Propiedades estructurales y biolgicas de Mycoplasmavirus

MVL3: una interaccin inusual Virus-Procariote

La cintica de adsorcin y crecimiento de Mycoplasma virus MVL3 en clulas
husped de Acholeplasma laidlawii 1305/68, han sido estudiadas con los
experimentos de crecimiento en un solo paso, lisis prematura, y de estallido
simple. Se encontr que el virus mata a las clulas infectadas husped. La
liberacin del virus comienza 90 minutos despus de la infeccin y contina
cerca de 10 a 15 horas. Por lo tanto, la produccin del virus es diferente a los
bacterifagos lticos clsicos y en cambio se asemeja a los virus citocidas no
lticos de animales. Los detalles estructurales del virus son descritos, y el peso
6

molecular del DNA lineal viral se ha encontrado que es de 26 x 10

Tres diferentes tipos de Mycoplasma virus infectando a Acholeplasma laidlawii

fueron originalmente aislado por Gourley (7,8 y 9). stos y los aislamientos
posteriores forman tres grupos (revisados por Maniloff et al,.15): (i) el grupo 1
de los aislados, son viriones desnudos en forma de bala. El aislado, MVL2, se
demostr que contiene una molcula circular de DNA monocatenario de 1.5
6

x 10

Daltones. (17) (ii) El grupo 2 de los virus son, partculas esfricas

envueltas. El MVL2 aislado, contiene una cadena doble de DNA en una sper
6

hlice circular cerrada covalentemente, alrededor de 7.8x 10

(13, 16) (iii) El

nico aislado del grupo 3 es MVL3. Este virus es una partcula polidrica
desnuda (alrededor de 60nm de dimetro) con una cola corta (alrededor de
25nm de largo) que contiene una hebra doble de DNA.
Estudios de los ciclos infecciosos de los grupos 1 y 2 de los Mycoplasma virus
(revisado por Maniloff et al., 15) han mostrado que ambos grupos son virus no
citocidas: las clulas infectadas continan creciendo mientras liberan la
progenie de los virus. En un reporte preliminar sobre el ciclo de infeccin del
MVL3, Liss, (13) not que las clulas infectadas mueren.
Aqu reportamos los estudios sobre el ciclo infeccioso del MVL3 mostrando que,
mientras las clulas infectadas ya no son ms viables (es decir, ya no son
capaces de formar colonias) la progenie del virus continua siendo liberada de
stas clulas durante varias horas. Este tipo de ciclo infeccioso se asemeja a
los virus citocida de animales no lticos en lugar de los bacterifagos lticos.
Tambin se presentan datos sobre la estructura del virion y del DNA viral.
MATERIALES Y MTODOS
Medios y Reguladores (solucin amortiguadora). Caldo
(contenido por litro: 20g de triptosa [Difco], 5 g de Tris, 5g de NaCl,
glucosa y 10mL de suero fraccin PPLO [Difco], y las placas de agar
(contienen: agar al 1% [Difco] en caldo triptosa) fueron utilizados para
clulas segn lo descrito por Maniloff (14).

triptosa
10g de
triptosa
cultivar

Solucin reguladora Tris-EDTA-NaCl (TES) (Tris-hidrocloruro 0.01 M, EDTA 0.001

M, NaCl 0.001 M [pH 8.0]) fue usada para lavar a las clulas y para el
procedimiento de purificacin del MVL3.
Clulas y virus. A. laidlawii 1305.K2 fue utilizada como clula husped en
todos los experimentos. Esta clona fue aislada de la cepa A. laidlawii M1305/68,
que fue amablemente suministrada por Gourlay (9). La clona 1305.K2 (referida
como K2) fue seleccionada por su alta eficacia de plaqueo, con Mycoplasma
virus MVL3 de un nmero al azar de clones M1305/68 aislados.
En todos los experimentos un cultivo de toda una noche de K2 (fase
estacionaria) fue diluido 1:5 en un medio fresco e incubado por 4 horas a 37C
antes de que el virus fuera agregado.
El Mycoplasma virus MVL3 fue cultivado a partir de una muestra del aislado
original de Gourley y Wyld (10). Para preparar una solucin madre de virus,
200mL de un cultivo de toda una noche de K2 fueron agregados a 800mL de
caldo triptosa, y despus de 2 horas de incubacin a 37C, MVL3 fue agregado
en una multiplicidad de infeccin (MOI) de 1. El cultivo fue incubado a 37C por
24 horas. La suspensin resultante fue precipitada por la adicin de
polietenglicol 6000 (Fisher Scientific Co.) a una concentracin final del 10%.
Despus de dejarlo reposar toda la noche de 3 a 5C, el precipitado fue
sedimentado por centrifugacin a 5C, a 15,000 g por 30 minutos. Despus
resuspender el precipitado en 10% del volumen original de TES, los
componentes celulares restantes fueron solubilizados por tratamiento con
Triton X-100 0.1% a 37C por 2 horas. El lisado fgico fue dializado toda la
noche contra dos litros de TES. La solucin resultante fue ajustada a una
densidad de 1.48 g/ cm

