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IV.

Resultados y Discusin

IV.

RESULTADOS Y DISCUSION

IV.1.

EVALUACIN DE LA CAPACIDAD BACTERICIDA DE UN PATRON DE NISINA


Con

la

finalidad

de

obtener

un

parmetro

de

medida

de

la

actividad

bactericida/bacteriostatica que permita cuantificar la actividad antimicrobiana de los


productos metablicos producidos por L. lactis, se utiliz como patrn la nisina y se testaron
diferentes metodologas para cuantificar su actividad antimicrobiana como fueron la
propuesta por Delgado et al. (2005) y la basada en la curva de calibrado obtenida a partir del
modelo dosis-respuesta para distintas concentraciones de nisina y considerando como
respuesta la inhibicin del crecimiento de L. innocua.
a.- La propuesta por Delgado et al. (2005)
La metodologa propuesta por Delgado et al. (2005) permite cuantificar la actividad
antimicrobiana de diversas sustancias en base a un patrn de nisina. A tal efecto, se
determina el dimetro del halo de inhibicin producido por la sustancia a testar y el obtenido
para un estndar de nisina. La actividad antimicrobiana se expresa como potencia en base a
una ecuacin matemtica (ecuacin 7).

(ecuacin 7)
Donde Am= rea del halo de la muestra a testar (mm 2), Ae= rea del halo del
estndar de nisina (mm2) y m= valor de la pendiente obtenido a partir del modelo dosisrespuesta (patrn de nisina frente a el microorganismo indicador expresado en
mm2/unidades de concentracin).
Este modelo lineal se basa en que los halos de inhibicin detectados, o respuesta
inhibitoria, varan linealmente con el logaritmo de la concentracin de sustancias
antimicrobianas, lo que implica que la pendiente de la curva dosis-respuesta es constante
para una bacteriocina dada, por lo tanto esta es considerada un parmetro de sensibilidad.

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IV. Resultados y Discusin

El valor de la pendiente de la recta dosis-respuesta para L. innocua se obtuvo


mediante la correlacin entre las concentraciones de nisina (expresadas en logaritmos
neperianos) y rea de los halos de inhibicin detectados utilizando la tcnica de difusin en
agar (apartado III.3.1.3.a.) y la metodologa descrita en el apartado III.3.2.
La figura IV.1. muestra la correlacin lineal entre las distintas dosis de nisina testadas
y las reas de inhibicin detectadas para el microorganismo indicador. El ajuste lineal
obtenido a partir de estos datos experimentales viene reflejado en la ecuacin 8 que se
muestran en la tabla IV.1. Considerando que la precisin de este mtodo de cuantificacin
est relacionada con los coeficientes de correlacin (R 2) y siendo este 0, 9955, se
corroborara la validez del modelo propuesto por Delgado et al. (2005).

rea de Inhibicin (mm2)

350
300
2

250
200
150
100
50
0
0

4
5
Ln C (mg/L)

Figura IV.1. Relacin entre el rea de inhibicin (mm2) y el logaritmo neperiano (Ln) de la
concentracin de nisina (mg/L) para L. innocua.

Cabe destacar que los lmites de deteccin para la nisina, bajo estas condiciones,
fueron de 25 mg/L a 1000 mg/L. Estos resultados coinciden con los observados por
Pongharangku & Demirci (2004). Con concentraciones de nisina de 1100 y 1200 mg/L no se
observ un incremento del halo de inhibicin respecto al obtenido con una dosis de 1000
mg/L, lo que indicara que la difusividad de la solucin de nisina en el agar no es infinita
(tabla IV.1). As, es de resaltar que las zonas de inhibicin se ven condicionadas por
mltiples factores como son el tipo de medio, la presencia o ausencia de surfactantes, la
pred-difusin (Pongtharangkul & Demirci, 2004) as como la variabilidad de bacteriocinas
(Delgado et al., 2005).

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IV. Resultados y Discusin

Tabla IV.1. Ajuste lineal de la relacin entre el logaritmo neperiano de la concentracin de nisina y el
rea del halo de inhibicin en mm2.
N ecuacin
8

Ecuacin
A = 49,549 LnC 58,956

R2
0, 99

A = Area de inhibicin (mm2); C= concentracin de nisina (mg/L)

El parmetro caracterstico m (valor de la pendiente obtenido a partir del modelo


dosis respuesta) para el microorganismo indicador L. innocua, permitir en las siguientes
fases de este trabajo, evaluar la actividad antimicrobiana en base a la potencia bactericida
en comparacin por la generada por la nisina, a partir de la ecuacin 8.
b.- La basada en la curva de calibrado obtenida a partir modelo de relacin dosis-respuesta
La segunda metodologa utilizada en el presente trabajo para calcular la actividad
bactericida est basada en una curva de calibrado obtenida a partir de un modelo de
relacin dosis-respuesta. En este caso se utilizaron tanto la tcnica de difusin en agar
siguiendo la misma metodologa que en el apartado anterior y la tcnica de dilucin en caldo
(III.3.1.3.b.) siguiendo la metodologa descrita en el apartado III.3.2.
As, a partir de los halos de inhibicin obtenidos, al testar diferentes concentraciones
de nisina utilizando la tcnica de difusin en agar, se represent la relacin existente entre el
logaritmo de la concentracin de nisina utilizada y estos. En la figura IV.2 se muestra a
relacin entre el dimetro del halo generado (mm) y la concentracin de nisina,
obtenindose la ecuacin 9 (tabla IV.2).

Log C (mg/L)

8
7
6
5
4
3
2
1
0
0

10
15
20
25
Dimetro del halo de inhibicin (mm))

Figura IV.2. Relacin entre el dimetro de inhibicin (mm) y el logaritmo de la concentracin


de nisina (Log C) (mg/L) para L. innocua.

