GUIN

1. A continuacin voy a realizar la presentacion de mi trabajo final

de carrera el cual ha consistido en la formulacion de un medio
de crecimiento para L.lactis que permita alcanzar una optima
actividad antilisteria
2. Actualmente las investigaciones en la industria alimentaria se
dirige a reemplazar las tcnicas de conservacin de alimentos
tradicionales por nuevas tcnicas debido a la creciente
demanda del consumidor por productos mas naturales (sin
aditivos) y saludables.
Es as como surge el trmino de BIOCONSERVACIN que se
refiere a una extensin de la vida til y a un incremento de la
seguridad de los alimentos utilizando la microbiota natural y/o
sus productos antibacterianos.
En este trabajo se plantea la posibilidad de utilizar bacterias
cido lcticas como BIOCONSERVANTE. Este efecto se dara
gracias a la produccin de diferentes metabolitos como cido
lctico, peroxido de hidrgeno, BACTERIOCINAS, etc. A la
vez que el crecimiento de este microorganismo creara una
competencia por los nutrientes con la flora patgena/alterante.
El crecimiento de estas bacterias cido lcticas le conferiran
al alimento el carcter de probitico, por el hecho de ser
microorganismos vivos que al ser ingeridos en cantidades
adecuadas ejerceran una influencia positiva en la salud del
consumidor.
3. El objetivo general fue formular un medio de crecimiento
optimo para L.lactis que permita alcanzar la mxima actividad
bactericida de dicho microorganismo y que pueda ser
incorporado a alimentos.
.
4. El plan de trabajo seguido se divide como podemos ver en 3
fases.
FASE1: En esta primera fase se cuantifico la capacidad
bactericida de un patron de nisina.

FASE 2: Se modelizo la curva de crecimiento del L.lactis y se

determino su actividad antilisteria.
FASE 3: Formulamos un medio optimo para la produccin de
metabiltos con actividad antilisteria a partir de L.lactis
5. Para la realizacin del patrn dosis respuesta se prearararon
diferentes disoluciones de nisina a diferentes concentracin y
se observo la respuesta frente al m.o indicador L.innouca.
Utilizando la metodologa de difusin en agar se prepararon
unas placas. con el m.o indicador de L.innocua (106 ufc/mL) y
se verti BHI agar (45C). Las placas se dejaron solidificar en
nevera (4C) durante 30min. A continuacin, en cada placa se
realizaron 5 pocillos de 9mm de dimetro y en los pocillos 1,
2, 3 y 4 se inocularon 100L de las diferentes concentraciones
de nisina a testar (25-1200mg/L), quedando el pocillo 5 sin
muestra. Las placas fueron incubadas durante 24 horas a
37C. Posteriormente se midio el dimetro de los halos de
inhicion.
Utilizando la tcnica de la dilucin en la dilucin en caldo se
prepararon una serie de tubos ensayo en los que se
mezclaron 1mL de las distintas disoluciones de nisina
indicadas en la figura con 1mL de L.innocua (10 6 ufc/mL). Tras
una incubacin de 20 horas a 37C se determino la carga
microbiana resultante mediante recuento en placa BHI agar
Obteniendose la dosis minima de nisina con actividad frente a
L.innocua.
La finalidad de este patrn dosis consiste en trasladar la
respuestas observadas por L.lactis frente a L.innucua a una
actividad equivalente de nisina.
6. Con la finalidad de determinar en que momento del desarrollo
el L.lactis produca la mayor actividad bactericida a) se
determino su curva de crecimiento y B) se evalu la actividad
antilisteria de los metabolitos producidos (SPP) a lo largo de su
desarrollo.
a) A partir de un inoculo de L.lactis se determino su curva de
crecimiento tras representar los valores obtenidos de ufc/mL
frente al tiempo. Posteriormente, la curva se modelizo segn

