Introduccin

La adaptacin y supervivencia de un gran nmero de especies bacterianas requiere a

menudo un sistema de respuesta a estrs cuando estos microrganismos se hallan expuestos a
condiciones adversas(HenggeAronis,1999). Elgende rpoS,codificaparalasubunidadsigma
tambinconocidocomos delaRNApolimerasa,seconocecomounreguladormaestrodela
transcripcindegenesinvolucradosenelcrecimientoenfaseestacionariayencondicionesdiveras
de estrscomobajatemperatura,hiperosmolaridad,bajopH(4.5), estresoxidativo,privacinde
nutrientes, entre otros, que est involucrado directamente con la sobrevivencia de la bacteria
(HenggeAronis,1999;Ishihama,1997).ElgenderpoSseencuentraaltayfinamentereguladoa
todoslosniveles,esdecirtranscripcional,traduccionalyposttraduccin Esteadicionalmentees
reguladopor3promotores(Ishihama,1997). Graciasalrolmencionado,quecumple estefactor
sigma, se encuentra altamente conservado en varias enterobacterias como Salmonella(Hengge
Aronis,1999).entreunodelosgenesquerpoSregulaencondicionesdeestrseselgendeKatE
quecodificaparala protenadelacatalasa hidroperoxidasaII(HPII),queesfundamentalenla
detoxificacindeespeciesreactivasdeoxgeno,(Ames,1985;Loewen,1984).
LaimportanciadeestudiarSalmonellaTyphimurium, esqueprovienede unafamilia
patogenicaquecausanenfermedadesenunampliorangodehospederos,incluyendogastroenteritis
yfiebretifoidea.RpoScontrolalaexpresindelosgenesdevirulenciaplasmidialesspv(Hengge
Aronis,2002).
EnestetrabajosedescribeunmtodosimpleparaevaluarlaexpresinderpoSatravsde
actividadgalactosidasaenfaseestacionariayfaseexponencialdecrecimiento.Usandoelmtodo
simpledeRedswap,basadoenelsistemalambdaRed,selogrinterrumpirelgencromosomalde
rpoS,medianteunacicatrizFRT,queluegopermitilaconstruccindefusionestranscripcionales
lacZY. De acuerdo a los antecedentes antes sealados una pregunta interesante que surgi Es
posibledelecionarcompletamenteelgenderpoSenSalmonellaTyphimuriummedianteredswap?
Nosotros planteamos la siguiente hiptesis la delecin del gen rpoS en Salmonella
Typhimuriumgeneraunfenotipoincapazdeproliferarencondicionesdeestrsoxidativo.
paraestetrabajopracticoladelecionderpos,puedeserseguibleindirectamentesufenotipo
atravsdelefectoquegeneralaenzimadelacatalasaenpresenciadeperxidodehidrogeno

ProcedimientoExperimental
Cepas y Plsmidos. pKD3: Este plsmido posee clonado el gen cat (que codifica para la
cloranfenicolacetiltransferasa)flanqueadoporsecuenciasFRT(FlpRecombinaseTarget),
pKD4: Este plsmido posee clonado el gen aph (que codifica para la aminoglicsido
fosfotransferasa presente en el transposn Tn5) flanqueado por secuencias FRT (Flp
Recombinase Target), adems posee un origen de replicacin condicional (oriR6K)
dependientedelapresenciadelaprotenaPi().Seutilizacomomoldeparalaamplificacin
por PCR del gen aph en la generacin de mutantes mediante reemplazo allico por
transformacindirectaconproductosdePCR.
pKD46:EsteplsmidoposeeclonadoslosgenesquecodificanparalassubunidadesBet,Gamy
ExodelarecombinasaReddelfagol,bajoelcontroldelpromotorPara.Adems,poseeelgenque
codificaparalablactamasacomomarcadordeseleccinyunorigendereplicacintermosensible
(no se replica a temperaturas iguales o superiores a 37C). Se utiliza para generar mutaciones
mediantereemplazoallicoportransformacindirectaconproductosdePCR.Esteprocesoocurre
medianteeventosderecombinacinhomlogacatalizadosporlarecombinasaReddelfagol.
pCP20:EsteplsmidoposeeclonadoelgenquecodificaparalarecombinasaFlpbajoel
controldeunpromotortermoinducible.Adems,poseeelgenblacomomarcadordeseleccin(b
lactamasa; resistencia a ampicilina) y un origen de replicacin termosensible (no se replica a
temperaturasigualesosuperioresa37C).Seutilizaparagenerardelecionesdematerialgentico
flanqueado por las secuencias FRT, mediante un evento de recombinacin sitioespecfica
catalizadoporlarecombinasaFlp.
pCE36: Este es un plsmido suicida que posee el gen aph (que codifica para la
aminoglicsido fosfotransferasa), adems de los genes LacZ, LacY y un origen de replicacin
condicional(oriR6K)dependientedelapresenciadelaprotenaPi().steplsmidotienerio
arribadelgenLacZunasecuenciasFRT(FlpRecombinaseTarget).Seutilizaparahacerfusiones
transcripcionales al recombinar las secuencias FRT de este plsmido con la cicatriz FRT del
cromosoma,estomediadoporlarecombinasaFlp.
ProtocoloPCR(100l):
PararealizarlosproductosPCRdelosplsmidospNK3opNK4conloscualessedebi
trabajarsesiguielsiguienteprotocoloendondeserealizunmixdebufferPCR(10x):10l,
MgCl2(50mM):3l,elpartidor1:10l,elpartidor2:10l,losdNTPs(40mM):2l,elplsmidoa
utilizar:Templado1l,laTaqpolimerasa:0,5lyelH2Odestilada:63l.AestamezclaPCRse
lerealizaron30ciclosdealineamientoa60Cyextensinde1:30min. Luego 2l del producto
PCR se someten a electroforesis en geles de agarosa al 1,0% en TAE 1x con el fin de
comprobar la eficiencia de la purificacin y estimar la cantidad de DNA presente en cada
muestra.

