Microtbulos.

Integrantes:

Profesores:
Dr. Sebastin Reyes.
Javiera Alarcn.
Carrera:
Qumica y Farmacia.

Introduccin.

El citoplasma de las clulas eucariontes posee una compleja estructura interna denominada
citoesqueleto, compuesta por filamentos dinmicos formados por protenas (1), que cumple
un papel importante en las actividades celulares y en la organizacin de sus organelos (2).
El citoesqueleto es una estructura sumamente dinmica, que se reorganiza a medida que la
clula cambia de forma, se divide e interacta con su medio ambiente (3).
Una de sus principales funciones es proporcionar un soporte mecnico a la clula y darle
forma (2), funcin especialmente importante en las clulas animales, por la carencia de
pared celular (2). Adems es el responsable directo de movimientos a gran escala, como el
deslizamiento sobre una superficie, la contraccin de las clulas musculares y los cambios
de la forma celular que se producen durante el desarrollo embrionario (3).
Son tres tipos de filamentos proteicos los que componen al citoesqueleto: filamentos de
actina, filamentos intermedios y microtbulos (4); cada uno de ellos cumple una funcin
diferente y estn formados por subunidades distintas.
Los delgados filamentos de actina se encuentran cerca de la membrana plasmtica y con
ello confieren la forma y la estabilidad a las clulas (4). Estn constituidos de molculas de
la protena globular llamada actina. Su papel estructural es soportar tensiones (2).
Los filamentos intermedios son otra clase de elementos del citoesqueleto, especializados
para soportar tensiones (al igual que los filamentos de actina). Cada tipo est constituido de
una subunidad diferente, que pertenece a una familia de protenas que incluyen a las
queratinas (2).
Finalmente se encuentran los microtbulos, cilindros huecos constituidos por tubulina,
protena globular (2) formada a su vez por subunidades de tubulina y tubulina (4).
Son largos y rgidos, y pueden desarmarse con rapidez en un sitio y rearmarse en otro (5).
En general, crecen desde el centro organizador de microtbulos (MTOC), que se ubica
cerca del ncleo, y se extienden hacia la periferia (5), formando un sistema de guas
intracelulares a lo largo de las cuales se desplazan organelos, vesculas y otros componentes
(3). Este sistema es responsable de anclar los organelos asociados a membrana y guiar el
transporte intracelular (3). Son estructuras dinmicas que se encuentran desensamblando y
ensamblando continuamente a diferentes velocidades por sus dos extremos (4). A pesar de
su inestabilidad dinmica, tambin pueden formar estructuras permanentes tales como
cilios y flagelos (3).
sta ltima estructura flagelo- se encuentra en los espermatozoides, clulas sexuales
masculinas, y le permite desplazarse para lograr la fecundacin (6).

En ste prctico, se obtendrn espermatozoides del epiddimo de un ratn, para observar el

movimiento flagelar y adems analizar el efecto de la colchicina, alcaloide soluble en agua
(7), sobre el movimiento flagelar.

Objetivos.

Observar el movimiento flagelar de gametos masculinos y cmo se ve afectado por

la colchicina.
Conocer la estructura de los microtbulos y sus componentes.
Comprender el rol fundamental de microtbulos en el movimiento celular.
Comprender la funcin de los microtbulos y sus protenas asociadas.

Mtodo de trabajo.
Procedimiento experimental.
El procedimiento de laboratorio comenz repartiendo a cada grupo un ratn (el que
ya haba sido sacrificado por dislocamiento del cuello), ste debi ser lavado con
abundante etanol, principalmente en el abdomen.
Posteriormente fue depositado sobre la bandeja de diseccin, que se encontraba
cubierta de toalla nova, y se comenz a abrir el abdomen por la lnea media. El
objetivo era encontrar el epiddimo, que era un conducto blanquecino, en el que
estaban adheridos los testculos. Una vez ubicado el epiddimo, se cort el tejido
que una los testculos a ste; de manera que, el epiddimo qued liberado y se cort
en sus dos extremos. Ambos fueron depositados en un tubo eppendorf y se les
agreg 100 l de PBS (medio), disgregndolos con tijeras o pinzas, para liberar los
espermatozoides.