los modelos cinticos de Gompertz y Baranyi y se obtuvieron

los parmetros caractersticos del desarrollo microbiano.
b) La actividad antimicrobiana del SPP se determino a lo largo
del crecimiento del L.lactis utilizando la tcnica de difusin en
agar
Para la obtencin del sustrato parcialmente purificado (SPP)
rico en sustancias antimicrobianas fundamentalmente
bacteriocinas y libre de clulas microbianas se procedi como
se indica en el esquema. En primer lugar, el L.lactis se inoculo
en caldo y se dejo incubar durante 21 horas. A cada hora se
extrajo una muestra a la que MRS y a cada hora se extrajo
muestra a la que se le realizo un proceso de pasteurizacin
con el fin de inactivar las clulas microbianas y un proceso de
centrifugacin obtenindose asi el Sustrato parcialmente
purificado (SPP) o sobrenadante libre de clulas.
7. En la tercera fase se testaron diferentes formulaciones con la
finalidad de obtener un medio que permitiese un ptimo
desarrollo de la actividad antilisteria del L.lactis.
Se trabajo con dos cepas de L.lactis (CECT 539 y CECT
4434) y los componentes utilizados en las formulaciones
fueron: sacarosa, peptona, extracto de levadura, fosfato
potsico, cloruro sdico y sulfato de magnesio. La variable
dependiente o respuesta considerada fue la actividad del
L.lactis.
Para la formulacin del medio optimo se utilizo la metodologa
de la superficie de respuesta.
8. La cuantificacin del L.lactis se realizo en base a un patrn de
nisina utilizando dos metodologias diferentes:a) La propuesta
por Delgado y b) La basada en la curva de calibrado.
a) Segn Delgado la actividad antimicrobiana se puede
expresar como potencia segn la formula P=
Donde
Am: Area del halo del L.lactis,
Ae: Area del halo de la nisina
m: es la pendiente de la recta que relaciona
el el ln C de nisina con al area del halo de
inhibicion para el m.o indicador L.innocua (el

area del halo se obtiene a partir de la tecnica

de la difusion en agar)
b ) Segn la metodologia basada en la curva de calibrado
Existe una relacion lineal entre el log C de nisina y el diametro
halo de inhibicion obtenidos a partir de la tecnica de la difusion
en agar. Al representar esta relacion se obtuvo la ecuacion de
una recta.
Por otro lado existe una relacion lineal entre la C de nisina y la
carga microbiana (ufc/mL) presente obtenida a partir de la
tecnica de la dilucion en caldo. Como se puede observar en la
fig la nisina es muy efectiva frente a L.innocua, siendo la CMI
de 300UI/mL. La concentracion minima inhibitaroria es la
dosis minima de nisina que genero la mortalidad total de 106
ufc/mL de L.innocua. La ampliacion del intervalo prctico de
accion nos da la ecuacion de una recta que relaciona la carga
microbiana presente con la C de nisina.
A partir de estas dos ecuaciones se pudo calcular la actividad
antimicrobiana de los metabolitos producidos por L.lactis,
relacionando el halo de inhibion generado por estos con la
carga microbiana presente en base a un patron de nisina.
9. En esta figura se puede muestran los datos experimentales y
las modelizaciones de Gompertz y de Baranyi. Como se puede
observar la curva obtenida se correspondi con un modelo
clsico de crecimiento microbiano en el que se distinguen 3
fases bien definidas.
En la tabla se muestra los parmetros cinticos de crecimiento
y los coeficientes de correlacin obtenidos a partir de las 2
modelos. Como se puede observar con los valores de R2 el
crecimiento de L.lactis se ajusta perfectamente a los dos
modelos utilizados. La fase de latencia se sita en torno a las
2 h. La velocidad de crecimiento es del orden de 0,5.La MDP
es algo superior a las 10 log ufc/mL
10. Segn los resultados obtenidos en las tres figuras la mayor
actividad antilisteria de L.lactis se logra tras incubar el m.o
entre 10-15 horas.

