Instituto Politcnico

Nacional
Escuela Nacional de
Ciencias Biolgicas
CURSO PRCTICO DE
MTODOS DE ANLISIS
Separacin de una mezcla de dos
aminocidos por Cromatografa de
Intercambio inico
Profesores:
Claudia Albany Resndiz Mora
Fernndez Lpez Francisco Carmelo.
5QM2, Seccin 2
Fechas de realizacin 22 y 25 Abril 2014
Fecha de entrega 06 de Mayo 2014

Alumno:
Romero Gonzlez Luis Emmanuel

OBJETIVOS
o
o

Emplear la tcnica de intercambio inico para la separacin de dos

aminocidos.
Comprobar la separacin mediante una reaccin colorida y el perfil de
elucin.

FUNDAMENTO
La cromatografa por intercambio inico es
logsticamente similar a la cromatografa por
afinidad. En ambos casos se usa una columna con
resina que se une a la protena de inters. Sin
embargo, en la cromatografa por intercambio
inico la interaccin es menos especfica y se basa
en la carga neta. Una resina de intercambio inico
tiene un ligando con carga positiva o negativa. Si
tiene carga negativa, es un intercambiador de
cationes.
La columna se equilibra al inicio con un
amortiguador de pH y fuerza inica apropiados. La
resina de intercambio se une a contraiones. Las protenas cuya carga neta sea
opuesta a la del intercambiador se quedarn en la columna, intercambindose por
los contraiones unidos. Las protenas que no tengan carga neta o que posean la
misma carga que el intercambiador saldr con el eluyente.

DATOS EXPERIMENTALES
1. Complete la siguiente tabla
Tubo No.

Volumen de elucin
(mL)

Tubo
No.

18
0.007

6
9

12

15

0.008

21

18
21
24
27
30
33
36
39
42
45

0.70
3

78

0.11
8

81

0.11
7

84

0.34
9

87

0.16
7

90

0.58
7

93

0.19
8

96

0.24

31
0.515

15

75

30
0.456

14

72

0.69
9

29
0.497

13

0.85
5

28
0.194

12

69

27
0.505

11

66

0.10
3

26
0.536

10

0.09

25
0.499

63

24
0.366

60

0.06
5

23
0.072

57

0.05
8

22
0.043

54

20
0

0.119

32

0.31
2

19
0.021

Volumen de
elucin
(mL)

2
16

48

33
0

17

51

34

99

0.22
6

102

0.84

35
105
36
108
37
En los tubos del 16 al 18 fue donde se llevo a cabo el
cambio de fase mvil, la solucin reguladora cambio
de pH 5.25 a pH 2.

111
38
114
38
117
40

120
Tabla 1. Separacin de la prolina y la histidina

0.53
5
0.30
1
0.42
3
0.24
5
0.07
7
0.11
5

Figura 1. Perfil de elucin, en el cual se observa, en el eje de las abscisas el

volumen de elucin y en un eje de ordenadas, a la izquierda el valor
correspondiente de A400 La lnea roja representa la elucin de la prolina y la lnea
amarilla representa la elucin de la histidina.
HISTIDINA

pK 1=6.0
pK 2 = 9.17
pI = (pK 1 + pK 2)/2
pI = (6.0+9.17)/2= 7.585

PROLINA

pK C / pK 1 =1.99
pK N / pK 2=10.60
pI = (pK 1 + pK 2)/2
pI = (1.99+10.60)/2= 6.295
CUESTIONARIO
a) Cul de los aminocidos eluy primero? Explique por qu.
El primero en eluir fue la prolina ya que este solo tendr un grupo cargado
positivamente y la histidina contara con dos por lo cual ser mas afn a ser
intercambiado por el ion mvil del intercambiador permitiendo que la prolina eluya
primero.
b) Cul es la importancia de regular la velocidad de elucin, qu pasa a altas y a
bajas velocidades?
Esto es importante para que a la velocidad en que se eluya no sea demasiado alta
para as permitir que el ion pueda ser sustituido en su totalidad y no solo un parte
de este, quedando retenido en el intercambiador y a una velocidad baja el tiempo

de la separacin sera demasiado. Asi que el regular la velocidad nos permitir

obtener una buena separacin.