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IV. Resultados y Discusin

Tambin se evalu la actividad antimicrobiana de la nisina mediante la tcnica de la


dilucin en tubo representndose la carga microbiana residual (ufc/mL) frente a la
concentracin de nisina testada (mg/L). En la figura IV.3. se muestra cual fue esta relacin,
adems del intervalo prctico de accin.

En este ltimo caso, se represent la

concentracin de nisina (mg/mL) frente la poblacin residual de L. innocua expresada como


log ufc/mL, obtenindose as la ecuacin 10 (tabla IV.2).

a)

b)

Figura IV.3. a) Relacin entre la concentracin de nisina (mg/L) y los recuentos de Listeria innocua
(ufc/mL) b) Ampliacin del intervalo prctico de accin, concentracin de nisina (mg/L) frente al
logaritmo de las ufc/mL de L. innocua.

Como se puede observar en la figura IV.3 la nisina tuvo una marcada actividad
antimirobiana frente a Listeria innocua, siendo la CMI (concentracin mnima) que gener la
mortalidad total de 300 mg/L 300 UI/mL.
Las ecuaciones obtenidas tras el ajuste lineal de las curvas dosis-respuesta
obtenidas tanto mediante las tcnicas de difusin en agar como mediante la de dilucin en
tubo (figuras IV.2 y IV.3, respectivamente) se muestran en la tabla IV.2.
Tabla IV.2. Ajuste lineal de las relaciones dosis-respuesta de la nisina frente a L. innocua, obtenidas
mediante la tcnica de difusin en agar (ecuacin 9) y dilucin en tubo (ecuacin 10).
N ecuacin
9
10

Ecuacin
Log C = 0,2149*(D) 1,0951
log(ufc/mL) = - 0,0426* C + 5,6928

R2
0,99
0,99

D= Dimetro de inhibicin (mm); C= concentracin de nisina (mg/L)

A partir de estas ecuaciones, se pudo calcular la actividad antimicrobiana de los


metabolitos producidos por L. lactis equiparndola a la actividad generada por una

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IV. Resultados y Discusin

determinada concentracin de nisina, relacionando el halo de inhibicin generado (ecuacin


9) o la carga microbiana residual (ecuacin 10) con una determinada concentracin de
nisina.
IV.2. CARACTERIZACIN DE Lactococcus lactis: CURVA DE CRECIMIENTO Y
ACTIVIDAD ANTILISTERIA
IV.2.1. Modelizacin de la curva de crecimiento
Considerando que la fase de crecimiento en la que se encuentran los
microorganismos es fundamental en la produccin de bacteriocinas y otros productos
metablicos con actividad antimicrobiana se determin la curva de crecimiento del
Lactococcus lactis tomando como referencia la cepa CECT 539 y siguiendo la metodologa
descrita en el apartado III.3.3.1
En la figura IV.4. se muestran los datos experimentales obtenidos y las
modelizaciones efectuadas en base a los modelos de Gompertz y Baranyi, puesto que estos
son los modelos ms ampliamente utilizado para describir el comportamiento microbiano
bajo condiciones definidas y controladas (Jurez et al., 2002; Puente, 2003).

Figura IV.4. Curva de crecimiento de L. lactis ajustada con los modelos cinticos de Gompertz y
Baranyi.

La curva obtenida se correspondi con el modelo clsico de crecimiento microbiano


en el que se distinguen tres fases bien definidas: latencia, crecimiento exponencial y

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IV. Resultados y Discusin

estacionaria (Clerselius, 2002). Los parmetros caractersticos de crecimiento microbiano


obtenidos a partir de de dichas modelizaciones se muestran en la tabla IV.3.

Tabla V.3. Parmetros cinticos del crecimiento microbiano y coeficiente de correlacin obtenidos a
partir de los modelos cinticos de Baranyi y Gompertz para L. lactis.

MODELOS
Parmetro

Gompertz

Baranyi

[(log ufc/mL)h-1]

0,5442

0,4954

[h]

2,4142

2,0376

No [log ufc/mL]

3,8303

3,8142

MDP [log ufc/mL]

10,6232

10,1006

R2

0,9737

0,9809

No: carga microbiana inicial [log ufc/mL]


: duracin de la fase de latencia (h)
: velocidad de crecimiento [log ufc/mL)h-1]
MDP: mxima densidad de poblacin [log ufc/mL]
R2: coeficientes de correlacin

Como se puede observar con los valores de R2 (tabla IV.3.) el crecimiento de L. lactis
se ajusta perfectamente a los modelos de Gompertz y Baranyi, no obstante el modelo de
Baranyi present un ajuste algo ms alto. Los resultados obtenidos reflejan que la fase de
latencia de L. lactis se sita en torno a las 2 horas, la velocidad de crecimiento es del orden
de 0,5 [(log ufc/mL)h-1] y la mxima densidad de poblacin es algo superior a 10 log
ufc/mL.

IV.2.2. Curva de crecimiento y actividad antilisteria del SPP


Tras analizar el comportamiento, en relacin a su curva de crecimiento de L. lactis
(CECT 539) se evalu la actividad antilisteria de los metabolitos producidos (sutrato
parcialmente purificado: SPP) a lo largo de dicha curva de crecimiento. A tal efecto, se
procedi siguiendo la metodologa descrita en el apartado III.3.3.2.

