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CALIBRACIÓN DE LOS MÉTODOS INSTRUMENTALES

Todos los métodos instrumentales, excepto dos: gravimétrico y culombimétrico, requieren de una calibración previa, que permita relacionar la señal obtenida por el instrumento para un determinado analito, con la concentración de éste. Los tres métodos más frecuentemente empleados para esta estrategia son: la curva de calibrado, las adiciones estándar y la adición de un patrón interno.

Curvas de calibrado.

Para realizar el método de la curva de calibrado se introducen en el instrumento de medida varios patrones que contienen concentraciones exactamente conocidas del analito y se registra la señal instrumental. Dicha señal es, posteriormente, corregida por la señal obtenida del blanco. En condiciones ideales el blanco es una disolución que contiene todos los elementos de la muestra a excepción del analito. Los datos obtenidos para la señal corregida se representan en una gráfica frente a la concentración del analito.

Tí t ul o del gr áf i co y = 0. 067x + 0.
Tí t ul o del
gr áf i co
y = 0. 067x + 0. 0297
R 2 = 0. 9989
1.
4
1.
2
1
0.
8
0.
6
0.
4
0.
2
0
0
5
10
15
20
[ X]
ppm
S

La Figura muestra una curva de calibrado característica, denominada también curva patrón o curva analítica. Este método es denominado por los anglosajones como adiciones de estándares externos, para diferenciarla del método de las adiciones estándar, es preferible denominarla curva de calibrado. Estas representaciones, como puede verse son, a menudo lineales, en un amplio intervalo de concentración (intervalo útil) lo cual es deseable, ya que están sujetas a menores errores que las curvas no lineales. Sin embargo, no es raro encontrar representaciones gráficas no lineales, las cuales requieren un elevado número de datos de calibración para establecer con precisión la relación entre la respuesta del instrumento y la concentración del analito.

La ecuación de la recta se obtiene por el método de los mínimos cuadrados que ya verán en la parte matemática, pero básicamente consiste en obtener la mejor recta que pasa por los puntos experimentales, nosotros veremos como obtenerla a partir de los datos mediante el uso del EXCEL. El éxito del método de la curva de calibrado depende, en gran medida de la exactitud que tengan la concentración de los patrones y de lo que se parezca la matriz de los patrones a la de la muestra que se analiza. Lamentablemente, reproducir la matriz de muestras complejas no es tarea fácil o imposible y sus efectos dan lugar a errores de método por la presencia de interferencias que no se pueden minimizar. Para intentar obviarlas, a menudo es necesario separar el analito del interferente antes de medir la señal en el instrumento.

Método de la adición estándar.

El método de la adición estándar es especialmente útil para analizar muestras complejas en las que la probabilidad de que se produzcan efectos debidos a la matriz es considerable. Este método puede aplicarse de diferentes formas. Una de las más habituales consiste en la adición de diferentes volúmenes de una disolución patrón a varias alícuotas de la muestra del mismo tamaño. Este proceso se conoce como adición de estándar a la muestra, o en inglés “spiking”. Posteriormente, cada disolución se lleva a un volumen fijo antes de efectuar la medida. Hay que tener en cuenta que cuando la cantidad de muestra es limitada, als adiciones estándar se pueden llevar a cabo por adiciones sucesivas de patrón a un único volumen del problema exactamente medido. Las medidas se van haciendo en la muestra original e inmediatamente después de cada adición de patrón. En la mayoría de las versiones del método de la adición estándar, la matriz de la muestra permanece constante o lo que es lo mismo es idéntica para cada adición, la única diferencia estriba en la concentración de analito que va cambiando con la adición. Como los patrones se preparan en alícuotas de la muestra, todos los demás componentes de la mezcla de la reacción serán iguales. En este método varias alícuotas idénticas, V x , de la disolución problema ocn una concentración a determinar C x se transfieren a matraces aforados de volumen V t . A cada uno de ellos se le añade un volumen variable del analito que tiene una concentración conocida C s o volumen del patrón o estándar, V s (ml). Se añaden entonces los reactivos adecuados y cada disolución se diluye hasta el volumen final del matraz aforado, V t . Se realizan las medidas instrumentales en cada una de estas disoluciones dando una señal S en el instrumento. Si la respuesta del instrumento es lineal, o lo que es lo mismo, proporcional a la concentración, como debe ser para que el método de la adición estándar sea aplicable, se puede escribir que:

