidad de degradación completa
de carbaryl a través del uso del consorcio de las dos cepas de Pseudomonas sp. , ya sea
que sean inoculadas las dos simultáneamente o que la cepa 50552 sea inoculada en la
fase de crecimiento exponencial de la cepa 50581 una vez que se haya generado 1-naftol,
pero antes de que se genere el metabolito desconocido (Chapalamagu et. al,1991).

Como producto de este consorcio el autor propone la vía metabólica probable para la
degradación completa de carbaryl (Chapalamagu et. al,1991):

Cuadro 4. Ruta metabólica propuesta para la

degradación de carbaryl por el consorcio de cepas 50552
y 50581 de Pseudomonas sp. (Chapalamagu et. al.,
1991).
Aislamiento, cultivo e inoculación de cepas C4, C5, y C6 de Pseudomonas sp.
según la investigación realizada por Swetha et. al. (2005)

Este estudio identifica tres cepas distintas a las utilizadas por Chapalamagu et. al (1991)
para la degradación de carbaryl, utilizándolo como fuente única de carbón que,
dependiendo de cada una de las cepas, hidroliza el carbaryl vía saliciato a gentisato o
catecohol (Swetha et. al., 2005).

Adicional al carbaryl, las tres cepas utilizan además 1-naftol, salicilato y 4-hidrobenzoato
como fuente de carbón (Swetha et. al., 2005).

Nota: Esta investigación está más enfocada a al establecimiento de la ruta metabólica y

del estudio de la actividad enzimática de las tres cepas, pero aporta información muy
importante para la biodegradación de carbaryl a través de estas cepas.

Medio de Cultivo

Las cepas aisladas fueron cultivadas en 150 ml de medio salino minimal en erlemeyer de
500 ml a 30 ºC a pH de 7,5. Para las cepas C4 y C5 los componentes del medio salino
minimal fueron los siguientes: 6 g K2HPO4, 4.1 g KH2PO4, 1 g NH4NO3, 100 mg
MgSO4.7H2O, 1mg MnSO4, 1 mg CuSO4.5H2O, 5 mg FeSO4.7H2O, 1 mg H3BO3, 5 mg
CaCl2.2H2O, 1 mg ZnSO4, 1 mg NaMoO4. Para la cepa C6 la composición es la misma
añadiendo 8 g de K2HPO4 y 1 g de KH2PO4; el medio fue suplementado con 0.1% de
hidrocarburo o 0.25% de glucosa como fuente de carbón. El crecimiento fue monitoreado
mediante espectrofotometría a 540 nm (Swetha et. al., 2005).

Para la identificación de metabolitos el medio fue acidificado a pH 2 con 2 N HCl y extraído

con un volumen igual de acetato de etilo. Esta solución fue analizada vía TLC utilizando
una solución disolvente de hexano, cloroformo y ácido acético en las siguientes
proporciones respectivamente 8:2:1 (vol/vol/vol) (Swetha et. al., 2005).

Dos gramos (2 g) de suelo contaminado con 0.1% de carbaryl fueron inoculados con cada
una de las cepas cultivadas en medio salino minimal. Se les permitió desarrollarse por
cuatro días y luego eran recultivadas cada 48 horas (Swetha et. al., 2005).

Resultados y Discusión

Cuadro 5. Perfil de crecimiento de las

tres cepas de Pseudomonas sp.
utilizadas, en círculo la cepa C4, en
triángulos la cepa C5, y en cuadrado la
cepa C6 en el medio salino minimal
con 0.1% de carbaryl (Swetha et. al.,
2005).
Como se había mencionado anteriormente, el estudio se encuentra enfocado a la actividad
metabólica de las tres cepas, y no a las tazas de degradación de carbaryl explícitamente,
sin embargo en el cuadro anterior observamos el crecimiento de las tres cepas inoculadas
en medio salino minimal con 0.1% de carbaryl, lo cual confirma la metabolización del
sustrato.

Cuadro 6. Cambios espectrales dependientes de tiempo para las reacciones de (A) carbaryl hidroxilasa y (B)
dioxigenasa de gentistato. Las flechas para arriba indican la generación de metabolitos, mientras que las flechas
para abajo indican la metabolización del sustrato (Swetha et. al., 2005)

Cuadro 7. Ruta metabólica propuesta para la

degradación de carbaryl en las tres cepas de
Pseudomonas sp. (C4, C5, C6) (Swetha et. al., 2005).