En la figura IV.5.a. se muestra la actividad antilisteria del SPP obtenido a partir de L.


lactis expresada como potencia, en base a la frmula propuesta por Delgado et. al. (2005)
(ecuacin 7, apartado IV.1.). En dicha figura los resultados vienen expresado en tanto por

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IV. Resultados y Discusin

cien de potencia bactericida, donde el 100% representa la mxima potencia de nisina


detectable por este mtodo y que fue de 1000 mg/L, como se ha mencionado en el apartado
IV.1. Como se puede observar, se detect un incremento de la potencia bactericida hasta las
15 horas de incubacin del L. lactis. Con tiempos de incubacin mayores se observ un
marcado descenso de la potencia bactericida del SPP.
Cuando la capacidad antibacteriana se expres en equivalentes de nisina y acorde a
la ecuacin 9 (apartado IV.1.) el comportamiento fue similar (figura IV.5. b.).
En la figura IV.5.c. se muestra el nivel residual de listeria acorde a la ecuacin 10
(apartado IV.1.) respecto al nivel de desarrollo de L. lactis, como se puede observar la
mxima actividad antilisteria se observ a las 15 horas de incubacin de L. lactis.
Segn los resultados observados en la figura IV.5. la mayor actividad antilisteria de
L. lactis y se logra tras incubar el microorganismo entre 10 y 15 horas. Por lo tanto y en base
a estos resultados se considera un tiempo de incubacin de 12 horas para los siguientes
ensayos, puesto que la brusca cada de la actividad antimicrobiana observada a partir de las
15 horas no aconseja apurar hasta dicho lmite.
Los resultados obtenidos indican que para que se produzca una ptima produccin
de metabolitos con actividad antimicrobiana es conveniente que el microorganismo se
encuentre en fase exponencial de crecimiento. En general, la sntesis de bacteriocinas tiene
lugar al final de la fase exponencial de crecimiento (Piard y Desmazeaud, 1992 b, Coventry
et al., 1996), por lo que se consideran metabolitos primarios o asociados al crecimiento. Esta
cintica, tpica de un metabolito primario o asociado al crecimiento, se ha observado en la
produccin de una serie de bacteriocinas obtenidas a partir de las bacterias lcticas (De
Vuyst y Vandamme, 1992; Parente y Ricciardi, 1999).
Por otra parte, la reduccin de la actividad antimicrobiana observada una vez
alcanzado el valor mximo, podra deberse a la degradacin de las bacteriocinas por las
proteasas liberadas al medio exocelular por el microorganismo productor, y/o a su adsorcin
a las celulas productoras a medida que aumenta la biomasa del cultivo.
El hecho de que la actividad antimicrobiana disminuya una vez alcanzado un valor
mximo, que depende de la cepa productora y de las condiciones de cultivo, lo que implica

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IV. Resultados y Discusin

que existe un momento en el que la produccin cesa y comienza un proceso de degradacin


o inactivacin (De Vuyst y Vandamme, 1992; Parente y Ricciardi, 1999).

a)

b)

c)

Figura IV.5 Evaluacin del nivel de crecimiento de L. lactis y actividad antilisteria correspondiente
expresada en funcin a) % potencia,b) concentracin equivalente de nisina y c) la supervivencia de
L.innocua.

IV.3. FORMULACIN UN MEDIO PTIMO PARA LA PRODUCCIN DE METABOLITOS


CON ACTIVIDAD ANTILISTERIA A PARTIR DE Lactococcus lactis

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IV. Resultados y Discusin

El mtodo de superficie de respuesta (MSR) fue introducido por Box y Wilson y


consiste en una coleccin de tcnicas estadsticas y matemticas que permite al
investigador inspeccionar una respuesta, que se puede mostrar como una superficie. Se
utiliza para desarrollar, mejorar y optimizar el sistema que interesa, en el cual la respuesta
que interesa, est influenciada por diferentes variables y el objetivo es el de la optimizacin
de la repuesta (Li et al., 2002; Gmez y Batista, 2006)
MSR se utilizada con xito en la industria qumica y en los ltimos aos se le ha dado
aplicacin en microbiologa para la formulacin de medios de cultivos, inclusive en la
produccin de L-lisina por procesos fermentativos usando extracto de levadura y glucosa
entre otros componentes (Dreyer et al., 2000).
Los medios de cultivo son tradicionalmente optimizados por el mtodo un factor a la
vez, o sea, variando un factor mientras que los otros se mantienen en un nivel constante. El
mtodo es simple y fcil, sin la necesidad de complejos anlisis estadsticos, pero involucra
un nmero de experimentos relativamente grande y la interaccin entre los factores es
frecuentemente ignorada. (Gmez y Batista, 2006). El RSM tiene varias ventajas respecto a
los mtodos clsicos experimentales ya que ofrece una gran cantidad de informacin con un
nmero reducido de experimentos y es posible observar la interaccin entre los parmetros
en procesos bioqumicos, donde la sinergia, el antagonismo, o la adicin son ms crticos
(Denis- Bas, 2007).
As el objetivo del estudio fue obtener un modelo de superficie de respuesta que
permita establecer condiciones para obtener valores elevados de actividad antilisteria
(respuesta) analizando el efecto de los seis componentes utilizados en la formulacin del
medio de crecimiento (factores). Para ello, se utiliz un diseo multifactorial de superficie de
respuesta, herramienta estadstica con la que se quiere determinar la influencia que pueden
tener los factores (variables independientes) sobre la respuesta.