(La suspensin de espermatozoides siempre debi mantenerse a temperatura

corporal, para evitar su muerte; es por esto, que se mantuvieron de forma
permanente en la mano de uno de los compaeros, conservando su temperatura).
Ya finalizada la extraccin del epiddimo y observada la estructura interna del ratn,
ste se envolvi en la toalla nova y se cubri con los dos guantes de quin estaba
realizando ste paso. El ratn fue llevado, por el ayudante, a refrigeracin a -20C
para luego de aproximadamente 3 meses ser incinerado junto con los otros ratones,
por alguna empresa externa.
Despus, se tomaron 20 l de la suspensin de espermatozoides y fueron
depositadas en un portaobjetos y cubiertas con un cubreobjetos; para luego ser
observadas al microscopio (objetivo 10X y 40X).
Finalmente, se volvieron a tomar 20 l de la suspensin de espermatozoides y
colocadas en un portaobjetos, pero sta vez, se le agreg, rpidamente, 10 l de una
solucin de colchicina. sta mezcla fue cubierta con un cubreobjetos y observada al
microscopio (objetivo 10X y 40X). Adems se debi anotar el tiempo que demor
en actuar la colchicina desde que fue depositada sobre la suspensin de
espermatozoides hasta que inhibi totalmente el movimiento flagelar (7).
Tambin es importante destacar datos del ratn utilizado durante el laboratorio:
Cepa: Balb C (vc), del 25 de Marzo.

Resultados.
Como primer paso en el practico N4, y por procedimiento se puso al ratn en posicin
cbito dorsal, para dar paso, inmediatamente, a la incisin de la piel y los tejidos
subcutneos abrindo su abdomen por la lnea media, bajo el intestino grueso como dicen
las indicaciones de la gua. Luego de hacerle la incisin como corresponde, pudimos
observar algunos de sus rganos, notando que una zona interna del ratn era de color
verdoso-caf, que abarcaba gran parte de su estructura, de apariencia gelatinosa, eran
especies de tubos entrecruzados, en algunas partes ms gruesos y en otras ms delgadas. Un
poco ms arriba, rozando estos seudos tubos amorfos nos encontramos con algo que
estaba abrazado al extremo superior de sta parte, era de color caf, no muy grande. Cerca
de la cola, en la parte inferior del ratn, encontramos una serie de partes blancas,
esponjosas y muy brillantes, todas tenan una forma distinta, al observar ms de cerca,
adentrndonos un poco ms en esta cavidad, nos encontramos con ms rganos, de tamao
pequeo, adecuados claramente para un ratn.

Figura 4: Imagen correspondiente a un ratn de la Cepa Balb C, diseccionado, abierto desde

su abdomen por la lnea media.

Etapa N 1: Se toman 20L de la suspensin de los espermatozoides del ratn y se

depositan en el portaobjetos, para analizarlo.

Figura 1: Imagen de
microscopio ptica
10X. La muestra corresponde a los 20L de la suspensin de espermatozoides extrados del
ratn.
Esta imagen pertenece a la primera muestra a analizar en el microscopio ptico a 10X, la
cual, se obtuvo mediante una delicada diseccin a un ratn, a partir del cual, se extrajo el
epiddimo. Luego de moler el epiddimo, cuidadosamente, hasta digregarlo por completo,
se le aadi 100L de medio de cultivo.
Por lo tanto, luego de todo el procedimiento experimental, se logr observar primeramente
un color rosado plido uniforme en la muestra, al igual que una compleja capa de burbujas
de diferentes tamaos, y minsculos puntos alrededor. Hacia un sector de la muestra se
distingua un color mucho ms oscuro, que el que presentaba la mayor parte de la muestra.
Adems, en la totalidad de la imagen era posible visualizar una gran cantidad de puntos
de un color negro, dispersos en toda la muestra y, algunos presentaban formas alargadas.

Etapa N 1: Se toman 20L de la suspensin de los espermatozoides del ratn y se

depositan en el portaobjetos, para analizarlo.

Figura 2: Imagen de microscopio ptica 40X. La muestra corresponde a los 20L de la

suspensin de espermatozoides extrados del ratn.
La finalidad que posee esta segunda imagen, es ver con mayor nitidez los elementos
presentes en la muestra, tratando de observar y analizar principalmente sus formas.
Se aprecia de manera inmediata por su aumento en el lente ptico, que las burbujas han
aumentado de tamao; tambin el color antes mencionado ha cambiado, ahora es una
especie de caf-mostaza, pero sigue manteniendo una tonalidad suave, la cual permite sin
duda alguna, distinguir lo que estamos buscando. Por ltimo, se divisan como en un tipo de
relieve, estructuras como pelos pequeos, cortos, algunos largos otros ms gruesos, los
cuales nacen de minsculos puntos. Estos se encuentran como una capa en toda la muestra,
ya sea solos o modelando un red en ciertas zonas de la muestra.