Como conclusión de este estudio se propone

la siguiente ruta metabólica: Carbaryl > 1-
Naftol > 1,2-dihidroxinaftaleno >
salicilaldehído > salicilato > gentisato >
maleilpiruvato (Swetha et. al., 2005).

Lamentablemente no existen datos explícitos

sobre la eficiencia de degradación del
carbaryl, sin embargo los diagramas
anteriores del crecimiento de las cepas y de
la actividad enzimática, confirman que estas
tres cepas poseen las características
necesarias para degradar grandes
concentraciones de carbaryl, lo cual las hace
cepas ideales para su aplicación en la
degradación y remediación de suelos
contaminados (Swetha et. al., 2005).
Aislamiento, cultivo e inoculación de la cepa RC100 de Arthrobacter sp. según la
investigación realizada por Hayatsu et. al. (1998)

En este estudio, se describe el proceso de aislamiento y caracterización de una cepa de

Arthrobabacter sp. capaz de utilizar al carbaryl como su única fuente de carbón. Además
se establece la ruta metabólica de degradación de carbaryl (Hayatsu et. al., 1998).

Nota: Esta investigación esta más enfocada al aislamiento de dos plásmidos de la cepa
RC100 de Arthrobacter sp. involucrados en la degradación de carbaryl.

Medio de Cultivo

La cepa aislada fue cultivada en medio minimal con 1.0 mM de carbaryl, así como medio
minimal con 1 mM de salicilato y medio minimal suplementado con 0.2% de glucosa,
0.4% de bactotriptona y 0.2% de almidón, a una temperatura de 30ºC y a un pH de 7
(Hayatsu et. al., 1998).

Una muestra de 10 g de suelo expuesto a carbaryl fue suspendido en 100 ml de medio

minimal con carbaryl como fuente de carbón (Hayatsu et. al., 1998).

Resultados y Discusión

El estudio reporta que la cepa RC100 de Arthrobacter sp. inoculada en medio minimal con
0.4 mM de carbaryl fue capaz de degradarlo completamente en 48 horas luego de haber
sido cultivada; en la muestra testigo se observó también una pequeña degradación del
carbaryl, atribuible a hidrólisis química (Hayatsu et. al., 1998).

Los principales metabolitos identificados en el sobrenadante luego de 4h de la inoculación

fueron 1-naftol y ácido salicílico, los cuales fueron identificados a través de Cromatografía
Líquida de Alto Rendimiento (HPLC). Esta cepa fue capaz de crecer en carbaryl, ácido
salisílco y 1-naftol (Hayatsu et. al., 1998).

Cuadro 8. Degradación de carbaryl por

crecimiento de la cepa RC 100 de
Arthrobacter sp. utilizando el carbaryl como
fuente única de carbón. En triángulos la
degradación de carbaryl del testigo debido a
hidrólisis química (Hayatsu et. al., 1998).
 Cuadro 9. Ruta metabólica propuesta para la
degradación de carbaryl por la cepa RC100 de
Arthrobacter sp (Hayatsu et. al., 1998).

La ruta metabólica es muy similar a la

utilizada por otras bacterias degradadoras de
carbamatos, pero difiere en la habilidad para
metabolizar el catecohol, por lo que toma la
ruta de gentisato para llegar a la degradación
completa de carbaryl (Hayatsu et. al., 1998).

Es conocido además que la habilidad de

Arthrobacter de degradar varios compuestos
orgánicos se encuentra codificada en
plásmidos catabólicos (Hayatsu et. al., 1998).

Aislamiento, cultivo e inoculación de la cepa AA101 de Citrobacter sp. según la

investigación realizada por Bahig et. al. (2008)

El objetivo de este estudio es el de determinar la resistencia varias especies de

microorganismos a varios compuestos xenobióticos para determinar cuáles de ellos tienen
el potencial de ser utilizados en aplicaciones de biodegradación (Bahig et. al., 2008).

Se recolectaron muestras de suelos agrícolas, de las cuales se aislaron microorganismos a

través del cultivo en solución salina (0,9%) en agar nutritivo, incubadas a 37ºC por 48
horas. Las colonias que se diferenciaban morfológicamente fueron aisladas y purificadas y
fueron mantenidas en agar nutritivo a 4ºC y recultivadas cada cuatro semanas (Bahig et.
al., 2008).