PreparacindeClulasElectrocompetentes:
Sesembr2mlS.Typhimurium14028s/pKD46encaldoluriaconglucosayampicilinaa30C
todalanoche,enunmatrazconvstagoagregar25mldecaldoluriaysuplementarconarabinosa,
luegoagregar200ldepreinculo,despusseincuba30CconagitacinhastaOD600=0,4.
Sellevaronlos25mldecultivoa2tuboscrexde30ml,secentrifugpor10min.a13000xg,se
eliminelsobrenadanteyseresuspendielpelleten20mldeglicerol10%estril,secentrifug
por10a13000xg.Serepitielpasoprevio2veces,resuspendiendoen25mldeglicerol10%
estrilcadavez,eliminarelsobrenadanteyresuspenderel pellet en1mldeglicerol10%estril,
centrifugarpor10min.a10000xg,eliminarelsobrenadanteyresuspenderelpelletfinalen50l
deglicerol10%,paraobtenerunvolumenaproximadode100ldebacteriaelectrocompetente.
ElectrotransformacinconProductodePCR:
Seprocedimezclando90 ldeclulascompetentescon10 ldelproductoPCR,secolocla
mezclaenunacubetaparaelectroporacin.Sefijelequipoa2,5KV,25F,800
yserealizuna
electroporacion,seresuspendiolamezclaen1mldeCL,seincub1ha37Cconagitacin,para
expresinfenotpica,posterioralaexpresinfenotpica,seplaque100lenplacasadecuadasy
los900lrestantes,centrifugar1mina13000xgyseresuspendien100lyseplaqueenplacas
adecuadasparaluegoincubara37Cpor24h.
ConfirmacindelaMutagnesis:
PormediodePCRconlasparejasdepartidorescorrectas,yconunaelectroforesisengeles
deagarosa,seobservalosdistintostamaosdel(los)ampliconesenlacepasilvestreyenlacepa
mutanteisognicaconelgenreemplazadoporuncassettederesistencia.
RemocindecassettesgnicosflanqueadosporsecuenciasFRT:
SetransformanlasclulaselectrocompetentesconelplsmidopCP20,sesembrenplacas
deagarluriaconampicilina(100g/ml),seincubtodalanochea30C.Lascoloniasobtenidasse
aslan3vecesenplacasdeagarluria,incubndolaa37C,laprdidadelcassetteseconfirmava
PCR,utilizandolaparejadepartidoresadecuados.
FusionestranscripcionalesutilizandoelreporteroLacZ:
Sesiembra2mldelacepaconlacicatrizFRTquetodavatieneelplsmidopCP20,enun
matrazconvstagoseagreg25mldecaldoluria,luegoseagreg200ldelpreinculoanterior.
Seincuba30CconagitacinhastaOD600=0,4.Sellevaronlos25mldecultivoa2tuboscrex
de30ml.Centrifugarpor10min.a13000xg,seeliminelsobrenadanteyseresuspendielpellet
en20mldeglicerol10%estril,secentrifugpor10a13000xg.Repetirelpasoprevio2veces,
resuspendiendo en 25 ml de glicerol 10% estril cada vez, se elimin el sobrenadante y se
resuspendiel pellet en1mldeglicerol10%estril. Secentrifugpor10min.a10000xg,se
eliminelsobrenadanteyseresuspendielpelletfinalen50ldeglicerol10%,paraobtenerun
volumen aproximado de 100 l de bacteria electrocompetente, se mezcl 90 l de clulas
competentescon1 ldelpCE36,colocarlamezclaenunacubetaparaelectroporacin.Fijarel
equipoa2,5KV,25F,800
yseelectropora. Seresuspendelamezclaen1mldeCL.Luego
incubar1ha30Cconagitacin,paraexpresinfenotpica,posterioralaexpresinfenotpica,

plaquear 100 l en placas adecuadas y los 900 l restantes, centrifugar 1 min a 13000 x g y
resuspenderen100lyplaquearenplacasadecuadas.Porultimoincubara37Cpor24h.
DeterminacindelaactividadBgalactosidasa:
Secrecieronlasbacteriasenlascondicionesquesequieremediractividad,sepusieronlos
cultivosenhielodurante15minparadetenersucrecimiento,acontinuacin sealicuotaronpara
cada muestra a evaluar 900 ml de buffer Z en triplicado, se agregaron 100 ml de cultivo, se
permeabilizlasclulasagregando10mldecloroformoy10mldeSDS0,1%,seagitfuertemente
porvrtexdurante30seg.seincub10mina30C,seagregaron200mldesolucinsustrato
ONPG4mg/ml.Secronometroeltiempodeduracindelareaccin(aparicindelcoloramarillo)
alos30min.Sedetuvolareaccinagregando500mldeNa2CO31M.

La actividad enzimtica (ONPG hidrolizado por minuto por ml) con la siguiente
frmula:

LasmedidasparaelBufferZfueronde:Na2HPO4(60mM);8,04gr.,NaH2PO4(40mM);
2,76gr.,KCl(10mM);0,37gr.,MgSO4(1mM);0,12gr.,haciendountotalde500ml.Seajust
elpHa7,0ysemantenera4C.Almomentodeusar,sesuplementelvolumennecesarioconb
mercaptoetanolhastaunaconcentracinfinalde50mM.
Paralasolucindedetencindelareaccin:seutilizNa2CO3(1M);10,6gr.,enuntotalde100
mldeaguabidestiladaysemantuva4C.
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