por adicin de CsCl y centrifugado para equilibrio a

40,000 rpm en un rotor Beckman tipo 42.1.

El virus se vea despus de la centrifugacin como una banda cerca de la mitad
del gradiente y fue removido colectando fracciones de la parte superior del
gradiente. La preparacin del virus se almacen a 4C sin remover el CsCl y fue
estable por lo menos 1 ao bajo estas condiciones. El rendimiento del virus
estaba en el intervalo de

13

10

14

5 x 10

unidades infecciosas por litro de

cultivo.
Determinacin del ttulo de virus y clulas. EL nmero de clulas viables
fueron determinadas contando las unidades formadoras de colonias (UFC) en
agar triptosa. Para minimizar el posible error de conteo debido a la tendencia
del micoplasmas de agregarse en un medio lquido, antes de sembrar en
placas la suspensin de clulas fue suavemente sonicada, colocando el tubo
del cultivo, en un bao de sonificacin (Industrias de ultrasonidos). La
dispersin de los agregados multicelulares fue seguida por microscopa de
contraste de fases. Las colonias generalmente eran visibles despus de 4 das
de incubacin en agar triptosa a 37C, fueron contadas despus de teirlas con
colorante de Dienes diluido (18).

Las partculas del virus MVL3 se evaluaron como UFP (unidades formadoras de
placas) en un agar blando recubriendo placas de agar triptosa: 0.1mL de
muestras de virus diluidas fueron mezclados con 0.1mL de un cultivo celular de
una noche y 1mL de caldo triptosa. La mezcla se calent brevemente a 45C y
se agreg 1mL de agar al 0.7% TES mantenido a 45C. La suspensin
resultante fue vertida en una placa con agar triptosa. Por este mtodo las
placas pudieron ser contadas despus de 24 horas de incubacin a 37C.
Adsorcin del virus: El virus (diluido 1:5) fue aadido a las clulas con una
MOI de 1. Las muestras fueron tomadas cada 5 minutos, filtrados a travs de
un filtro con membranas de 0.2 m (Sartorius) para remover clulas y virus
adsorbidos, y analizado para UFP. Se calcularon las constantes de adsorcin de
primer orden segn lo descrito por Sten (19).
Crecimiento de un solo paso. El protocolo de Delbriik (2) fue usado. El
virus (diluido 1:5) fue aadido a las clulas en un MOI de alrededor de 0.1,
despus 30 minutos a 37C, para permitir la adsorcin del virus, el cultivo
infectado se diluy