Medio de Cultivo

Para la prueba de degradación de pesticidas, se aislaron las especies identificadas en

medio salino minimal cuya composición fue la siguiente: 0.5 g (NH4)2SO4, 0.2 g
MgSO4.7H2O, 0.05 g CaCl2, 2.44 g Na2HPO4 y 1.5 g de KH2PO4, un litro de agua destilada
a un pH de 6.8, suplementado con 1mM de fenol, 50 µg/ml de carbaryl ó cipermetrina. La
temperatura de incubación fue de 37ºC (Bahig et. al., 2008).
Aproximadamente, el 61% de las bacterias aisladas fueron capaces de asimilar y utilizar el
carbaryl como única fuente de carbón y energía, la cepa AA101 de Citrobacter sp. mostró
la mejor taza de crecimiento en carbaryl (Bahig et. al., 2008).

Esta cepa fue inoculada en 50 ml de medio salino minimal con 50 µg/ml de carbaryl e
incubada a 37 ºC. El cultivo, recolectado durante una fase avanzada de crecimiento
exponencial fue inoculada en tres matraces con medio salino minimal suplementado con
carbaryl, éstas a su vez fueron incubadas a 30ºC. El crecimiento de la cepa fue
monitoreado constantemente en intervalos regulares vía Densidad Óptica a 600 nm (Bahig
et. al., 2008).

Resultados y Discusión

De las bacterias aisladas, la cepa AA101 de Citrobacter sp. mostró la mayor taza de
degradación de carbaryl por lo que fue seleccionada para los ensayos de biodegradación.
Se siguió el crecimiento del inóculo de carbaryl y de glucosa vía Densidad Óptica a 600 nm
y se encontrón que existe una diferencia significativa en el crecimiento entre los dos
medios; esto puede ser debido a la diferencia en la disponibilidad de la fuente de carbón
(Bahig et. al., 2008).

Se reportó que el crecimiento de esta cepa inoculada en medio salino minimal con
carbaryl como única fuente de carbón fue considerablemente lento y bajo (Bahig et. al.,
2008).

Cuadro 10. Crecimiento de Citrobacter AA101 en
medio salino minimal con carbaryl como fuente única
de carbono (serie de cuadros), medio salino más
glucosa (serie de rombos), cultivo de nutrientes
(serie de triángulos) y medio salino sin fuente de
carbono como testigo (serie de X), todos incubados
a 37ºC (Bahig et. al., 2008).
Cuadro 11. Análisis espectral del sobrenadante del
crecimiento de Citrobacter AA101 en medio salino
minimal con carbaryl al momento del inóculo, a 3 a 6 y a
9 días después, incubado a 37ºC. La flecha a 276 nm
indica el pico de absorción de carbaryl (Bahig et. al.,
2008).
Comparación de los casos de estudio

Antes de comenzar con la comparación de las diferentes especies utilizadas, las cuales han
sido revisadas previamente, es de importancia establecer que el objetivo de este estudio es
identificar la mejor opción para una biodegradación completa de carbaryl a CO2+H2O.

Por el objetivo expuesto, la reacción buscada (utilizando la fórmula promedio de biomasa),

independientemente de la ruta metabólica que se elija, debería ser la siguiente:

Balanceando obtenemos la siguiente reacción teórica

Es pertinente realizar la comparación de cada caso tomando en cuenta los aspectos

relevantes del proceso: diseño del medio del cultivo y resultados obtenidos.