En la fase inicial del estudio se trat de identificar los ingredientes del medio que
tienen un efecto significativo en la produccin de sustancias antimicrobianas. Para ello se

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IV. Resultados y Discusin

opt por un diseo factorial fraccionado (DDF) 2 6-2, con seis factores a dos niveles,
requirindose por tanto 16 experimentos (ver apartado III.3.4.1)
En la segunda fase del estudi se trat de describir la naturaleza de la superficie de
respuesta en la regin del optimo, utilizando un diseo central compuesto (DCC) para dos
factores, con un diseo factorial 22 con 2 factores (Ver apartado III.3.4.2)

IV.3.1. Determinacin de la actividad antilisteria del sustrato parcialmente purificado


(SPP).
Como se ha indicado en el apartado anterior la respuesta considerada en este
trabajo fue la actividad antilisteria del SPP obtenido tras el desarrollo, en los diferentes
medios de crecimiento testado, de dos cepas de L. lactis la CECT 539 y la CECT 4434.
Para determinar la actividad antilisteria producida por las cepas de lactococcus se
utiliz la tcnica de la dilucin en caldo (apartado III.3.1.3.b.) ya que las medidas de
inhibicin del crecimiento mediante esta tcnica producen resultados ms fiables y
cuantificables que los obtenidos mediante la tcnica de difusin en agar (Papagianni, 2006).
A tal efecto, se prepararon 16 medios de cultivo con las combinaciones de sacarosa,
peptona, extracto de levadura, KH2PO4, NaCl, Mg SO4 7 H2O pertinentes (apartado III.3.4.1)
procediendo como se indica en el apartado (III.3.4.1.a).Transcurrido el tiempo ptimo de
incubacin se determin la concentracin minina inhibitoria del sustrato parcialmente
purificado (SPP) siguiendo la metodologa descrita en el apartado III.3.4.1.c. para cada una
de las 16 formulaciones testadas.
En la tabla IV.4. se muestran los volmenes de sobrenadante con los que se logra la
inhibicin total del crecimiento del inoculo de L. innocua. A partir de la tabla IV.4. se
determin la actividad antilisteria para cada formulacin y para cada una de las cepas de
estudio utilizando la ecuacin 4, apartado III.3.4.1. de materiales y mtodos, en base a la
CMI de un patrn de nisina, siendo esta de 300 mg/L 300 UI/mL, segn los resultados
observados en el apartado IV.1. Los resultados de actividad antilisteria para las 16
formulaciones ensayadas y las dos cepas de L. lactis se muestran en la figura IV.6.
Los resultados obtenidos muestran que los valores ms altos de actividad se
obtuvieron con la formulacin 8, seguido de la formulacin 14, para ambas cepas y de la 2

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IV. Resultados y Discusin

para la cepa 539. En tercer lugar, se situara la formulacin 3 para la cepa 539 y la 7 y 9
para la cepa 4434. En la tabla IV.5. se resumen estos resultados

Tabla IV.4. Diferentes composiciones testadas (formulacin, de acuerdo a la tabla III.4.),


dilucin del sobrenadatante y volumen de este en la que se produjo inhibicin total del crecimiento de
listeria para L.lactis CECT 539 y CECT 4434.
* En

L. lactis
CECT 539

CECT 4434

formulacin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

dilucin inhibitoria *
13
5
7
11
9
5
7
11
8
15
16
17
14
16
14
11
3
5
6
15
9
7
9
11
10
13
16
17
15
12
13
10

base a los valores de la tabla III.5.

45

SPP en incubacin (mL) *


0,4
0,8
0,7
0,5
0,6
0,8
0,7
0,5
0,65
0,3
0,25
0,2
0,35
0,25
0,35
0,5
0,9
0,8
0,75
0,3
0,6
0,7
0,6
0,5
0,55
0,4
0,25
0,2
0,3
0,45
0,4
0,55

IV. Resultados y Discusin

a)

b)

Figura IV.6. Actividad antilisteria (mg/L) para las 16 formulaciones del medio de crecimiento
estudiadas (n ensayo) para L. lactis CECT 539 (a) y CECT 4434 (b).

Tabla IV.5. Resumen de las formulaciones con mayor actividad antilisteria para L.lactis CECT
539 y CECT 4434.
L.
LACTIS
CECT
539

CECT
434

FORMULACI
N
8
2
14
3
8
14
7
9

Actividad
(UI/mL)

COMPONENTES (G/L)
X1
13,333
13,333
13,333
6,667
13,333
13,333
6,667
6,667

X2
13,333
6,667
6,667
13,333
13,333
6,667
13,333
6,667

X3
14,000
6,000
14,000
6,000
14,000
14,000
14,000
6,000

X4
6,667
6,667
13,333
6,667
6,667
13,333
6,667
13,333

X5
3,000
3,000
1,000
3,000
3,000
1,000
1,000
1,000

X6
0,047
0,167
0,167
0,047
0,047
0,167
0,167
0,167

X1: Sacarosa, X2: Peptona, X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4, X5: NaCl, X6:MgSO4.7H2O

46

1500
1200
1200
1000
1500
1200
1000
1000

IV. Resultados y Discusin

Uno de los controles que se realiz sobre los medios de cultivo fue la determinacin
de su pH antes de la extraccin del SPP. Como se muestra en la figura IV.7. existi una
correlacin lineal, para ambas cepas, entre el pH del medio de cultivo y la actividad
antilisteria del SPP.

a)

b)

Figura IV.7. Representacin de actividad (UI/mL) frente a pH para L. lactis a) CECT 539, b)
CECT 4434.