Etapa N2: Se aaden 10L de una solucin de colchicina a la muestra con una suspensin
de 20 l de espermatozoides del ratn.

Figura 3: Imagen de microscopio ptica 40X. La muestra corresponde a la mezcla de la

suspensin de espermatozoides con una solucin de colchicina.
En esta imagen, el primer cambio que podemos percibir, es el color, el cual se hace mucho
ms suave, que en la imagen anterior (figura 2), pero con cambios de tonalidades en
distintas zonas de la muestra. Tambin se aprecia como una especie de red de pelos,
mayormente en el centro de la muestra, y en ciertos lugares, principalmente en los
alrededores de la muestra se notan unas formas de grietas, rodeadas de pequeos puntos
negros.

Discusin.

Al diseccionar a la rata albina para la extraccin del epiddimo, se observ e identific sus
rganos, descritos a continuacin:
Por procedimiento de laboratorio pasamos inmediatamente a abrir su abdomen por la lnea
media (luego de haberlo lavado con abundante etanol). Despus de hacerle la incisin como
corresponda, pudimos identificar algunos rganos antes de extraer el que nos concerna
para el anlisis. En primer lugar nos percatamos de un rgano cuyo tamao era
indudablemente grande, era de color caf oscuro y corresponde al hgado. Detrs del hgado
en el lado izquierdo encontramos el estomago, el cual posee un color plomizo, despus de
seguir observando y reconociendo rganos del animal, nos encontramos con el intestino, el
que es muy largo y de color plomo suave con verde musgo. Luego pasamos al aparato
urinario, en el cual localizamos los riones, ms abajo los testculos y grasa adherida a la
cabeza del epiddimo (lo cual recibe el nombre de cuerpo adiposo testicular).
En la figura 5 se sealan los nombres correspondientes de sus vsceras:

Figura 5. Fotografa ampliada en la parte inferior para mostrar con mayor detalle los rganos.

Se utiliz en el prctico el epiddimo de una rata debido a que en l los espermatozoides

estn concentrados y en su interior van experimentando la maduracin espermtica (8), lo
que est estrechamente relacionado con la edad del mamfero (8).

La rata tena aproximadamente tres meses; edad en la que la maduracin sexual es

alcanzada, por lo tanto, sus espermatozoides tambin ya eran maduros, y por ende, se
encontraban aptos para el experimento (8).
Luego de extraer las muestras y visualizarlas al microscopio (Figura 1 y Figura 2), los
espermatozoides presentaban muy poco movimiento flagelar. La causa de esto pudo haber
sido la temperatura a la que se encontraban, la cual, durante el procedimiento de laboratorio
era inferior, a la temperatura a la que son mantenidos en el interior de las gnadas
(aproximadamente, temperatura corporal: 37C) (4).
En la Figura 3, en la que se le agreg colchicina a la muestra, no se observ ningn cambio
en la muestra, estando los gametos tan inmviles como al inicio. Debido a que la accin de
la colchicina es impedir la polimerizacin de los microtbulos (6), presentes en el flagelo
de los espermatozoides, es decir, inhibir el movimiento flagelar, se esper que al aadirla a
las clulas sexuales vivas stas se detuvieran por completo, luego de haber pasado unos
minutos, lo cual no sucedi, ya que desde mucho antes los espermatozoides de la muestra
estaban sin movimiento, por ende, no se percibi cambio alguno en nuestro caso. El tiempo
aproximado que demora en actuar la colchicina, inhibiendo el movimiento flagelar, es
alrededor de 2 a 3 minutos aproximadamente (8).
Por lo tanto, se deduce que la muestra con colchicina fuera fallida debido a que los
espermatozoides necesitaban estar a una temperatura relativamente alta para mantenerse
vivos, y al realizar el prctico, en un ambiente inadecuado con una baja temperatura
climtica, los espermatozoides murieron antes de realizar la mezcla con colchicina.
Conclusin.
Finalmente se puede concluir que se cumpli el objetivo de comprender el rol fundamental
de los microtbulos en el movimiento flagelar. Este movimiento es el resultado de la
polimerizacin y despolimerizacin de los microtbulos, que son estructuras tubulares
formadas por subunidades de alfa y beta tubulina, y de la accin de protenas motoras,
como la dinena y quinesina, quienes mediante el gasto de ATP pueden desplazar organelos
a lo largo del microtbulo. Adems se logr comprender el efecto de la colchicina, que es
un alcaloide inhibidor de la formacin de microtbulos, sobre el movimiento flagelar;
puesto que la unin tubulina-colchicina produce un cambio qumico y estructural,
impidiendo la polimerizacin y despolimerizacin de los microtbulo, lo que ocasiona,
obviamente, que el flagelo deje de moverse.