Resultados y Discusión

Comparación del Medio de Cultivo

Temperatura
pH del
Cepa Medio Composición de
medio
Incubación
10 g NaCl
Pseudomonas sp.
Minimal 10 g triptona 30ºC 7
(cepa 50552)
5 g de almidón
10 g NaCl
Pseudomonas sp.
Minimal 10 g triptona 30ºC 7
(cepa 50581)
5 g de almidón
10 g NaCl
Consorcio cepas
Minimal 10 g triptona 30ºC 7
50552-50581
5 g de almidón
6 g K2HPO4
4.1 g KH2PO4
1 g NH4NO3
100 mg MgSO4.7H2O
1mg MnSO4
1 mg CuSO4.5H2O
Pseudomonas Salino
5 mg FeSO4.7H2O 30ºC 7.5-8
cepa C4 Minimal
1 mg H3BO3
5 mg CaCl2.2H2O
1 mg ZnSO4
1 mg NaMoO4
0.1% hidrocarburo
0.25% glucosa
6 g K2HPO4
4.1 g KH2PO4
1 g NH4NO3
100 mg MgSO4.7H2O
Pseudomonas Salino
1mg MnSO4 30ºC 7.5-8
cepa C5 Minimal
1 mg CuSO4.5H2O
5 mg FeSO4.7H2O
1 mg H3BO3
5 mg CaCl2.2H2O
 1 mg ZnSO4
1 mg NaMoO4
0.1% hidrocarburo
0.25% glucosa
6 g K2HPO4
4.1 g KH2PO4
1 g NH4NO3
100 mg MgSO4.7H2O
1mg MnSO4
1 mg CuSO4.5H2O
5 mg FeSO4.7H2O
Pseudomonas Salino
1 mg H3BO3 30ºC 7.5-8
cepa C6 Minimal
5 mg CaCl2.2H2O
1 mg ZnSO4
1 mg NaMoO4
8 g de K2HPO4 y 1 g de
KH2PO4
0.1% hidrocarburo
0.25% glucosa
1 mM salilciliato
Arthrobacter sp. 0.2% glucosa
Minimal 30ºC 7
cepa RC100 0.4% bactotriptona
0.2% de almidón
0.5 g (NH4)2SO4
0.2 g MgSO4.7H2O
Citrobacter sp. Salino 0.05 g CaCl2
30ºC 6.8
cepa AA101 Minimal 2.44 g Na2HPO4
1.5 g de KH2PO4
1mM fenol
(Bahig et. al., 2008), (Chapalamagu et. al.,1991), (Hayatsu et. al., 1998), (Swetha et. al.,
2005)

En primer lugar, tomando en cuenta los componentes que se requieren para la preparación
del medio de cultivo para la incubación de las diferentes cepas degradadoras de carbaryl, la
opción más favorable sería optar por las cepas de Pseudomonas sp. de la investigación de
Chapalamagu et. al. (1991) o por la cepa de Arthrobacter sp. del estudio llevado a cabo por
Hayatsu et. al. (1998); sobre todo si se tiene en mente una escalada del bioprocesos para
biomagnificación o tratamiento de grandes volúmenes de suelo contaminado a través de
landfarming, considerando el componente económico del proyecto.

En cuanto a la temperatura, todos los autores concuerdan en que la temperatura a la que se

debe trabajar para la degradación de carbaryl es de 30ºC, y el pH varía según las diferentes
cepas de 6.8 a 8, el cual constituye un rango bastante restringido, lo que nos indica que lo
óptimo es trabajar en un pH neutro de 7 a 7.5. En este caso no existe un limitante para
trabajar con cualquiera de las cepas mencionadas, el control de este parámetro se lo
realizaría directamente en el suelo a tratar, por lo que la mejor opción en este caso sería
trabajar mediante landfarming.

Comparación de resultados

Cantidad de Carbaryl Tiempo de Producto de

Cepa
Inoculada Degradación Degradación
Pseudomonas sp. 1-naftol+
1 mg 40 horas
(cepa 50581) Metabolito desconocido
Pseudomonas sp. No degrada carbaryl
36 horas CO2+H2O
(cepa 50552) (degradación 1mg 1-
 naftol)
Consorcio cepas
1 mg 36 horas CO2+H2O
50552-50581
Pseudomonas
20 mg ¿? CO2+H2O

cepa C4
Pseudomonas
20 mg ¿? CO2+H2O

cepa C5
Pseudomonas
20 mg ¿? CO2+H2O

cepa C6
Arthrobacter sp.
8.04 mg 48 horas CO2+H2O
cepa RC100
Citrobacter sp.
50 mg ¿? ¿?
cepa AA101
(Bahig et. al., 2008), (Chapalamagu et. al.,1991), (Hayatsu et. al., 1998), (Swetha et. al.,
2005)

Comparando los resultados de la degradación de carbaryl de las diferentes cepas revisadas,

podemos establecer lo siguiente:

La cepa que menos se acerca al comportamiento deseado es Citrobacter sp. cepa AA101, en
el mismo estudio se concluye que, aunque relativamente fue la cepa que mayor crecimiento
tuvo entre todas las cepas que fueron capaces de crecer en un medio con carbaryl como
única fuente de carbón, el crecimiento en una muestra de 50 mg de carbaryl, el crecimiento
fue lento y bajo (Bahig et. al., 2008). Además no se indica que haya sido capaz de degradar
completamente la cantidad de carbaryl a la que estuvo expuesta; por este motivo queda
descartada como la cepa ideal para nuestro objetivo de bioremediación de suelos
contaminados con este carbamato.