Los resultados obtenidos indicaron una buena correlacin entre el pH del medio,
comprendido entre 4 y 6,5, y la actividad antilisteria de los sustratos parcialmente purificados
obtenidos tras incubar las distintas cepas de L. lactis en los medios de cultivo elaborados
con las 16 formulaciones testadas en esta fase del trabajo. La tabla IV.6. muestra las
ecuaciones de regresin lineal obtenidas as como los coeficientes de correlacin para cada
una de las cepas de L. lactis.
Tabla IV.6. Ecuaciones de regresin lineal y coeficientes de correlacin entre los valores de
actividad y de pH para L.lactis CECT 539 (ecuacin 11) y CECT 4434 (ecuacin 12).
N ecuacin
11
12

Ecuacin
A = 563 pH-2194
A = 558,46 pH-2088,7

R2
0,86
0,91

A: actividad (mg/L)

Lo que significa que cuanto ms elevado es el pH del medio, entre 4 y 6,5, mayor es
la actividad antilisteria. As, el control del pH es esencial a la hora de optimizar la produccin
de bacteriocinas. el pH ptimo para la sntesis de bacteriocinas es por lo general de 5,5 a 6,
valor algo menor que el ptimo para el desarrollo de las LAB, aunque este valor sufre
variaciones entre especies incluso entre cepas (Parente et al., 1994; Chinachoti et al., 1997).

47

IV. Resultados y Discusin

IV.3.2. Diseo factorial fraccionado (DFF)


Para conocer las variables ms influyentes, es decir los componentes del medio de
cultivo que ms influyeron sobre los valores de la actividad antimicrobiana, se utiliz, como
representacin matemtica de la metodologa de superficie de respuesta (MSR), un modelo
lineal de primer orden, tal y como viene indicado en el apartado III.3.4.1. (ecuacin 3). As,
se obtuvieron las ecuaciones (13) y (14) para L. lactis CECT 539 y 4434 respectivamente
(tabla IV.7.).
Tabla IV.7. MSR: ecuaciones lineales de primer orden y coeficientes de correlacin para
L.lactis CECT 539 (ecuacin 13) y CECT 4434 (ecuacin 14).
N
ecuacin
13
14

Ecuacin

R2

A= 733,31 + 71,26 X1+ 7,42 X2 + 103,29X3 105,53X4 + 60,86X5 1.17X6

0,28

A = 698,5022 + 63,09X1 + 32,63X2 + 99,41X3 -32,003X4 -38,87X5 +3,25X6

0,16

A: actividad (mg/L)
X1: Sacarosa, X2: Peptona, X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4, X5: NaCl, X6:MgSO4.7H2O (g/L)

Al analizar los valores de los coeficientes de regresin obtenidos (R2), 0,28 y 0,17
para las cepas 539 y 4434 respectivamente, se deduce que la superficie de respuesta en
estos casos no se puede ajustar a un plano. Para obtener un mejor ajuste habra que
emplear un modelo de orden superior o bien un modelo no lineal.
Otra forma de comprobar el ajuste del modelo es comparando los resultados
obtenidos experimentalmente para cada una de las cepas con los valores predichos o
estimados por el modelo mismo.
Los resultados de actividad antilisteria (mg/L) obtenidos con los modelos lineales
anteriormente mencionados (ecuaciones 13 y 14) as como los valores reales observados,
para cada una de las formulaciones testadas, se muestran en la tabla IV.8.

48

IV. Resultados y Discusin

Tabla IV.8 Diseo experimental factorial fraccionado DDF y resultados de actividad (mg/L)
observados y predichos.
L. lactis

OBSERVAD
PREDICHOS
3
OS2
1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
428,6
597,156
2
+1
-1
-1
-1
+1
+1
1200,0
859,119
3
-1
+1
-1
-1
+1
-1
1000,0
733,756
4
+1
+1
-1
-1
-1
+1
375,0
752,144
5
-1
-1
+1
-1
+1
+1
750,0
923,194
6
+1
-1
+1
-1
-1
-1
600,0
946,256
7
-1
+1
+1
-1
-1
+1
857,1
816,219
8
+1
+1
+1
-1
+1
-1
1500,0
1082,86
CECT 539
9
-1
-1
-1
+1
-1
+1
600,0
383,756
10
+1
-1
-1
+1
+1
-1
600,0
650,394
11
-1
+1
-1
+1
+1
+1
375,0
520,356
12
+1
+1
-1
+1
-1
-1
461,5
543,419
13
-1
-1
+1
+1
+1
-1
428,6
714,469
14
+1
-1
+1
+1
-1
+1
1200,0
732,856
15
-1
+1
+1
+1
-1
-1
857,1
607,494
16
+1
+1
+1
+1
+1
+1
500,0
869,456
1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
375,0
300,0
2
+1
-1
-1
-1
+1
+1
857,14
740,996
3
-1
+1
-1
-1
+1
-1
750,0
825,0
4
+1
+1
-1
-1
-1
+1
428,57
544,714
5
-1
-1
+1
-1
+1
+1
333,33
449,474
6
+1
-1
+1
-1
-1
-1
600,0
675,0
7
-1
+1
+1
-1
-1
+1
1000,0
883,856
8
+1
+1
+1
-1
+1
-1
1500,0
1425,0
CECT 4434
9
-1
-1
-1
+1
-1
+1
1000,0
1075,0
10
+1
-1
-1
+1
+1
-1
461,54
577,684
11
-1
+1
-1
+1
+1
+1
375,0
300,0
12
+1
+1
-1
+1
-1
-1
545,45
429,306
13
-1
-1
+1
+1
+1
-1
500,0
383,856
14
+1
-1
+1
+1
-1
+1
1200,0
1125,0
15
-1
+1
+1
+1
-1
-1
750,0
866,144
16
+1
+1
+1
+1
+1
+1
500,0
575,0
1: factores y niveles codificados (X1: Sacarosa, X2: Peptona, X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4,
X5: NaCl, X6:MgSO4.7H2O)
2: valores de actividades experimentales
3: valores de actividades calculadas segn el modelo lineal de primer orden (ecuaciones 13 y 14)
Formulacin

X1
1

X21

X3

X4

X5

X6

49

IV. Resultados y Discusin

Para determinar la relacin existente entre los factores considerados y la respuesta


obtenida (actividad antilisteria) se efectuaron ANOVAs (tabla IV.9)
Tabla IV.9. DDF: anlisis de varianza para la respuesta actividad antilisteria para L. lactis
CECT 539 y CECT 4434.

