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A. Mycobacterium tuberculosis3
M. tuberculosis resistentes
Un problema que se est extendiendo en los ltimos aos es la aparicin de M.
tuberculosis resistentes a antibiticos. En funcin de la las resistencias a antibiticos
que presentan las distintas cepas, podemos distinguir:
Multiresistentes (MDR): Que son bacterias que desarrollan resistencia frente a
rifampicina (RMP) e isoniacida (INH), que son los tratamientos de primera lnea.
Ultrarresistentes (XDR): Bacterias resistentes a drogas de primera lnea y a cualquier
miembro de la familia de las fluoroquinolonas y al menos frente a uno de segunda lnea
(kanamicina (KAN) o capromicina (CPM)).
Han sido identificadas mutaciones en un nmero limitado de genes y regiones
intergnicas (IGRs) en cepas resistentes de M. tuberculosis, pero an no estn
claras todas las causas genticas de la resistencia a antibiticos
Diagnstico
B. Mycobacterium leprae,4,5
Mycobacterium leprae, es una especie bacteriana, tambin conocida con el nombre de
bacilo de Hansen, es la bacteria que causa la lepra o "enfermedad de Hansen". Es
intracelular y pleomrfica, aunque usualmente tiene forma de bastn, es cido-alcohol
resistente, aerobia y slo remotamente emparentada con Mycobacterium tuberculosis.
Patogenia
Produce la lepra, una enfermedad granulomatosa crnica, de comienzo insidioso, que
tiene un perodo de incubacin de varios aos.
La lepra es una infeccin causada por el Mycobacterium leprae que es un parsito
intracelular obligado que se multiplica lentamente en clulas fagocitarias
mononucleares como los histiocitos de la piel y en las clulas de Schwann de los
nervios.
Clasificacin:
Existen dos tipos diferentes de Mycobacterium leprae: el lepromatoso y el tuberculoide.
a. Tipo lepramotoso
En l, el curso es el progresivo, con lesiones nodulares cutneas; involucracin insidiosa
de troncos nerviosos; bacilos cido-resistentes abundantes en las lesiones cutneas, y
una prueba cutnea de la lepromina negativa (extracto de tejido lepromatoso).
b. Tipo tuberculoide
I.
PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS
Una vez que la muestra fue recolectada, el proceso siguiente es la descontaminacindigestin. Las micobacterias son ms r es i s ten tes que las dems bacterias de flora
normal o microbiota debido a la alta cantidad de l p i d os en su p ared cel u l ar , por
consecuente estas son ms res i s ten t es a las soluciones acidas y alcalinas que
normalmente eliminan a las dems bacterias. De esta manera, es posible utilizar agentes
descontainantes o bactericidas que eliminen a la microbiota normal que las acompaen
en la muestra a analizar. El cu l ti vo mi crob i ol gi co de las micobacterias se lleva
en promedio hasta 3 semanas, por lo que es importante eliminar la microbiota normal
para evitar un sobrecrecimiento de estas y as obtener un mejor crecimiento el cultivo.
Los procesos de digestin-descontaminacin, solo pueden ser establecidos y realizados
por laboratorios clasificados en el n i vel I I d e s ervi ci os . Estos procesos requieren
de un manejo cuidadoso dentro de una ca mp an a d e s egu ri d ad junto con todas las
medidas de b i o s e g u ri da d disponibles en las instalaciones del laboratorio de n i v el I I .
1 . DIGESTION Y DESCONTAMINACIN
Como anteriormente se ha mencionado, una vez obtenida la muestra a analizar y es
considerado el diagnstico microbiolgico por cu l ti vo , se debe de tener en cuenta el
proceso de digestin-descontaminacin antes del inoculo en el med i o d e cu l ti vo .
Las muestras; respiratorias, lquidos de lavado gstrico, heces, orina, tejidos
postmortem., son las muestras ms frecuentemente sometidas al proceso de digestindescontaminacin, en especial si estas presentan una consistencia mucosa o que de
antemano es reconocida como una muestra que trae consigo un exceso de microbiota.
Los agentes ms comnmente utilizado para este proceso son los que a continuacin se
describen:
N-acetil-L-cistena
ms 2 % de NaOH .
Ditiotreitol ms 2%
de NaOH .
COMENTARIOS
Solucin de descontaminacin leve con una agente mucoltico
NALC para liberar las micobacterias atrapadas en el mucus. Lmite
de exposicin al NaOH de 15 minutos.