Por lo tanto, y en base a estos resultados se considera un

tiempo de incubacin de 12 horas para los siguientes ensayos,
puesto que la brusca caida de la actividad antimicrobiana
observada a partir de las 15 horas no aconseja apurar hasta
dicho limite.
11. En la fase inicial de este estudio se utiliz un diseo factorial
fraccionado (DFF), Los ingredientes o factores del medio de
crecimiento considerados fueron: sacarosa, peptona, extracto
de levadura, KH2PO4, NaCl y MgSO4.7H2O Para cada uno de
estos factores se consideraron 2 niveles (inferior y superior)
(tabla),
De acuerdo con los diseos factoriales y teniendo en cuenta
que en el presente diseo se han considerado 6 factores con
dos niveles, se tratara de un diseo 2 6 siendo necesarios la
realizacin de 64 experimentos. Este nmero se redujo
utilizando un diseo factorial fraccionado (DFF) de tipo 2 6-2
siendo en este caso necesarios 16 experimentos En la tabla.
se muestra el diseo utilizado
La variable dependiente o respuesta considerada fue la
actividad antilisteria del SPP extrado cuando el L. lactis se
desarrollaba en los diferentes medios testados durante 12
horas de incubacin (tiempo optimo de incubacin que se
estableci en el apartado anterior para una mayor produccin
de metabolitos antimicrobianos y por tanto mayor actividad).
12. Aqu se muestran los resultados de actividad antilisteria
para las 16 formulaciones ensayadas y las dos cepas de
L.lactis consideradas.
Los resultados obtenidos muestran que los valores mas altos
de actividad para la cepa 539 fueron las formulaciones 8, 2,
14 y 3. Para el caso de la cepa 4434 fueron las formulaciones
8, 14, 7 y 9.
En esta tabla podemos observar a priori la influencia de los
factores en el medio de cultivo.

13. Aqu se muestra el diagrama de pareto estandarizado para

la cepa 539 y la cepa 4434.
El diagrama de pareto es una representacin grfica del
anlisis de varianza donde igualmente se observa los factores
ms influyentes, en su respectivo orden sobre la actividad
antilisteria. Los efectos de color azul (-) son inversamente
proporcionales a la variable de respuesta (actividad), mientras
que los de color gris (+) son efectos directamente
proporcionales a la variable respuesta. El diagrama incluye
una lnea vertical cuya ubicacin depende del intervalo de
confianza determinado (95% en este caso). Todo efecto que
pase sobrepase esta lnea ser de considerable significancia
para la actividad antimicrobiana
En este caso, ninguno de los factores del medio tiene efecto
significativo y esto tanto para la cepa 539 como para la 4434.
Para la cepa 539 en el diagrama de pareto se observa
claramente como se los seis factores del medio son el sulfato
potasico de forma negativa y el extracto de levadura de forma
positiva los que han resultado afectar en mayor medida a la
actividad. Esto indica que niveles altos de fosfato potasico en
le medio de cultivo dan lugar a actividades menores, mientras
que mientras que el extracto de levadura, sacarosa y el Na Cl
favorecen la obtencin de niveles mayores de actividad. Por
otro lado, las concentraciones de MgSO 4 y la peptona no
parecen afectar apenas a la actividad.
Para la cepa de Lactococcus lactis CECT 4434, en el
diagrama de pareto mostrado en la figura IV.9. se observa
claramente que el factor ms influyente sobre la actividad fue
el extracto de levadura. Adems, la actividad tiende a
disminuir al aumentar las concentraciones de KH 2PO4 y el
NaCl (coeficientes negativos), dndose el efecto opuesto en el
resto de los factores (coeficientes positivos). Por el contrario
las concentraciones de MgSO 4 7 H2O no parecen afectar
apenas a la actividad.
Hay que considerar, que para el anlisis de varianza se
medido la contribucin de cada factor eliminando
interacciones entre los factores presentes en el medio,
decir, la sinergia, el antagonismo o la adicin crticos en

ha
las
es
los

procesos bioqumicos. Por tanto, para que estas interacciones

sean consideradas, se tendran que utilizar modelos
matemticos de orden superior para cuyo clculo sera
necesario la realizacin de ms ensayos, y/o la reduccin del
nmero de factores para simplificar el modelo matemtico
empleado.
14. En la segunda fase del estudio se trato de describir la
naturaleza de la superficie de respuesta en la region del
optimo utilizando un diseo central compuesto (DCC) para dos
factores, 22 en estrella rotable y ortoganal.
Aunque en la primera fase de optimizacion del medio ninguno
de los componentes del medio resulto ser significativo para
una maxima actividad antilistera, en esta etapa se considero
el extracto de levadura y el KH2PO4.
En la tabla se muestra el diseo DCC rotable y ortogonal, asi
como los valores codificados y sin codificar de los dos factores
del medio considerados y los valores de actividad para cada
una de las cepas de L.lactis.
15. Aqu se muestra el diagrama de pareto estandarizado para
la cepa 539 y 4434.
En la figura. se muestra el diagrama de pareto para la cepa de
Lactococcus lactis CECT 539. En este se observa como la
levadura afecta de forma positiva a la actividad y el KH 2PO4 de
forma negativa como observ antes de la reoptimizacin del
medio si bien la influencia del KH 2PO4 en este caso es menor.
Adems, las interacciones BB (KH 2PO4 - KH2PO4) y AA
(extracto de levadura extracto de levadura) resultaron
afectar negativamente, incluso en mayor medida que el
KH2PO4 a la actividad antilisteria. Los trminos AA y BB
indican que los factores considerados tienen un
comportamiento cuadrtico respecto a la actividad.
En el caso de la cepa Lactococcus lactis CECT 4434, al igual
que se haba observado antes de la reoptimizacin del medio
(figura IV.9.), el extracto de levadura fue la variable ms
influyente, siendo en este caso significativamente influyente
(P-value<0,05) con un valor positivo. Adems tanto la