S =

kV C

s

s

V

t

+

kV C

x

x

V

t

donde k es una constante de proporcionalidad. La representación de S, en función de V s , es una línea recta de la forma:

S

=

mV

s

+

b

donde la pendiente m y la ordenada en el origen b, vienen dadas, respectivamente por:

m =

kC

s

V

t

y

b =

kV C

x

x

V

t

Si m y b se determinan por mínimos cuadrados, este sistema de ecuaciones nos permite conocer k y C x , dado que el resto de términos es conocido.

Se puede obtener el valor de la desviación estándar en la determinación de la concentración C x , suponiendo que las incertidumbres en todas las magnitudes conocidas, C s , V t , V x y V s son despreciables frente a la variación en la determinación de los parámetros de ajuste de la

recta m y b. Entonces, la varianza relativa del resultado

las varianzas relativas de m y b. Esto es,

se toma como la suma de

S

c C x
c C
x

2

S

c

C

x

2

S

m

= 

m

2

+   S

b

b

2

donde S m es la desviación estándar en la estimación de la pendiente a partir del método de los mínimos cuadrados, S b es la desviación estándar de la ordenada en el origen y S c es la desviación estándar que estamos buscando que despejando de la anterior ecuación, nos queda finalmente:

S

c

= C

x

2 2  S   S  m b   +  
2
2
 S 
 S 
m
b
+ 
m
b 

Método del patrón interno.

En un análisis, un patrón interno es una sustancia que se añade a todas las muestras, blancos y patrones de calibrado en una cantidad fija. También puede ser un componente mayoritario de la muestra y los patrones pero que está en una concentración lo suficientemente elevada como para que se pueda considerar que es la misma en todos los casos. En este caso el calibrado es una representación gráfica del cociente entre la señal del analito y la señal del patrón interno, en función de la concentración de analito en los patrones. En las muestras, este cociente se utiliza para determinar la concentración de analito a partir de la curva de calibrado. Si se elige y se usa adecuadamente un patrón interno, se pueden compensar algunos errores aleatorios o sistemáticos. Así, si las señales del analito y del patrón interno tienen una respuesta proporcional al error aleatorio instrumental y a las fluctuaciones del método, la relación entre dichas señales es independiente de dichas fluctuaciones. Si ambas señales se modifican de la misma forma por el efecto de la matriz, también se compensan en ambas dichos efectos. Cuando el patrón interno es el componente mayoritario de las muestras y de

los patrones, también puede suceder que se compensen los errores producidos en la preparación de la muestra, disolución y filtrado. La mayor dificultad para aplicar el método del patrón interno es encontrar la sustancia adecuada que responda a estas características, así como para incorporarlas a las muestras y a los patrones de forma reproducible. El patrón interno deberá dar una señal similar a la del analito en la mayoría de los casos paro lo suficientemente diferente como para que ambas señales sean distinguibles por el instrumento. Se debe asegurar la ausencia de patrón interno en la matriz de la muestra de tal forma que la única procedencia del patrón sea la cantidad añadida. Por ejemplo, el litio es un patrón interno adecuado para las determinaciones de sodio o potasio en suero sanguíneo, debido a que el comportamiento químico del litio es similar al de ambos analitos pero no aparece de forma natural en la sangre.

Por ejemplo, el método de patrón interno se utiliza con frecuencia, para la determinación de elementos traza en metales por espectroscopia de emisión. Así, para determinar las partes por millón de antimonio y estaño contenidas en plomo utilizado para la fabricación de acumuladores, se compara la intensidad relativa de la línea más intensa de cada uno de los elementos minoritarios con la intensidad de una línea débil del plomo. En general, estas relaciones estarán menos afectadas por las variables que surgen como consecuencia de las muestras que emiten radiación. En el desarrollo de cualquier nuevo método de patrón interno, se debe verificar que los cambios en la concentración del analito no afectan a la intensidad de la señal que procede del patrón interno. Para garantizar que el procedimiento sea satisfactorio se requiere dedicar bastante tiempo y esfuerzo a la preparación de un conjunto de muestras de plomo puro que contengan concentraciones exactamente conocidas de antimonio y estaño.