Agente mucoltico muy efectivo usado con NaOH al 2%. El nombre
comercial del ditiotreitol es Sputolysin. El reactivo es ms costoso
que el NALC. Lmite de exposicin al NaOH de 15 minutos.
Preferido
por
los
laboratorios
que
no
pueden
controlar
NaOH al 4 %
Fosfato trisdico al 13
%
cido oxlico al 5 %
til
en
el
procesamiento
de
muestras
que
la
concentracin
de
microorganismos
competidores
es
mnima
2. CENTRIFUGACIN.
Una buena centrifugacin es pieza clave para obtener mayor cantidad de micobacterias
en el sedimento.
Como ya se ha descrito anteriormente, las micobacterias
poseen gran cantidad de lpidos en su pared celular. El lpido
tiene el efecto de que el microorganismo tenga muy baja
densidad. Si se pretende que sedimente la mayor cantidad de
microorganismos durante la centrifugacin, la densidad del
lquido en el que se suspende la muestra debe ser mantenida
tan baja como sea posible, y la fuerza de centrifugacin
aplicada a la muestra debe ser tan alta como sea prctico.
II.
para
el
diagnstico
especfico
de
las
infecciones
por
estos
1. MEDIOS SLIDOS.
Se pueden dividir en dos grupos bsicos: medios con huevo o con agar.
1.1. Medios slidos con huevo. Son medios ricos que contienen huevo (entero o slo
yema), fcula de patata, sales, glicerol y un agente inhibidor como es el verde de
malaquita. Las ventajas fundamentales radican en la buena recuperacin de gran parte
1.2. Medios slidos con agar. Estos medios sintticos, tipo 7H10 y 7H11 de
Middlebrook, son transparentes y permiten una deteccin rpida del crecimiento
micobacteriano (10-12 das) que puede distinguirse de los residuos de la muestra en la
siembra. Adems se pueden utilizar para las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos.
La inclusin de un 2% de glicerol permite un mejor crecimiento del complejo M.
avium-intracellulare. El medio 7H11 contiene un 0,1% de hidrolizado de casena que
favorece la recuperacin de las cepas de M. tuberculosis resistentes a la isoniacida. Los
principales inconvenientes residen en un precio superior a los medios con huevo, una
vida media corta (1 mes a 2-8 C) y una mayor tasa de contaminaciones al contener una
concentracin menor de verde de malaquita. El almacenaje es delicado ya que un exceso
de temperatura o exposicin a la luz puede deteriorar el medio y estimular la produccin
de formaldehdo que es txico para las micobacterias.
1.3. Medios selectivos. Son medios no rutinarios con o sin huevo que contienen agentes
antimicrobianos para inhibir la contaminacin bacteriana y/o mictica acompaante.
2. MEDIOS BIFSICOS.
3. MEDIOS LQUIDOS.
efecta lecturas cada dos horas generando un grfico para cada cultivo y a travs de un
sistema experto determina si el cultivo es positivo o negativo. Tiene capacidad para
1920 cultivos simultneos. Admite cualquier mtodo clsico de descontaminacin y
puede utilizarse para todo tipo de muestras, incluyendo sangre y mdula sea. Las
pruebas de sensibilidad estn disponibles para tres frmacos: isoniacida, rifampicina y
etambutol.
Aunque ha sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) y los datos
iniciales son muy prometedores, la utilizacin sistemtica de estas pruebas en los
laboratorios de Microbiologa est en proceso de consolidacin y consenso general.
III.
Estudios epidemiolgicos9
Para determinar la resistencia primaria (RP) y la resistencia adquirida (RA).
Resistencia Primaria (RP): Es aquella que se observa en pacientes que nunca
recibieron tratamiento antituberculoso.
Resistencia Adquirida (RA): Es aquella que aparece en el curso del tratamiento,
usualmente como resultado de un rgimen teraputico inadecuado, fallas en la
prescripcin, falta de cumplimiento del tratamiento de parte del paciente.
Drogas
crtica (mcg/mL)
Isoniacida (INH)
0.2
Estreptomicina (SM)
4.0
Etambutol (EMB)
2.0
Rifampicina (RFP)
40.0
a=
b=
Procedimiento9,10
Todo el procedimiento debe realizarse en una Cabina de Bioseguridad Tipo II.
a) Preparacin de la suspensin bacilar:
Distribuir 3 mL de agua destilada estril en tubos de prueba de 20 x 150 mm
estril, con tapn de algodn.
Extraer las colonias de la cepa en estudio con una esptula, cogiendo el mayor
nmero posible.