Por otro lado, tenemos el caso de las tres cepas de Pseudomonas sp. (C4, C5 y C6), que a
pesar de que tuvieron un crecimiento favorable en exposición a la mayor cantidad de carbaryl
de todas las alternativas revisadas (20 mg), y que en la discusión se la reporta como una de
las mejores alternativas para aplicaciones de biodegradación (Swetha et. al., 2005), no se
indica explícitamente si cualquiera de estas cepas fue capaz de degradar completamente todo
el carbaryl presente, a pesar de que la ruta metabólica sugiere una degradación completa a
CO2+H2O, ni el tiempo en el que lo haría. Como referencia, se ha definido en el estudio que
las tres cepas entran a un crecimiento estacionario a las 20 horas de haber sido inoculados
(Swetha et. al., 2005), sin embargo esto no confirma explícitamente que se haya degradado
todo el carbaryl. Para su aplicación en el proceso de bioremediación de suelos contaminados
con carbaryl, se debería confirmar esta información.

En cuanto a las dos cepas restantes de Pseudomonas sp. (50581 y 50552) se identificó que
individualmente no degradan completamente el carbaryl: la cepa 50581 lo degrada hasta 1-
naftol en la fase de crecimiento exponencial, luego al entrar a la fase estacionaria comienza a
metabolizar el 1-naftol a un metabolito no identificado. La cepa 50552 por sí misma no
degrada carbaryl en absoluto, fue aislada por su capacidad de degradar 1-naftol, producido
por la cepa 50581 en la fase de crecimiento exponencial, a CO2+H2O. Además se identificó la
especificidad de estas cepas para la degradación de carbaryl, ya que no mostraron
crecimiento en otro tipo de carbamatos (Chapalamagu et. al.,1991). La única forma en que
estas dos cepas contribuyen a nuestro objetivo de bioremediación de suelos contaminados
con carbaryl, es el uso de un complejo de los dos microorganismos para lograr metabolizar
completamente este pesticida, pero esto puede suponer una dificultad en la escalada para la
aplicación en landfarming, tal como se ha planteado.

Por último, tenemos el caso de la cepa RC100 de Arthrobacter sp., la cual fue capaz de
degradar 0.4mM de carbaryl (80.4 g) en 48 horas luego de haber sido inoculada. Adicional a
esta respuesta tan acelerada, se determinó que esta cepa, debido a la codificación de dos
plásmidos específicos, degrada el carbaryl a 1-naftol, y puede seguir degradándolo
directamente a CO2+H2O, sin necesidad de crear un consorcio para complementar la ruta
metabólica (Hayatsu et. al., 1998).

A mi criterio, la mejor opción para la biodegradación de suelos contaminados con carbaryl en

la industria bananera es la cepa RC100 de Arthrobacter sp., y en segundo lugar optaría por el
uso del consocio de las cepas 50581 y 50552 de Pseudomonas sp., tanto por las tazas de
degradación de carbaryl, el tiempo en que lo hacen, y el costo de la preparación del medio de
cultivo.

El uso de las otras tres cepas de Pseudomonas sp. dependería de la confirmación cuantitativa
de la taza de degradación del pesticida en cuestión y del tiempo requerido, un punto en
contra de esta opción es el costo de la preparación de los medios de cultivo, pero al parecer
por la cantidad de carbaryl utilizada en los ensayos, puede ser la opción más efectiva, aunque
debe ser comprobada cuantitativamente su taza de degradación.

Conclusiones

Habiendo revisado los aspectos más importantes del desarrollo de las diferentes opciones
analizadas para proponerlas para el tratamiento de carbaryl en suelos contaminados en la
industria bananera, se estableció que la mejor opción es el uso de la cepa RC100 de
Arthropobacter sp. debido a los resultados mostrados en cuanto a la taza más eficiente de
degradación de este carbamato en comparación a las revisadas en los demás estudios y a la
relativa sencillez de los componentes del medio de cultivo, lo que supone una inversión
menor en la escalada para un proceso de bioremediación de suelos.