Cuestionario.
1. Describir la estructura y composicin de los microtbulos.

Los microtbulos son tbulos cilndricos de 25nm de dimetro cuya pared mide 5 nm
de espesor. Estn formados por molculas de tubulina, de naturaleza proteca. Cada
microtbulo est constituido a partes iguales por tubulina alfa y tubulina beta (9).
Los microtbulos son polares se alargan (polimerizan) por un extremo, el extremo
positivo, y se acortan o despolimerizan por el opuesto, el extremo negativo. En las
clulas animales los microtbulos crecen a partir del centrosoma, que acta como
centro organizador de los mismos (9).
En general, los microtbulos son filamentos individuales que parten hacia el citoplasma
desde las proximidades del ncleo. Son rectilneos o con gran radio de curvatura y
nunca estn ramificados. Solo se encuentran en clulas eucariontes y forman un sistema
de fibras a lo largo de las cuales los orgnulos rodeados de membrana pueden viajar.
Pueden formar estructuras lbiles como el huso acromtico o mittico durante la
divisin celular o estructuras estables como los centriolos, cilios y flagelos (9).
El estudio detallado de la estructura de los microtbulos revela que estn constituidos,
generalmente, por 13 subunidades globulares (10).
Los microtbulos se han aislado de diversos rganos, siendo el tejido nervioso una de
las principales fuentes de obtencin, dado el gran nmero de microtbulos presente en
los axones de clulas nerviosas. Qumicamente, los microtbulos estn formados por
una protena dimrica llamada tubulina, de aproximadamente 120,000 daltones, y cada
dmero est formado, a su vez, por dos polipptidos denominados alfa tubulina y beta
tubulina. Cuando las molculas de tubulina se ensamblan para formar a los
microtbulos, constituyen los llamados protofilamentos de tubulina, los cuales se
disponen de manera escalonada en hileras formadas con la molcula de alfa tubulina de
un dmero, alineada junto a la molcula de beta tubulina de la siguiente hilera (10).
2. Comprender la funcin de los microtbulos y sus protenas asociadas.
Los microtbulos son componentes del citoesqueleto que tienen un papel organizador
interno crucial en todas las clulas eucariotas, y a algunas tambin les permiten
moverse. (2) Los microtbulos intervienen en diversos procesos celulares que
involucran desplazamiento de vesculas de secrecin, movimiento de orgnulos,
transporte intracelular de sustancias, as como en la divisin celular (mitosis y meiosis)
(2).
Las protenas asociadas a los microtbulos reciben el nombre de protenas MAP. Las
protenas asociadas a los microtbulos citoplasmticos (clula en Interfase), son de
varios tipos MAPs de alto peso molecular y los factores Tau. MAPs y Tau inducen la
polimerizacin in vitro de la tubulina purificada. Se unen a los microtbulos formados

por un lado de la molcula, y en el otro extremo se unen a varias molculas de la

tubulina a la vez, sirviendo como sitio de nucleacin. (11)
Entre la MAP tienen una importancia particular las protenas motoras (sirven para la
motilidad, contraccin y cambios de forma celulares, tambin trasladan
macromolculas y organelos de un punto a otro del citoplasma.) como las Dinenas,
Quinesnas. Estas utilizan la energa del ATP para moverse unidireccionalmente a lo
largo de los microtbulos, pero no lo hacen como finalidad absoluta, sino que mueven
cargas determinadas (grnulos, orgnulos) a las cuales se han unido. Las Dinenas
mueven su carga hacia el extremo munus (en general desde la periferia celular hacia
dentro de la clula; transporte retrgrado en las neuronas), mientras que la Quinesnas la
mueven hacia el extremo plus(es decir el centro de la clula; transporte antergrado en
las neuronas. (11)