Colocar las colonias en la pared interna del tubo, humedecer stas con el agua.
Triturar las colonias con ayuda de una bagueta esmerilada estril, hasta lograr
homogenizarlas.
Mezclar suavemente con la ayuda de la bagueta, hasta obtener una suspensin
homognea.
Dejar reposar la suspensin por unos minutos hasta sedimentar.
Tomar el sobrenadante y ajustar la turbidez de la suspensin (suspensin madre)
comparando con el patrn de turbidez que contiene un miligramo/mL de masa
bacilar.
b) Preparacin de Diluciones:
Distribuir 9 mL de agua destilada estril a cada uno de los 6 tubos (20x150 mm)
Previamente esterilizados y roturarlos del 1 al 6.
Preparar diluciones al dcimo de 10-1 a 10-6.
Con una pipeta aspirar 1 mL del sobrenadante de la suspensin madre agregar al
tubo rotulado con 10-1, cambiar de pipeta y mezclar bien para homogenizarlo.
Tomar 1 mL de la dilucin 10-1 y agregar al tubo rotulado con 10-2, y
homogenizar bien. Continuar con las diluciones as sucesivamente hasta llegar al
tubo rotulado con 10-6.
Es importante cambiar de pipeta en cada dilucin.
Separar los tubos 10-3, 10-5, 10-6.
c) Siembra:
Antes de la siembra verificar si los medios contiene lquido de condensacin, el
cual debe eliminarse.
Serie 1. Dilucin 10-3
Se siembra 0,2 mL de la dilucin a cada uno de los siguientes tubos:
2 tubos de medio Lowenstein-Jensen sin droga, es el tubo Control.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Isoniacida.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Estreptomicina.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Etambutol.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Rifampicina.
Serie 2. Dilucin 10-5
Se siembra 0,2 ml de la dilucin a cada uno de los siguientes tubos:
2 tubos de medio Lowenstein-Jensen sin droga, es el tubo Control.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Isoniacida.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Estreptomicina.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Etambutol.
1 tubo con medio Lowenstein-Jensen con Rifampicina.
Figura
I.
Prueba
de
sensibilidad
la
DE
LA
Pirazinamida.
INDICACIONES
PARA
LA
REALIZACION
PRUEBA
DE
SENSIBILIDAD10
Cultivo positivo obtenido de muestras de pacientes:
Al trmino del quinto mes de tratamiento.
En retratamiento.
Multitratados.
HIV Positivos/SIDA.
Para estudios epidemiolgicos de Resistencia Primaria y Adquirida del M.
tuberculosis, a los medicamentos antituberculosos.
RECOMENDACIONES9,10
Los cultivos deben estar acompaados de sus respectivas fichas.
Anotar en el tubo el N de identificacin y la fecha de siembra.
El cultivo no debe tener menos de 30 das ni ms de 60 das contados a partir de
la fecha de siembra.
El nmero de colonias por tubo no deber ser menor de 10 colonias claramente
diferenciadas.
El medio no deber estar alcalinizado, acidificado ni contaminado con hongos.
IV.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
[Visitado
16
abril
2014]
Disponible
en:
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S172646342009000300005
7. Recoleccin y procesamiento de muestras. [Visitado 16 abril 2014] Disponible
en:http://www.fcq.uach.mx/phocadownload/Academico/Material_de_Estudio/m
icobacterias/muestras/muestras_tb.html
8. Esteban, J. Gonzlez, J. Palacios, J. Procedimientos en Microbiologa Clnica Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y
Microbiologa
Clnica.
Visitado
[12
de
abril
del
2014].
Web
[http://www.facebook.com/l.php?u=http%3A%2F%2Fwww.seimc.org%2Fconte
nidos%2Fdocumentoscientificos%2Fprocedimientosmicrobiologia%2Fseimcprocedimientomicrobiologia9a.pdf&h=iAQGsEAVG]
9. Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (Lima). El laboratorio de
salud pblica frente a la emergencia de la tuberculosis resistente / Centro
Nacional de Laboratorios de Salud Pblica. Lima : Ministerio de Salud: Instituto
Nacional de Salud, 2001. [Visitado 17 abril 2014] Disponible en:
http://www.minsa.gob.pe/pvigia/publicaciones/tuberculosis/4laboratorio_salud_
publica.pdf
2010.[Visitado
17
abril
2014]
Disponible
en:
http://www.slideshare.net/alertomendoza/mtodos-para-detectar-la-resistencia-afrmacos-anti-tuberculosis