Tcnica de CGH-array

Mara Rodrguez-Rivera

Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de Patologia.

Hospital del Mar. Programa de Cncer-IMIM. Barcelona

ndice
Introduccin a los microarrays
Arrays genmicos

Condiciones del ADN

Tcnica de CGH-array
Aplicaciones

Introduccin

Qu es un microarray?

Tipos de microarrays

Introduccin

Qu es un microarray?

Tipos de microarrays

Introduccin: Qu es un microarray?
Mikro (del griego,pequeo) y array (del ingls,distribucin
ordenada)
Coleccin de biomolculas ordenadas en filas y columnas
sobre un soporte slido miniaturizado.

Introduccin

Que es un microarray?

Tipos de microarrays

Introduccin: Tipos de microarrays

Tejido (TMA)
Protenas
Clulas
Genmicos
Expresin
miRNA
Metilacin

Introduccin: Tipos de microarrays

Tejido (TMA)
Protenas
Clulas
Genmicos
Expresin
miRNA
Metilacin

Microarrays genmicos

Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte
slido que permiten detectar alteraciones en el genoma
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)

Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte
slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)

Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Microarrays genmicos: Arrays de CGH

Array de BACs:

- BAC: Bacterial Artificial Chromosome

- Puede ser casero
- Perkin ElmerTM, BlueGnomeTM

Array de oligos comerciales:

- Oligonucletido: secuencias pequeas de ADN 50pb

- Agilent TechnologiesTM, NimbleGen (RocheTM), BlueGnomeTM

- Diferentes formatos
- Microarrays prefabricados o custom

Microarrays genmicos: Arrays de CGH

Estudio de hibridacin comparativa (ADN tumoral vs ADN

control) que permite detectar ganancias y/o prdidas de
material gentico

Microarrays de CGH

Microarrays genmicos
Coleccin de sondas de ADN dispuestas sobre un soporte
slido que permiten detectar alteraciones en el genoma.
Tipos de microarrays genmicos:
Arrays de CGH (Comparative Genome Hybridization)

Arrays de SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Microarrays genmicos: Arrays de SNPs

Contiene adems sondas de oligonucletidos
correspondientes a variantes allicas de SNPs seleccionados
(oligoarray).
SNP ( Single nucleotide polymorphism ):
- Variacin de la secuencia de ADN que afecta a una
sola base
- 1 SNP cada 1000 bases

Microarrays genmicos: Arrays de SNPs

Permite obtener el nmero de copias de ADN y el
genotipo (seal de fluorescencia para cada alelo)
Hibridacin no competitiva:
- La muestra problema y control (si disponible) se hibridan
en arrays independientes
- Posterior comparacin de resultados

Microarrays de SNP

Microarrays genmicos: Arrays de SNPs

Prdida de heterocigosidad sin cambio en el nmero de copias
(CNN-LOH)

Importancia en genes supresores de tumores:

mutacin heterocigota mutacin homocigota

Genes supresores de tumores: p53

Mutacin p53

Proliferacin
clulas
anormales

CGH vs SNP

CGH

SNP

Hibridacin competitiva

Hibridacin no competitiva

Muestra y control en
un mismo array

Muestra y control se hibridan

por separado

Ganancias y prdidas

Ganancias y prdidas
LOH

CGH y SNP:Limitaciones

No detecta alteraciones equilibradas

No detecta diferentes clones

>30% clulas tumorales

Protocolo tcnico
arrays CGH

Microarrays genmicos: ADN

ADN:
Sangre perifrica o mdula sea
Separacin de poblaciones celulares (microbeads)

Tejido en fresco
Tejido congelado (OCT)
Micro-Macrodiseccin del tumor

Parafina
Micro-Macrodiseccin del tumor

ADN: Tipos de extraccin

Extraccin automatizada

Extraccin manual
Kits columnas
Kit manual

ADN: Tipos de extraccin

Extraccin automatizada

Extraccin manual
Kits columnas
Kit manual

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

ADN: Criterios de calidad

Cantidad ADN:
500ng

Calidad ADN:
Espectofotmetro

ADN: Criterios de calidad

Espectofotmetro: NanoDrop 1000
Ratio ADN/ARN (A260/280) > 1.80
Ratio ADN/alcoholes, fenoles (A260/230) > 1.80