L. lactis

CECT 539

CECT 4434

FACTOR
X1:sacarosa
X2:peptona
X3:extractolevadura
X4:KH2PO4
X5:NaCl
X6:MgSO4
Error total
Total (corr.)
X1:sacarosa
X2:peptona
X3:extractolevadura
X4:KH2PO4
X5:NaCl
X6:MgSO4
Error total
Total (corr.)

SUMA DE
CUADRAD
OS
81239,3
877,641
170714
178190
59328,8
21,8556
1,25919E6
1,74956E6

GL

1
1
1
1
1
1
9
15
R2=0,28
63676,7
1
17030,9
1
158131,
1
16387,2
1
24181,0
1
2810,33
1
1,40756E6
9
1,68978E6
15
R2=0,17

CUADRAD
O MEDIO

RAZNF

VALORP

81239,3
877,641
170714
178190
59328,8
21,8556
139910

0,58
0,01
1,22
1,27
0,42
0,00

0,4656
0,9386
0,2980
0,2883
0,5312
0,9903

63676,7
17030,9
158131,
16387,2
24181,0
2810,33
156395,

0,41
0,11
1,01
0,10
0,15
0,02

0,5393
0,7490
0,3409
0,7536
0,7033
0,8963

El anlisis de varianza indica los parmetros ms influyentes en la actividad, con un


intervalo de confianza del 95%, es decir, con un error mximo del 5%. Todos aquellos
factores que obtengan un valor P<0,05 sern considerados como significativos en la
actividad. En este caso, ninguno de los factores del medio tiene efecto significativo y esto
tanto para la cepa 539 como para la 4434.
Hay que considerar, que para el anlisis de varianza se ha medido la contribucin de
cada factor eliminando las interacciones entre los factores presentes en el medio, es decir, la
sinergia, el antagonismo o la adicin crticos en los procesos bioqumicos. Por tanto, para
que estas interacciones sean consideradas, se tendran que utilizar modelos matemticos
de orden superior para cuyo clculo sera necesario la realizacin de ms ensayos, y/o la
reduccin del nmero de factores para simplificar el modelo matemtico empleado.

50

IV. Resultados y Discusin

Sin embargo, aunque el diseo factorial fraccionado, al que se ha intentado ajustar la


superficie de respuesta mediante una ecuacin lineal de primer orden, no sea aceptable,
este modelo nos permite describir la importancia de cada componente presente en el medio
de cultivo y de cmo pueden afectar en la actividad antimicrobiana.
El diagrama de pareto es una representacin grfica del anlisis de varianza donde
igualmente se observa los factores ms influyentes, en su respectivo orden sobre la
actividad antilisteria. Los efectos de color azul (-) son inversamente proporcionales a la
variable de respuesta (actividad), mientras que los de color gris (+) son efectos directamente
proporcionales a la variable respuesta. El diagrama incluye una lnea vertical cuya ubicacin
depende del intervalo de confianza determinado (95% en este caso). Todo efecto que pase
sobrepase esta lnea ser de considerable significancia para la actividad antimicrobiana.
Para la cepa de Lactococcus lactis CECT 539, del diagrama de pareto mostrado en
la figura IV.8. se observa claramente que de los seis factores del medio son el KH 2PO4, de
forma negativa, y el extracto de levadura, de forma positiva los que han resultado afectar en
mayor medida a la actividad. Esto indica que niveles altos de KH2PO4 en el medio de cultivo
dan lugar a actividades menores, mientras que el extracto de levadura, sacarosa y el Na Cl
favorecen la obtencin de niveles mayores de actividad. Por otro lado, las concentraciones
de MgSO 4 y la peptona no parecen afectar apenas a la actividad.

Figura IV.8. Diagrama de Pareto (DFF) para L.lactis CECT 539

51

IV. Resultados y Discusin

Para la cepa de Lactococcus lactis CECT 4434, en el diagrama de pareto mostrado


en la figura IV.9. se observa claramente que el factor ms influyente sobre la actividad fue el
extracto de levadura. Adems, la actividad tiende a disminuir al aumentar las
concentraciones de KH2PO4 y el NaCl (coeficientes negativos), dndose el efecto opuesto en
el resto de los factores (coeficientes positivos). Por el contrario las concentraciones de
MgSO 4 7 H2O no parecen afectar apenas a la actividad.

Figura IV.9 Diagrama de Pareto (DFF) para L.lactis CECT 4434

Diversos estudios indican un marcado efecto del KH2PO4 sobre la produccin de


nisina por parte de L. lactis (De Vuyst & Vandame, 1993; Li et al. ,2002). Asi, Li et al. (2002)
indican que concentraciones elevadas de KH2PO4 (15 g/L) dan lugar a mayores
concentraciones de nisina que concentraciones bajas (5g/L). Otros autores indican que el
KH2PO4 es el ingrediente del medio que ms favorece la sntesis de nisina (De Vuyst &
Vandame, 1993). En este caso el KH 2PO4 parece afectar de forma negativa la produccin de
bacteriocinas.

52

IV. Resultados y Discusin

Por otro lado la produccin de nisina es ptima cuando se utiliza como fuente de
carbono la glucosa, sacarosa o xilosa (Matsusaki et al., 1996; Chinachoti et al., 1997). Sin
embargo, una produccin mxima de biomasa no se corresponde con obligatoriamente con
una produccin mxima de bacteriocina (Parente y Ricciardi, 1994).