DISCUSIN
Como se sabe este tipo de cromatografa por intercambio inico se basa en la
separacin de las molculas en base a la carga con la que cuentan. Para la esta
prctica de separacin de una mezcla de dos aminocidos los cuales fueron
prolina e histidina se utiliz un intercambiador catinico dbil (amberlita IRC-50)
que tiene como in fijo al COO- y como in mvil al H+, que al ser previamente
hinchada en buffer de citrato de sodio pH 5.25 se intercambi el H + por el ion Na+,
ya que este se encuentra en alta concentracin. Despus de esto se realizo el
empaquetamiento de la columna con el intercambiador y se aplic la muestra que
contena la mezcla de los aminocidos y se eluy primero con regulador de
citratos pH 5.25, a este pH ambos aminocidos tienen carga positiva con la
diferencia de que la histidina tendr 2 grupos cargados positivamente uno es el
grupo amino y otro es el de su cadena lateral imidazol, ya que el pka de la
histidina para el grupo amino es de 6.0 y para el grupo imidazol es de 9.17, estos
valores nos indican que a pH por debajo de 9 .17 tendr el grupo imidazol con
carga positiva y a pH por debajo de 6 tendr al grupo imidazol y al amino cargado
positivamente, mientras que la prolina solo tiene uno que es el grupo amino del
esqueleto del aminocido cuyo pka es de aproximadamente 10.60, esta diferencia
hace que la histidina sea ms positiva por lo que quedara unida al ion fijo del
intercambiador liberando al Na+ que ocupaba ese lugar, posteriormente al cambiar
el pH a 2 significara que habr mayor cantidad de protones aumentando as la
concentracin de iones H+ que desplazaran a la histidina del intercambiador
permitiendo su elucin.
Una vez obtenidas las fracciones en tubos de ensaye, se realizo una reaccin
colorida con ninhidrina para comprobar si se haba llevado a cabo la separacin de
los aminocidos empleados, el color que se obtiene al reaccionar la ninhidrina con
la prolina resulta de una tonalidad amarilla mientras que la reaccin con la
histidina da un color violeta, aplicando un mtodo espectrofotomtrico esto nos
permite realizar un perfil de elucin midiendo su absorbancia a distintas longitudes
de onda 400 nm para el tono violeta y 570 nm para el amarillo.
Hay que resaltar que durante el proceso de la separacin y en vista de los
resultados obtenidos, una mala separacin, lo cual se puede deber a que el
momento de empaquetar la columna se observ la formacin de estratos; as
como la presencia de burbujas, que adems de ser una muestra de un mal
empaquetamiento nos interfieren con la elucin de los aminocidos ya que en
estas pueden quedarse atrapados y provocar distorsiones del cromatograma al
salir despus. Este tipo de factores, as como la incubacin, la cual pudo llevarse
por ms del tiempo necesario con lo cual se evaporo el diluyente de la ninhidrina
que era etanol, produciendo la disminucin del volumen con lo que se podra
obtener una absorbancia diferente al estar hasta cierto punto ms concentrada la
muestra por la evaporacin.

Todos estos factores son los que pudiesen explicar el cromatograma que se mostr
anteriormente. Resultado en la presencia de varios picos y valles lo que nos indica
tanto una mala resolucin, como una mala separacin.

CONCLUSIN
Empleando la tcnica de intercambio inico se separaron dos aminocidos de
acuerdo a la carga con la que cuentan y a sus grupos ionizable.
Mediante una reaccin con ninhidrina se realizo el perfil de elucin ya que estos
absorben a diferentes longitudes de onda.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Mary K. Campbell,Shawn O. Farrell. Bioqumica (2003) Editorial Thomson, 4ta
edicin. Mxico. Pg. 118-123
Donald Voet,Judith G. Voet. Bioqumica (2004) Editorial medica Panamericana, 3ra
edicin. Montevideo, Uruguay. Pg. 142-143