106

veces en caldo triptosa fresco precalentado para

reducir infecciones posteriores . Las muestras fueron tomadas en varios

tiempos y sembradas para UFP (unidades formadoras de placas).
Produccin del virus en tiempos largos. Para estos experimentos, las
clulas fueron infectadas con una MOI (multiplicidad de infeccin) de 10, para
asegurarse de que cada clula estuviera infectada, y la produccin del virus fue
seguida por 42 horas, las muestras fueron tomadas y analizadas para UFP a
intervalos de 30 minutos entre 1 y 4 horas y despus de eso, en intervalos de 2
horas. Un cultivo idntico fue infectado comenzadas las 12 horas despus de
iniciado el primer cultivo para as permitir que la produccin del virus fuera
continuamente monitoreada durante el da.
Inactivacin de UFC. El ttulo de las clulas fue determinado antes, y, a los
15 minutos, 30 minutos, y 9 horas despus de la infeccin (en un MOI de 10).
Las placas de agar fueron incubadas durante 3 semanas en una cmara
hmeda para asegurarse de que las colonias de crecimiento lento no se
perdieran.
Lisis artificial. Estos experimentos siguieron lo primero descrito por Doemann
(3). Las clulas fueron infectadas con una MOI de 0.1 y, despus de 30 minutos
de adsorcin a 37C, fue diluido 100 veces en caldo triptosa. En varios tiempos
las muestras fueron tomadas por duplicado. Una fue sembrada directamente
para analizar a las clulas infectadas y al virus libre. A la otra muestra se le
aadi Triton X-100 a una concentracin final de 0.1%. Este tratamiento lisa
las clulas pero no afecta la viabilidad del virus. La muestra lisada fue diluida

104 a 105

veces para reducir la concentracin de Triton y sembrar para

anlisis del virus libre y el intracelular.

Experimento modificado de estallido simple. El tamao de estallido medio
se determin en una modificacin del experimento de estallido simple descrito

por Ellis y Delbriick (4). Aunque el protocolo original de estallido simple utiliza
un MOI muy bajo, el experimento con MVL3 tuvo que utilizar una MOI ms alta
debido a los grandes tiempos de incubacin requeridos. Las clulas fueron
infectadas con un MOI de 1. Despus de 30 minutos la suspensin de clulas
fue diluida

10

veces para un volumen final de 200mL. ste fue divido en

200 muestras de 1mL: 100 muestras de 1mL fueron analizadas para UFP
despus de 8 horas de la infeccin y 100 fueron analizadas despus de 48
horas de infeccin.
Cintica de estallido simple. Para medir la cintica de la produccin del
virus, solo por clulas infectadas. 20 unidades de filtrado Millex (Millipore Co:
tamao del poro, 0.2Lm) fueron inoculadas cada una con un promedio de
menos de una clula infectada. Para esto, se prepar una solucin de clulas
diluidas como se describe en el experimento de estallido simple y fue filtrada a
travs de cada unidad Millex. Por lo tanto, cada filtro recibi cero o una clula
infectada. Una jeringa de 20mL con caldo triptosa fue montada en la parte
superior de la unidad de filtro, y una jeringa vaca de 5mL fue conectada en el
fondo del filtro por una pieza esteril de tubera Tygon. (Fig.1). Despus de 4, 8 y
24 horas de incubacin, 1mL de caldo triptosa se agreg a travs del filtro,
usando la jeringa inferior para generar una filtracin con presin negativa y
analizarlas para UFP. En cada tiempo 5mL de caldo triptosa fueron vertidos a
travs del filtro para remover cualquier virus libre restante del filtro. Se
encontr que la mayora de la progenie del virus fue removida del filtro en el
primer mL de muestra que se retir en cada tiempo. Despus de 5mL
subsecuentes de lavado (que contena de 0 a UFP/5mL) no mas UFP pudieron
ser removidas. Por lo tanto, el virus removido de un filtro en tiempos
posteriores representa que recin se liberaba el virus.
Microscopa electrnica. (i) Tincin negativa. El virus purificado fue
adsorbido a las redes de microscopio de electrones de carbono recubierto y
teido negativamente con cido fosfotngstico (pH 7.0). Micrografas
electrnicas similares fueron obtenidas con acetato de uranilo acuoso (80.5%).
Las fotografas fueron tomadas a 50,000x aumentos con iluminacin de campo
brillante en un Siamens Emilskop 102 en 80kV con un objetivo de 40m de
apertura.
(ii).Medida del DNA. Para la medida del DNA, se us el procedimiento de
Kleinschmidt (11). El virus purificado fue disociado en una reserva conteniendo

1011

UFP/mL, por adicin de dodecil sulfato-fenol de sodio al 1% (1:1) y

agitando gentilmente. Despus de la separacin de fases, el dodecil sulfatofenol de sodio fue removido por dilisis contra TES. La solucin resultante del
DNA fue diluida 1:10 en una solucin conteniendo acetato de amonio 0.5M
(concentracin final) y 0.1mg de citocromo c por mL. Una cantidad de 50L de
esta solucin fue difundida en una hipofase de acetato de amonio 0.25M y
recogida con rejillas revestidas de carbono. Estas fueron teidas con