La protena Tau, que abunda en el SNC y en el sistema nervioso perifrico, se localiza

fundamentalmente a nivel neuronal y esta especficamente en los axones. La funcin de
sta protena se vincula con el ensamblaje y la unin de los microtbulos, que de este
modo son estabilizados. Los estudios de maduracin neuronal han permitido establecer
que la protena Tau es una fosfoprotena (molcula compuesta de protenas y lpidos), y
que su fosforilacin es regulada durante el desarrollo, es mayor en etapas tempranas de
la vida y que se reduce significativamente en la edad adulta.(5)

3. Explicar la secuencia de ensamblaje de los microtbulos.

La formacin de los microtbulos comienza con la nucleacin. sta etapa ocurre en el
centrosoma, regin que se ubica generalmente cerca del ncleo y al que se considera un
centro organizador de microtbulos (2) y es el proceso en el que los dmeros de
tubulina y comienzan a unirse a un anillo de tubulina (5) con una orientacin

especfica, lo que determina que el extremo menos quede al interior del centrosoma y el
extremo ms en el exterior (3). El contacto longitudinal entre los dmeros los vincula en
una estructura lineal que recibe el nombre de protofilamento (5).
La polimerizacin de los dmeros de tubulina requiere la presencia de GTP, por lo que
antes de incorporarse al microtbulo en formacin, se fija GTP en la tubulina (en la
tubulina se encuentra GTP tambin, pero fijado permanentemente) (5). Entonces el
complejo GTP se polimeriza, y en algn momento el GTP se hidroliza a GDP (5). A
medida que se van agregando ms y ms subunidades, mientras se hidroliza el complejo
GTP, se forma un casquete de GTPs, el cual se encontrar en el extremo y evitar el
desensamblaje del microtbulo (3) (al ser los enlaces entre dmeros con GDP
inestables).
Si la velocidad a la que se unen los dmeros es mayor a la hidrlisis de GTP, siempre
habr un casquete de GTP en el extremo. Por el contrario, si los dmeros se incorporan
con lentitud al microtbulo, la tubulina con GDP alcanza al extremo ms, y se
despolimerizar gran parte del microtbulo. De esta forma se liberan los dmeros unidos
a GDP y en el citoplasma son rpidamente convertidos a GTP, comenzando nuevamente
la polimerizacin (3).

Bibliografa.

[1] Tortora G., Funke B. & Case C., (2007). 'Mecanismos de patogenicidad microbianos'.
Introduccin a la microbiologa. 9 ed. Buenos Aires, Argentina: Mdica Panamericana.
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[2]Campbell N. & Reece J. , (2007). 'Un viaje por la clula'. Biologa. 7 ed. Espaa:
MdicaPanamericana. p.(112-118).
[3] Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K. & Peter W.,
(2006). 'El citoesqueleto'. Introduccin a la biologa celular. 2nd ed. Madrid, Espaa:
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[4] Mller-Esterl W., (2008). 'Estructura y dinmica del citoesqueleto'. Bioqumica.
Fundamentos para Medicina y Ciencias de la Vida. Barcelona: Reverte. p.(431).
[5]Ross M. &Pawlina W., (2007). 'El citoplasma celular'. Histologa. 5 ed. Buenos Aires,
Argentina: Mdica Panamericana. p.(61-65).
[6] Wolpert L., (2010). 'Clulas germinales, fecundacin y sexo'. Principios Del Desarrollo.
3 ed. Espaa: Mdica Panamericana. p.(432).
[7] Gua del laboratorio.
[8] (En lnea) Gua universitaria. Espermatognesis en vertebrados (mamferos).
Universidad
Autonoma.
Disponible
en:
http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/Descargas/guion_practica2.pd
f
[9] Velasco J, Romero T, Salamanca C, Lpez R. (2009). Unidad 3: 'Organizacin celular'.
Biologa 2 Bachillerato. pp.119.
[10] Jimnez.(2002).Captulo 9: Citoesqueleto. Biologa celular y molecular. pp 285.
[11] (En lnea) Disponible en: http://www.iqb.es/cbasicas/biolmol/cap11/biomol11.htm