interaccin AA como la BB resultaron ser ms influyentes que

la propia variable B (KH2PO4).
16. .En base a los resultados obtenidos se realiz los diagramas
de superficies con la finalidad de obtener la concentracin de
cada variable (extracto de levadura y KH 2PO4) que genere una
mayor produccin de sustancias antimicrobianas por parte de
las cepas en estudio. En las figuras se muestran las
superficies de respuesta obtenidas. para L. lactis CECT 539 y
CECT 4434
En la tabal se muestran los valores mximo de actividad
obtenidos a partir del Diseo central compuesta, asi como las
cantidades de los dos factores del medio necesarias para
alcanzar dicha actividad.
17. Conclusiones
1. Se puede calcular la actividad antimicrobiana de los
metabolitos producidos por L. lactis equiparndola a la
actividad generada por una determinada concentracin de
nisina, relacionando el halo de inhibicin generado o la carga
microbiana residual con el equivalente a una determinada
concentracin de nisina, siendo la CMI de esta bacteriocida, en
las condiciones ensayadas de 300 mg/L 300 UI/mL..
2. La mayor actividad antilisteria del Lactococcus lactis se logra
cuando el microorganismo se encuentra al final de su fase
exponencial de crecimiento (15 horas) tras incubarlo en un
medio de crecimiento comercial (MRS). No obstante, se
considera ptimo un tiempo de incubacin de 12 horas, puesto
que a las 15 horas se produce la brusca cada de la actividad
antimicrobiana.
3. Cuando se analiza el efecto de los componentes del medio de
crecimiento (sacarosa, peptona, extracto de levadura,
KH2PO4, NaCl, Mg SO4 7 H2O) sobre la actividad antilisteria
de Lactococcus lactis CECT 539 y CECT 4454, utilizando un
diseo factorial fraccionado, con seis factores a dos niveles (2 62
) y la metodologa de superficie de respuesta, se observa que
ninguno de los componentes tiene efecto significativo sobre la
actividad antimicrobiana. Adems, al analizar los valores de los
coeficientes de regresin obtenidos se deduce que la

superficie de respuesta en estos casos no se puede ajustar a

un plano. Para obtener un mejor ajuste hay que emplear un
modelo de orden superior o bien un modelo no lineal.
4. Al simplificar el diseo experimental, considerando un diseo
central compuesto 22 en estrella rotable y ortogonal,
considerando los componentes con mayor significacin
(extracto de levadura y KH2PO4), en base a los resultados
obtenidos en el anlisis del diseo factorial fraccionado. El
efecto observado sobre la actividad antilisteria de estos
componentes defiere en funcin de la cepa considerada y
nicamente el extracto de levadura tiene efecto significativo
sobre la actividad antimicrobiana, incrementndola, en el caso
de la cepa CECT 4434.
5. La mxima actividad antilisteria de los metabolitos producidos
por la cepas CECT 539 sera equivalente a la producida por
1421,95 mg/L de nisina y se lograra en un medio formulado
con 12,20 g/L de extracto de levadura y 8.84 g/L de KH 2PO4.
Para la cepa CECT 4434 concentraciones de 12,77g/L de
extracto de levadura y 10,51g/L de KH 2PO4 generarian una
respuesta equivalente a 1247 mg/L de nisina, considerando el
resto de los componentes del medio a las concentraciones
ms bajas testadas siendo estas de 6,667 g/L para la sacarosa
y la peptona, 1g/L para el extracto NaCl y 0,047 g/L para el Mg
SO4 7 H2O.