5 x 10

de acetato de uranilo en etanol 50%. La observacin en el Siemens Emilskop

102 fue hecha sin estar en campo oscuro o en campo brillante despus de
rotar sombreadamente con Pt-Pd. El microscopio se calibr con una rejilla
replica. Se midieron las molculas de negativos proyectados con una
computadora Wang 2200 equipada con un digitalizador PenX (Zscherbel,
Germany).
Resultados
Estudios estructurales. Las partculas del virus teidas negativamente son
polidricas, cerca de 60nm de dimetro (fig.2). Los viriones tiene una cola
corta, cerca 20nm de largo y 10nm de dimetro, adjuntados en un collar de
alrededor 8nm de espesor y 16nm de ancho. Con frecuencia las fibras son
vistas, generalmente aparecen estar fijadas en el collar. An no ha sido posible
determinar ya sea la longitud, o el nmero de fibras por virin.
Las molculas de DNA purificadas del MVL3 son lineales. Las mediciones de la
longitud del contorno de 93 molculas (fig.3) dio un peso molecular estimado
6

de (26+- 0.6) x 10

. No se observaron molculas circulares.

Adsorcin del virus. La adsorcin del virus MVL3 sigue una cintica de
primer orden, el nmero de UFP no adsorbidas durante la adsorcin disminuye
exponencialmente (datos no mostrados). La tasa de primer orden de la
constante K fue calculada de estos experimentos y se encontr que es de

3 x 1010 cm3 /min.

Crecimiento en un solo paso. El crecimiento del MVL3 en clulas K2 fue
estudiado por 5 horas despus de la infeccin (fig.4). Despus de un periodo
latente de 90 minutos, el nmero de UFP comenz a elevarse. Ninguna meseta
fue alcanzada durante el tiempo de este experimento. Puesto que la cintica
de liberacin del virus bajo las condiciones de crecimiento de un solo paso son
de orden cero con respecto al virus libre, la grfica semilogaritmica (fig.4) suele
utilizarse para trazar datos ocultos lineales de la liberacin del virus. Una
grfica lineal de estos datos, aunque menos conveniente para mostrar un
amplio rango de valores de UFP, muestra que la liberacin del virus continua
como una funcin lineal del tiempo. (fig.4 inserto).
Crecimiento en tiempos largos del virus. Puesto que el MVL3 mata a su
clula husped (experimentos descritos a continuacin) la produccin del virus
debe parar eventualmente. Esto no fue observado durante los experimentos de
crecimiento de un solo paso de 5 horas (fig.4). Por lo tanto el protocolo de
crecimiento de un solo paso tuvo que ser modificado. Debido al alto
rendimiento del virus en las clulas infectadas, junto con el continuo
crecimiento de clulas no infectadas si el experimento se lleva a cabo en una
MOI baja, adems la infeccin se espera que ocurra durante experimentos
largos.
Para experimentos de crecimiento en tiempos largos del virus, una MOI de 10,
fue usada para asegurarse de que no hubiera una cantidad significativa de