Tan importante como el tipo de fuente de carbono es la concentracin inicial de


carbohidratos. Estudios realizados por Vuyst Vandame (1992) con nisina revelaron que
cuando la concentracin de sacarosa aumenta de 10 a 40 g/L la respuesta experimenta un
descenso de 19 a 10,9 a pesar de que se produca ms biomasa.
Se ha estudiado tambin el efecto de diferentes fuentes de nitrgeno y su
concentracin sobre la produccin de nisina (de Vuyst y Vandame, 1993). As, se vio que
los mejores rendimientos en la produccin de bacteriocina se obtenan con fuentes de
nitrgeno completas como por ejemplo el extracto de levadura. Cuando se usa extracto de
levadura se producen niveles altos de clulas y de bacteriocinas quiz porque contienen
algunos aminocidos o pptidos que actan como inductores o precursores de la sntesis de
bacteriocina. La concentracin ptima de nitrgeno (como casiotina) para la mxima sntesis
de nisina fue de 6,5 g/L con 59UI/mL Una concentracin alta de lactosa disminuye la
produccin de nisina, debido al alto contenido de carbohidratos en el extracto de levadura
(17,5%) esto se explica por la inhibicin del sustrato o por el control que suministra el
sustrato en la sntesis de la bacteriocina (Guerra, 2001).
La produccin de bacteriocinas est muy influenciada por el tipo y concentracin de
fuentes de carbono, nitrgeno y fosfato, as como por los cationes y agentes surfactantes
presentes en el medio. En lo referente a los iones (PO4) y cationes (Mg y Ca) presentes en
el medio, el efecto que estos ejercieron sobre la produccin de bacteriocinas es especifico
de la cepa productora. Por ejemplo, la presencia de fosfato inorgnico mejora la produccin
de nisina en el caso de ciertas cepas de

L.lactis (De Vuyst & Vandame, 1993). Otros

aditivos, como el Tween 80 y el etanol, estimulan la produccin de algunas bacteriocinas (De


Vuyst et al., 1996).

53

IV. Resultados y Discusin

IV.3.3. Diseos centrales compuestos (DCC)


Los resultados obtenidos en la primera fase de optimizacin del medio de cultivo
para una mxima actividad antimicrobiana no indicaron como significativo, en la produccin
de metabolitos activos, ninguno de los componentes del medio. No obstante y con la
finalidad de completar el estudio, se realizaron nuevas experiencias. En este caso se
consideraron las interacciones entre los factores presentes en el medio, es decir, la sinergia,
el antagonismo o la adicin
En esta etapa se pretendi analizar el efecto del factor con mayor significacin para
cada cepa estudiada, aunque estos no fuese estadsticamente significativos, como fueron el
extracto de levadura y KH2PO4 (X3 y X4, respectivamente). El resto de los factores (X1:
Sacarosa, X2: Peptona, X5: NaCl, X6:MgSO4.7H2O) se consideraron a su nivel inferior al no
tener apenas efecto sobre la produccin de metabolitos antilisteria. Adems, se consider un
diseo central compuesto 22 en estrella rotable y ortogonal. Aplicando la ecuacin 6
(apartado III.3.4.2.) se obtuvieron las ecuaciones de segundo orden (15) y (16) para L. lactis
CECT 539 y 4434 respectivamente (tabla IV.10.).
Tabla IV.10. MSR: ecuaciones de segundo orden y coeficientes de correlacin para L.lactis
CECT 539 (ecuacin 15) y CECT 4434 (ecuacin 16).
N
Ecuacin

R2

A= 315,845 + 107,902X3 + 101,312X4 - 4,23699X32 - 0,510267X3X4


- 5,3775X42

0,94

A= 80,7543 + 118,271X3 + 78,5443X4 - 4,8586X32 + 0,53955X3X4

0,99

ecuaci
n
15
16

- 4,0621X4
A: actividad (mg/L)
X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4 (g/L)

54

IV. Resultados y Discusin

Los resultados de actividad antilisteria (mg/L) obtenidos con los modelos de segundo
orden anteriormente mencionados (ecuaciones 15 y 16) as como los valores reales
observados, para cada una de las formulaciones testadas, se muestran en la tabla IV.11,
cabe destacar que los intervalos analizados fueron de 4,34 y 15,66 g/L, correspondientes a
las codificaciones -1 y +1 respectivamente.

Tabla IV.11. Diseo experimental DCC rotable y ortogonal y resultados de actividad (mg/L)
observados y predichos.
L. lactis

CECT 539

CECT 4434

Formulaci
n
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8

X31

X41

OBSERVAD
OS2

PREDICHO
S3

-1
1
-1
1
1,414
-1,414
0
0
-1
1
-1
1
1,414
-1,414
0
0

1
1
-1
-1
0
0
1,414
-1,414
1
1
-1
-1
0
0
1,414
-1,414

850,0
1100,0
1000,0
1400,0
800,0
600,0
465,5
428,6
750,0
1100,0
750,0
1100,0
600,0
333,3
200,0
200,0

937,438
1109,18
1033,13
1270,26
885,299
514,701
397,142
496,958
773,02
1107,5
777,068
1042,41
635,437
297,863
178,406
221,594

1: factores y niveles codificados (X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4,)


2: valores de actividades experimentales
3: Valores de actividad calculadas segn el modelo lineal de primer orden (ecuaciones 15 y 16)

Para determinar la relacin existente entre los factores considerados y la respuesta


obtenida (actividad antilisteria) se efectuaron ANOVAs (tabla IV.12.)
Tabla IV.12. Anlisis de varianza (DCC) para la respuesta actividad antilisteria para L. lactis
CECT 539 y CECT 4434
L. lactis
FACTOR
CECT
539

X3:extractolevadura
X4:KH2PO4
AA
AB
BB
Error total
Total (corr.)