El uso del consorcio de las cepas 50581 y 50552 de Pseudomonas sp. también mostró ser
efectivo para la degradación de carbaryl, y a pesar de que el medio de cultivo es que
supondría una menor dificultad, sobre todo para la escalada, no se lo aconsejó como la
alternativa principal debido a la dificultad que podría suponer el aislamiento de estas dos
cepas específicas. Otro punto en contra es la especificidad que han desarrollado estas dos
bacterias para la degradación específica de carbaryl, ya que no fueron efectivos al momento
de degradar otros carbamatos, lo cual contrasta con la habilidad mostrada por las demás
cepas para crecer en otros carbamatos como fuente única de carbón y energía, lo cual crea
una condición ideal para el tratamiento de suelos expuestos a fumigaciones cíclicas.

No se propuso el uso de las cepas C4, C5 y C6 de Pseudomonas sp. debido a la falta de

información sobre las tazas de degradación de carbaryl, aunque en la bibliografía se
mencionó que estas tres cepas constituyen una buena alternativa para el tratamiento
biológico de pesticidas. Además, el medio de cultivo es más complejo que el de las otras
cepas, lo que se traduce en un costo mayor para la escalada.

La bibliografía revisada coincide, en que con respecto a los parámetros críticos para el
desarrollo de bacterias degradadoras de carbaryl en laboratorio, se debe mantener una
temperatura de 30ºC y un pH entre 6.8 y 8, como única fuente de carbono y energía se
utilizó el carbaryl, pero en algunos casos, principalmente en el medio de cultivo de las cepas
C4, C5 y C6 de Pseudomonas sp. se añadieron más elementos constituyentes, lo cual supone
un costo elevado en la escalada del bioproceso, por lo que se priorizó la atención a las
especies cuyo medio de cultivo era más sencillo.
Recomendaciones

Se recomienda en primer lugar realizar un estudio taxonómico de las cepas analizadas, que
nos permita identificar a qué especie pertenecen y tener un conocimiento más amplio de sus
características, para poder confirmar o replantear los resultados y conclusiones realizados en
este trabajo.

También es necesario complementar la información bibliográfica referente a la capacidad de

degradación de pesticidas de las cepas C4, C5 y C6 de Pseudomonas sp., para determinar si
su aplicación en tratamiento de suelos contaminados con carbaryl es económicamente
factible, sobre todo tomando en cuenta que el medio de cultivo para el desarrollo de estas
cepas es el más complejo de los analizados, por lo que se requiere una justificación
fundamentada en una taza de degradación ideal para justificar la escala de este bioproceso.

Tomando en cuenta los parámetros críticos expuestos anteriormente, se debería revisar si se

requieren las mismas condiciones para la escalada a un bioproceso a nivel de landfarming o
biopilas para tratamiento ex situ o bioaumentación para tratamientos in situ.

Bibliografía

- Araya, M., 2004, “La Biodegradación Acelerada de Nematicidas No-Fumigantes en

Plantaciones Comerciales de Banano (Musa AAA)” CORBANA S.A. Guápiles, Costa
Rica.

- Bahig, A., Aly, E., Khaled, A., Amel, K., 2008, “Isolation, Characterization and
Application of bacterial population from agricultural soil at Sohag Province, Egypt”
Sohag University, Egipto.

- Chapalamagu, S., Chaudhry, R., 1991, “Hydrolysis of Carbaryl by a Pseudomonas sp.

and Construction of a Microbial Consortium That Completely Metabolizes Carbaryl”
Oakland University.

- Hayatsu, M., Hirano, M., Nagata, T., 1998, “Involvement of Two Plasmids in the
Degradation of Carbaryl by Arhthrobacter sp. Strain RC100” National Institute of
Food, Tukuba, Japón.

- INIBAP, CATIE, CORBANA, INIA, IDIAP, IDIAF, CEDAF, 2004, “Innovaciones

tecnológicas para el manejo de la calidad y salud de suelos bananeros de América
Latina y el Caribe” INIBAP. Washington, Estados Unidos.

- Ministerio de Ambiente, 2004, “Texto Unificado de Legislación Ambiental Secundaria

Capítulo VI Anexo 1: NORMA DE CALIDAD AMBIENTAL Y DE DESCARGA DE
EFLUENTES : RECURSO AGUA”

- Swetha, V., Phale, P., 2005, “Metabolism of Carbaryl via 1,2-Dihydroxynaphthalene

by Soil Isolates Pseudomonas sp. Strains C4, C5 and C6. Institute of Technology,
Bombay, India.

- Xu, S., 2000, “Environmental Fate of Carbaryl” Environmental Monitoring & Pest
Management. Sacramento, Estados Unidos.