Concentracin

ADN: Criterios de calidad

Integridad ADN

ADN no degradado

ADN degradado (smear)

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

Marcaje del ADN

ADN tumoral

ADN control

Desnaturalizacin

Marcaje

Cy5 -dUTP

Cy3 -dUTP

Marcaje del ADN

Marcaje aleatorio (Random Priming)

Marcaje del ADN

Marcaje aleatorio (Random Priming)

Marcaje del ADN

Marcaje aleatorio (Random Priming)

Marcaje del ADN

Marcaje aleatorio (Random Priming)

Hibridacin
Preparacin del array e hibridacin (muestra y control)

Muestra (Cy5)
Hibridacin
Control (Cy3)

Hibridacin: Preparacin del array

Unimos el mixer con el array

Hibridacin
Pipeteamos la muestra dentro del mixer

Hibridacin
Horneado

48-72h

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

Lavados y secado
Lavados de astringencia

Secado

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

Escaneado del array

Plataforma MS200 NimbleGen, ROCHE TM

Preparacin ADN

Marcaje

Hibridacin

Lavados y secado

Escaneado

Anlisis de datos

Visualizacin de datos
Se obtiene una imagen con la lectura de los dos
fluorocromos (Cy3 y Cy5)
Se genera un archivo por cada fluorocromo para poder
analizar en forma de datos

Anlisis
ADN tumoral > ADN control
Ganancia

ADN tumoral < ADN control

Prdida
ADN tumoral = ADN control
Normal

Anlisis de datos

Software para la visualizacin de los datos

Anlisis paralelo con tablas de datos

Anlisis de datos

Software para la visualizacin de los datos

Anlisis paralelo con tablas de datos

Anlisis de datos: Principios

Sonda

Cromosoma

Ideograma

Cariotipo
molecular

Anlisis visual: Ejemplos

DEVA

Anlisis visual: Ejemplos

Nexus

Anlisis visual: Ejemplos

Ganancia
Prdida
Nexus

Anlisis de datos

Software para la visualizacin de los datos

Anlisis paralelo con tablas de datos

Anlisis datos: Ejemplos

N sondas: > 5
Log2 Ratio: < - 0.2 (Prdidas)
> 0.2 (Ganancias)

Aplicaciones
arrays genmicos

Aplicaciones arrays genmicos

Oncohematologa
Diagnstico
Pronstico
Investigacin

Post-natal y Pre-natal
Sndromes asociados a ganancias/prdidas de material gentico:
Deleciones: ej sndrome de Cri-du-chat (5p-)
Aneuploidias: +21 (Sd.Down), +13 (Sd.Patau), +18 (Sd.Edwards), +X/Y
(Sd.Turner, )
Alteraciones en genes asociados a retraso mental y autismo

Nuevos sndromes

Aplicaciones arrays genmicos: Ejemplos

Estudio de carcinomas de clulas renales (CCR) mediante
arrays de CGH y cariotipo
N=24

16 CCR de clulas claras

5 CCR papilares
2 CCR cromfobos
1 Oncocitoma

Tejido fresco:
Estudio citogentico
Extraccin ADN

Poster SEAP- 081. M.Salido

CCR-CC: Citogentica

45,X,add(X)(p28),der(1)t(1;1)(p36;q12),del(3)(p14),-14

CCR-CC: CGH-arrays

CCR-CC: CG vs CGH-arrays

Resumen

Buena herramienta complementaria

Diferentes formatos
Limitaciones
Coste cada vez menor

Agradecimientos:
Dra.Blanca Espinet
Dra.Marta Salido
Dra.Anna Puiggros
Carme Melero
Dra.Silvia de Muga

Dra.Nuria Juanpere
Dr.Josep Lloreta
Dr.Josep M Corominas
Prof.Sergi Serrano
Agradecimientos:

Laboratori de Citogentica Molecular. Servei de

Patologia. Hospital del Mar. Programa de CncerIMIM. Barcelona