SUMA DE
CUADRAD
OS
60615,9
23904,3
41951,2
4403,48
67575,6
49558,1
774880

55

GL

CUADRAD
O MEDIO

1
1
1
1
1
2
7
2
R =0,93

60615,9
23904,3
41951,2
4403,48
67575,6
24779,0

RAZNF

VALOR-P

2,45
0,96
1,69
0,18
2,73

0,2583
0,4296
0,3229
0,7143
0,2405

IV. Resultados y Discusin

CECT
4434

X3:extractolevadura
X4:KH2PO4
AA
AB
BB
Error total
Total (corr.)

130454
1351,11
55164,6
4923,46
38560,9
8079,73
929325

1
1
1
1
1
2
7
R2=0,99

130454
1351,11
55164,6
4923,46
38560,9
4039,86

32,29
0,33
13,66
1,22
9,55

0,0296
0,6215
0,0661
0,3847
0,0907

En la figura IV.10. se muestra el diagrama de pareto para la cepa de Lactococcus


lactis CECT 539. En este se observa como la levadura afecta de forma positiva a la actividad
y el KH2PO4 de forma negativa como observ antes de la reoptimizacin del medio (figura
IV.8.) si bien la influencia del KH2PO4 en este caso es menor. Adems, las interacciones BB
(KH2PO4 - KH2PO4) y AA (extracto de levadura extracto de levadura) resultaron afectar
negativamente, incluso en mayor medida que el KH 2PO4 a la actividad antilisteria. Los
trminos AA y BB indican que los factores considerados tienen un comportamiento
cuadrtico respecto a la actividad.
Diagrama de Pareto Estandarizada para actividad

+
-

BB
A:extracto de levadura
AA
B:KH2PO4
AB
0

2
3
Efecto estandarizado

Figura IV.10. Diagrama de Pareto (DCC) para L.lactis CECT 539

En el caso de la cepa Lactococcus lactis CECT 4434, al igual que se haba


observado antes de la reoptimizacin del medio (figura IV.9.), el extracto de levadura fue la
variable ms influyente, siendo en este caso significativamente influyente (P-value<0,05) con
un valor positivo. Adems tanto la interaccin AA como la BB resultaron ser ms influyentes
que la propia variable B (KH2PO4).

56

IV. Resultados y Discusin


Diagrama de Pareto Estandarizada para actividad

+
-

A:extracto de levadura
AA
BB
AB
B:KH2PO4
0

2
3
4
Efecto estandarizado

Figura IV.11. Diagrama de Pareto (DCC) para L.lactis CECT 4434

En base a los resultados obtenidos se realiz los diagramas de superficies con la


finalidad de obtener la concentracin de cada variable (extracto de levadura y KH 2PO4) que
genere una mayor produccin de sustancias antimicrobianas por parte de las cepas en
estudio. En las figuras IV.12. y IV.13. para L. lactis CECT 539 y CECT 4434 respectivamente
se muestran las superficies de respuesta obtenidas.

Superficie de Respuesta Estimada

1500

actividad (mg/L)

1200
900
600
300
0

18
15
12

9
12
extracto de levadura

15

18

9
6
3
KH2PO4
0

actividad (mg/L)
0.0-150.0
150.0-300.0
300.0-450.0
450.0-600.0
600.0-750.0
750.0-900.0
900.0-1050.0
1050.0-1200.0
1200.0-1350.0
1350.0-1500.0
1500.0-1650.0

Figura IV.12 Superficie de respuesta estimada para L.lactis CECT 539.

57

IV. Resultados y Discusin


Superficie de Respuesta Estimada

1500

actividad (mg/L)

1200
900
600
300
0

18
15
12

9
12
extracto de levadura

15

18

9
6
3
KH2PO4
0

actividad (mg/L)
0.0-150.0
150.0-300.0
300.0-450.0
450.0-600.0
600.0-750.0
750.0-900.0
900.0-1050.0
1050.0-1200.0
1200.0-1350.0
1350.0-1500.0
1500.0-1650.0

Figura IV.13 Superficie de respuesta estimada para L.lactis CECT 4434.

As en la tabla IV.13. se muestran las concentraciones ptimas de las dos variables


en estudio y la actividad que se genera. Como se observa para la cepa CECT 539 los
alores de 12,20 g/L de extracto de levadura y 8.84 g/L de KH2PO4 genera una actividad de
1421,95 mg/L. Para la cepa 4434 los valores de 12,77g/L de extracto de levadura y 10,51g/L
de KH2PO4 la respuesta de actividad que se predice es de 1247 mg/L.
Tabla IV.13. Optimizacin de la actividad

L lactis
CECT 539

L lactis
CECT 4434

Factor
X3 (g/L)
X4 (g/L)
Actividad*
(mg/L)
X3
X4
Actividad *
(mg/L)

ptimo
12,20
8,84
1421,95
12,77
10,51
1247,97

* Actividad predicha

En base al estudio realizado, la concentracin de los distintos componentes del


medio de cultivo que generara una mayor actividad en las cepas en estudio es la que se
muestra en la tabla IV.14.
Tabla IV.14. Concentracin de los distintos componentes del medio de cultivo que

generan un mayor actividad de las cepas L.lactis CECT 539 y CECT 4434.
Componente

Concentracin (g/L)
CECT 539
CECT 4434

58

IV. Resultados y Discusin

Sacarosa
Peptona
Extracto de levadura
KH2PO4
NaCl
MgSO4.7H2O

6,667
6,667
12,20
8,84
1,000
0,047

59

6,667
6,667
12,77
10,51
1,000
0,047