clulas infectadas. Las mediciones del crecimiento del virus durante tiempos
largos (fig.5) indican que las partculas del virus son liberadas de las clulas
infectadas en un periodo de 10 a 15 horas. Cerca de 10 a 15 horas despus de
la infeccin se alcanza una meseta en ttulo de virus que permanece sin
cambios por al menos otras 27 horas. Puesto que el ttulo final de virus es 120
veces ms alto que el nmero de centros infecciosos medidos despus de la
adsorcin, el rendimiento promedio del virus fue alrededor de 120.
Despus de 24 horas de infeccin, el cultivo sigue ligeramente turbio. En un
microscopio de contraste de fases, partculas del tamao de clulas de A.
laidlawii an podan ser reconocidas junto con esferas translucidas de
dimetros arriba de 10m. Ningn aumento adicional en la turbidez fue
observado despus de varios das de incubacin.
Lisis artificial. La posible existencia de partculas infecciosas intracelulares
del virus durante el periodo latente fue examinada por lisis artificial de clulas
infectadas (fig.6). Considerando la liberacin fisiolgica del virus como se
muestra en los experimentos de crecimiento en un solo paso comienza 90
minutos despus de la infeccin, las partculas maduras pueden ser
demostradas alrededor de los 70 minutos despus de la infeccin por lisis
artificial de las clulas infectadas. A partir de 3 horas de este experimento, el
ttulo del virus intracelular fue siempre ms alto que el ttulo del virus libre,
indicando que la maduracin y la liberacin del virus contina en estas clulas
infectadas.
El experimento no fue continuado por ms de tres horas, puesto que despus
de este tiempo la reinfeccin podra afectar la cintica observada.
Estallido simple. Las clulas infectadas en una MOI baja, fueron diluidas en
200 tubos, tales que cada tubo reciba un promedio de menos de una clula
infectada (tabla 1). La mitad de los tubos fueron analizados para UFP despus
de 8 horas y la otra mitad fueron analizados despus de 24 horas. Los datos
son mostrados en la tabla 1 y en la figura 7.
Los anlisis de estos datos (son descritos por Ellis y Delbruck [4]) muestran que
cada tubo haba recibido un promedio de 0.63 clulas infectadas; por lo tanto,
estadsticamente en cada tiempo, 37 tubos reciban 1 clula, 9 reciban 2
clulas, y 1 reciba 3 clulas. De estos datos, el promedio del rendimiento del
virus por clula infectada fue de 140 despus de 8 horas de la infeccin y 236
despus de 24 horas. Esto es ms alto que lo estimado por el experimento de
crecimiento a tiempos largos (fig.5) donde la MOI alta podra haber reducido el
rendimiento del virus.
Los datos de estallido simple indican que los virus MVL3 son liberados de las
clulas infectadas durante un tiempo extendido por mecanismos de liberacin
no lticos en lugar de una sola explosin.
Cintica de estallido simple. Para confirmar la conclusin de que las clulas
infectadas individuales producen virus durante un periodo extendido, la
produccin del virus en clulas infectadas individuales fue analizada en varios

tiempos durante 24 horas. Veinte filtros fueron cada uno inoculados con
muestras de 1mL preparadas como se describe en el experimento de estallido
simple. El filtrado de cada filtro fue analizado para UFP A 3, 8 Y 24 horas de
infeccin. Los datos obtenidos en un experimento tpico son mostrados en la
Tabla 2. Puesto que en siete de los filtros se encontr que no contenan clulas
infectadas (Tabla 2), estadsticamente por una distribucin de Poisson, siete
filtros recibieron una clula infectada, cuatro recibieron dos clulas infectadas,
uno recibi tres clulas infectadas, y uno recibi cuatro clulas infectadas.
Puede verse que la aparicin y la tasa de liberacin del virus de clulas
individuales como en funcin del tiempo de infeccin son altamente variables.
Cada clula que comienza a producir el virus durante el transcurso de un
experimento contina hacindolo a travs del ltimo punto de datos.
La viabilidad de clulas infectadas con MVL3. Las clulas K2 y el virus se
mezclaron en una MOI de 10 y se incubaron a 37C. Se tomaron muestras justo
antes de la adicin del virus y durante la infeccin y analizadas por UFC. El
nmero de UFCs disminuye rpidamente despus de la adicin del virus
(fig.8): la fraccin superviviente fue de

105

103

despus de 30 minutos y de

despus de 9 horas. La produccin del virus fue medida a lo largo de la

infeccin, y los resultados fueron similares a la curva de crecimiento a largo

plazo mostrada en la figura 4. Por lo tanto, aunque una clula infectada no
pueda formar una colonia, la produccin del virus contina por varias horas.
Discusin.
Las partculas del virus MVL3 tienen una cabeza polidrica de alrededor de
60nm y una cola corta (cerca de 20nm de largo) con un collar y probablemente
fibras, y contiene una molcula de DNA lineal de alrededor de

26 x 10

Daltones. Observaciones morfolgicas similares han sido reportadas por

Garwes et al. (6) and R.M. Cole (personal communication). El MVL3 se asemeja
al grupo de bacterifagos de cola corta para el cual el colifago T7 es la especie.
(Revisado por Fenner 5.). Las caractersticas de estos fagos es que son de
cpsides isomtricas de cerca de 65nm de dimetro con colas cortas y DNA
lineal de doble hebra de alrededor de

25 x 106

Daltones.

El MVL3 es el nico Micoplasmavirus que contiene DNA lineal (en lugar de

circular) y en tener una estructura de cola (cf. Maniloff et al., 15). La funcin
de las colas en los bacterifagos es la fijacin de las partculas del virus a los
componentes de la pared celular bacteriana y la penetracin del cido nucleico
viral a travs de la pared. Sin embargo, el MVL3 infecta a A. laidlawii, una
clula que no tiene pared y est limitada por una simple membrana de
lipoprotenas de 7nm. (1). Por lo tanto, el papel de la cola del MVL3 y las
estructuras fibrilares, que aparecen para ser fijadas al collar, en la fijacin del
virus a los componentes de la membrana husped y la penetracin del DNA
viral en las clulas es de especial inters.

En

estos

estudios,

la

constante

experimentalmente encontrada de

tasa

3 x 10

10

de

adsorcin

del

MVL3

fue

cm /min . Para comparar esto

con el nmero de colisiones virus-clulas, en una tasa constante de primer

orden fue calculado de las colisiones cinticas (descritos por Stent, 19). Este
clculo asume que cada colisin virus-clula conduce a la adsorcin y, por lo
tanto, el cmputo est basado en el nmero de colisiones entre
aproximadamente un virus esfrico de 60nm y 1 esfera (1m de dimetro)
cuya rea de superficie es igual a una clula de Mycoplasma. La tasa constante
terica es de

2 x 109

cm 3 /min , que se trata de un orden de magnitud

mayor que los resultados experimentales. Esto indica que la adsorcin requiere
un alto grado de especificidad en la interaccin virus-clula.
Diferente de otros Mycoplasmavirus que han sido descritos (e.g., Maniloff et al.,
15), el MVL3 mata a sus clulas husped. Pero en contraste con otros
bacterifagos el MVL3 no tiene un ciclo ltico clsico. En su lugar, las clulas
infectadas con MVL3, aunque ya no son viables (en el sentido de ser UFC)
continan para liberar la progenie del MVL3 durante varias horas. Una
examinacin individual de clulas infectadas en un estudio de cintica de
estallido simple, mostr que la tasa de liberacin del virus fluctu durante el
tiempo que la clula estuvo produciendo el virus. Esto podra ser explicado por
un modelo en el cual una clula infectada, y en lugar de continuar liberando la
progenie del virus, libera a los virus en pulsos, en cada pulso siendo la
liberacin de un nmero variado de virus. Coherente con este modelo, nuestros
estudios preliminares de microscopia electrnica sugieren que un fragmento de
una clula infectada podra producir vesculas de membranas rodeando
partculas de los virus separadas del resto de las clulas. Por lo tanto, la
interaccin virus-clula infectada del MVL3 se asemeja a esos virus citocidas no
lticos de animales.
La liberacin total de virus por clula infectada (medida en experimentos de
estallido simple) se encontr que vara sobre un rango de 100 veces de clula a
clula. Adems el rendimiento para este virus es diferente entre las clulas, el
experimento de estallido simple mostr que el tiempo en que una clula
individual infectada comienza a liberar el virus vara de clula en clula.
Al comienzo de estos estudios, usando lo que sabemos, han sido ligeramente
favorables las condiciones de crecimiento celular, un periodo de latencia ms
largo y una produccin de virus ms pequea fueron observados y dados en un
reporte preliminar. (K. Haberer, 1978 Fourth Int. Congr. Virol. Abstr.,p. 173).
Problemas fisiolgicos similares y clulas husped de diferentes cepas podran
explicar la pequea produccin del virus MVL3 reportado por Lyss (12). En el
desarrollo el protocolo experimental usado en los estudios reportados aqu, se
encontr que, para obtener curvas de crecimiento del virus, reproducibles y
buenas producciones del virus, debe tenerse cuidado de asegurar que las
clulas husped estn creciendo activamente en el tiempo de infeccin.